胆汁酸标志物组合物及应用和血清检测试剂盒的制作方法

胆汁酸标志物组合物及应用和血清检测试剂盒
【技术领域】
1.本发明涉及一种辅助用于对高危人群进行胃癌/早期胃癌筛查的胆汁酸标记物组合及血清检测试剂盒，属于检验医学及临床化学、临床医学领域。


背景技术：

2.胃癌是一种具有高度侵袭性和致命性的恶性消化道肿瘤，根据2015年《临床肿瘤杂志》(ca:acancer journal for clinicians)的权威报道，全球范围内胃癌的发病率高居男性肿瘤第四位，死亡率高居第三位[torre,l.a.et al.global cancer statistics,2012.ca.cancer j.clin.65,87
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108 (2015).]。目前，手术与化疗是胃癌治疗的主要临床手段，胃癌的诊治时机和病理分级决定着患者的预后，早发现早治疗，手术创伤小，并发症少，预后更好。但目前我国约90％的胃癌新发病例都属于进展期，术后5年期生存率低于30％，而根据来自日本的研究报道，早期胃癌的术后5年生存率能超过90％[katai,h.et al.five-year survival analysis of surgically resected gastric cancer casesin japan:a retrospective analysis of more than 100,000patients from the nationwide registry ofthe japanese gastric cancer association(2001-2007).gastric cancer off.j.int.gastric cancerassoc.jpn.gastric cancer assoc.21,144
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154(2018).]。因此，在高危人群中开展胃癌/早期胃癌筛查和诊断对于胃癌防控与治疗具有十分重要的临床价值。
[0003]
根据我国现行的临床行业共识，胃癌高危人群是指年龄40岁及以上，且有既往胃病史、或幽门螺杆菌感染、或来自胃癌高发地区、或暴露于吸烟、饮酒、嗜食腌制食品等风险因素的自然人群。目前临床上，内镜与血清肿瘤标志物检测是胃癌筛查与诊断的主要手段。胃镜与组织活检是诊断胃癌的金标准，适用于进展期胃癌筛查。胃镜精查可以提高早期胃癌的检出率，但其实施依赖于电子染色、高清电子放大等特殊精良的胃镜设备与熟练内镜医师高超的操作技能，二者缺一不可，这意味着利用胃镜精查开展胃癌筛查的医疗资源是很有限的。同时，胃镜检查还有一定的创伤性，患者感受较痛苦和恐惧焦虑[ho,s.w.t.&tan,p.dissection of gastric cancer heterogeneity for precisiononcology.cancer sci.110,3405
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3414(2019).]，因而导致患者依从性较差。而目前临床上常用的血清肿瘤标志物，例如癌胚抗原(cae)、糖类抗原ca199、ca125、ca242等，尽管具有无创且患者依从性高等优势，但其灵敏度与特异性均不理想(进展期胃癌阳性率约为20～30％，早期胃癌阳性率小于10％)，因而国家消化系统疾病临床医学研究中心等机构2018年发表的行业共识中已不建议将其作为胃癌/早期胃癌筛查的检测手段[国家消化系统疾病临床医学研究中心,中华医学会健康管理学分会,中国医师协会内镜医师分会消化内镜专业委员会,中国医师协会内镜医师分会消化内镜健康管理与体检专业委员会&国家消化内镜质控中心.中国早期胃癌筛查流程专家共识意见 (草案)(2017年，上海).胃肠病学23,(2018).]。而另一方面，同时联合利用血清胃蛋白酶原比值(pgr)、胃酶素(g17)和幽门螺杆菌抗体检测等多种手段辅助胃癌筛查的技术路线仍面临着多指标叠加导致检验成本高、需
要依赖于多种不同体系的检测技术参与、临床应用仍不普及等挑战。因此，开发简便有效、单一方法可测、低成本、无创且患者依从性好的血清检测试剂盒用于胃癌/早期胃癌的辅助筛查，弥补内镜筛查和血清肿瘤标记值检测的不足，实现对受试者是否需要接受内镜精查(包括活检、病理切片等)的精准分层，将有助于提高在高危人群中开展胃癌/早期胃癌筛查的普及度和准确率，对改善我国严峻的胃癌防控现状具有一定的现实意义。
[0004]
代谢组学技术是发现肿瘤标志物和研究疾病机制的重要组学手段[faubert,b.,solmonson,a.& deberardinis,r.j.metabolic reprogramming and cancer progression.science 368,eaaw5473 (2020).]，大量研究业已证实胃癌的发病与代谢调控异常有关。例如，有报道发现能量、氨基酸与脂质的代谢异常与胃癌进展有关[huang,s.et al.identification and validation of plasma metabolomicsignatures in precancerous gastric lesions that progress to cancer.jama netw.open 4, e2114186(2021).]，胃癌的腹膜复发具有独特的代谢特征等等[kaji,s.et al.metabolomic profiling ofgastric cancer tissues identified potential biomarkers for predicting peritoneal recurrence.gastriccancer off.j.int.gastric cancer assoc.jpn.gastric cancer assoc.23,874
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883(2020).]。在一项多中心临床试验中，胆汁返流已被证明是胃癌前病变和胃癌发展的独立危险因素[zhang,l.y.et al. bile reflux is an independent risk factor for precancerous gastric lesions and gastric cancer:anobservational cross-sectional study.j.dig.dis.22,282
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290(2021).]，而胆汁酸是胆汁中的主要成分，它们对消化道功能维持和胃肠免疫起着重要的调节作用，越来越多的研究揭示了胆汁酸代谢参与消化道癌变发生发展分子调控的多样角色[jia,w.,xie,g.&jia,w.bile acid-microbiotacrosstalk in gastrointestinal inflammation and carcinogenesis.nat.rev.gastroenterol.hepatol. 15,111
