玉米蛋白肽包埋的岩藻黄素复合纳米颗粒在制备预防/缓解/降低糖尿病饮品中的应用的制作方法

1.本发明属于食品技术领域，尤其涉及一种玉米蛋白肽包埋的岩藻黄素复合纳米颗粒在制备预防/缓解/降低糖尿病饮品中的应用。


背景技术：

2.岩藻黄素(fx)是一种主要的类胡萝卜素，存在于褐藻和硅藻的叶绿体中。fx的化学结构独特，有一个不同寻常的烯键、一个5,6-单环氧化合物。因为它的结构独特，来源广泛，所以fx的研究在近些年备受关注。fx在抗肿瘤、抗炎、清除自由基活性、抗肥胖、抗氧化、抗糖尿病、抗疟疾和抗血脂等生物学方面的功能(bae et al.2020)，使其在医药及食品行业表现出巨大的潜在价值和应用前景。然而，fx具光热不稳定性，酸、碱不稳定性，不溶于水等特点(zhao et al.2014)，很大程度上限制了其在医药食品领域的应用(mcclements 2018)。
3.蛋白是具有多种基团的生物大分子之一，具有天然的两亲结构，因此是活性成分输送的优良载体。原则上动物蛋白和植物蛋白等所有的蛋白质都能用于胶体输送。然而，同动物蛋白相比，植物蛋白是从农作物中提取而获得，来源于食用油、淀粉及其他食品加工过程中的副产物。它们消耗更少的自然资源，属于“环境友好”型蛋白，不仅能够为人体提供每日所需营养，而且还能够为人体提供动物蛋白所不具备的健康因子。从经济效益出发，植物蛋白较动物蛋白的成本普遍低，因此找到一款适合输送活性物质的植物蛋白，是目前纳米输送研究的重中之重。
4.可用于制备生物聚合类纳米封装体系的植物蛋白须具有两亲性，其中醇溶类植物蛋白在这方面表现尤为出色(thorat and dalvi 2012)。例如玉米醇溶蛋白zein，它不仅拥有较多的极性官能团，并且具有自组装性，即通过改变溶剂极性可诱导其自动形成纳米颗粒，用以封装活性物质(wang and padua2010)。然而与之前所例举的包埋体系弊端一致，单独使用zein对活性物质进行包埋效果甚微。
5.与蛋白质相比，肽作为水解后的短链蛋白产物，用它作为载体，具有直径小、易合成、易修饰并且可以被肠道直接吸收的特点，因此植物多肽：玉米蛋白肽(zh)是优于zein的理想载体。目前，使用zh包埋活性物质，处于起步阶段，相关的案例并不多见，对于其在饮品中进一步应用探讨更是未见。


技术实现要素：

6.本发明提供了一种玉米蛋白肽包埋的岩藻黄素复合纳米颗粒在制备预防/缓解/降低糖尿病饮品中的应用，该饮品以fx-zh复合纳米颗粒为主要原料，由于复合纳米颗粒粒径较小，且带有大量负电荷，使得其具有很好的稳定性。并且，由于植物多肽zh的包裹，使得fx可以安全的通过胃酸顺利进入肠道发挥其生物活性的功效，从而具有良好的降血糖功效。
7.为了达到上述目的，本发明提供了一种玉米蛋白肽包埋的岩藻黄素复合纳米颗粒在制备预防/缓解/降低糖尿病饮品中的应用。
8.作为优选，所述饮品中加入有玉米蛋白肽包埋的岩藻黄素复合纳米颗粒，其中，所述岩藻黄素的浓度为0.01-1.0mg/ml，且所述复合纳米颗粒的冻干粉末的红外谱图中具有以下官能团：
9.o-h基团拉伸：3303
±
50cm-1
、c-h基团拉伸：2927
±
50cm-1
；和
10.所述复合纳米颗粒冻干粉末经萃取后的有机相干燥粉末的红外谱图中具有以下官能团：
11.o-h基团拉伸：3461
±
50cm-1
、c-h基团拉伸：2923
±
50cm-1
、异戊二烯键基团：1929
±
10cm-1
、c＝o基团拉伸：1647
±
30cm-1
、c-h基团弯曲：1455
±
30cm-1
、c-o基团拉伸：1031
±
30cm-1
；和
12.所述复合纳米颗粒冻干粉末经萃取后的水相干燥粉末的红外谱图中具有
