一种基于上转换纳米生物传感体系对丙烯酰胺含量的检测方法

1.本发明属于食品安全检测技术领域，具体涉及一种基于上转换和银纳米簇特异性体系检测丙烯酰胺含量的方法。


背景技术：

2.丙烯酰胺一种广泛存在于热加工食品中的一种物质，主要是在高温低湿度条件下，通过天冬酰胺和还原糖之间的美拉德反应产生。人体的许多器官都可以吸收和积累丙烯酰胺，并与血红蛋白、dna或酶结合造成伤害。已经有研究证明，丙烯酰胺具有遗传毒性、神经毒性、生殖毒性和潜在的致癌作用。世界卫生组织规定每日饮用水中丙烯酰胺限量为0.5μg/l。
3.传统的丙烯酰胺检测方法，如气相色谱法和高效液相色谱法，虽然具有较高的准确性和稳定性，但是其仪器设备昂贵、操作步骤繁琐，不能满足丙烯酰胺含量的快速检测。本发明提出了一种快速准确的丙烯酰胺含量检测方法，克服传统方法高成本、速度慢的的缺陷，提高汞检测的灵敏度和准确性。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于解决现有技术存在的问题，如检测时间长、仪器成本高等缺陷，提供了一种基于上转换和银纳米簇，借助dna自组装特性的特异性体系用于食品中丙烯酰胺定量的荧光纳米传感器，从而实现食品中丙烯酰胺的快速、灵敏、准确的检测。
5.为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
6.本发明提供一种丙烯酰胺的检测方法，包括以下步骤：
7.步骤一，核心上转换纳米材料的制备：将六水氯化钆、六水氯化镱、六水氯化铥加入到甲醇a中超声溶解，再加入油酸和1-十八烯，形成混合溶液；在氩气保护条件下进行第一次加热搅拌反应，反应后冷却至室温，得到冷却液；将氟化铵、氢氧化钠和甲醇b混合后，加入冷却液中，进行第一次水浴反应，反应后升温进行第二次水浴反应；水浴反应后在氩气保护条件下进行第二次加热搅拌反应，反应后冷却至室温，得到反应产物；经清洗、真空干燥得到核心上转换纳米材料；
8.步骤二，核壳上转换纳米材料的制备：将六水氯化钇加入到甲醇c中超声溶解，转移到油酸和1-十八烯的混合液中；在氩气的保护下，进行第一次加热搅拌反应，反应后冷却至室温，得到冷却液；
9.将步骤一得到的核心上转换纳米溶于环己烷中，再和氟化铵、氢氧化钠以及甲醇d混合后，加入冷却液中，进行第一次水浴反应，反应后升温进行第二次水浴反应；水浴反应后在氩气保护下，第二次加热搅拌反应，冷却至室温，得到反应产物；对反应产物清洗，真空干燥得到核壳上转换纳米材料；
10.步骤三，核壳上转换纳米材料的功能化修饰：将步骤二得到的核壳上转换纳米材
料加入到盐酸中，超声分散；清洗后分散于乙醇中，加入去离子水与氨水，在一定温度条件下进行第一次搅拌反应；反应后再加入正硅酸四乙脂进行第二次搅拌反应；最后加入3-氨丙基三乙氧基硅烷，进行第三次搅拌反应，得到反应产物；经清洗、真空干燥，得到氨基功能化核壳上转换纳米材料；
11.步骤四，适配体互补链1(dna1)功能化的核壳上转换纳米材料：将步骤三得到的氨基功能化核壳上转换纳米材料溶解在磷酸盐缓冲液a中；然后加入戊二醛，搅拌反应；用磷酸盐缓冲溶液离心清洗后溶于磷酸盐缓冲溶液b，加入亲和素进行第一次孵育反应；最后加入适配体互补链1(dna1)进行第二次孵育得到dna1链功能化的核壳上转换纳米材料；
12.步骤五，特异性检测体系的建立：将步骤四得到的dna1功能化的核壳上转换纳米材料溶解于磷酸盐缓冲液中，加入丙烯酰胺适配体和适配体互补链2(dna2)进行孵育，得到丙烯酰胺的特异性检测体系；