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128(2018).]。因此，胆汁酸类小分子代谢物在胃癌筛查与诊断中具有实用潜力与开发价值。本发明利用深度覆盖的血清胆汁酸靶向代谢组学技术对258例胃癌/早期胃癌和健康对照组受试者血清样本进行了检测，测定了49种血清胆汁酸浓度值以及28个浓度比值、亚类浓度之和等衍生指标，在此基础上进行代谢物优选与组合研究，流程如图1。首先，利用正交偏最小二乘-判别分析，计算模型中代谢物对样本分类的贡献度，结合t检验和多重检验校正显著性水平遴选出34个有价值的候选指标；随后，利用套索回归(lasso)将34个候选指标压缩到6个精简指标(表1)；再逐个递减指标利用不同的胆汁酸标记物组合构建诊断模型，评估其诊断性能(表1)；并综合考虑试剂盒工程实施的便捷性、诊断模型的易读性与检测成本等因素后，最终优选出两种胆汁酸代谢物，采用二元逻辑回归模型将其联合用作胃癌/早期胃癌辅助筛查的组合式标志物。我们的研究也证实胆汁酸与多个胃癌临床指标以及癌变组织中her-2、p53、ki-67等肿瘤增殖相关蛋白之间存在着显著相关性。在已知的胆汁酸分子中，牛磺酸缀合型石胆酸是胆汁酸受体tgr5最强的激动剂，能够促进原癌的发生。3-葡萄糖醛酸缀合型脱氧胆酸是葡糖糖醛酸转移酶ugt将糖基供体鸟苷二磷酸葡萄糖醛酸转移给脱氧胆酸形成的产物，目前其生物学功能还不明确，它参与胃癌癌变的机制有待进一步研究。目前尚无将上述两种胆汁酸代谢物联合用于胃癌/早期胃癌辅助筛查的研究报告。


技术实现要素：

[0005]
本发明针对目前临床上在高危人群中开展胃癌/早期胃癌筛查的诸多挑战，例如内镜因有创性而导致患者依从性差、现有血清肿瘤标志物准确性差、胃镜精查受限于临床资源有限而普及度低等难题，提供了一种基于两种血清胆汁酸定量检测的新的标记物组合以及血清检测试剂盒，应用于胃癌/早期胃癌筛查和/或高危人群精准分层。所述发明的标志物组合和检测试剂盒的特征如下：
[0006]
本发明所述的胆汁酸标记物组合包括两种胆汁酸类小分子代谢物，即：牛磺酸缀合型石胆酸和3-葡萄糖醛酸缀合型脱氧胆酸。
[0007]
本发明所述的血清检测试剂盒包括定量液、提取液、微孔板与参比样。其中，定量液含有定量外标物牛磺酸缀合型石胆酸单钠盐、3-葡萄糖醛酸缀合型脱氧胆酸，所述外标物分别用于受试者待检血清中牛磺酸缀合型石胆酸、3-葡萄糖醛酸缀合型脱氧胆酸的浓度定量和/或定性鉴定。提取液是含内标物氘代牛磺酸缀合型石胆酸-d4单钠盐、氘代正熊脱氧胆酸-d5的甲醇-乙腈混合液(体积比1:1，内标物浓度均为50ng/ml)，用于受试者待检血清样本的预处理和胆汁酸提取，上述内标物同时也分别用于牛磺酸缀合型石胆酸、3-葡萄糖醛酸缀合型脱氧胆酸的定量。试剂盒含有3张微孔板，其中一号板是单孔容量750微升的深孔板，用于受试者待检血清预处理和胆汁酸提取；二号板是单孔容量450微升的浅孔板，用于干燥自一号板中转移出的受试者待检血清的提取物；三号板同二号板，二号板中的提取物干燥后复溶，复溶液转移至三号板中供液相色谱串联质谱仪上机检测。
[0008]
本发明所述的血清检测试剂盒的工作流程是：(1)受试者采血后，取80～100μl待检血清样本逐份转移至一号板微孔中，加入320～400μl提取液，1500rpm转速涡旋振荡3分钟，将一号板放入离心机，5000rpm转速离心20分钟，得胆汁酸提取物；(2)每份待检样本吸取260～320μl胆汁酸提取物转移至二号板微孔，氮气吹干或者真空减压干燥，使用150～200μl 15％甲醇水混合液(甲醇的体积比可在5～100％之间，但高比例甲醇会影响检测胆汁酸的色谱峰形，低比例甲醇会影响复溶时对胆汁酸的溶解)将干燥后的提取物复溶，得待检样本复溶液，同法操作将参比样复溶；(3)复溶液5000rpm转速离心20分钟后，每份待检样本和参比样吸取140～190μl复溶液转移至三号板微孔中，即可进行液相色谱串联质谱仪上机检测；(4)将所述的定量液、经处理后的受试者待检血清样本、参比样分别经液相色谱串联质谱检测，比较定量液(20～200ng/ml之间任一浓度点)中外标物牛磺酸缀合型石胆酸、3-葡萄糖醛酸缀合型脱氧胆酸与受试者待检血清质谱扫描记录的色谱峰的保留时间，保留时间相差
±
0.05分钟以内，即判断该色谱峰为受试者待检血清中检测到的两个标志物的色谱峰，实现对受试者待检血清中两个胆汁酸标记物的定性鉴定。若保留时间相差
±
0.05分钟窗口内无色谱峰，则判断受试者待检血清中两个胆汁酸标记物的含量因低于检测限而未检出，峰面积值设为零；比较任一浓度点定量液中内标物氘代牛磺酸缀合型石胆酸-d4、氘代正熊脱氧胆酸-d5 与受试者待检血清质谱扫描记录的色谱峰的保留时间，保留时间相差
±
0.05分钟以内，即判断该色谱峰为两个标志物分别对应的内标物的色谱峰，实现对受试者待检血清中内标物的定性鉴定。定量液、受试者待检血清、参比样中牛磺酸缀合型石胆酸与内标物氘代牛磺酸缀合型石胆酸-d4各自的峰面积值以及二者比值、3-葡萄糖醛酸缀合型脱氧胆酸与内标物氘代正熊脱氧胆酸-d5各自的峰面积值以及二者比值都分别进行记录计算。以定量液中外标物浓度值为x，以前述相应的比值为y，分别绘制牛磺酸缀合型石胆
酸、3-葡萄糖醛酸缀合型脱氧胆酸的定量工作曲线并建立定量工作方程。分别将受试者待检血清样本、参比样中记录计算的前述峰面积比值代入方程得到质量浓度，再经过样本预处理体积折算和摩尔量换算，即计算出受试者牛磺酸缀合型石胆酸、3-葡萄糖醛酸缀合型脱氧胆酸的血清浓度值，单位nmol/l。参比样的血清浓度测定结果在说明书标定值的75～125％范围内认定血清胆汁酸的定量检验质量合格。(5)以用于构建诊断模型的训练集受试者所述两种胆汁酸血清浓度值为自变量，以受试者分类信息为响应值(胃癌组分类信息设定为1，健康对照组分类信息设定为0)进行二元逻辑回归分析将所述两种胆汁酸代谢物组合成诊断模型，记录模型的截距、所述两种胆汁酸的系数，将二元逻辑回归模型的数学等式变换后，得胃癌阳性预测值(gc-ppv) 计算公式。公式中ctlca、cdca-3g分别为牛磺酸缀合型石胆酸、3-葡萄糖醛酸的血清浓度值， e为自然常数。将受试者所述胆汁酸血清浓度代入公式，计算出受试者的gc-ppv值。
[0009]
公式:
[0010]
(6)本发明确定基于所述两个胆汁酸标志物组合用于胃癌筛查的最佳截断值(cut-off value)是 0.829，受试者gc-ppv值高于0.829判定为胃癌阳性病例，反之为阴性。截断值的设定方法是首先根据所有训练集受试者gc-ppv值和分类信息绘制简称roc，图中x轴表示诊断模型的100％
‑ꢀ
特异性％，y轴表示诊断模型的灵敏度％。最佳截断值是roc曲线中灵敏度与特异性之和最大处对应的gc-ppv值。本发明涉及的血清检测试剂盒使用单位可以根据新的训练集和现场的实验结果确定新的二元逻辑回归模型，并设定新的最佳截断值。
[0011]
本发明涉及的两种胆汁酸在胃癌组与健康对照组间均有显著的浓度差异，且都对辅助胃癌筛查具有良好的效果。两种胆汁酸联合用作标志物组合后，诊断模型的特异性提升至99.3％，roc曲线的曲线下面积(auc)提升至0.992，同时灵敏度仍维持在98.2％的优异水平。据此，本发明优选的两种胆汁酸标志物组合所呈现的良好诊断性能使其具备辅助胃癌筛查的实用价值。同时所述胆汁酸标志物组合在辅助早期胃癌筛查中性能也令人满意，同样具有临床实用价值。
[0012]
本发明所述血清检测试剂盒具有诊断灵敏度与特异性高、组合简单、单一方法可测、低成本、无创且患者依从性好等特点。所述两种胆汁酸标志物组合可以实现对受试者是否需要接受内镜精查(包括活检、病理切片等)的精准分层的筛查目标。
[0013]
本发明涉及胆汁酸类小分子代谢物牛磺酸缀合型石胆酸、3-葡萄糖醛酸缀合型脱氧胆酸作为标志物组合制备用于胃癌/早期胃癌辅助筛查的血清检测试剂盒的新应用。本发明还涉及用于胃癌/早期胃癌辅助筛查的血清检测试剂盒，通过液相色谱串联质谱法检测受试者上述两种胆汁酸代谢物的血清浓度，将其代入二元逻辑回归模型计算所述标志物组合的胃癌/早期胃癌阳性预测值，再与诊断模型的最佳截断值相比较，从而判断受试者是否为胃癌/早期胃癌阳性病例，据此可以实现对高危人群是否需要接受胃镜精查的精准分层。所述两种胆汁酸标志物组合的联合应用对于高危人群的胃癌和早期胃癌筛查均具有良好的辅助效果。本发明所述检测试剂盒具有诊断特异性与灵敏度高、组合简单、单一方法即可测定、检测成本低、受试者依从性好、无创等特点，有助于提高胃癌/早期胃癌的筛查普及率与准确性。