13.以下官能团：
14.o-h基团拉伸：3303
±
50cm-1
、c-h基团拉伸：2924
±
50cm-1
、酰胺基团：1651
±
20cm-1
。
15.作为优选，所述复合纳米颗粒的dls粒径介于68nm-350nm之间，pdi值介于0.15-0.25之间，zeta电位值介于-25到-40之间。
16.作为优选，所述复合纳米颗粒中玉米蛋白肽的浓度为1-5mg/ml。
17.作为优选，所述饮品中所加入的玉米蛋白肽包埋的岩藻黄素复合纳米颗粒的质量为100-600mg/100ml。
18.作为优选，所述饮品中加入的玉米蛋白肽包埋的岩藻黄素复合纳米颗粒通过保护和修复hfd/stz诱导的β细胞损伤以增强胰岛素的表达。
19.作为优选，所述饮品中加入的玉米蛋白肽包埋的岩藻黄素复合纳米颗粒通过激活insr/pi3k/akt信号通路以改善葡萄糖转运、糖代谢和葡萄糖稳态。
20.作为优选，所述饮品中加入的玉米蛋白肽包埋的岩藻黄素复合纳米颗粒通过抑制pi3k/akt异常的胰岛素信号通路以改善胰岛素抵抗。
21.本发明还提供了一种预防/缓解/降低糖尿病饮品，所述饮品中加入有玉米蛋白肽包埋的岩藻黄素复合纳米颗粒，其中，所述岩藻黄素的浓度为0.01-1.0mg/ml，玉米蛋白肽的浓度为1-5mg/ml，所加入的玉米蛋白肽包埋的岩藻黄素复合纳米颗粒的质量为100-600mg/100ml。
22.在上述方案中，fx-zh复合纳米颗粒可以通过以下方法制备得到：
23.将玉米蛋白(3％，w/v)分散于去离子水，用2m naoh将ph调为9.0。将分散液转入自动电位仪，按酶和底物比为2:100加入蛋白酶，并控制酶解温度为50℃，通过自动滴定维持ph恒定为9.0。通过控制酶解时间，可以得到不同分子量的玉米醇溶蛋白肽。
24.玉米醇溶蛋白肽的水解：用1m hcl将酶解液的ph调节为7.0，并于95℃热处理5min将酶失活。将水解液于25℃，10000r/min离心20min除去少量不溶物，用截留分子量为100da的透析膜对上清液进行24h的透析脱盐处理，透析过程在4℃进行，每隔8h更换一次透析液。最后将经过透析的水解液进行冷冻干燥处理，并将获得的水解物放入自封袋于4℃保存，所得水解物的分子量介于190-5000da之间。
25.将fx溶于无水乙醇配制成0.5mg/ml的储备液。将zh溶于去离子水，配制浓度为1-10mg/ml的溶液。使用均质仪将溶液进行剪切，期间取1ml的fx乙醇溶液逐滴滴加到10ml玉米醇溶蛋白肽溶液中，剪切时间一共3分钟。使用真空旋蒸仪将溶液中的乙醇除去，并用去离子水补充体积。将制备的溶液于10,000g离心20min除去不溶物(或直接使用420μm水系膜过滤)，得到包埋完成的fx复合纳米颗粒。
26.在上述方法中，可使用慢速(转速500-1000rpm)均质仪进行剪切，也可以使用高速(转速1000-10000rpm)均质仪进行剪切，优选使用高速均质仪。
27.与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于：
28.本发明提供了一种预防/缓解/降低糖尿病饮品，以fx-zh复合纳米颗粒为主要原料，结合体外各种理化指标，研究了该复合纳米颗粒对糖尿病小鼠的降血糖效果。fx-zh复合纳米颗粒可以大幅度提高fx在水溶液中的溶解度，并且还能够对其在贮藏过程中的化学稳定性提供了良好的保护作用。该fx-zh复合纳米颗粒的粒径较小，且带有大量负电荷，使得其具有很好的稳定性。并且，由于植物多肽zh的包裹，使得fx可以安全的通过胃酸顺利进入肠道发挥其生物活性的功效，因此它作为降血糖功效产品效果显著。
附图说明