13.步骤六，丙烯酰胺检测标准曲线的建立：在步骤五中制备得丙烯酰胺的特异性检测体系中分别加入不同浓度的丙烯酰胺标准溶液，得到不同浓度的检测液，一种浓度的丙烯酰胺标准溶液对应一份特异性检测体系，两者为一一对应关系；再对不同浓度检测液进行离心得到沉淀物，使用磷酸盐缓冲液对沉淀物进行清洗，清洗后的沉淀物再次分散于磷酸盐缓冲液c中，加入硝酸银溶液第一次反应后，加入硼氢化钠溶液进行第二次反应；反应后测定加入不同浓度的丙烯酰胺溶液的特异性检测体系的荧光强度信号特征值，记为y，建立丙烯酰胺浓度(c)与荧光强度信号特征值的关系，即得到丙烯酰胺检测标准曲线；
14.步骤七，食品样本中丙烯酰胺含量的检测：将食品样本粉碎，加入去离子水震荡并超声处理；然后将上清液通过固相萃取柱净化，得到净化后的上清液加入到丙烯酰胺的特异性检测体系中，测定特异性检测体系的荧光强度信号特征值，通过步骤六所构建的丙烯酰胺检测标准曲线，计算出食品样本中丙烯酰胺的含量。
15.优选的，步骤一中，所述六水氯化钆、六水氯化镱、六水氯化铥、甲醇a的用量比为0.07434g：0.07593g：0.0015g：4ml；所述超声溶解的时间为10min；所述第一次加热搅拌反应，温度为150～170℃，时间为30min；所述第二次加热搅拌反应的温度为290～310℃，时间为1h；所述甲醇a、油酸和1-十八烯的体积比为4ml：4ml：7ml；所述甲醇a、氟化铵、氢氧化钠、甲醇b的用量比为4ml：0.06g：0.04g：4ml；所述第一次水浴反应的温度为40～60℃，水浴反应40min，第二次水浴反应的温度为100℃，水浴反应10min。
16.优选的，步骤二中，所述六水氯化钇和甲醇c的用量比为0.1214g：4ml；所述超声溶解的时间为10～15min；所述第一次加热搅拌反应的温度为150～170℃，时间为30min；所述第二次加热搅拌反应的温度为290～310℃，时间为1h；所述甲醇c、油酸、1-十八烯、核心上转换纳米材料、环己烷、氟化铵、氢氧化钠、甲醇d的用量比为4ml：4ml：7ml：50mg：5ml：0.06g：0.04g：4ml；所述第一次水浴反应的温度为40～60℃，水浴反应时间为40min，第二次水浴反应的温度为60～80℃，水浴反应时间为30min。
17.优选的，步骤三中，所述核壳上转换纳米材料、盐酸、乙醇、去离子水、氨水、正硅酸四乙脂、3-氨丙基三乙氧基硅烷的用量比为20mg：1ml：60ml：10ml：2.5ml：0.01-0.05ml：0.03～0.08ml；所述盐酸浓度为0.1m；所述超声分散时间为10～15min；所述氨水的体积浓度为25％；所述第一次搅拌的温度为65℃，搅拌时间为10min；所述第二次搅拌的温度为65℃，搅拌时间2～6h；所述第三次搅拌的温度为65℃，搅拌时间为1～3h。
18.优选的，步骤四中，所述氨基功能化核壳上转换纳米材料、磷酸盐缓冲液a、戊二醛、磷酸盐缓冲溶液b、亲和素、dna1的用量比为20mg：10ml：2.5ml：10ml：0.1ml：0.1ml；所述搅拌反应时间为2h；所述磷酸盐缓冲液a和磷酸盐缓冲液b浓度均为10mm，ph均为7.4；所述戊二醛的体积浓度为25％；所述亲和素浓度为1mg/ml。
19.优选的，步骤四中所述dna1浓度为60nm，溶剂为磷酸盐缓冲液，所述dna1的序列为5
’‑
biotin-tttttttttt aat cgc tga atg aaa tcc acg tgg cca cac act cat cca cca ccc ggg tgg ggt ggg gtg ggg-3’；所述第一次孵育反应的温度为37℃，孵育时间为12h；所述第二次孵育反应的温度为37℃，孵育时间为2-24h。
20.优选的，步骤五中，所述dna1功能化的核壳上转换纳米材料、磷酸盐缓冲液、丙烯酰胺适配体和dna2的用量比为20mg：10ml：0.1ml：0.1ml；所述孵育的温度为37℃，孵育时间为10～60min。
21.优选的，步骤五中，所述丙烯酰胺适配体的浓度为60nm，溶剂为磷酸盐缓冲液，所述适配体序列为5
’‑