【附图说明】
[0014]
图1.本发明涉及的胆汁酸代谢物的优选与标志物组合研究过程的示意图。
[0015]
图2.实施例1～5中6个纳入标志物组合研究的胆汁酸指标在胃癌组与健康对照组的柱图。(a)牛磺酸缀合型石胆酸血清浓度，(b)3-葡萄糖醛酸缀合型脱氧胆酸血清浓度，(c)正胆酸血清浓度， (d)猪胆酸血清浓度，(e)3-硫酸化牛磺酸缀合型石胆酸血清浓度，(f)猪脱氧胆酸/石胆酸血清浓度比值
[0016]
图3.实施例1～5中6个纳入标志物组合研究的胆汁酸指标单独用于辅助胃癌筛查诊断的roc曲线图。(a)牛磺酸缀合型石胆酸，(b)3-葡萄糖醛酸缀合型脱氧胆酸，(c)正胆酸，(d)猪胆酸，(e) 3-硫酸化牛磺酸缀合型石胆酸，(f)猪脱氧胆酸/石胆酸血清浓度比值。灵敏度、特异性、auc与 auc95％置信区间等信息见图标注。
[0017]
图4.实施例1～6中不同的标志物组合用于辅助胃癌/早期胃癌筛查诊断的roc曲线图。(a)实施例1：两个胆汁酸标记物组合用于辅助胃癌筛查的roc曲线(牛磺酸缀合型石胆酸 3-葡萄糖醛酸缀合型脱氧胆酸)；(b)实施例2：三个胆汁酸组合用于辅助胃癌筛查的roc曲线(牛磺酸缀合型石胆酸 3-葡萄糖醛酸缀合型脱氧胆酸 正胆酸)；(c)实施例3：四个胆汁酸组合用于辅助胃癌筛查的roc曲线(牛磺酸缀合型石胆酸 3-葡萄糖醛酸缀合型脱氧胆酸 正胆酸 猪胆酸)；(d)实施例 4：五个胆汁酸组合用于辅助胃癌筛查的roc曲线(牛磺酸缀合型石胆酸 3-葡萄糖醛酸缀合型脱氧胆酸 正胆酸 猪胆酸 3-硫酸化牛磺酸缀合型石胆酸)；(e)实施例5：六个胆汁酸指标组合用于辅助胃癌筛查的roc曲线(牛磺酸缀合型石胆酸 3-葡萄糖醛酸缀合型脱氧胆酸 正胆酸 猪胆酸 3
‑ꢀ
硫酸化牛磺酸缀合型石胆酸 猪脱氧胆酸/石胆酸比值，其五个为血清浓度值)。(f)实施例6：两个胆汁酸标记物组合用于辅助早期胃癌筛查的roc曲线(牛磺酸缀合型石胆酸 3-葡萄糖醛酸缀合型脱氧胆酸)。灵敏度、特异性、auc与auc95％置信区间等信息见图标注。
[0018]
图5.(a)实施例1：基于本发明涉及的两个胆汁酸标记物组合计算得出的受试者胃癌阳性预测率 (gc-ppv)在胃癌组和健康对照组的分布散点图，红色横线表示模型最佳截断值0.829；(b)基于本发明涉及的两个胆汁酸标记物组合计算得出的受试者早期胃癌阳性预测率(egc-ppv)在早期胃癌组和健康对照组的分布散点图，红色横线表示模型最佳截断值0.715。(c)实施例7：168例盲样(80例胃癌与88例健康对照)测试结果。
【具体实施方式】
[0019]
【实施例1】基于两种胆汁酸标记物组合的胃癌辅助筛查
[0020]
1.临床试验设计：研究项目经过医学伦理会批准，受试者纳入临床试验前签署知情同意书。用于构建胃癌筛查诊断模型的训练集包括145例健康对照组受试者(年龄60.31
±
12.15岁，男性108人，女性37人)和113例胃癌组受试者(年龄63.33
±
10.59岁，男性79人，女性34人)，其中68例为进展期胃癌(病理切片下癌组织浸润超过胃壁黏膜下层，侵犯到胃壁肌层)，45例为早期胃癌(病理切片下癌组织尚未侵犯到胃壁肌层，仅限于胃壁黏膜层及黏膜下层)。根据第八版美国癌症联合委员会(ajcc)制定的癌症分级系统，47例患者属于i期，10例属于ii期，34例属于iii期，22例属于iv期。
[0021]
2.受试者血清采集：按照医院检验科静脉采血常规操作采集受试者血清。使用中华人民共和国卫生行业标准ws/t 661—2020中规定的红色管盖真空负压采血管，采血后室
温静置30分钟，离心分离血清，存储在-20℃冰箱中待检。
[0022]
3.受试者待检血清预处理：受试者待检血清样本室温下解冻，逐份分别转移80μl至一号微孔板的微孔中，使用电动分液器逐孔分别加入320μl提取液(体积比1:1的甲醇-乙腈混合液)，提取液含内标物氘代牛磺酸缀合型石胆酸-d4单钠盐、氘代正熊脱氧胆酸-d5(浓度均为50ng/ml)，1500rpm
ꢀ×
3min涡旋振荡后，5000rpm
×
20min离心去除蛋白沉淀，分别一一转移260μl胆汁酸提取物至二号板的微孔中，真空减压干燥3h，逐孔加入150μl 15％甲醇-水混合液将干燥后样品复溶，1500 rpm
×
3min涡旋振荡后，5000rpm
×
20min离心再次去除蛋白沉淀，分别一一转移120μl复溶液至三号板的微孔中备液相色谱串联质谱上机检测。
[0023]
参比样制备与处理：取9.900ml golden west diagnostics公司生产的ultra-low hormones& steroids型号人工血清加入具塞试管中，分别加入50μl含2nmol/ml浓度的牛磺酸缀合型石胆酸 15％甲醇-水溶液(v/v，下同)和50μl含60nmol/ml浓度的3-葡萄糖醛酸缀合型脱氧胆酸15％甲醇-水溶液，电动摇床上振摇10min充分混匀，得含牛磺酸缀合型石胆酸、3-葡萄糖醛酸缀合型脱氧胆酸血清浓度分别为10nmol/l、300nmol/l的参比血清样。按照每份80μl的使用体积，分别转移96份置于与一号板相同型号的微孔板的微孔中，使用电动分液器逐孔加入320μl提取液(提取液溶剂、内标组成与浓度均同上)，1500rpm
×
3min涡旋振荡后，5000rpm
×
20min离心去除蛋白沉淀，每孔分别转移出260μl胆汁酸提取物置于另一具塞试管中，电动摇床上振摇10min将其充分混匀，分别转移90份(每份260μl)至90个螺旋盖管中，真空减压干燥3h，即得到90 份参比样。取任一个参比样加入150μl 15％甲醇-水混合液复溶，1500rpm
×
3min涡旋振荡后， 5000rpm
×
20min离心再次去除蛋白沉淀，转移120μl参比样复溶液至三号板的微孔中备液相色谱串联质谱上机检测。
[0024]
4.液相色谱串联质谱检测：胆汁酸检测使用日本岛津公司shimadzu lc-20adxr型液相色谱仪串联美国爱博才思公司sciex 5500 三重四极杆质谱仪，采用选择反应监测模式(srm)扫描，内标法定量。
[0025]
4.1液相色谱方法：胆汁酸分离使用ace excel pfp c18色谱柱(填料粒径2μm,内径2.1mm，柱长100mm)，二元洗脱流动相是2mm乙酸铵水溶液(a)和乙腈(b)，流速是0.4ml/min，柱温度是45℃，进样体积是3μl。色谱洗脱梯度设定为：b相体积比起始比例17％，维持0.5分钟，第0.5～10分钟线性递升至30％，第10～13分钟至55％，第13～14分钟维持55％，第14.1分钟下降至起始比例17％，并维持到第16分钟，完成。
[0026]
4.2质谱方法：turbo v电喷雾离子源，负离子电离电压-4.5kv，离子源温度550℃，气帘气压强 35磅力/平方英寸，喷雾气压强50磅力/平方英寸，辅助加热气压强50磅力/平方英寸。使用选择反应监测模式扫描，牛磺酸缀合型石胆酸扫描离子对是母离子482.3
→
子离子80、去簇电压与碰撞电压均为-130v，其对应内标物氘代牛磺酸缀合型石胆酸-d4的扫描离子对是母离子486.3
→
子离子 80、去簇电压与碰撞电压分别为-130v和-127v；3-葡萄糖醛酸缀合型脱氧胆酸扫描离子对是母离子567.3
→
子离子505.3、去簇电压与碰撞电压分别为-120v和-50v，其对应内标物氘代正熊脱氧胆酸-d5的扫描离子对是母离子382.3
→
子离子382.3(氘代正熊脱氧胆酸-d5的结构因为难以发生二级质谱碎裂，所以srm扫描的母离子与子离子一样)、去簇电压与碰撞电压分别为-160v和-20v。
[0027]
5.定量工作曲线与胆汁酸定量：定量液是含外标物(12个浓度点)以及相同浓度内
