一种提高产后亲鱼成活率的银白鱼人工繁殖方法与流程

1.本发明属于水产养殖技术领域，具体涉及一种提高产后亲鱼成活率的银白鱼人工繁殖方法。


背景技术：

2.银白鱼属于滇池特有鱼类，相关全人工繁殖技术获得突破，亲鱼可经人为干预获得批量受精卵。银白鱼是滇池特有土著物种，全球仅分布于滇池水体。目前银白鱼种群几近消失，处于濒危状态。
3.目前，培育获得大量银白鱼的主要方法依赖于人工繁育。但在银白鱼人工繁殖过程中，发现亲鱼性腺发育不同步，仿生态繁殖受精率、孵化率低，效果不好。由于银白鱼生性脆弱，对催产素敏感，人工繁殖催产素施用、人工催产授精都会对亲鱼造成较大损伤，催产率低，亲鱼产后死亡率非常高，有的组高达90％。因此目前亟需尽可能提高催产率、受精率、孵化率的同时降低产后亲鱼死亡率的技术。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种提高产后亲鱼成活率的银白鱼人工繁殖方法，既保证高催产率、受精率、孵化率，又能避免对亲鱼损伤、死亡。
5.本发明提供了一种提高产后亲鱼成活率的银白鱼人工繁殖方法，包括以下步骤：
6.将银白鱼雄鱼和雌鱼分别进行亲鱼养殖至性腺发育成熟，对雄鱼和雌鱼进行人工催产；
7.所述人工催产的方法为2次注射法，2次注射的间隔时间为18h～20h；第1次注射按照1～1.5μg/kg鱼体的剂量注射促黄体素释放激素a3，第2次注射为按照3～5μg/kg鱼体、3mg/kg鱼体、200～600iu/kg鱼体的剂量注射促黄体素释放激素a3、马来酸地欧酮和绒毛膜促性腺激素；
8.人工催化后的雄鱼和雌鱼产卵受精后，将粘有受精卵的介质转移至孵化环境中孵化，将产后的雄鱼和雌鱼经消毒杀菌后分别转移到单独的养护环境中养护，养护环境避免应激扰动，投喂黄芪多糖拌饵饲料。
9.优选的，在亲鱼养殖期间，养殖环境条件：水质清新、水体深度为40～50cm、水体的溶氧量为6～8mg/l、保持流水循环、遮阴，保持安静。
10.优选的，所述人工催产的注射部位为胸鳍基部腹腔。
11.优选的，所述产卵受精的环境条件：养殖温度为12～16℃，水体的溶解氧为8～10mg/l，水深为50cm～60cm，遮阴。
12.优选的，所述产卵受精的方式包括自然产卵受精和人工半干法产卵受精；
13.优选的，所述产卵受精在设置有介质的环境中进行；
14.所述介质包括鹅卵石和铺在所述鹅卵石下的水草。
15.优选的，所述水草的种类包括以下一种或几种水草：粉绿狐尾藻、金鱼藻和眼子
菜。
16.优选的，所述孵化环境的温度为12～16℃。
17.优选的，所述孵化环境保持流水循环，所述流水循环的水流速度为0.4～0.6m/s。
18.优选的，所述产后的雄鱼和雌鱼的消毒杀菌方法包括用含1.2g/m3硫醚沙星和1.5ml/m3五黄的泼洒液处理30～40min；
19.所述黄芪多糖拌饵的投喂时间为14～16d；
20.所述养护环境避免应激扰动的方法为双层草席遮盖；
21.所述养护环境的条件如下：水体溶解氧为8～10mg/l，保持流水。
22.优选的，在银白鱼人工繁殖过程中，所用的水体经过五级生物球处理和紫外消毒处理。
23.本发明提供了一种提高产后亲鱼成活率的银白鱼人工繁殖方法，确定一种适合银白鱼的催产素组合和配比的人工催产方法，实现产卵受精，减少亲鱼的损害，再结合消毒杀菌、减少应激扰动和提高免疫力的三重护理措施对产后亲鱼进行精细护理，既保证高催产率、受精率、孵化率，又能避免对亲鱼损伤、死亡。实验表明，本发明提供的方法既确保非常高的催产率(100％)、受精率(95％以上)、孵化率(90％以上)，又兼顾产后亲鱼存活率100％，操作更为简单，降低成本，为濒危银白鱼批量人工繁殖提供技术支撑。
具体实施方式
