同型半胱氨酸检测试剂盒及同型半胱氨酸的检测方法与流程

1.本发明涉及体外检测技术领域，特别涉及一种同型半胱氨酸检测试剂盒及同型半胱氨酸的检测方法。


背景技术：

2.同型半胱氨酸(hcy)是体内三种含硫氨基酸之一，是蛋氨酸代谢的中间产物，其本身不参与蛋白质的合成。蛋氨酸分子含有s甲基；在与atp作用生成s腺苷蛋氨酸后，可通过各种转甲基作用为体内已知的约50多种具有重要生理活性的物质提供甲基。s腺苷蛋氨酸在甲基转移酶作用下将甲基转移至另一物质后，生成s腺苷同型半胱氨酸，后者进一步脱去腺苷，生成同型半胱氨酸。血浆中的同型半胱氨酸约70％与白蛋白结合，为结合型。其余的游离型则主要以二硫同型半胱氨酸和以二硫键结合的同型半胱氨酸-半胱氨酸化合物形式存在，只有少量以还原型同型半胱氨酸存在于血浆中。我们通常所指的是总的同型半胱氨酸浓度。正常空腹状态下，hcy血浆浓度为5-15μmol/l，遗传或获得性因素使得hcy浓度使得hcy浓度持续高于正常值，即称为高同型半胱氨酸血症。近年来大量研究证实同型半胱氨酸水平升高与心脑血管疾病、外周血管疾病、神经系统退行性疾病、糖尿病、妊娠高血压综合征、肝硬化、慢性肾病等疾病高度相关。
3.目前用于检测hcy的方法主要有液高效液相法、循环酶法、酶联免疫法和化学发光免疫法，液高效液相(hplc)法需要进行衍生化处理，操作较为复杂；循环酶法的灵敏度较低；酶联免疫法对样本要求较高，且灵敏度较低。


技术实现要素：

4.本发明的主要目的是提出一种同型半胱氨酸检测试剂盒及同型半胱氨酸的检测方法，旨在提出一种安全性好、灵敏度高、稳定期长的同型半胱氨酸检测试剂盒。
5.为实现上述目的，本发明提出一种同型半胱氨酸检测试剂盒，包括：
6.第一试剂，所述第一试剂为包被有sah抗体的磁微粒工作液；
7.第二试剂，所述第二试剂为碱性磷酸酶标记的sah衍生物酶标工作液；
8.第三试剂，所述第三试剂为还原剂缓冲液，所述还原剂为dtt、tcep和β巯基乙醇中的至少一种；以及，
9.第四试剂，所述第四试剂为sahh和ado的缓冲液。
10.可选地，所述第一试剂为用封闭剂封闭的包被有sah抗体的磁微粒工作液，所述封闭剂为带亲水基团的peg封闭剂。
11.可选地，所述第一试剂中，所述封闭剂的浓度为0.5～3％(w/v)。
12.可选地，所述磁微粒为甲苯磺酰基磁珠。
13.可选地，所述sah衍生物为带peg链bsa衍生物。
14.可选地，所述第二试剂包括碱性磷酸酶标记的sah衍生物和酶结合物稀释液，所述碱性磷酸酶标记的sah衍生物和所述酶结合物稀释液的稀释比为0.01～0.1％(w/v)。
15.可选地，所述第三试剂中，所述还原剂的浓度为0.5～2mg/ml。
16.可选地，所述第四试剂中，所述sahh的浓度为0.05～0.2mg/ml，所述ado的浓度为50～200μmol/l。
17.可选地，还包括校准品，所述校准品包括同型半胱氨酸抗原和校准品稀释液，所述校准品中，所述同型半胱氨酸抗原的浓度为0μmol/l、1μmol/l、5μmol/l、10μmol/l、20μmol/l及50μmol/l。
18.本发明还提出一种同型半胱氨酸的检测方法，采用如上所述的同型半胱氨酸检测试剂盒，包括以下步骤：
19.混合待测样本、第一试剂、第二试剂、第三试剂及第四试剂，孵育反应后进行磁分离清洗，之后加入化学发光底物液；
20.检测化学底物发光液的相对发光强度，并根据检测到的相对发光强度，计算同型半胱氨酸的浓度；
21.其中，所述化学发光底物液为amppd。
22.本发明提供的同型半胱氨酸检测试剂盒中，第一试剂含有包被有sah抗体的磁微粒，第二试剂含有碱性磷酸酶标记的sah衍生物，第三试剂含有dtt、tcep和β巯基乙醇中的至少一种，第四试剂含有sahh和ado，该同型半胱氨酸检测试剂盒采用酶促化学发光的竞争免疫测试法原理对同型半胱氨酸进行检测，待测样本中不同形式的同型半胱氨酸被还原剂还原为游离的同型半胱氨酸，游离的同型半胱氨酸被sahh和ado转化为sah，sah和碱性磷酸酶标记的sah衍生物竞争有限的包被有sah抗体的磁微粒，通过相对光单位数测定化学发光反应，待测样本中的同型半胱氨酸量和相对光单位数(rlu)的量成反比，该同型半胱氨酸检测试剂盒灵敏度高、准确定量、无放射性风险及其操作简单，检测时间短，不易出现交叉反应；此外，dtt、tcep和β巯基乙醇等各种还原剂可以处理样本的同时，加入抗体竞争反应，将整个检测效率极大的提高。