cag tcc agg aca gat tcg cga gtg gtc gtg gtg agg tgc gtg tat ggg tgg tgg atg agt gtg tgg cca cgt gga ttt cat tca gcg att-3’；所述dna2浓度为60nm，溶剂为磷酸盐缓冲液，所述dna2序列为5
’‑
ccc tta atc ccc ata cac gca cct cac cac gac cac tcg cga atc tgt cct gga ctg-3’。
22.优选的，步骤六中，所述丙烯酰胺的特异性检测体系、丙烯酰胺标准溶液、磷酸盐缓冲液c、硝酸银溶液以及硼氢化钠溶液的用量比为0.5ml：0.15ml：0.65ml：0.016ml：0.016ml；所述丙烯酰胺检测时间为5～60min；第一次反应条件为4℃静置15min；所述第二次反应条件为震荡30～40s；所述硝酸银的浓度为1.2μm；所述硼氢化钠的浓度为1.2μm；所述磷酸盐缓冲液d浓度为10mm，ph为7.4；所述丙烯酰胺标准溶液的浓度为0.001～100μm；
23.所述测定检测溶液的荧光强度信号特征值y，具体是测定980nm激发光激发下450nm荧光强度值；所述丙烯酰胺检测标准曲线，是指构建特异性检测体系的荧光强度信号特征值与丙烯酰胺浓度关系的标准曲线，即y＝alog(c) b，其中，a、b为常数；y：荧光强度特征值；c：丙烯酰胺浓度。
24.优选的，步骤七中，所述食品样品和去离子水的用量比为1g：1ml；所述丙烯酰胺的特异性检测体系、净化后的上清液用量比为0.5ml：0.15ml；所述超声时间为30～60min。
25.本发明所使用的甲醇a、甲醇b、甲醇c、甲醇d均为甲醇，字母a、b、c、d仅为名称上的区别；本发明所使用的磷酸盐缓冲液a、磷酸盐缓冲液b、磷酸盐缓冲液c均为磷酸盐缓冲液(ph＝7.4)，字母a、b、c仅为名称上的区别。
26.与现有检测技术相比，本发明的有益效果如下：
27.1.本发明公开了一种食品中丙烯酰胺的荧光检测方法，是基于上转换-银纳米簇特异性体系对食品中丙烯酰胺含量的检测方法，具体是通过上转换纳米粒子作为荧光供体、银纳米簇作为荧光受体，通过适配体及dna组装构建丙烯酰胺检测体系，具有较高的特异性和抗干扰能力，实现食品中丙烯酰胺的高灵敏、低成本和特异性检测。
28.2.本发明构建的特异性检测体系，具体优化设计的上转换纳米材料-银纳米簇的混合检测体系，对丙烯酰胺具有强的荧光响应性，可有效消除背景荧光及其他分子的干扰，对丙烯酰胺的检测具有高特异性，克服了传统方法的不足，对保障食品安全至关重要。
29.3.本发明建立的的丙烯酰胺浓度与荧光强度信号特征值的线性浓度范围为
0.001-100μm，具有较宽的线性检测范围，检测限lod为0.011μm，可以满足食品中丙烯酰胺含量的高灵敏检测，具有很好的通用性，比传统方法的检测精度和灵敏度高。
附图说明
30.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
31.图1为实施例1制备的核壳上转换纳米粒子的透射电镜图。
32.图2为实施例1制备的功能化核壳上转换纳米粒子的透射电镜图。
33.图3为实施例1制备的银纳米簇的透射电镜图。
34.图4为实施例1中不同丙烯酰胺浓度下上转换纳米材料-银纳米簇混合体系的荧光信号。
35.图5为实施例1中上转换纳米材料-银纳米簇混合体系的丙烯酰胺检测标准曲线。
具体实施方式
36.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的技术方案进行清楚地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
37.下面结合说明书附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。