24.本发明提供了一种提高产后亲鱼成活率的银白鱼人工繁殖方法，包括以下步骤：
25.将银白鱼雄鱼和雌鱼分别进行亲鱼养殖至性腺发育成熟，对雄鱼和雌鱼进行人工催产；
26.所述人工催产的方法为2次注射法，2次注射的间隔时间为18h～20h；第1次注射按照1～1.5μg/kg鱼体的剂量注射促黄体素释放激素a3，第2次注射为按照3～5μg/kg鱼体、3mg/kg鱼体、200～600iu/kg鱼体的剂量注射促黄体素释放激素a3、马来酸地欧酮和绒毛膜促性腺激素；
27.人工催化后的雄鱼和雌鱼产卵受精后，将粘有受精卵的介质转移至孵化环境中孵化，将产后的雄鱼和雌鱼经消毒杀菌后分别转移到单独的养护环境中养护，养护环境避免应激扰动，投喂黄芪多糖拌饵饲料。
28.在本发明中，所述人工催产的方法优选为第1次注射按照1μg/kg鱼体的剂量注射促黄体素释放激素a3，第2次注射为按照3μg/kg鱼体、3mg/kg鱼体、200iu/kg鱼体的剂量注射促黄体素释放激素a3、马来酸地欧酮和绒毛膜促性腺激素。
29.在本发明中，在亲鱼养殖期间，养殖环境条件：水质清新、水体深度为40～50cm、水体的溶氧量为6～8mg/l、保持流水循环、遮阴，保持安静。所述银白鱼雄鱼和雌鱼在人工催产前进行亲鱼养殖。所述银白鱼雄鱼和雌鱼的养殖密度分别为在直径2米的亲鱼培育缸中投放30尾雌鱼或雄鱼。水体的溶氧量的控制优选采用纳米气盘进行。所述纳米气盘产生的微纳米气泡在水中上升速度慢、停留时间长、增加溶氧效果好。保持流水循环的方法优选为在亲鱼养殖水体上方设置一根进水管。进水管的水流速度优选为0.7～1m/s，更优选为0.8～0.9m/s。
30.在本发明中，性腺发育成熟是指银白鱼的性腺发育至iv期。雄鱼和雌鱼的人工催
产方法相同。所述人工催产的注射部位优选为胸鳍基部腹腔。所述人工催产方法的第一次注射优选为左边胸鳍，第二次注射优选为右边胸鳍，以便减少对亲鱼损伤。第一次注射后，雌雄放回原培育缸暂养，第二次注射完成后，雌雄放入同一孵化缸。本发明在实验前期摸索了多种适合银白鱼的人工催产方案，通过调整激素组成以及剂量配比，实现既保证较高的催产率又保证较高的产后亲鱼存活率。
31.在本发明中，所述产卵受精的环境条件优选：养殖温度为12～16℃，水体的溶解氧为8～10mg/l，水深为50cm～60cm，遮阴，更优选为养殖温度为14～5℃，水体的溶解氧为9mg/l，水深为55cm。所述产卵受精优选在设置有介质的环境中进行。所述介质包括鹅卵石和铺在所述鹅卵石下的水草。所述水草的种类包括以下一种或几种水草：粉绿狐尾藻、金鱼藻和眼子菜。
32.在本发明中，将粘有受精卵的介质转移至孵化环境中孵化，优选将将粘有受精卵的水草均匀分铺到3个孵化缸(离缸底水面20cm处有一层均匀铁丝)铁丝上，缸顶加盖遮阴网。所述孵化环境的温度优选为12～16℃，更优选为13～15℃，最优选为14℃。实验研究表明，低于12℃水霉难控制，影响孵化率；高于16℃畸形率高。所述孵化环境优选保持流水循环，所述流水循环的水流速度优选为0.4～0.6m/s，更优选为0.5m/s。
33.在本发明中，所述产后的雄鱼和雌鱼的消毒杀菌方法优选包括用含1.2g/m3硫醚沙星和1.5ml/m3五黄的泼洒液处理30～40min。所述处理的方法优选为浸泡。所述黄芪多糖拌饵饲料的投喂时间优选为14～16d，更优选为15d。黄芪多糖拌饵饲料的投喂量为鱼体重的3％～5％，更优选为4％。在黄芪多糖拌饵饲料中黄芪多糖和饲料的质量比优选为0.004～0.006:1的比例，更优选为0.005:1。