29.图1为fx-zh复合纳米颗粒的样品粒径测量示意图；
30.图2为fx-zh、zh以及fx粉末的傅里叶变换红外光谱；
31.图3为fx高效液相色谱图，从上到下分别是100μg/ml，50μg/ml，20μg/ml，10μg/ml，1μg/ml；
32.图4为fx高效液相色谱标准曲线以及公式；
33.图5为不同饮食干预对血液指标(a，#表示与dc组相比显著差异，#p《0.05,##p《0.01,###p《0.001)以及肝脏组织病理学损害的影响(b，100
×
标尺100μm，400
×
标尺50μm)；
34.图6为不同实验组对空腹血清胰岛素(ins)、脂肪素(adpn)、胰高血糖素样肽-1(glp-1)和肝糖原(glycogen)的影响，#表示与dc组相比显著差异，#p《0.05,##p《0.01,###p《0.001；未标注代表不显著p》0.05；
35.图7为不同处理组小鼠肝脏中实时反转录定量pcr实验结果，其中*表示与nc组相比显著差异，*p《0.05,**p《0.01,***p《0.001；#表示与dc组相比显著差异，#p《0.05,##p《0.01,###p《0.001；
36.图8为不同处理组对实验小鼠fbg，其中*表示与nc组相比显著差异，*p《0.05,**p《0.01,***p《0.001；#表示与dc组相比显著差异，#p《0.05,##p《0.01,###p《0.001；ns代表与nc相比不显著；
37.图9为不同处理组对实验小鼠口服葡萄糖耐量试验ogtt(a)和胰岛素耐受试验itt(b)结果的影响，其中*表示与nc组相比显著差异，*p《0.05,**p《0.01,***p《0.001；#表示与dc组相比显著差异，#p《0.05,##p《0.01,###p《0.001；
38.图10为gnas、camk和β-actin表达的蛋白质印迹的代表性图像(a)，不同处理组对gnas(b)和camk(c)通路关键蛋白表达的影响水平测定和标准化。其中*表示与nc组相比显著差异，*p《0.05,**p《0.01,***p《0.001；#表示与dc组相比显著差异，#p《0.05,##p《0.01,###p《0.001。
具体实施方式
39.下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
40.实施例1ph值测量
41.取100ml样品，在室温下，使用ph计(品牌：梅特勒上海)，经校准后测量。
42.结果表明，该饮品的ph值介于5.8-8.0之间。
43.实施例2粒径、动态光散射技术(pdi)和zeta电位的测量
44.在25℃通过马尔文zs90测量。使用四面透光的一次性塑料样品池测量粒径和pdi数据(动态光散射技术)。zeta电位的数据则通过马尔文1070型电位测量池测量得到。
45.从图1中可以看出，玉米蛋白肽包埋的岩藻黄素复合纳米颗粒的dls粒径介于68nm-350nm之间，pdi值介于0.15-0.25之间，zeta电位值介于-25到-40之间。颗粒分布均匀，表面具有负电荷。
46.实施例3活性物质参数检测
47.样品前处理：
48.取100ml饮品，将其在-40℃进行冷冻真空干燥24小时后得到产品粉末a(内含fx-zh)备用。为了提取a中的核心物质fx和壁材植物多肽zh，准确称取a待测样0.020g-0.040g(精确至0.001g)，加入1ml水，放入超声波清洗机中超声5min使其溶解充分。在1ml新鲜制备的水溶液中加入1ml甲基叔丁基醚/丙酮(1:1,v/v)，在4000g下离心10分钟。此时fx均溶解到有机相中，而植物多肽zh的壁材在水相中。收集含有fx的有机相，重复上述步骤2-3次，直到有机相呈透明色。分离有机相和水相后，将有机相在氮气流下干燥得到粉末b(内含fx)。并将水相再次置于零下40℃进行冷冻真空干燥2小时，得到粉末c(内含植物多肽zh)。