标物的12份甲醇-水溶液(甲醇体积比是15％)，用于建立内标法定量工作曲线。外标物是牛磺酸缀合型石胆酸、 3-葡萄糖醛酸缀合型脱氧胆酸，12份定量工作曲线溶液中两种外标物分别的浓度从低到高依次为： 0.2271、0.4541、0.9083、1.8165、3.6329、7.2657、14.5313、29.0625、58.1250、116.2500、 232.5000、465.0000ng/ml，依次简称为l1、l2、l3、l4、l5、l6、l7、l8、l9、l10、l11、 l12。两个外标物对应的内标物分别是氘代牛磺酸缀合型石胆酸-d4、氘代正熊脱氧胆酸-d5，浓度均为70ng/ml。将定量工作曲线溶液和处理后的受试者血清样本、参比样分别进行液相色谱串联质谱检测，比较定量液(58.1250ng/ml浓度点)中外标物牛磺酸缀合型石胆酸、3-葡萄糖醛酸缀合型脱氧胆酸与受试者待检血清质谱扫描记录的色谱峰的保留时间，保留时间相差
±
0.05分钟以内，即判断该色谱峰为受试者待检血清中检测到的两个标志物的色谱峰，实现对受试者待检血清中两个胆汁酸标记物的定性鉴定。若保留时间相差
±
0.05分钟窗口内无色谱峰，则判断受试者待检血清中两个胆汁酸标记物的含量因低于检测限而未检出，峰面积值设为零；比较任一浓度点定量液中内标物氘代牛磺酸缀合型石胆酸-d4、氘代正熊脱氧胆酸-d5与受试者待检血清质谱扫描记录的色谱峰的保留时间，保留时间相差
±
0.05分钟以内，即判断该色谱峰为两个标志物分别对应的内标物的色谱峰，实现对受试者待检血清中内标物的定性鉴定；
[0028]
定量液、受试者待检血清、参比样中牛磺酸缀合型石胆酸与内标物氘代牛磺酸缀合型石胆酸-d4各自的峰面积值以及二者比值、3-葡萄糖醛酸缀合型脱氧胆酸与内标物氘代正熊脱氧胆酸-d5各自的峰面积值以及二者比值都分别进行记录计算(表2：定量液、受试者待检血清、参比样中检测胆汁酸与外标物的峰面积，表3：定量液、受试者待检血清、参比样中对应内标物的峰面积)。以对应定量液中外标物浓度为x，以前述相应的比值为y，分别绘制定量工作曲线并建立定量工作方程，如下。牛磺酸缀合型石胆酸的定量工作曲线方程：y＝0.01296x-0.000692
[0029]
3-葡萄糖醛酸缀合型脱氧胆酸的定量工作曲线方程：y＝0.00134x 4.914e-4
[0030]
分别将受试者待检血清样本、参比样记录计算的前述峰面积比值代入方程，即可计算出受试者待检血清、参比样中牛磺酸缀合型石胆酸、3-葡萄糖醛酸缀合型脱氧胆酸的质量浓度值(单位ng/ml)，先分别乘以样本预处理环节引入的体积折算系数2884.6154(来自《3.受试者待检血清预处理》项下描述的数值，计算公式：1000
×
[(a b)
÷
a]
×
[c
÷
d]，1000表示ng/ml与ng/l间的单位换算， a表示待检血清使用体积，b表示提取液使用体积，c表示加入到二号板中用于将干燥后提取物复溶的15％甲醇-水混合液的使用体积，d表示从一号板转移至二号板的胆汁酸提取物的体积)，再分别除以两个胆汁酸外标物的摩尔质量483.70424g/mol、612.65978g/mol，最终得到两个胆汁酸代谢物的血清浓度，单位为nmol/l(表4)。参比样中牛磺酸缀合型石胆酸、3-葡萄糖醛酸缀合型脱氧胆酸的测定值分别为标定值的112.4％和110.1％，认定实施例1的血清胆汁酸的定量检验质量合格。牛磺酸缀合型石胆酸在胃癌组和健康对照组的血清浓度分别为(平均值
±
标准差)13.22
±
2.64nmol/l 和5.30
±
2.65nmol/l(图2a)，3-葡萄糖醛酸缀合型脱氧胆酸在胃癌组和健康对照组的血清浓度分别为2153.0
±
207.9nmol/l和1651.0
±
718.7nmol/l(图2b)。使用spss统计软件对所述两种胆汁酸代谢物在胃癌组和健康对照组间的血清浓度进行t检验，结果表明两组之间具有显著性差异 (p《0.0001)，胃癌组的血清浓度要高于健康对照组。
[0031]
6.基于单一代谢物的诊断模型与诊断性能评价：分别根据所有受试者牛磺酸缀合
型石胆酸、3-葡萄糖醛酸缀合型脱氧胆酸的血清浓度值和分类信息(分为胃癌组和健康对照组)，使用graphpad prism 软件绘制牛磺酸缀合型石胆酸(图3a)和3-葡萄糖醛酸缀合型脱氧胆酸各自的roc曲线(图3b)，图中x轴是诊断模型的100％-特异性％，y轴是诊断模型的灵敏度。单独使用牛磺酸缀合型石胆酸辅助胃癌筛查的诊断灵敏度和特异性分别为99.1％和97.2％，单独使用3-葡萄糖醛酸缀合型脱氧胆酸辅助胃癌筛查的诊断灵敏度和特异性分别为98.2％和50.3％。
[0032]
7.基于标记物组合的诊断模型与阳性预测值计算：以所有受试者所述两种胆汁酸血清浓度值为自变量，以受试者分类信息为响应值，其中胃癌组分类信息设定为1，健康对照组分类信息设定为0，使用graphpad prism软件进行二元逻辑回归分析将所述两种胆汁酸组合成一个诊断模型，结果模型的截距等于18.18，牛磺酸缀合型石胆酸、3-葡萄糖醛酸缀合型脱氧胆酸的系数分别为-1.223、
ꢀ‑
0.003013，二元逻辑回归模型的数学等式是： ln((1-[gc-ppv])/[gc-ppv])＝18.18-1.223
×
ctlca-0.003013
×
cdca-3g，ln表示以自然常数为底的对数。将其变换后得公式1，将胃癌组和健康对照组每一个受试者样本所述胆汁酸血清浓度值分别代入公式1，计算出受试者的胃癌阳性预测值(gc-ppv)。根据所有受试者的gc-ppv值和分类信息(按照胃癌组和健康对照组划分)，使用graphpad prism软件绘制胃癌筛查诊断模型的roc曲线(图4a)，图中x轴是诊断模型的100％-特异性％，y轴是诊断模型的灵敏度。
[0033]
公式1：
[0034]
公式中ctlca、cdca-3g分别为牛磺酸缀合型石胆酸、3-葡萄糖醛酸缀合型脱氧胆酸的血清浓度值，e为自然常数。
[0035]
roc曲线显示所述两个标记物组合诊断模型的灵敏度为98.2％，特异性为99.3％，曲线下面积auc 为0.991，auc95％置信区间为0.980～1.000，换言之即auc有95％的概率出现在此区间内，这些都表明两种胆汁酸标记物组合对辅助胃癌筛查具有良好的诊断效果。同时相较于单独使用牛磺酸缀合型石胆酸或3-葡萄糖醛酸缀合型脱氧胆酸单一代谢物，两种胆汁酸代谢物的联合应用在维持出色的灵敏度和准确性的前提下(单一最佳99.1％，组合98.2％)，还改善了诊断模型的特异性(单一最佳97.2％，组合99.3％)，即将阴性受试者误诊为阳性的假阳性率降低了，这对于胃癌筛查是尤为重要的(表1)。两种胆汁酸标记物组合的联合应用使得诊断模型的灵敏度与特异性更为均衡，辅助胃癌筛查的诊断性能更出色。
[0036]
按照灵敏度与特异性之和最大的原则，即roc曲线左上角拐点处，确定用于胃癌筛查诊断模型的最佳截断值是0.829。在此研究实施例中，113例胃癌组中有111例的gc-ppv高于截断值，被判断为胃癌阳性，准确率98.23％，假阴性率1.77％。145例健康对照组中有144例的gc-ppv低于截断值，被判断为胃癌阴性，准确率99.31％，假阳性率0.69％(表5，图5a)。
[0037]
【实施例2】基于三个胆汁酸标记物组合的胃癌辅助筛查
[0038]
1.临床试验设计：同实施例1(即采用实施例1相同的受试者)。
[0039]
2.受试者血清采集：同实施例1此相应过程和条件。
[0040]
3.受试者待检血清预处理：在实施例1基础上，提取液新增内标物氘代beta-鼠胆酸-d5，浓度为 50ng/ml，其余同实施例1此相应过程和条件。
0.003054
×
cdca-3g-0.05935
×
cnorca，ln表示以自然常数为底的对数。将其变换后得公式2，将每一个受试者样本所述胆汁酸血清浓度值分别代入公式2，计算出受试者的胃癌阳性预测值(gc-ppv)。根据所有受试者的gc-ppv值和分类信息，使用graphpad prism软件绘制胃癌筛查诊断模型的roc曲线(图4b)，图中x轴是诊断模型的100％-特异性％，y轴是诊断模型的灵敏度。