34.在本发明中，所述养殖环境避免应激扰动的方法优选为双层草席遮盖，以同时实现遮光、降噪，透气的目的。所述养护环境的条件如下：水体溶解氧为8～10mg/l，更优选为9mg/l，高溶解氧的水体有利于产后亲鱼的快速恢复。所述养护环境优选保持流水。在银白鱼人工繁殖过程中，所用的水体优选经过五级生物球处理和紫外消毒处理。在养护过程中，每天观察水体，如有死鱼及时捞出。
35.下面结合实施例对本发明提供的一种提高产后亲鱼成活率的银白鱼人工繁殖方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
36.实施例1
37.一种提高产后亲鱼成活率的银白鱼人工繁殖方法，选取性腺发育到ⅳ期、状态好的银白鱼进行人工繁殖，步骤如下：
38.(1)前期准备：人工催产前一周内各挑选30尾雌鱼、雄鱼分别暂养于2个直径2米的亲鱼培育缸内，水深45cm，缸内放置纳米气盘，保证溶解氧为8mg/l，在孵化缸上部10cm处设置一根进水管，保持流水(流速为0.7m/s)，水质经过五级生物球处理及紫外消毒处理，水质清新、溶氧充足。银白鱼易受惊吓乱窜，亲鱼培育缸盖遮阴网，弹力绳固定。
39.(2)人工催产：每年惊蛰前一周和后一周期间(三月初)银白鱼性腺发育到ⅳ期，雌雄鱼采用相同催产方法，相同剂量，2次注射法，注射部位胸鳍基部腹腔注射。第1次注射剂量为促黄体素释放激素a3(lhrh-a3)1.2μg/kg鱼体，间隔时间20h进行第2次注射；第2次注射剂量为促黄体素释放激素a3(lhrh-a3)4μg/kg鱼体 马来酸地欧酮(dom)3mg/kg鱼体 绒毛膜促性腺激素(hcg)400iu/kg鱼体。第一针打左边胸鳍，第二针打右边胸鳍，以减少对亲
鱼损伤；第一次注射后雌雄放回原培育缸暂养，第二次注射完成后，雌雄放入同一孵化缸。
40.(3)自然产卵受精：将第二次注射完成的雌雄亲鱼放入同一孵化缸待产；孵化缸设置：2个直径2米的孵化缸内，缸底放置浸泡充分的鹅卵石，鹅卵石下均匀铺设水草(粉绿狐尾藻、金鱼藻和眼子菜)，通过纳米气盘保证缸内溶氧充足(10mg/l)，保持流水刺激，水深55cm，水质经过五级生物球处理及紫外消毒处理。缸上盖遮阴网，弹力绳固定。孵化缸的水温通过恒温棒保持在15℃，28小时左右全部自然产空，经自然受精，受精卵粘在水草上。
41.4)孵化：将粘有受精卵的水草均匀分铺到3个孵化缸(离缸底水面20cm处有一层均匀铁丝)铁丝上，缸顶加盖遮阴网，避免阳光直射，放置和孵化缸圆周嵌合的纳米充气盘增氧，连续加注微量新水(流速为0.5m/s)。孵化温度通过恒温棒保持在15℃。
42.5)产后亲鱼护理
43.产后亲鱼移到单独养殖缸前，将养殖缸进行药物消毒，具体方法为采用硫醚沙星1.2g/m3 五黄泼洒液1.5ml/m3药浴15min，1次；
44.黄芪多糖按1kg饲料5g配比混合制备黄芪多糖拌饵饲料，连续投喂15天，每天投喂量为鱼体重的3％；
45.养殖缸用水经过五级生物球处理及紫外消毒处理；产后亲鱼转移至养殖缸后，用双层草席遮盖，充气泵充气、微流水控制，细心观察，如有死鱼及时捞出。
46.评估人工催产的催化效果，按照公式i计算催产率。
47.催产率(％)＝人工催产后产卵的雌鱼尾数/催产雌鱼尾数*100％
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公式i
48.统计自然产卵受精后的受精情况，按照公式ii计算受精率。
49.受精率(％)＝受精卵数/卵粒总数*100％
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公式ii
50.统计受精卵的孵化情况，按照公式iii计算孵化率。
51.孵化率(％)＝成功孵化的受精卵数/受精卵总数
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公式iii