49.3.1傅里叶红外光谱仪测产品吸收峰
50.测试前，将上述粉末a、b、c及kbr粉末一同放到真空干燥箱中，于110℃干燥5h。然后将样品a、b、c分别与kbr粉末以1：6的比例放于玛瑙研钵中充分混合，并研磨至粉末变细，经液压机压制成透明小圆片。所有样品均以纯kbr的红外光谱作为谱线背景。使用傅里叶变换红外光谱仪扫描400-4000cm-1
范围内的光谱图。结果见图2。
51.图2显示了上述样品fx-zh、zh以及fx粉末的傅里叶变换红外光谱结果，具体为：
52.1)粉末b(fx)有一个小而宽的o-h拉伸(3461
±
50cm-1
)，在2923
±
50cm-1
有一个强的疏水c-h拉伸振动和一个特殊fx独特的异戊二烯键(1929
±
10cm-1
)显示其不稳定性。c＝o拉伸(1647
±
30cm-1
)、c-h剪切和弯曲(1455
±
30cm-1
)、c-o拉伸(1031
±
30cm-1
)等，这些都是fx的标准特征峰。
53.2)粉末c(zh)的特征峰是宽而强的o-h伸展(3303
±
50cm-1
)，显示了zh的亲水性，c-h伸展(2924
±
50cm-1
)代表其疏水性，以及特征峰酰胺带(1651
±
20cm-1
)。
54.3)粉末a(fx-zh)的特征峰与粉末c(zh)类似，但是有一些变化，如在3303
±
50cm-1
处的o-h拉伸变强变宽并且蓝移直3304cm-1
，而2927
±
50cm-1
处的疏水c-h拉伸强度下降，这可能是由于fx的疏水官能团与zh结合导致fx-zh的亲水能量增加。其次，fx的特定异戊二烯键(1929
±
10cm-1
)被大大削弱直消失，很可能是由于fx的化学键进入zh形成的空腔，zh本身
的结构在ft-ir中被削弱，这也可以通过比较fx和fx-zh的光谱结果来证明，在被称为指纹的区域，400-1000cm-1
之间的许多峰消失了。这也意味着fx在被zh包裹后，由于氢键、疏水和静电之间的相互作用，其稳定性增加。
55.上述方法用于定性判定产品中的有效成分是否为fx和植物多肽zh，并相互作用形成复合物fx-zh。当检测指标的谱峰与上图三条谱峰均一致的情况下，可以判定产品中有效成分为fx和植物多肽zh。
56.3.2高效液相色谱定量分析
57.1)标准溶液的配制
58.将fx标准储备溶液用乙腈逐级稀释，配制成浓度为1μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、50μg/ml、100μg/ml的岩藻黄素标准溶液。分别取上述溶液经滤膜过滤至液相瓶中待测。
59.2)样品溶液的配制
60.取样品粉末b 0.020g(精确至0.001g)，然后溶解在1毫升的乙腈中，经滤膜过滤至液相进样瓶中待测。
61.3)高效液相色谱上机条件
62.通过高效液相色谱检测fx的浓度，设置如下。色谱柱。sb-c18(4.6mm x 250mm，5μm)，波长：450nm，洗脱流速：0.8ml/min，柱温：25℃，流动相。乙腈(90％)和水(10％)，注射量：10μl。
63.4)样品中fx含量计算方法
64.样品中fx含量按式(b.1)计算，计算保留三位有效数字。
65.x＝(c
ⅹvⅹ
10-6
/m)
×fⅹ
100
………………………
b.1
66.式中∶
67.x-样品中岩藻黄素含量，单位为百分率(％)；
68.c-样品制备液中岩藻黄素浓度，单位为微克每毫升(ug/ml)；
69.v-样品制备液最终定容体积，单位为毫升(ml):