[0051]
公式2：公式中ctlca、cdca-3g、cnorca分别为牛磺酸缀合型石胆酸、3-葡萄糖醛酸缀合型脱氧胆酸、正胆酸的血清浓度值，e为自然常数。
[0052]
roc曲线显示所述三个标记物组合诊断模型的灵敏度为98.2％，特异性为99.3％，曲线下面积auc 为0.992，auc95％置信区间为0.982～1.000，换言之即auc有95％的概率出现在此区间内。按照灵敏度与特异性之和最大的原则，即roc曲线左上角拐点处，确定用于胃癌筛查诊断模型的最佳截断值是0.768。在此研究实施例中，113例胃癌组中有111例的gc-ppv高于截断值，被判断为胃癌阳性，准确率98.23％，假阴性率1.77％。145例健康对照组中有144例的gc-ppv低于截断值，被判断为胃癌阴性，准确率99.31％，假阳性率0.69％(表5)。由以上数据可知，实施例2中三个标记物组合的诊断性能与实施例1中两个标记物组合的诊断性能无差异。
[0053]
【实施例3】基于四个胆汁酸标记物组合的胃癌辅助筛查
[0054]
1.临床试验设计：同实施例1(即采用实施例1相同的受试者)。
[0055]
2.受试者血清采集：同实施例1此相应过程和条件。
[0056]
3.受试者待检血清预处理：在实施例1基础上，提取液新增内标物氘代beta-鼠胆酸-d5、氘代胆酸
ꢀ‑
d4，浓度为50ng/ml，其余同实施例1此相应过程和条件。
[0057]
4.液相色谱串联质谱检测：同实施例1此相应过程和条件。
[0058]
4.1液相色谱方法：同实施例1此相应过程和条件。
[0059]
4.2质谱方法：在实施例1基础上，增加正胆酸、猪胆酸的检测，其余同实施例1。正胆酸与内标物氘代beta-鼠胆酸-d5的质谱扫描条件同实施例2。猪胆酸扫描离子对是母离子407.3
→
子离子 407.3、去簇电压与碰撞电压为-160v和-20v，其对应内标物氘代胆酸-d4的扫描离子对是母离子 411.3
→
子离子411.3、去簇电压与碰撞电压分别为-160v和-20v。
[0060]
5.定量工作曲线与胆汁酸定量：在实施例1基础上，定量液外标物新增正胆酸、猪胆酸，12个浓度点设置同实施例1中的牛磺酸缀合型石胆酸。内标物新增氘代beta-鼠胆酸-d5、氘代胆酸-d4，浓度同实施例1中的氘代牛磺酸缀合型石胆酸-d4，其余同实施例1。定量液、受试者待检血清、参比样中牛磺酸缀合型石胆酸与内标物氘代牛磺酸缀合型石胆酸-d4各自的峰面积值以及二者比值、3
‑ꢀ
葡萄糖醛酸缀合型脱氧胆酸与内标物氘代正熊脱氧胆酸-d5各自的峰面积值以及二者比值、正胆酸与内标物氘代beta-鼠胆酸-d5各自的峰面积值以及二者比值、猪胆酸与内标物氘代胆酸-d4各自的峰面积值以及二者比值都分别进行记录计算(表2：定量液、受试者待检血清、参比样中检测胆汁酸与外标物的峰面积，表3：定量液、受试者待检血清、参比样中对应内标物的峰面积)。以对应定量液中外标物浓度为x，以前述相应的比值为y，分别绘制定量工作曲线并建立定量工作方程。
[0061]
牛磺酸缀合型石胆酸的定量工作曲线方程：同实施例1此相应过程和条件。
[0062]
3-葡萄糖醛酸缀合型脱氧胆酸的定量工作曲线方程：同实施例1此相应过程和条件。
[0063]
正胆酸的定量工作曲线方程：同实施例2此相应过程和条件。
[0064]
猪胆酸的定量工作曲线方程：y＝0.01310x 8.86370e-4
[0065]
分别将受试者待检血清样本记录计算的前述峰面积比值代入方程，即可计算出受试者待检血清中牛磺酸缀合型石胆酸、3-葡萄糖醛酸缀合型脱氧胆酸、正胆酸、猪胆酸的质量浓度值(单位ng/ml)，先分别乘以样本预处理环节引入的体积折算系数2884.6154(计算公式同实施例1)，再分别除以三个胆汁酸外标物的摩尔质量483.70424g/mol、612.65978g/mol、394.54482g/mol、408.57140 g/mol，最终得到四个胆汁酸代谢物的血清浓度测定结果，单位为nmol/l(表4)。牛磺酸缀合型石胆酸、3-葡萄糖醛酸缀合型脱氧胆酸的血清浓度同实施例1，正胆酸的血清浓度同实施例2，猪胆酸在胃癌组和健康对照组的血清浓度分别为38.47
±
43.88nmol/l和21.92
±
21.59nmol/l(图2d)。使用spss统计软件对所述四种胆汁酸代谢物在胃癌组和健康对照组间的血清浓度进行t检验，结果表明两组之间具有显著性差异(p《0.0001)，胃癌组的血清浓度要高于健康对照组。
[0066]
6.基于单一代谢物的诊断模型与诊断性能评价：根据所有受试者猪胆酸的血清浓度值和分类信息 (按照胃癌组与健康对照组划分)，使用graphpad prism软件绘制猪胆酸的roc曲线(图3d)，图中x轴是诊断模型的100％-特异性％，y轴是诊断模型的灵敏度。单独使用猪胆酸辅助胃癌筛查的诊断灵敏度和特异性分别为69.0％和58.6％，与实施例1中牛磺酸缀合型石胆酸和3-葡萄糖醛酸缀合型脱氧胆酸的标记物组合的诊断性能相差甚远。
[0067]
7.基于标记物组合的诊断模型与阳性预测值计算：以所有受试者所述四个胆汁酸代谢物血清浓度值为自变量，以受试者分类信息为响应值，其中胃癌组分类信息设定为1，健康对照组分类信息设定为0，使用graphpad prism软件进行二元逻辑回归分析将所述四个胆汁酸代谢物组合成一个诊断模型，结果模型的截距等于18.88，牛磺酸缀合型石胆酸、3-葡萄糖醛酸缀合型脱氧胆酸、正胆酸、正胆酸猪胆酸的系数分别为-1.124、-0.002846、-0.05061、-0.03613，二元逻辑回归模型的数学等式是： ln((1-[gc-ppv])/[gc-ppv])＝18.88-1.124
×
ctlca-0.002846
×
cdca-3g-0.05061
×
cnorca-0.0361 3
×
chca，ln表示以自然常数为底的对数。将其变换后得公式3，将每一个受试者样本所述胆汁酸血清浓度值分别代入公式3，计算出受试者的胃癌阳性预测值(gc-ppv)。根据所有受试者的 gc-ppv值和分类信息，使用graphpad prism软件绘制胃癌筛查诊断模型的roc曲线(图4c)，图中x轴是诊断模型的100％-特异性％，y轴是诊断模型的灵敏度。
[0068]
公式3：
[0069]
公式中ctlca、cdca-3g、cnorca、chca分别为牛磺酸缀合型石胆酸、3-葡萄糖醛酸缀合型脱氧胆酸、正胆酸、猪胆酸的血清浓度值，e为自然常数。
[0070]
roc曲线显示所述四个标记物组合诊断模型的灵敏度为98.2％，特异性为99.3％，曲线下面积auc 为0.992，auc95％置信区间为0.984～1.000，换言之即auc有95％的概率出现在此区间内。按照灵敏度与特异性之和最大的原则，即roc曲线左上角拐点处，确定用于胃癌筛查诊断模型的最佳截断值是0.643。在此研究实施例中，113例胃癌组中有111例的gc-ppv高于截断值，被判断为胃癌阳性，准确率98.23％，假阴性率1.77％。145例健康对照组中有144例的gc-ppv低于截断值，被判断为胃癌阴性，准确率99.31％，假阳性率0.69％
(表5)。由以上数据可知，实施例3中四个标记物组合的诊断性能与实施例1中两个标记物组合的诊断性能无差异。
[0071]
【实施例4】基于五个胆汁酸标记物组合的胃癌辅助筛查
[0072]
1.临床试验设计：同实施例1(即采用实施例1相同的受试者)。。
[0073]
2.受试者血清采集：同实施例1此相应过程和条件。
[0074]
3.受试者待检血清预处理：在实施例1基础上，提取液新增氘代beta-鼠胆酸-d5、氘代胆酸-d4、氘代3-硫酸化牛磺酸缀合型石胆酸-d4单钠盐，浓度为50ng/ml，其余同实施例1。
[0075]
4.液相色谱串联质谱检测：同实施例1此相应过程和条件。
[0076]
4.1液相色谱方法：同实施例1此相应过程和条件。
[0077]