52.统计养护7d后的亲鱼的死亡情况，按照公式iv计算产后亲鱼存活率。
53.产后亲鱼存活率(％)＝产后7天存活亲鱼数/催产亲鱼总数
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公式iv
54.实施例2
55.一种提高产后亲鱼成活率的银白鱼人工繁殖方法，选取性腺发育到ⅳ期、状态好的银白鱼进行人工繁殖，步骤如下：
56.(1)前期准备：人工催产前一周内各挑选30尾雌鱼、雄鱼分别暂养于2个直径2米的亲鱼培育缸内，水深50cm，缸内放置纳米气盘，保证溶解氧为6mg/l，在孵化缸上部10cm处设置一根进水管，保持流水(流速为0.8m/s)，水质经过五级生物球处理及紫外消毒处理，水质清新、溶氧充足。银白鱼易受惊吓乱窜，亲鱼培育缸盖遮阴网，弹力绳固定。
57.(2)人工催产：每年惊蛰前一周和后一周期间(三月初)银白鱼性腺发育到ⅳ期，雌雄鱼采用相同催产方法，相同剂量，2次注射法，注射部位胸鳍基部腹腔注射。第1次注射剂量为促黄体素释放激素a3(lhrh-a3)1.5μg/kg鱼体，间隔时间20h进行第2次注射；第2次注射剂量为促黄体素释放激素a3(lhrh-a3)5μg/kg鱼体 马来酸地欧酮(dom)3mg/kg鱼体 绒毛膜促性腺激素(hcg)600iu/kg鱼体。第一针打左边胸鳍，第二针打右边胸鳍，以减少对亲鱼损伤；第一次注射后雌雄放回原培育缸暂养，第二次注射完成后，雌雄放入同一孵化缸。
58.(3)自然产卵受精：将第二次注射完成的雌雄亲鱼放入同一孵化缸待产；孵化缸设置：2个直径2米的孵化缸内，缸底放置浸泡充分的鹅卵石，鹅卵石下均匀铺设水草(粉绿狐
尾藻、金鱼藻和眼子菜)，通过纳米气盘保证缸内溶氧充足(10mg/l)，保持流水刺激，水深60cm，水质经过五级生物球处理及紫外消毒处理。缸上盖遮阴网，弹力绳固定。孵化缸的水温通过恒温棒保持在15℃，24小时左右全部自然产空，经自然受精，受精卵粘在水草上。
59.4)孵化：将粘有受精卵的水草均匀分铺到3个孵化缸(离缸底水面20cm处有一层均匀铁丝)铁丝上，缸顶加盖遮阴网，避免阳光直射，放置和孵化缸圆周嵌合的纳米充气盘增氧，连续加注微量新水(流速为0.6m/s)。孵化温度通过恒温棒保持在14℃。
60.5)产后亲鱼护理
61.产后亲鱼移到单独养殖缸前，将养殖缸进行药物消毒，具体方法为采用硫醚沙星1.2g/m3 五黄泼洒液1.5ml/m3药浴15min，1次；
62.黄芪多糖按1kg饲料5g配比混合制备黄芪多糖拌饵饲料，连续投喂14天，每天投喂量为鱼体重的5％；
63.养殖缸用水经过五级生物球处理及紫外消毒处理；产后亲鱼转移至养殖缸后，用双层草席遮盖，充气泵充气、微流水控制，细心观察，如有死鱼及时捞出。
64.按照实施例1的方法分别统计催产率、受精率、孵化率以及亲鱼产后存活率。
65.实施例3
66.一种提高产后亲鱼成活率的银白鱼人工繁殖方法，选取性腺发育到ⅳ期、状态好的银白鱼进行人工繁殖，步骤如下：
67.(1)前期准备：人工催产前一周内各挑选30尾雌鱼、雄鱼分别暂养于2个直径2米的亲鱼培育缸内，水深40cm，缸内放置纳米气盘，保证溶解氧为7mg/l，在孵化缸上部10cm处设置一根进水管，保持流水(流速为0.9m/s)，水质经过五级生物球处理及紫外消毒处理，水质清新、溶氧充足。银白鱼易受惊吓乱窜，亲鱼培育缸盖遮阴网，弹力绳固定。
68.(2)人工催产：每年惊蛰前一周和后一周期间(三月初)银白鱼性腺发育到ⅳ期，雌雄鱼采用相同催产方法，相同剂量，2次注射法，注射部位胸鳍基部腹腔注射。第1次注射剂量为促黄体素释放激素a3(lhrh-a3)1μg/kg鱼体，间隔时间20h进行第2次注射；第2次注射剂量为促黄体素释放激素a3(lhrh-a3)3μg/kg鱼体 马来酸地欧酮(dom)3mg/kg鱼体 绒毛膜促性腺激素(hcg)200iu/kg鱼体。第一针打左边胸鳍，第二针打右边胸鳍，以减少对亲鱼损伤；第一次注射后雌雄放回原培育缸暂养，第二次注射完成后，雌雄放入同一孵化缸。