70.m-样品的质量，单位为克(g):
71.f-样品的稀释倍数。
72.结果见图3和4。如图3所示，fx标准峰的保留时间在8.118分钟前后，重复率好。因此当待测样品的峰值在保留时间7.8-8.4分钟之间，可以定性判定为是fx的特征峰。如图4所示，fx在a
450
处的峰面积和其浓度具有很好的线性关系。通过此公式，可以计算出待测样品的fx浓度，因此可以定量的测定产品中fx含量。当使用上述方法测得的fx含量在0.01-1.0mg/ml时，判定为我们的产品。
73.基于以上可知，通过结合傅里叶红外仪与高效液相色谱可以实现对产品中fx-zh的定性和定量鉴别。当样品经过上述步骤处理后，傅里叶红外谱图与图1一致后，我们可以定性判定样品为fx-zh。再将样品经过高效液相色谱检测，当它在保留时间7.8-8.4分钟之间有峰值，并且经过计算fx浓度在0.01-1.0mg/ml判定为是我们的产品。
74.实施例4动物实验
75.6周大的雄性c57bl/6小鼠购自北京唯尚立拓科技有限公司。饲养条件为24
±
2℃，12h/12h光照/黑暗周期，55
±
10％湿度，自由获取食物和饮用水。适应一周后，首次将动物随机分配到正常饮食(lfd：4％脂肪，51％碳水化合物和20％蛋白质)的对照组(nc)(n＝8)
和高脂肪饮食组(hfd：35％脂肪，26％碳水化合物和26％蛋白质，n＝60)。在诱导高脂肪饮食六周后，hfd组的小鼠被施以空腹注射链脲霉素(stz，45mg/kg，溶于0.1m柠檬酸钠缓冲液)，每周一次，持续四周。测量空腹血糖(fbg)，连续两周保持fbg≥11.5mm/l的小鼠被用作糖尿病小鼠(n＝40)，而其他小鼠被保留。糖尿病小鼠进行第二次随机分组：分别为糖尿病对照组(dc，n＝8)、阳性对照组(pc，n＝8)、fz(n＝8)、fx(n＝8)和zh(n＝8)组。按成人服药量的10倍进行计算后，小鼠给药量如下：盐酸二甲双胍(200微克/克小鼠体重/天)、fz(40微克fx/克小鼠体重/天)、游离fx(40微克/克小鼠体重/天)和zh(1毫克/克小鼠体重/天)分别在每天晚上5点给治疗组(pc、fz、fx和zh)服用，对照组和dc在同一时间接受相同体积的饮水。实验期间每周记录体重、食物/水摄入量和fbg。本研究中使用的所有实验方案都得到了动物护理和使用委员会的批准(编号：spxy2021030503)，动物遵循机构伦理准则。
76.4.1口服葡萄糖耐量试验(ogtt)和胰岛素耐量试验(itt)
77.药物灌胃4周后，对动物进行口服葡萄糖耐量试验(ogtt)。在动物禁食8小时后，给所有动物口服葡萄糖(2.0g/kg)。然后，在0、30、60、120和180分钟内从尾巴顶端提取血样，以测定血糖水平。
78.胰岛素耐受试验(itt)是在ogtt三天后进行的，动物禁食8小时后，小鼠皮下注射0.75u/kg的胰岛素。测量注射胰岛素后0、30、60、120和180分钟的血糖水平。ogtt和itt的曲线下面积(auc)是通过梯形规则计算的。
79.实验结束时，小鼠禁食12小时并安乐死。收集血液并在3500rpm(4℃)下离心20分钟以获得血清。组织保存在-80℃以备进一步分析。
80.4.2小鼠血脂和肝损伤修复的相关测定
81.每周用血糖仪测量小鼠fbg。灌胃4周后，小鼠被断颈处死。血清中的丙氨酸氨基转移酶(alt)、天冬氨酸氨基转移酶(ast)碱性磷酸酶(akp)的水平采用市售试剂盒(南京建城生物工程研究所，中国南京)测定(实验结果见图5a)。血清胰岛素(ins)、脂肪素(adpn)、胰高血糖素样肽-1(glp-1)水平用市售的酶联免疫吸附试验(elisa)试剂盒(南京建城生物工程研究所，中国南京)进行检测，糖原glycogen用商业试剂盒(江莱比奥，中国上海)进行分析。所有的测试程序都是按照制造商的说明进行的(实验结果见图6)。