附图说明
23.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅为本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
24.图1为本发明提出的同型半胱氨酸检测试剂盒的线性分析结果图；
25.图2为本发明提出的同型半胱氨酸检测试剂盒的临床样本符合性测试结果图。
26.本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
27.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。
28.需要说明的是，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。另外，
全文中出现的“和/或”的含义，包括三个并列的方案，以“a和/或b”为例，包括a方案、或b方案、或a和b同时满足的方案。此外，各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
29.目前用于检测hcy的方法主要有液高效液相法、循环酶法、酶联免疫法和化学发光免疫法，液高效液相(hplc)法需要进行衍生化处理，操作较为复杂；循环酶法的灵敏度较低；酶联免疫法对样本要求较高，且灵敏度较低。
30.鉴于此，本发明提出一种同型半胱氨酸检测试剂盒，包括第一试剂、第二试剂、第三试剂以及第四试剂，所述第一试剂为包被有sah抗体的磁微粒工作液，所述第二试剂为碱性磷酸酶标记的sah衍生物酶标工作液，所述第三试剂为还原剂缓冲液，所述还原剂为dtt、tcep和β巯基乙醇中的至少一种，所述第四试剂为sahh和ado的缓冲液。
31.其中，sah为s-腺苷同型半胱氨酸，游离的同型半胱氨酸在酶作用下能够得到sah；dtt为二硫苏糖醇，是一种还原剂，有抗氧化作用；tcep是一种硫醇类还原剂，在水溶液中的稳定性和溶解性较好，在酸性、碱性溶液中的稳定性也不错；sahh为s腺苷l同型半胱氨酸水解酶，ado为腺苷，游离的同型半胱氨酸在sahh和ado存在下，被转换成sah。
32.本发明提供的同型半胱氨酸检测试剂盒中，第一试剂含有包被有sah抗体的磁微粒，第二试剂含有碱性磷酸酶标记的sah衍生物，第三试剂含有dtt、tcep和β巯基乙醇中的至少一种，第四试剂含有sahh和ado，该同型半胱氨酸检测试剂盒采用酶促化学发光的竞争免疫测试法原理对同型半胱氨酸进行检测，待测样本中不同形式的同型半胱氨酸被还原剂还原为游离的同型半胱氨酸，游离的同型半胱氨酸被sahh和ado转化为s-腺苷同型半胱氨酸(sah)，sah和碱性磷酸酶标记的sah衍生物竞争有限的包被有sah抗体的磁微粒，通过相对光单位数测定化学发光反应，待测样本中的同型半胱氨酸量和相对光单位数(rlu)的量成反比，该同型半胱氨酸检测试剂盒灵敏度高、准确定量、无放射性风险及其操作简单，检测时间短，不易出现交叉反应；此外，dtt、tcep和β巯基乙醇等各种还原剂可以处理样本的同时，加入抗体竞争反应，将整个检测效率极大的提高。
33.进一步地，所述第一试剂为用封闭剂封闭的包被有sah抗体的磁微粒工作液，所述封闭剂为带亲水基团的peg封闭剂。sah抗体直接包被磁珠，会有非特异性吸附，使本底值异常，因此需要用到封闭剂，常规的封闭剂如bsa等效果一般。而带亲水基团的peg封闭剂中引入了亲水性的基团，尽可能保持抗体的构型及特性，极大的降低非特异性吸附；此外，亲水基团也有助于提高磁微粒上包被的抗体的稳定性。
34.其中，peg为聚乙二醇，能够作为封闭剂，以减少非特异性结合。bsa即牛血清白蛋白，是最常用的封闭剂，大部分bsa中有少量的抗体残留，会导致抗原/抗体之间的交叉反应，产生高背景，杂带较多或使得本底水平增高。