4.2质谱方法：在实施例1基础上增加正胆酸、猪胆酸、3-硫酸化牛磺酸缀合型石胆酸的检测，其余同实施例1。正胆酸与内标物氘代beta-鼠胆酸-d5的质谱扫描参数同实施例2，猪胆酸与内标物氘代胆酸-d4质谱扫描条件同实施例3。3-硫酸化牛磺酸缀合型石胆酸扫描离子对是母离子562.3
→
子离子482.3、去簇电压与碰撞电压为-120v和-45v，其对应内标物氘代3-硫酸化牛磺酸缀合型石胆酸-d4的扫描离子对是母离子566.3
→
子离子486.3、去簇电压与碰撞电压分别为-120v和-40v。
[0078]
5.定量工作曲线与胆汁酸定量：在实施例1基础上，定量液外标物新增正胆酸、猪胆酸、3-硫酸化牛磺酸缀合型石胆酸，12个浓度点设置同实施例1中的牛磺酸缀合型石胆酸。内标物新增氘代beta
‑ꢀ
鼠胆酸-d5、氘代胆酸-d4、氘代3-硫酸化牛磺酸缀合型石胆酸-d4单钠盐，浓度同实施例1中的氘代牛磺酸缀合型石胆酸-d4，其余同实施例1。定量液、受试者待检血清、参比样中牛磺酸缀合型石胆酸与内标物氘代牛磺酸缀合型石胆酸-d4各自的峰面积值以及二者比值、3-葡萄糖醛酸缀合型脱氧胆酸与内标物氘代正熊脱氧胆酸-d5各自的峰面积值以及二者比值、正胆酸与内标物氘代beta-鼠胆酸-d5各自的峰面积值以及二者比值、猪胆酸与内标物氘代胆酸-d4各自的峰面积值以及二者比值、 3-硫酸化牛磺酸缀合型石胆酸与内标物3-硫酸化牛磺酸缀合型石胆酸-d4各自的峰面积值以及二者比值都分别进行记录计算(表2：定量液、受试者待检血清、参比样中检测胆汁酸与外标物的峰面积，表3：定量液、受试者待检血清、参比样中对应内标物的峰面积)。以对应定量液中外标物浓度为x，以前述相应的比值为y，分别绘制定量工作曲线并建立定量工作方程。
[0079]
牛磺酸缀合型石胆酸的定量工作曲线方程：同实施例1此相应过程和条件。
[0080]
3-葡萄糖醛酸缀合型脱氧胆酸的定量工作曲线方程：同实施例1此相应过程和条件。
[0081]
正胆酸的定量工作曲线方程：同实施例2此相应过程和条件。
[0082]
猪胆酸的定量工作曲线方程：同实施例3此相应过程和条件。
[0083]
3-硫酸化牛磺酸缀合型石胆酸：y＝0.01160x 0.00119
[0084]
分别将受试者待检血清样本记录计算的前述峰面积比值代入方程，即可计算出受试者待检血清中牛磺酸缀合型石胆酸、3-葡萄糖醛酸缀合型脱氧胆酸、正胆酸、猪胆酸、3-硫酸化牛磺酸缀合型石胆酸的质量浓度值(单位ng/ml)，先分别乘以样本预处理环节引入的体积折算系数2884.6154，再分别除以五个胆汁酸外标物的摩尔质量483.70424g/mol、612.65978g/mol、394.54482g/mol、 408.57140g/mol、607.73110g/mol，最终得到五个胆汁
酸代谢物的血清浓度测定结果，单位为 nmol/l(表4)。牛磺酸缀合型石胆酸、3-葡萄糖醛酸缀合型脱氧胆酸的血清浓度同实施例1，正胆酸的血清浓度同实施例2，猪胆酸的血清浓度同实施例3，3-硫酸化牛磺酸缀合型石胆酸在胃癌组和健康对照组的血清浓度分别为90.17
±
103.10nmol/l和56.59
±
65.17nmol/l(图2e)。使用spss 统计软件对所述五种胆汁酸代谢物在胃癌组和健康对照组间的血清浓度进行t检验，结果表明两组之间具有显著性差异(p《0.0001)，胃癌组的血清浓度要高于健康对照组。
[0085]
6.基于单一代谢物的诊断模型与诊断性能评价：根据所有受试者3-硫酸化牛磺酸缀合型石胆酸的血清浓度值和分类信息(按照胃癌组与健康对照组划分)，使用graphpad prism软件绘制3-硫酸化牛磺酸缀合型石胆酸的roc曲线(图3e)，图中x轴是诊断模型的100％-特异性％，y轴是诊断模型的灵敏度。单独使用3-硫酸化牛磺酸缀合型石胆酸辅助胃癌筛查的诊断灵敏度和特异性分别为 66.4％和55.2％，与实施例1中牛磺酸缀合型石胆酸和3-葡萄糖醛酸缀合型脱氧胆酸的标记物组合的诊断性能相差甚远。
[0086]
7.基于标记物组合的诊断模型与阳性预测值计算：以所有受试者所述五个胆汁酸代谢物血清浓度值为自变量，以受试者分类信息为响应值，其中胃癌组分类信息设定为1，健康对照组分类信息设定为0，使用graphpad prism软件进行二元逻辑回归分析将所述五个胆汁酸代谢物组合成一个诊断模型，结果模型的截距等于17.48，牛磺酸缀合型石胆酸、3-葡萄糖醛酸缀合型脱氧胆酸、正胆酸、猪胆酸、3-硫酸化牛磺酸缀合型石胆酸的系数分别为-1.221、-0.002058、-0.05879、-0.03128、 0.01251，二元逻辑回归模型的数学等式是：ln((1-[gc-ppv])/[gc-ppv])＝17.48-1.221
×
ctlca-0.002058
×
cdca-3g-0.05879
×
cnorca
ꢀ‑
0.03128
×
chca 0.01251
×
ctlca-3s，ln表示以自然常数为底的对数。将其变换后得公式4，将胃癌组和健康对照组每一个受试者样本所述胆汁酸血清浓度值分别代入公式4，计算出受试者的胃癌阳性预测值(gc-ppv)。根据所有受试者的gc-ppv值和分类信息，使用graphpad prism软件绘制胃癌筛查诊断模型的roc曲线(图4d)，图中x轴是诊断模型的100％-特异性％，y轴是诊断模型的灵敏度。
[0087]
公式4：
[0088]
公式中ctlca、cdca-3g、cnorca、chca、ctlca-3s分别为牛磺酸缀合型石胆酸、3-葡萄糖醛酸缀合型脱氧胆酸、正胆酸、猪胆酸、3-硫酸化牛磺酸缀合型石胆酸的血清浓度值，e为自然常数。
[0089]
roc曲线显示所述五个标记物组合诊断模型的灵敏度为98.2％，特异性为99.3％，曲线下面积 auc为0.994，auc95％置信区间为0.985～1.000，换言之即auc有95％的概率出现在此区间内。按照灵敏度与特异性之和最大的原则，即roc曲线左上角拐点处，确定用于胃癌筛查诊断模型的最佳截断值是0.597。在此研究实施例中，113例胃癌组中有111例的gc-ppv高于截断值，被判断为胃癌阳性，准确率98.23％，假阴性率1.77％。145例健康对照组中有144例的gc-ppv低于截断值，被判断为胃癌阴性，准确率99.31％，假阳性率0.69％(表5)。由以上数据可知，实施例 4中五个标记物组合的诊断性能与实施例1中两个标记物组合的诊断性能无差异。
[0090]
【实施例5】基于六个胆汁酸标记物组合的胃癌辅助筛查
[0091]
1.临床试验设计：同实施例1(即采用实施例1相同的受试者)。
[0092]
2.受试者血清采集：同实施例1此相应过程和条件。
[0093]
3.受试者待检血清预处理：在实施例1基础上，提取液新增氘代beta-鼠胆酸-d5、氘代胆酸-d4、氘代3-硫酸化牛磺酸缀合型石胆酸-d4单钠盐、氘代熊脱氧胆酸-d4、氘代石胆酸-d4，浓度均为50 ng/ml，其余同实施例1此相应过程和条件。
[0094]
4.液相色谱串联质谱检测：同实施例1此相应过程和条件。
[0095]
4.1液相色谱方法：同实施例1此相应过程和条件。
[0096]
4.2质谱方法：在实施例1基础上，增加正胆酸、猪胆酸、3-硫酸化牛磺酸缀合型石胆酸、猪脱氧胆酸、石胆酸的检测，其余同实施例1。正胆酸与内标氘代beta-鼠胆酸-d5的质谱扫描条件同实施例2。猪胆酸与内标氘代胆酸-d4的质谱扫描参数同实施例3。3-硫酸化牛磺酸缀合型石胆酸与内标3-硫酸化牛磺酸缀合型石胆酸-d4的质谱扫描参数同实施例4。猪脱氧胆酸扫描离子对是母离子 391.3
→
子离子391.3、去簇电压与碰撞电压为-160v和-20v，其对应内标物氘代熊脱氧胆酸-d4的扫描离子对是母离子395.3
→
子离子395.3、去簇电压与碰撞电压分别为-180v和-20v。石胆酸扫描离子对是母离子375.3
→
子离子375.3、去簇电压与碰撞电压为-160v和-25v，其对应内标物氘代石胆酸-d4的扫描离子对是母离子379.3