69.(3)自然产卵受精：将第二次注射完成的雌雄亲鱼放入同一孵化缸待产；孵化缸设置：2个直径2米的孵化缸内，缸底放置浸泡充分的鹅卵石，鹅卵石下均匀铺设水草(粉绿狐尾藻、金鱼藻和眼子菜)，通过纳米气盘保证缸内溶氧充足(9mg/l)，保持流水刺激，水深50cm，水质经过五级生物球处理及紫外消毒处理。缸上盖遮阴网，弹力绳固定。孵化缸的水温通过恒温棒保持在13℃，24小时左右全部自然产空，经自然受精，受精卵粘在水草上。
70.4)孵化：将粘有受精卵的水草均匀分铺到3个孵化缸(离缸底水面20cm处有一层均匀铁丝)铁丝上，缸顶加盖遮阴网，避免阳光直射，放置和孵化缸圆周嵌合的纳米充气盘增氧，连续加注微量新水(流速为0.6m/s)。孵化温度通过恒温棒保持在13℃。
71.5)产后亲鱼护理
72.产后亲鱼移到单独养殖缸前，将养殖缸进行药物消毒，具体方法为采用硫醚沙星1.2g/m3 五黄泼洒液1.5ml/m3药浴15min，1次；
73.黄芪多糖按1kg饲料5g配比混合制备黄芪多糖拌饵饲料，连续投喂15天，每天投喂
量为鱼体重的4％；
74.养殖缸用水经过五级生物球处理及紫外消毒处理；产后亲鱼转移至养殖缸后，用双层草席遮盖，充气泵充气、微流水控制，细心观察，如有死鱼及时捞出。
75.按照实施例1的方法分别统计催产率、受精率、孵化率以及亲鱼产后存活率。
76.实施例1～3的人工繁育结果见表1。
77.表1实施例1～3的人工繁育结果
[0078][0079]
实施例4
[0080]
按照实施例3的方法进行银白鱼人工繁殖，区别仅在于，人工催化方法和产卵受精方式不同，具体见表2和表3。
[0081]
表2不同处理的人工催产剂量
[0082][0083]
统计结果见表3。
[0084]
表3不同人工催产剂量的结果
[0085]
[0086][0087]
实施例5
[0088]
按照实施例3的方法进行银白鱼人工繁殖，区别仅在于，产卵受精方式为人工半干法。
[0089]
产后7天亲鱼成活率为93.75％，比自然产卵受精方式(实施例3记载，100％)相比，稍微降低。
[0090]
对比例1
[0091]
按照实施例3的方法进行银白鱼人工繁殖，区别仅在于，分别进行肌肉注射和胸腔注射。
[0092]
结果表明，肌肉注射吸收不好，效果来的慢，胸腔注射会伤及内脏。从银白鱼解剖结构和实践看，本发明采用腹腔注射是既伤不到内脏，催产素吸收效果又好的方式。
[0093]
对比例2
[0094]
按照实施例3的方法进行银白鱼人工繁殖，区别仅在于，在孵化培养过程中温度分别设置为10℃、13℃、16℃、18℃和21℃，孵化时间为120～480h。
[0095]
结果见表4。
[0096]
表4孵化温度对孵化结果的影响
[0097]
[0098][0099]
表4结果表明，不适宜的孵化温度直接影响孵化率，鱼苗畸形率提高，具体的，10℃下孵化培养，导致水体中水霉发生比较严重，影响孵化率；而采用17℃孵化培育，畸形率高。
[0100]
对比例3
[0101]
按照实施例3的方法进行银白鱼人工繁殖，区别仅在于，在产后亲鱼养护过程中注射留下的针孔用涂抹红霉素，将产后亲鱼置于用高锰酸钾浸浴的养殖缸中。
[0102]
在人工催产方法相同的情况下，采用上述常规产后亲鱼养护亲鱼存活率达85％左右。
[0103]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。