35.所述第一试剂中，所述封闭剂的浓度为0.5～3％(w/v)。比如，所述封闭剂的浓度为0.5％(w/v)、1％(w/v)或3％(w/v)。
36.进一步地，所述磁微粒为甲苯磺酰基磁珠。在磁珠表面涂层导入甲苯磺酰基基团，即得甲苯磺酰基磁珠。采用甲苯磺酰基磁珠捕获sah抗体，甲苯磺酰基基团作为活性基团结
合在磁珠表面，使得磁微粒可以在不使用偶联剂的情况下偶联抗体，简化了操作步骤。
37.需要说明的是，在本发明实施例中，所述磁微粒的粒径为1.0～3.0μm，所述包被有sah抗体的磁微粒中，所述sah抗体的包被浓度为0.1～1.0μg/t。
38.所述第一试剂主要采用以下步骤制得：选择合适粒径(1.0～3.0μm)的磁微粒原液，分别将sah抗体按照0.1～1.0μg/t的浓度包被到磁微粒表面，得到第一试剂。
39.所述第一试剂包括用封闭剂封闭的包被有sah抗体的磁微粒和tris缓冲液，所述tris缓冲液由50mm tris(三羟甲基氨基甲烷)、100mm nacl(氯化钠)、1.2％bsa和1g/l proclin 300(液体生物防腐剂)组成。
40.进一步地，所述sah衍生物为带peg链bsa衍生物。以带peg链bsa衍生物作为sah衍生物，进一步提升热稳定和信噪比，且不受内源性生物素的干扰。
41.所述第二试剂包括碱性磷酸酶标记的sah衍生物和酶结合物稀释液，所述碱性磷酸酶标记的sah衍生物和所述酶结合物稀释液的稀释比为0.01～0.1％(w/v)。也即，每1000ml所述酶结合物稀释液加入0.1～1g所述碱性磷酸酶标记的sah衍生物。其中，所述酶结合物稀释液包括ph值为7.4的tris缓冲液和稳定剂，所述ph值为7.4的tris缓冲液由50mm tris、100mm nacl、1g/l proclin 300、1mm mgcl2和5mm zncl2组成，所述稳定剂为牛血清白蛋白、甘氨酸、海藻糖、明胶和甘油中的至少一种。所述第二试剂主要采用以下步骤制得：向ph值为7.4的tris缓冲液加入稳定剂，得到酶结合物稀释液，然后将碱性磷酸酶标记的sah衍生物用酶结合物稀释液按0.01～0.1％(w/v)的稀释比稀释得到第二试剂。
42.进一步地，所述第三试剂中，所述还原剂的浓度为0.5～2mg/ml。比如，所述还原剂的浓度为0.5mg/ml、1mg/ml或2mg/ml。所述还原剂当还原剂的浓度小于0.5mg/ml时，不同形式的同型半胱氨酸还原不充分；当还原剂的浓度大于2mg/ml时，会降低碱性磷酸酶标记的sah衍生物和包被有sah抗体的磁微粒上包被的sah抗体的活性。
43.所述第四试剂中，所述sahh的浓度为0.05～0.2mg/ml，所述ado的浓度为50～200μmol/l。比如，所述sahh的浓度为0.05mg/ml、0.1mg/ml或0.2mg/ml，所述ado的浓度为50μmol/l、100μmol/l或200μmol/l。在上述浓度下，游离的同型半胱氨酸能够更充分地转化成sah。
44.所述同型半胱氨酸检测试剂盒还包括校准品，所述校准品包括同型半胱氨酸抗原和校准品稀释液，所述校准品中，所述同型半胱氨酸抗原的浓度为0μmol/l、1μmol/l、5μmol/l、10μmol/l、20μmol/l及50μmol/l。其中，所述校准品稀释液为由50mm tris、100mm nacl、1.2％bsa和1g/l proclin 300组成的ph值为7.4的tris缓冲液。
45.需要说明的是，由于第一试剂、第二试剂和校准品中含有bsa等惰性蛋白，惰性蛋白有助于保护碱性磷酸酶标记的sah衍生物和包被有sah抗体的磁微粒上包被的sah抗体的活性，免受到还原剂的影响。
46.本发明还提供一种如上所述的同型半胱氨酸检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
47.(1)制备校准品
48.校准品稀释液是由50mm ph 7.4的tris缓冲液配制而成，其中含有：50mm tris，100mm nacl，1.2％bsa，1g/l proclin 300。按照设定的hcy校准品浓度将相应的hcy纯品加入上述缓冲液中，制备成系列浓度的5个校准品；5个校准品的浓度分别为0μmol/l、1μmol/