→
子离子379.3、去簇电压与碰撞电压分别为-160v和-20 v。
[0097]
5.定量工作曲线与胆汁酸定量：在实施例1基础上，定量液外标物新增正胆酸、猪胆酸、3-硫酸化牛磺酸缀合型石胆酸、猪脱氧胆酸、石胆酸，12个浓度点设置均与实施例1中牛磺酸缀合型石胆酸相同。内标物新增氘代beta-鼠胆酸-d5、氘代胆酸-d4、氘代3-硫酸化牛磺酸缀合型石胆酸-d4单钠盐、氘代熊脱氧胆酸-d4单钠盐、氘代石胆酸-d4，浓度均与实施例1实施例1中氘代牛磺酸缀合型石胆酸-d4相同，其余同实施例1。定量液、受试者待检血清、参比样中牛磺酸缀合型石胆酸与内标物氘代牛磺酸缀合型石胆酸-d4各自的峰面积值以及二者比值、3-葡萄糖醛酸缀合型脱氧胆酸与内标物氘代正熊脱氧胆酸-d5各自的峰面积值以及二者比值、正胆酸与内标物氘代beta-鼠胆酸-d5各自的峰面积值以及二者比值、猪胆酸与内标物氘代胆酸-d4各自的峰面积值以及二者比值、3-硫酸化牛磺酸缀合型石胆酸与内标物3-硫酸化牛磺酸缀合型石胆酸-d4各自的峰面积值以及二者比值、猪脱氧胆酸与内标物氘代熊脱氧胆酸-d4各自的峰面积值以及二者比值、石胆酸与内标物氘代石胆酸-d4 各自的峰面积值以及二者比值都分别进行记录计算(表2：定量液、受试者待检血清、参比样中检测胆汁酸与外标物的峰面积，表3：定量液、受试者待检血清、参比样中对应内标物的峰面积)。以对应定量液中外标物浓度为x，以前述相应的比值为y，分别绘制定量工作曲线并建立定量工作方程。
[0098]
牛磺酸缀合型石胆酸的定量工作曲线方程：同实施例1此相应过程和条件。
[0099]
3-葡萄糖醛酸缀合型脱氧胆酸的定量工作曲线方程：同实施例1此相应过程和条件。
[0100]
正胆酸的定量工作曲线方程：同实施例2此相应过程和条件。
[0101]
猪胆酸的定量工作曲线方程：同实施例3此相应过程和条件。
[0102]
3-硫酸化牛磺酸缀合型石胆酸的定量工作曲线方程：同实施例4此相应过程和条件。
[0103]
猪脱氧胆酸的定量工作曲线方程：y＝0.01955x 0.01491
[0104]
石胆酸的定量工作曲线方程：y＝0.01851x 0.01377
[0105]
分别将受试者待检血清样本记录计算的前述峰面积比值代入方程，即可计算出受试者待检血清中牛磺酸缀合型石胆酸、3-葡萄糖醛酸缀合型脱氧胆酸、正胆酸、猪胆酸、3-硫酸化牛磺酸缀合型石胆酸、猪脱氧胆酸、石胆酸的质量浓度值(单位ng/ml)，先分别乘以样本预处理环节引入的体积折算系数2884.6154，再分别除以七个胆汁酸外标物的摩尔质量483.70424g/mol、612.65978 g/mol、394.54482g/mol、408.57140g/mol、607.73110g/mol、392.572g/mol、376.5726g/mol，得到七个胆汁酸的血清浓度测定结果，单位为nmol/l(表4)，最后计算猪脱氧胆酸/石胆酸浓度比值。牛磺酸缀合型石胆酸、3-葡萄糖醛酸缀合型脱氧胆酸的血清浓度同实施例1，正胆酸的血清浓度同实施例2，猪胆酸的血清浓度同实施例3，3-硫酸化牛磺酸缀合型石胆酸的血清浓度同实施例4。猪脱氧胆酸/石胆酸的浓度比值在胃癌组和健康对照组分别为1.039
±
1.927和0.551
±
0.782(图2f)。使用spss统计软件对所述两种胆汁酸浓度比在胃癌组和健康对照组间的血清浓度进行t检验，结果表明两组之间具有显著性差异(p《0.0001)，猪脱氧胆酸/石胆酸浓度比值在胃癌组中要高于健康对照组。
[0106]
6.基于单一代谢物的诊断模型与诊断性能评价：根据所有受试者猪脱氧胆酸/石胆酸浓度比值和分类信息(按照胃癌组与健康对照组划分)，使用graphpad prism软件绘制猪脱氧胆酸/石胆酸浓度比的 roc曲线(图3f)，图中x轴是诊断模型的100％-特异性％，y轴是诊断模型的灵敏度。单独使用猪脱氧胆酸/石胆酸浓度比辅助胃癌筛查的诊断灵敏度和特异性分别为53.1％和69.7％，与实施例1 中牛磺酸缀合型石胆酸和3-葡萄糖醛酸缀合型脱氧胆酸的标记物组合的诊断性能相差甚远。
[0107]
7.基于标记物组合的诊断模型与阳性预测值计算：以所有受试者所述五个胆汁酸代谢物血清浓度值和猪脱氧胆酸/石胆酸浓度比值，共计6个指标为自变量，以受试者分类信息为响应值，其中胃癌组分类信息设定为1，健康对照组分类信息设定为0，使用graphpad prism软件进行二元逻辑回归分析将所述六个指标组合成一个诊断模型，结果模型的截距等于17.06，牛磺酸缀合型石胆酸、3-葡萄糖醛酸缀合型脱氧胆酸、正胆酸、猪胆酸、3-硫酸化牛磺酸缀合型石胆酸、猪脱氧胆酸/石胆酸浓度比的系数分别为-1.233、-0.001818、-0.05152、-0.02882、0.01354、-0.3342，二元逻辑回归模型的数学等式是：ln((1-[gc-ppv])/[gc-ppv])＝17.06-1.233
×ctlca-0.001818
×cdca-3g-0.05152
×cnorca
ꢀ‑
0.02882
×chca
0.01354
×ctlca-3s-0.3342
×rhdca/lca
，ln表示以自然常数为底的对数。将其变换后得公式5，将胃癌组和健康对照组每一个受试者样本所述胆汁酸血清浓度值和猪脱氧胆酸/石胆酸浓度比值分别代入公式5，计算出受试者的胃癌阳性预测值(gc-ppv)。根据所有受试者的gc-ppv 值和分类信息，使用graphpad prism软件绘制胃癌筛查诊断模型的roc曲线(图4e)，图中x 轴是诊断模型的100％-特异性％，y轴是诊断模型的灵敏度。
[0108]
公式5：
[0109][0110]
公式中c
tlca
、c
dca-3g
、c
norca
、c
hca
、c
tlca-3s
分别为牛磺酸缀合型石胆酸、3-葡萄糖醛酸缀合型脱氧胆酸、正胆酸、猪胆酸、3-硫酸化牛磺酸缀合型石胆酸的血清浓度值，r
hdca/lca
是猪脱氧胆酸与石胆酸之间血清浓度的比值，e为自然常数。
[0111]
roc曲线显示所述6个指标组合诊断模型的灵敏度为98.2％，特异性为98.6％，曲线下面积 auc为0.993，auc95％置信区间为0.985～1.000，换言之即auc有95％的概率出现在此区间内。按照灵敏度与特异性之和最大的原则，即roc曲线左上角拐点处，确定用于胃癌筛查诊断模型的最佳截断值是0.539。在此研究实施例中，113例胃癌组中有111例的gc-ppv高于截断值，被判断为胃癌阳性，准确率98.23％，假阴性率1.77％。145例健康对照组中有143例的gc-ppv低于截断值，被判断为胃癌阴性，准确率98.62％，假阳性率1.38％(表5)。由以上数据可知，实施例 5中六个标记物组合的特异性要低于实施例1中两个标记物组合。
[0112]
综合实施例1、2、3、4、5的研究结果来看，两个胆汁酸标记物组合(牛磺酸缀合型石胆酸 3
‑ꢀ
葡萄糖醛酸缀合型脱氧胆酸)用于辅助胃癌筛查的诊断效果与三个胆汁酸组合(牛磺酸缀合型石胆酸 3-葡萄糖醛酸缀合型脱氧胆酸 正胆酸)、四个胆汁酸组合(牛磺酸缀合型石胆酸 3-葡萄糖醛酸缀合型脱氧胆酸 正胆酸 猪胆酸)、五个胆汁酸组合(牛磺酸缀合型石胆酸 3-葡萄糖醛酸缀合型脱氧胆酸 正胆酸 猪胆酸 3-硫酸化牛磺酸缀合型石胆酸)、六个胆汁酸指标组合(牛磺酸缀合型石胆酸 3-葡萄糖醛酸缀合型脱氧胆酸 正胆酸 猪胆酸 3-硫酸化牛磺酸缀合型石胆酸 猪脱氧胆酸/石胆酸比值)之间无差异(灵敏度均为98.2％，特异性均为99.3％)。因此，从试剂盒工程实施的便捷性、诊断模型的易读性以及检验成本等角度出发，本发明优选使用牛磺酸缀合型石胆酸和3-葡萄糖醛酸缀合型脱氧胆酸联合应用的标记物组合，对于辅助胃癌筛查具有均衡的灵敏度与特异性，诊断性能出色(表1和表5)。
[0113]
【实施例6】早期胃癌的辅助筛查
[0114]
