一种纳米金检测凝血酶的方法

1.本发明涉生物标志物检测技术领域，尤其设计蛋白质检测，具体为一种纳米金检测凝血酶的方法。


背景技术：

2.凝血酶(thrombin)作为一种凝血级联主要效应的丝氨酸蛋白酶，在生理和病理凝血中起着关键作用。凝血酶常被作为生物标志物，为疾病的早期发现和治疗提供依据，对凝血酶的高灵敏检测在临床诊断中具有重要意义。
3.纳米金由于具备灵敏的局域表面等离激元共振传感和易于合成、修饰的特点，常与核酸适配体联用用于开发比色检测方法。在此过程中，通常依靠靶标诱导纳米金团聚，通过观察纳米金溶液吸收光光谱变化来进行检测。但该方法检测灵敏度不够高，检测方法仍有改进空间。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明为了解决现有依靠纳米金团聚开展检测问题，提供一种依靠纳米金由团聚到解聚的凝血酶检测方法，可以方便、经济、高灵敏地检测凝血酶。
5.为达到上述目的，本发明包括寡合苷酸功能化纳米金的制备，包括如下步骤：
6.(1)tb-apt1@aunps和tb-capt1@aunps的制备
7.多个腺嘌呤片段的寡合苷酸功能化纳米金，用tb-apt1和tb-capt1先进行4000rpm的离心处理1min，再用te缓冲液稀释至浓度为100μm的适配体稀释液，后分别进行震荡和离心处理三次，以保证适配体充分溶解于缓冲液中；
8.取25.6μl的tb-apt1和tb-capt1稀释液分别加入到2.2.3合成好的1.6ml浓度为8nm的纳米金胶体溶液中，充分混合后，保持轻微的搅拌状态，室温下持续24h。该适配体与纳米金的的摩尔比约为200：1，标记tb-apt1@aunps(200:1)和tb-capt1@aunps(200:1)；
9.向两个初步修饰适配体的纳米金溶液中先加入16μl浓度为500mm的tris-acetate缓冲液，静置1h后再加入160μl浓度为1m的nacl溶液(记住nacl溶液可以分为几个批次加入，间隔1h，避免一次加入过多导致团聚)，最后静置48h(加入比例：每1ml混合液大约加入10μl的500mm的tris-acetate缓冲液和100μl的1m的nacl溶液)；
10.将静置后的tb-apt1@aunps和tb-capt1@aunps分别加入到超声清洗后的离心管中，16900g离心处理30min后去除上清液，再加入超纯水还原至原体积，再重复离心操作两次，最后一次用tris缓冲液(tris25mm，nacl400mm，ph＝8.2)还原至原体积，多次离心操作以去除未修饰上适配体。
11.(2)tb-apt1@aunps和tb-apt1b@aunps杂交处理
12.将待使用的2ml离心管分别用乙醇和去离子水分别超声清洗5min；
13.取250μl，浓度是8nm的tb-apt1@aunps和250μl，浓度是8nm tb-capt1@aunps，分别加入到清洗后的离心管中，混合均匀后置于冰箱4℃环境静置，时间大于3小时。
14.取50μl杂交原液，250μl tris缓冲液(tris25mm，nacl50mm，ph＝8.2)，和50ul不同浓度的凝血酶溶液进行吸光光光谱测试。
15.本发明的其他优点、目标和特征在某种程度上将在随后的说明书中进行阐述，并且在某种程度上，基于对下文的考察研究对本领域技术人员而言将是显而易见的，或者可以从本发明的实践中得到教导。本发明的目标和其他优点可以通过下面的说明书来实现和获得。
附图说明
16.为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作优选的详细描述，其中：
17.图1为本发明检测策略设计示意图；
18.图2为本发明不凝血酶浓度下吸收光谱图；
19.图3为本发明吸收光光强比值与凝血酶浓度对数的拟合曲线。
具体实施方式
20.以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。需要说明的是，以下实施例中所提供的图示仅以示意方式说明本发明的基本构想，在不冲突的情况下，以下实施例及实施例中的特征可以相互组合。
21.其中，附图仅用于示例性说明，表示的仅是示意图，而非实物图，不能理解为对本发明的限制；为了更好地说明本发明的实施例，附图某些部件会有省略、放大或缩小，并不代表实际产品的尺寸；对本领域技术人员来说，附图中某些公知结构及其说明可能省略是可以理解的。
22.本发明实施例的附图中相同或相似的标号对应相同或相似的部件；在本发明的描述中，需要理解的是，若有术语“上”、“下”、“左”、“右”、“前”、“后”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此附图中描述位置关系的用语仅用于示例性说明，不能理解为对本发明的限制，对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语的具体含义。
23.实施例：
24.如图1所示，将实验用离心管进行清洗处理；
25.杂交原液配制：tb-capt1@aunps:tb-apt1@aunps＝2.5(摩尔比)，混合均匀后置于冰箱4℃环境中静置，》＝3h；
26.测试步骤：取杂交原液50μl 200μl tris缓冲液(tris25mm，nacl50mm，ph＝5.63) 50μlpbs配制的凝血酶溶液，孵育40min后检测；所采用凝血酶浓度配比如下：
27.凝血酶0pm：50μl杂交原液 200μl缓冲液5 50μlpbs
28.凝血酶10pm：50μl杂交原液 200μl缓冲液5 50μlpbs配置的凝血酶(60pm)
29.凝血酶50pm：50μl杂交原液 200μl缓冲液5 50μlpbs配置的凝血酶(0.3nm)
30.采用类似的方法最终配制成的凝血酶浓度有：10pm、50pm、100pm、500pm、1nm、5nm、10nm、20nm、40nm。
31.获得如图2所示的吸收光光谱图。取波长为620nm和520nm的吸收光光强比值，绘制如图3所示的标准曲线。
32.最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。