l、5μmol/l、10μmol/l、20μmol/l及50μmol/l。
49.(2)制备第一试剂
50.a.取甲苯磺酰基磁珠10mg重悬于0.1m，ph 9.5的硼酸缓冲液中，放置于磁力架上静止1分钟，除去上清液；
51.b.添加900μl的0.1m，ph 9.5的硼酸缓冲液，涡旋混匀；
52.c.加入相应量的sah包被抗体至反应终浓度400μg/ml，涡旋混匀；
53.d.加入450μl的3m硫酸铵/0.1m，ph9.5的硼酸缓冲液，涡旋混匀；
54.e.37℃旋转混匀18小时；
55.f.加入亲水基团的peg封闭剂至终浓度1％，涡旋混匀，并在37℃旋转混匀6h；
56.g.反应结束后，将其置于磁力架上静止1分钟，除去上清液，用清洗缓冲液(25mm tris ph 7.2、150mm nacl、0.1％tween20)重悬；重复3次；
57.h.最后重悬于50mm tris、100mm nacl、1.5g/l牛血清蛋白、1g/l proclin 300，制得0.2mg/ml的第一试剂。
58.(3)制备第二试剂
59.取sah衍生物，加入浓度为0.1m，ph值为7.0的pbs缓冲液，混匀，加入新配置的10.0mg/ml edc水溶液，活化30分钟，然后加入浓度为5mg/ml的碱性磷酸酶溶液混匀，室温避光保存2小时后取出，用30kd的超滤柱除盐纯化，收集的剩余体积溶液加一半甘油，保存于-20℃备用。
60.稀释液配方如下：50mm tris、100mm nacl、1.5g/l牛血清蛋白、1g/l proclin 300、1mm mgcl2(氯化镁)、5mm zncl2(氯化锌)、50g/l甘油、20g/l甘氨酸、20g/l海藻糖，ph6.5；将碱性磷酸酶标记的sah衍生物用稀释液按照0.01～0.1％(w/v)的比例进行稀释配制成第二试剂。
61.(4)制备第三试剂
62.用50mm ph6.0的柠檬酸、0.9％氯化钠，稀释β巯基乙醇的至0.5～2mg/ml。
63.(5)制备第四试剂
64.用50mm ph6.5的磷酸盐缓冲液分别稀释sahh及ado至0.05～0.2mg/ml及50～200μmol/l。
65.本发明还提出一种同型半胱氨酸的检测方法，采用如上所述的同型半胱氨酸检测试剂盒，包括以下步骤：
66.混合待测样本、第一试剂、第二试剂、第三试剂及第四试剂，孵育反应后进行磁分离清洗，之后加入化学发光底物液；
67.检测化学底物发光液的相对发光强度，并根据检测到的相对发光强度，计算同型半胱氨酸的浓度；
68.其中，所述化学发光底物液为amppd。
69.amppd是1，2-二氧环乙烷衍生物，作为碱性磷酸酶底物，反应速度快，能在很短时间内提供正确可靠的结果。
70.需要说明的是，检测所用仪器为全自动化学发光免疫仪(cl-2000)(粤械注准20192220656)，免疫学检测方法为竞争免疫测试法，即仪器依次加入50μl第三试剂、20μl的hcy样本、50μl第四试剂、50μl第一试剂、50μl第二试剂，37℃孵育反应10min后，进行磁分离
清洗，清洗完后仪器自动加入化学发光底物液300μl后，将反应杯移到光电采集模块中采集光信号值，仪器自动转换为浓度，显示测试结果。
71.本发明提供的同型半胱氨酸的检测方法，采用酶促化学发光的竞争免疫测试法原理对同型半胱氨酸进行检测，待测样本中不同形式的同型半胱氨酸被还原剂还原为游离的同型半胱氨酸，游离的同型半胱氨酸被sahh和ado转化为sah，sah和碱性磷酸酶标记的sah衍生物竞争有限的包被有sah抗体的磁微粒，通过相对光单位数测定化学发光反应，待测样本中的同型半胱氨酸量和相对光单位数的量成反比，该检测方法灵敏度高、准确定量、无放射性风险及其操作简单，检测时间短，不易出现交叉反应。
72.以下结合具体实施例和附图对本发明的技术方案作进一步详细说明，应当理解，以下实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
73.实施例1灵敏度的检测