38.实施例1：
39.本发明公开一种基于上转换和银纳米簇特异性体系的食品中丙烯酰胺含量检测方法，具体步骤为：
40.步骤一，核心上转换纳米材料的制备：准确称取0.07434g六水氯化钆、0.07593g六水氯化镱、0.0015g六水氯化铥，用4ml甲醇超声溶解10min，转移至三口烧瓶中，加入4ml油酸和7ml十八烯；在氩气的保护下，第一次加热到160℃、磁力搅拌30min冷却至室温；向冷却液中逐滴加入0.06g的氟化铵和0.04g的氢氧化钠的甲醇溶液4ml，然后第一次水浴50℃下反应40min，第二次水浴100℃反应10min，使溶液中的甲醇完全挥发；接着，在氩气保护条件下，第二次加热到300℃、磁力搅拌反应1h，冷却至室温，得到反应产物；最后，用乙醇和环己烷(体积比为1:2)混合溶液对反应产物进行清，真空干燥得到核心上转换纳米材料。
41.图1为本发明实施例1所制备的核心上转换纳米粒子的透射电镜图，电镜图片表明核心上转换纳米粒子是单分散的，直径约为18nm。
42.步骤二，核壳上转换纳米材料的制备：将0.1214g六水氯化钇加入到4ml甲醇中超声溶解10min，转移至三口烧瓶中，加入4ml油酸和7ml十八烯；在氩气的保护下，第一次加热到160℃、磁力搅拌30min冷却至室温；向冷却液中逐滴加入0.06g的氟化铵和0.04g的氢氧化钠的甲醇溶液4ml，然后第一次水浴50℃下反应40min，第二次水浴70℃反应30min，使溶液中的甲醇完全挥发；接着，在氩气保护条件下，第二次加热到300℃、磁力搅拌反应1h，冷却至室温，得到反应产物；最后，用乙醇和环己烷(体积比为1:2)混合溶液对反应产物进行
清，真空干燥得到核壳上转换纳米材料；
43.图2为本发明实施例1所制备的核壳上转换纳米粒子的透射电镜图，如图所示可以看出，核壳上转换纳米粒子直径增大到50nm左右，分散性良好。
44.步骤三，核壳上转换纳米材料的功能化修饰：将20mg步骤二得到的核壳上转换纳米材料加入到1ml盐酸(0.1m)中，超声分散15min；用乙醇清洗后再次分散于60ml乙醇中，加入10ml去离子水与2.5ml氨水(25％)，进行65℃搅拌反应10min；加入0.03ml正硅酸四乙脂，搅拌反应4h；加入0.05ml的3-氨丙基三乙氧基硅烷，搅拌反应2h，得到反应产物；对反应产物清洗，真空干燥，得到氨基功能化核壳上转换纳米材料；
45.图3为实施例1制备的功能化核壳上转换纳米粒子的透射电镜图，可以看出核壳上转换纳米粒子均匀包裹了约10nm厚的二氧化硅壳，表明了上转换纳米粒子的成功氨基化。
46.步骤四，适配体互补dna1链1(dna1)功能化的核壳上转换纳米材料：将20mg步骤三得到的氨基功能化核壳上转换纳米材料溶解在10ml磷酸盐缓冲液(10mm，ph＝7.4)中；然后加入2.5ml戊二醛(25％)，搅拌反应2h；用磷酸盐缓冲溶液清洗后溶于10ml磷酸盐缓冲溶液(10mm，ph＝7.4)中，加入0.1ml亲和素(1mg/ml)在37℃孵育反应12h；最后加入0.1ml的dna1(60nm)，dna1链为5
’‑
biotin-tttttttttt aat cgc tga atg aaa tcc acg tgg cca cac act cat cca cca ccc ggg tgg ggt ggg gtg ggg-3’，在37℃孵育6h得到dna1链功能化的核壳上转换纳米材料；
47.步骤五，特异性检测体系的建立：将20mg步骤四得到的dna1链功能化的核壳上转换纳米材料溶解于10ml磷酸盐缓冲液中，加入0.1ml丙烯酰胺适配体(60nm)，适配体为5
’‑
cag tcc agg aca gat tcg cga gtg gtc gtg gtg agg tgc gtg tat ggg tgg tgg atg agt gtg tgg cca cgt gga ttt cat tca gcg att-3’，加入0.1mldna2链(60nm)，dna2为5