技术特征：
1.一种纳米金检测凝血酶的方法，其特征在于：设计两种寡核苷酸，分别记为tb-apt1和tb-capt1。tb-apt1是凝血酶的核酸适配体。tb-capt1是tb-apt1的部分互补链。tb-apt1通过使用多个腺嘌呤片段锚定在纳米金表面，记为tb-apt1@aunps，tb-capt1通过使用多个腺嘌呤片段锚定在纳米金表面，记为tb-capt1@aunps。由于tb-apt1和tb-capt1部分碱基序列互补，tb-apt1和tb-capt1形成杂交链，引起tb-apt1@aunps和tb-capt1@aunps团聚。2.根据权利要求1所述的检测方法，凝血酶加入溶液后，tb-apt1会与凝血酶结合。由于tb-apt1与凝血酶之间结合力高于tb-apt1与tb-capt1。这将导致tb-apt1和tb-capt1组成的杂交链解开，引起tb-apt1@aunps和tb-capt1@aunps分离。3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于：所述tb-apt1的碱基序列为：5
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aaa aaa aaa a ttt tt agt ccg tgg tag ggc agg ttg ggg tgact-3’。4.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于：所述tb-capt1的碱基序列为：5
’‑
aaa aaaaaa a ttt tt a cct gcc cta cca cgg act-3’。

技术总结
本发明公开了一种纳米金检测凝血酶的方法。该方法设计两种寡核苷酸序列，分别记为TB-Apt1和TB-cApt1，TB-Apt1为凝血酶核酸适配体，TB-cApt1为凝血酶核酸适配体的互补链。寡核苷酸分别通过多个腺嘌呤片段锚定在纳米金表面。TB-Apt1与TB-cApt1相互杂交，引起纳米金发生团聚。添加凝血酶后，TB-Apt1与凝血酶结合，TB-Apt1与TB-cApt1形成的杂交链分离，纳米金由团聚状态变为分散状态。纳米金在溶液中分散状态的程度与凝血酶浓度成正相关关系。通过观察纳米金溶液吸收光光谱强度即可计算出凝血酶浓度。本发明通过使用腺嘌呤片段将寡核苷酸修饰在纳米金表面，降低了核酸功能化纳米金的成本，运用凝血酶诱导纳米金由团聚到解聚的过程实现凝血酶的低浓度检测，提高检测方法的灵敏度。度。度。


技术研发人员：吴江 黄昱
受保护的技术使用者：中国科学院重庆绿色智能技术研究院
技术研发日：2022.04.18
技术公布日：2022/7/29