74.参照clsi ep17-a文件推荐的实验方案对5份浓度近似检出限的低值样本进行检测，每份样本检测5次，对检测结果按照大小进行排序，符合低于生产企业提供的空白限数值(空白限为0.5μmol/l)的检测结果的数量应小于或等于3个，即可认为生产企业提供的空白限和检出限的设置基本合理，求得灵敏度为1μmol/l。说明本发明提供的同型半胱氨酸检测试剂盒的灵敏度较高。
75.表1灵敏度检测结果表
76.序号s1s2s3s4s510.710.820.800.880.9120.690.710.820.890.9530.610.740.760.760.9040.660.830.850.840.9750.680.750.730.820.86
77.实施例2线性的检测
78.对浓度为0μmol/l、1μmol/l、5μmol/l、10μmol/l、20μmol/l及50μmol/l的校准品进行线性分析，得到结果见表2和图1，计算线性相关系数r＝0.9981，该试剂盒的线性范围为1～50μmol/l。由此说明，本发明提供的同型半胱氨酸检测试剂盒的线性范围宽。
79.表2校准品的线性分析结果表
80.浓度(μmol/l)发光值(rlu值)01302952112556395111215310985784207626035052254
81.实施例3准确度测试
82.取浓度为10μmol/l及20μmol/l两个hcy样品，每个样本浓度各做3个平行测试，用本试剂盒进行检测，计算相对偏差，其测量结果的相对偏差应在
±
10％范围内。说明本发明提供的同型半胱氨酸检测试剂盒的准确度高，能够准确定量。
83.表3准确度测试结果表
[0084][0085][0086]
实施例4抗干扰实验
[0087]
取待检测样品分别加入血红蛋白、甘油三酯、胆红素三种干扰物，用本发明提供的同型半胱氨酸检测试剂盒检测待测样本干扰物加入前后hcy的含量，根据nccls的文件标准，计算二者的偏差，以
±
10％为接受范围。结果表明，相对偏差均在
±
10％以内。说明本发明提供的同型半胱氨酸检测试剂盒具有较强的抗干扰能力。
[0088]
表4抗干扰实验结果表
[0089]
干扰物质添加前添加后相对偏差血红蛋白500mg/dl2020.84％甘油三酯2500mg/dl2019.90.5％胆红素12mg/dl2020.21％
[0090]
实施例5临床样本符合性测试
[0091]
采集本市一医疗机构提供的110例样本(涵盖整个线性范围)，用本发明提供的同型半胱氨酸检测试剂盒以及雅培同型半胱氨酸测试试剂盒分别进行测试，计算试验结果相关性为：r2＝0.994，k值为1.0035，结果见图2，与雅培hcy测试试剂盒的相关性非常好，能满足实际应用的需求，能准确测定样本中hcy浓度。
[0092]
实施例6磁珠封闭剂筛选
[0093]
通过选用不同的封闭剂封闭包被有抗体的磁珠，其测试结果如下表5，选用带亲水基团的封闭剂其信噪比有明显的提高。
[0094]
表5封闭剂信噪比测试结果表
[0095][0096][0097]
用不同的封闭剂封闭包被有抗体的磁珠，放置于4℃、37℃，分别在1、4、7天后拿出测试；测试结果如下表6，选用带亲水基团的封闭剂封闭的磁珠稳定性更佳。
[0098]
表6封闭剂稳定性测试结果表
[0099][0100]
实施例7 sah衍生物筛选
[0101]
用bsa-sah及bsa-linker-sah衍生物制备酶结合物，其中bsa-linker-sah中的linker为含有多个peg的化合物。其测试结果如下表7，bsa-linker-sah衍生物制备的酶结合物的信噪比更高。
[0102]
表7 sah衍生物信噪比测试结果表
[0103][0104]
表7中，ap即碱性磷酸酶。
[0105]
用bsa-sah及bsa-linker-sah衍生物制备酶结合物，放置于4℃、37℃，分别在1、4、7天后拿出测试；测试结果如下表8，选用bsa-linker-sah衍生物稳定性更佳。
[0106]
表8 sah衍生物稳定性测试结果表
[0107][0108][0109]
表8中，ap即碱性磷酸酶。
[0110]
以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的专利保护范围内。