82.4.3血红素和伊红(h&e)染色
83.小鼠肝脏组织在4％多聚甲醛中固定，然后在一系列的乙醇和二甲苯溶液中脱水和脱色，并嵌入石蜡中。随后，将组织切成5μm厚的薄片。脱蜡脱水后，用苏木精和伊红染色，用中性胶密封，通过显微镜检查(olympus ckx53，日本)观察染色后的组织，并获得图像进行分析(图5b)。
84.二型糖尿病常与脂质代谢异常有关。血清alt和ast水平，它们通常被用作肝脏疾病(如肝脂肪变性)的诊断指标。结合上述4.2、4.3相关测定结果发现，虽然dc组和nc组之间的ast和alt值没有显著差异，但dc的平均值高于nc组，使用饮食干预后，小鼠ast和alt值出现了不同程度的降低。其中fx-zh对于二者都有较大程度的降低，而fx实验组，只针对ast降低较为明显。而dc组的akp含量与nc组相比显著增加(图5a)，这可能是由高血糖和stz注射引起的肝细胞受损。由于akp大部分来源于肝脏，进过肝脏由胆汁排出，如果肝细胞受到损害，导致肝功能异常，影响了排泄的过程，就会导致akp的偏高。fx-zh和pc的干预显著降低了akp的水平，fx和zh实验组对akp水平也有不同程度的降低，但效果次于fx-zh实验组。
85.为了进一步验证上述发现，我们使用小鼠肝脏组织切片进行了h&e和油红o染色分析。根据图5b所示的肝脏组织的h&e染色结果，dc组小鼠的肝脏表现出明显的破坏性变化，包括局灶性肝细胞坏死，肝窦炎症细胞浸润；血管和肝窦充血，以及弥散性微泡性脂肪变性。然而，与dc组相比，fx和fx-zh干预组的切片显示出很少的病理损伤特征，肝细胞空泡变性和炎症细胞浸润明显减少，表明肝脏在一定程度上受到了保护。fx-zh组显示出较好的径向肝窦，细胞形态和肝小叶更加完整。上述肝脏h&e染色切片与血清指标结果一致，证明fx-zh对脂质代谢的调节作用，有助于帮助修复受损肝细胞，其效果显著优于未封装的fx。
86.进一步，分析了对小鼠胰岛素抵抗的相关影响。
87.胰岛素抵抗(ir)是二型糖尿病的显著特征之一。在这项研究中，通过elisa检测血清中的胰岛素(ins)、脂肪素(adpn)、胰高血糖素样肽-1(glp-1)和糖原(glycogen)来评估外周ir的程度(xia,xu et al.2020)。在二型糖尿病中，身体对胰岛素产生抵抗，导致可从血液中去除并作为糖原储存的葡萄糖数量减少。身体最初会产生更多的胰岛素来补偿这种抵抗(nawaz,zhang et al.2021)。从图6a的结果来看，与nc组相比，dc组的胰岛素明显增加，说明二型糖尿病可以引起胰岛素抵抗。而饮食干预后，与dc组相比，小鼠的胰岛素含量明显下降，并恢复到nc组的水平。组间无明显差异。
88.adpn和glp-1是促进胰岛素分泌的激素，可以改善胰岛素抵抗(hung,wang et al.2010)。研究表明，adpn和glp-1在二型糖尿病患者甚至具有二型糖尿病遗传倾向的正常血糖受试者中的表达明显低于其在正常人群中的表达(herzberg-schafer,heni et al.2012)。如图6b所示，dc组的adpn和glp-1均为组内最低值，而经过饮食干预后，adpn和glp-1的含量有不同程度的提高，与dc组相比，adpn的含量在pc和fx-zh组明显增加。这一结果进一步表明，fx-zh和盐酸二甲双胍可以显著改善胰岛素抵抗，而未封装的fx与dc组无显著差异。
89.另外我们检测了肝脏中肝糖原的含量。一般来说，糖尿病患者的葡萄糖生成受损，表明肝脏中的糖原积累减少(l
ó