1.临床试验设计：研究项目经过医学伦理会批准，受试者纳入临床试验前签署知情同意书。早期胃癌筛查研究队列训练集包括145例健康对照组受试者和45例早期胃癌受试者。根据第八版美国癌症联合委员会(ajcc)制定的癌症分级系统，45例患者均为i期胃癌。
[0115]
2.受试者血清采集：同实施例1此相应过程和条件。
[0116]
3.受试者待检血清预处理：同实施例1此相应过程和条件。
[0117]
4.液相色谱串联质谱检测：同实施例1此相应过程和条件。
[0118]
4.1液相色谱方法：同实施例1此相应过程和条件。
[0119]
4.2质谱方法：同实施例1此相应过程和条件。
[0120]
5.定量工作曲线与胆汁酸定量：同实施例1。定量液、受试者待检血清、参比样中牛磺酸缀合型石胆酸与内标物氘代牛磺酸缀合型石胆酸-d4各自的峰面积值以及二者比值、3-葡萄糖醛酸缀合型脱氧胆酸与内标物氘代正熊脱氧胆酸-d5各自的峰面积值以及二者比值都分别进行记录计算(表2：定量液、受试者待检血清、参比样中检测胆汁酸与外标物的峰面积，表3：定量液、受试者待检血清、参比样中对应内标物的峰面积)。以对应定量液中外标物浓度为x，以前述相应的比值为y，分别绘制定量工作曲线并建立定量工作方程。其余操作同实施例1。
[0121]
牛磺酸缀合型石胆酸的定量工作曲线方程：同实施例1此相应过程和条件。
[0122]
3-葡萄糖醛酸缀合型脱氧胆酸的定量工作曲线方程：同实施例1此相应过程和条件。
[0123]
参比样中牛磺酸缀合型石胆酸、3-葡萄糖醛酸缀合型脱氧胆酸的测定值分别为标
定值的112.4％和110.1％，认定实施例1的血清胆汁酸的定量检验质量合格。牛磺酸缀合型石胆酸在早期胃癌组和健康对照组的血清浓度分别为(平均值
±
标准差)12.85
±
1.93nmol/l和5.30
±
2.65nmol/l，3-葡萄糖醛酸缀合型脱氧胆酸在胃癌组和健康对照组的血清浓度分别为2162.0
±
106.7nmol/l和 1651.0
±
718.7nmol/l(表4)。使用spss统计软件对所述两种胆汁酸代谢物在早期胃癌组和健康对照组间的血清浓度进行t检验，结果表明两组之间具有显著性差异(p《0.0001)，早期胃癌组的血清浓度要高于健康对照组。
[0124]
6.基于标注物组合的诊断模型与阳性预测值计算：以所有受试者所述牛磺酸缀合型石胆酸和3
‑ꢀ
葡萄糖醛酸缀合型脱氧胆酸血清浓度值为自变量，以受试者分类信息为响应值，其中早期胃癌组分类信息设定为1，健康对照组分类信息设定为0，使用graphpad prism软件进行二元逻辑回归分析将所述两个指标组合成一个诊断模型，结果模型的截距等于27.13，牛磺酸缀合型石胆酸、3-葡萄糖醛酸缀合型脱氧胆酸的系数分别为-1.323、-0.006491，二元逻辑回归模型的数学等式是： ln((1-[egc-ppv])/[egc-ppv])＝27.13-1.323
×
ctlca-0.006491
×
cdca-3g，ln表示以自然常数为底的对数。将其变换后得公式6，将早期胃癌组和健康对照组每一个受试者样本所述胆汁酸血清浓度值代入公式6，计算出受试者的早期胃癌阳性预测值(egc-ppv)。根据所有受试者的egc-ppv 值和分类信息(按照早期胃癌组和健康对照组划分)，使用graphpad prism软件绘制早期胃癌筛查诊断模型的roc曲线(图4f)，图中x轴是诊断模型的100％-特异性％，y轴是诊断模型的灵敏度。
[0125]
公式6：
[0126]
roc曲线的灵敏度为97.8％，特异性为100.0％，曲线下面积auc为0.991，auc95％置信区间为0.973～1.000，换言之即auc有95％的概率出现在此区间内，这些都表明二个胆汁酸标记物组合对辅助早期胃癌筛查也具有良好的诊断效果。
[0127]
按照灵敏度与特异性之和最大的原则，即roc曲线左上角拐点处，确定用于早期胃癌筛查诊断模型的最佳截断值是0.715。在此研究实施例中，45例早期胃癌组中有44例的egc-ppv高于截断值，被判断为早期胃癌阳性，准确率97.78％，假阴性率2.22％。145例健康对照组egc-ppv 均低于截断值，被判断为胃癌阴性，准确率100％，假阳性率0％(表5，图5b)。这再次表明本发明涉及的二个胆汁酸标记物组合对早期胃癌的辅助筛查也具有良好的判别效果与较高的应用价值。
[0128]
【实施例7】盲样测试
[0129]
1.临床验证实验设计：研究项目经过医学伦理会批准，受试者纳入临床试验前签署知情同意书。盲样验证集包括88例健康对照受试者和80例胃癌受试者。根据第八版美国癌症联合委员会(ajcc) 制定的癌症分级系统，25例患者属于i期，29例属于ii期，16例属于iii期，10例属于iv期。测试前将受试者样本做盲样化处理，测试过程中质谱检验人员、数据分析人员与流程复核人员均不知道盲样的实际分类。测试完成后揭盲，比较诊断模型判定结果与实际临床诊断间的异同，并计算筛查的准确率。
[0130]
2.受试者血清采集：同实施例1此相应过程和条件。
[0131]
3.受试者待检血清预处理：同实施例1此相应过程和条件。
[0132]
4.液相色谱串联质谱检测：同实施例1此相应过程和条件。
[0133]
4.1液相色谱方法：同实施例1此相应过程和条件。
[0134]
4.2质谱方法：同实施例1此相应过程和条件。
[0135]
5.定量工作曲线与胆汁酸定量：同实施例1此相应过程和条件。定量液、盲样待检血清、参比样中牛磺酸缀合型石胆酸与内标物氘代牛磺酸缀合型石胆酸-d4各自的峰面积值以及二者比值、3-葡萄糖醛酸缀合型脱氧胆酸与内标物氘代正熊脱氧胆酸-d5各自的峰面积值以及二者比值都分别进行记录计算(表6)。以对应定量液中外标物浓度为x，以前述相应的比值为y，分别绘制定量工作曲线并建立定量工作方程。
[0136]
牛磺酸缀合型石胆酸的定量工作曲线方程：y＝0.01745x-0.01616。
[0137]
3-葡萄糖醛酸缀合型脱氧胆酸的定量工作曲线方程：y＝0.00161x 1.34173e-4。
[0138]
分别将盲样待检血清样本、参比样记录计算的前述峰面积比值代入方程，计算出盲样待检血清、参比样中牛磺酸缀合型石胆酸、3-葡萄糖醛酸缀合型脱氧胆酸的质量浓度值，按照实施例1描述的操作做体积折算与摩尔量换算(体积折算公式与摩尔质量同实施例1)，最终得到两个胆汁酸代谢物的血清浓度，单位为nmol/l(表6)。本实施例中参比样牛磺酸缀合型石胆酸、3-葡萄糖醛酸缀合型脱氧胆酸的测定值分别为标定值的76.6％和93.7％，认定实施例7的血清胆汁酸的定量检验质量合格。
[0139]
6.胃癌阳性预测值计算与揭盲结果：将每一个盲样所述胆汁酸血清浓度值代入公式1，计算出受试者的胃癌阳性预测值(gc-ppv)。gc-ppv值高于最佳截断值0.829，则判断此盲样为胃癌阳性，反之，则为阴性。在实施例7中，有79个盲样的筛查结果为胃癌阳性，89个为胃癌阴性。揭盲后发现，实际临床诊断为胃癌的受试者有80例，阳性筛查准确率为95.0％，假阳性率为5.0％；临床诊断不是胃癌的健康受试者有88例，阴性筛查准确率为96.6％，假阴性率为3.4％(表7)。本发明所述胆汁酸标记物组合和血清检测试剂盒在盲样验证测试中展示了良好的胃癌辅助筛查效果。
[0140]
表1
[0141][0142]
表2
[0143]
[0144]
[0145]
[0146]
[0147]
[0148]
[0149][0150]
表3
[0151]
[0152]
[0153]
[0154]
[0155]
[0156]
[0157]
[0158][0159]
表4
[0160]
[0161]
[0162]
[0163]
[0164]
[0165]
[0166][0167]
表5
[0168][0169][0170]
表6
[0171]
[0172]
[0173]
[0174]
[0175][0176]
表7
[0177]
[0178]
[0179]
[0180]
[0181]