pez-soldado,guinovart et al.2021)。然而，如图6b所示，组间无显著差异。对比平均值来看fx-zh组肝糖原含量有所增加，有助于葡萄糖的储备，这有助于体内血糖的调节。
90.为了验证fx和fx-zh的抗糖尿病机制，我们在mrna水平上研究了糖原合成和糖代谢的insr/pi3k/akt途径的基因表达，该途径是葡萄糖转运、糖代谢和葡萄糖稳态的关键基因。ampk/glut2的基因表达与脂质代谢相关，可以间接调节体内葡萄糖水平。insr/pi3k/akt mrna表达水平的结果显示，fx和fx-zh实验组有效地上调了insr/pi3k/akt以及ampk/glut2表达水平(图7)。其中调节脂质代谢的重要中间基因glut2对fx-zh更为敏感，并且fx-zh实验组对pi3k的上调也显著高于fx实验组。这些结果支持了这样一个事实：岩藻黄素可以通过抑制异常的胰岛素信号通路pi3k/akt来改善胰岛素抵抗，而这些信号通路与葡萄糖摄取和肝脏糖代谢有关。fx-zh更高效的改善改善胰岛素受体的活性，从而上调与葡萄糖代谢相关的各种基因表达。
91.进一步，分析了对于小鼠血糖的相关影响。
92.对小鼠进行6周的hfd和连续4次stz注射后，图8展示了实验期间小鼠空腹血糖(fbg)水平。与nc组相比，fx-zh组小鼠的血糖与其不具有显著差异(使用bonferroni校正，p＝0.137)，也就是表示在fx-zh灌胃处理下，糖尿病小鼠的血糖值已恢复正常。与dc组对比，
可以实现降糖30％的效果。仅次于fx-zh的为pc组，它的血糖值显著低于dc糖尿病组，但值得注意的是pc组的血糖值与nc组有显著差异，这就意味着pc的用药可以缓解糖尿病的症状，降低血糖值，但无法将其恢复成正常状态。最后，未封装的fx以及壁材zh组的血糖与dc无显著差异，他们并不能缓解糖尿病症状。因此，从血糖的数据上显示封装后的fx-zh干预在一定程度上缓解糖尿病的指标，对糖尿病的治疗有显著效果。
93.为了进一步验证小鼠的糖尿病程度，我们进行了口服葡萄糖耐量试验(ogtt)，结果见图9a。所有处理组的曲线下面积(auc ogtt)可以用于表示糖尿病严重程度。面积越大代表糖尿病越严重。结果显示所有用药组均高于对照组(nc)。与dc组相比，fx-zh的曲线下面积(auc ogtt)明显降低，而未封装组fx与dc无显著差异。ogtt是衡量机体对急性高血糖反应能力的一个重要指标，常用于评估糖代谢和胰岛β细胞功能。我们的研究结果表明，fx-zh可以促进葡萄糖的吸收和代谢。有趣的是，壁材zh本身也有一定的降低葡萄糖效果，因此封装后的fx优秀的降糖效果有可能是fx和zh的加成作用，其效果优于二甲双胍的pc组。评估糖尿病的另一个指标胰岛素耐受试验(itt)结果见图9b。与ogtt一样，面积越大代表糖尿病越严重。如图9b所示，与其他组相比，dc组的aucitt面积最大，其次是pc组。处理组的aucitt值均高于对照组，而fx-zh组与nc组的差异最小，只有一颗星，而其他组与nc的差异均为二星以上。另外，与糖尿病dc组相比较，三种样品均有不同程度的胰岛素抵抗，其中fx-zh组效果最好。因此fx-zh在提高胰岛素敏感性方面起到良好的作用。二型糖尿病以高血糖、胰岛素抵抗和胰岛素敏感性受损为特征(and turgut 2020)。上述结果初步表明，fx有助于减轻二型糖尿病的症状，封装后的fx可以改善血糖不耐受和胰岛素抵抗。
94.4.4实时反转录定量pcr(rt-qpcr)
95.用sparkscript ii rt plus试剂盒(sparkjade，中国济南)提取肝脏组织中的总mrna并逆转为cdna。使用2
×
sybr green qpcr混合液(sparkjade，济南，中国)，通过rt-qpcr检测对mrna表达水平进行定量。使用的特异性引物见表1。
96.表1.特定引物序列
[0097][0098]
基因β-actin被用来作为内部参考
[0099]
4.5蛋白免疫印迹分析
[0100]
取100mg胰腺样品在ripa裂解缓冲液(裂解液中按100：1加入pmsf蛋白酶抑制剂)中均质化3min，然后在10000rpm下离心5min(4℃)，以获得用于western blot检测的上清液。通过总蛋白定量测定试剂盒测量上清液的总蛋白含量。在10％sds聚丙烯酰胺凝胶的每个孔道加入等量蛋白质(20μg)进行电泳，然后转移到pvdf膜中。将膜浸入5％bca中封闭2小
时，封闭结束后用tbst清洗pvdf膜，每10min洗一次，共洗3次。随后在4℃下用抗体：抗β-actin抗体(1:5000)、抗camk抗体(1:1000)、抗gnas抗体(1:1000)孵育过夜。此后，用tbst清洗pvdf膜，每10min洗一次，共洗3次。然后用goat anti-rabbit igg(h l)hrp二抗(1:10000)孵育2小时，再用tbst洗涤3次后，使用ecl使条带发光。采用image j软件分析条带光密度。
[0101]
胰岛素分泌对葡萄糖和其他营养刺激的反应依赖于ca
2
，钙调素依赖性蛋白激酶ii(camk ii)是一种多功能酶，在胰岛中高度表达，并与胰岛素分泌囊泡相关。camk ii可以在ca
2
激增后维持其自身的活性(rochlitz,voigt et al.2000)。当用盐酸二甲双胍，fx和fx-zh干预糖尿病小鼠后，干预组小鼠胰腺中camk ii的表达量要显著高于dc组(图10)，而壁材本身zh并未提高糖尿病小鼠的camk ii的表达。
[0102]
gnas基因也是胰岛β细胞胰岛素分泌能力的重要调节因子(sabiha,bhatti et al.2021)。如图10所示盐酸二甲双胍，fx和fx-zh干预后，小鼠的gnas的相对表达量与正常组无差异。而dc和zh组小鼠gnas的相对表达量显著低于正常组。这表明在糖尿病小鼠中，胰岛素的表达受到抑制，而fx和fx-zh可以保护和修复hfd/stz诱导的β细胞损伤，从而增强胰岛素的表达，这进一步支持了岩藻黄素在改善抗糖尿病作用中的潜在作用。
[0103]
4.6统计分析
[0104]
所有的数据都是从三个以上的独立重复实验中收集的，并由spss分析软件(23.0)处理。结果以平均值
±
标准误差(sem)表示。对于所有的统计分析，组间差异通过单因素方差分析和lsd检验来分析。
[0105]
4.7总结
[0106]
本发明提供了一种预防/缓解/降低糖尿病饮品，以fx-zh复合纳米颗粒为主要原料，结合体外各种理化指标，研究了该复合纳米颗粒对糖尿病小鼠的降血糖效果。
[0107]
以c57bl/6j雄性小鼠构建糖尿病模型，结果表明fx-zh可以有效降低小鼠血糖，改善胰岛素抵抗并修复胰岛β细胞。由蛋白质免疫印迹结果可知，fx-zh对胰岛素抵抗的改善可能是由于fx-zh可以上调camk与gnas蛋白的表达。在hfd/stz诱导的糖尿病小鼠中，通过激活insr/pi3k/akt信号通路，封装后的fx显著改善了fx的降血糖和降血脂作用。与自由fx相比，fx-zh处理对糖尿病小鼠的胰腺显示出显著的保护作用，这可能是通过糖尿病信号通路实现的，该通路与胰岛β细胞的抗氧化反应有关。fx-zh处理显著改善了camk ii的蛋白表达，表明封装后fx可以作为调节胰岛β细胞胰岛素表达的辅助因子。此外，fx-zh可以修复肝细胞损伤和肝增大。因此，fx-zh将为开发潜在的抗糖尿病功能性食品提供有效依据。