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ccc tta atc ccc ata cac gca cct cac cac gac cac tcg cga atc tgt cct gga ctg-3’，在37℃孵育20min，得到丙烯酰胺的特异性检测体系。
48.步骤六，丙烯酰胺检测标准曲线的建立：在0.65ml步骤五中制备得特异性检测体系中分别加入不同浓度的丙烯酰胺标准溶液，孵育10min得到不同浓度的检测液，一种浓度的丙烯酰胺溶液对应一份特异性检测体系，两者为一一对应关系；在对丙烯酰胺孵育后的核壳上转换纳米材料用磷酸盐缓冲液进行清洗，再次分散于0.65ml磷酸盐缓冲液中，加入0.16ml硝酸银溶液(1.2μm)在4℃静置反应15min后，加入0.16ml硼氢化钠溶液(1.2μm)巨烈震荡30s以合成银纳米簇，如图4所示合成的银纳米簇直径约为4nm；然后在980nm激发光激发下，测定加入不同浓度的丙烯酰胺溶液的特异性检测体系的在450nm荧光强度信号特征值y，建立丙烯酰胺浓度(c)与荧光强度信号特征值y的关系，得到丙烯酰胺检测标准曲线，如图5所示y＝886.15log(c) 5956.6，决定系数r2＝0.9749，检测限为0.011μm，线性范围为0.001-100μm。
49.步骤七：食品样本中丙烯酰胺含量的检测：将1g食品样本粉碎，加入1ml去离子水震荡并超声处理40min；然后将上清液净化，加入到特异性检测体系中，测定特异性检测体系的荧光强度信号特征值，通过步骤六所构建的丙烯酰胺检测标准曲线，计算出食品样本中丙烯酰胺的含量。
50.实施例2：
51.本发明公开一种基于上转换和银纳米簇特异性体系的食品中丙烯酰胺含量检测
方法，具体步骤为：
52.步骤一，核心上转换纳米材料的制备：准确称取0.07434g六水氯化钆、0.07593g六水氯化镱、0.0015g六水氯化铥，用4ml甲醇超声溶解10min，转移至三口烧瓶中，加入4ml油酸和7ml十八烯；在氩气的保护下，第一次加热到150℃、磁力搅拌30min冷却至室温；向冷却液中逐滴加入0.06g的氟化铵和0.04g的氢氧化钠的甲醇溶液4ml，然后第一次水浴40℃下反应40min，第二次水浴100℃反应10min，使溶液中的甲醇完全挥发；接着，在氩气保护条件下，第二次加热到290℃、磁力搅拌反应1h，冷却至室温，得到反应产物；最后，用乙醇和环己烷(体积比为1:2)混合溶液对反应产物进行清，真空干燥得到核心上转换纳米材料。
53.步骤二：核壳上转换纳米材料的制备：将0.1214g六水氯化钇加入到4ml甲醇中超声溶解10min，转移至三口烧瓶中，加入4ml油酸和7ml十八烯；在氩气的保护下，第一次加热到150℃、磁力搅拌30min冷却至室温；向冷却液中逐滴加入0.06g的氟化铵和0.04g的氢氧化钠的甲醇溶液4ml，然后第一次水浴40℃下反应40min，第二次水浴60℃反应30min，使溶液中的甲醇完全挥发；接着，在氩气保护条件下，第二次加热到290℃、磁力搅拌反应1h，冷却至室温，得到反应产物；最后，用乙醇和环己烷(体积比为1:2)混合溶液对反应产物进行清，真空干燥得到核壳上转换纳米材料。
54.步骤三，核壳上转换纳米材料的功能化修饰：将20mg步骤二得到的核壳上转换纳米材料加入到1ml盐酸(0.1m)中，超声分散15min；用乙醇清洗后再次分散于60ml乙醇中，加入10ml去离子水与2.5ml氨水(25％)，进行65℃搅拌反应10min；加入0.01ml正硅酸四乙脂，搅拌反应2h；加入0.03ml的3-氨丙基三乙氧基硅烷，搅拌反应1h，得到反应产物；对反应产物清洗，真空干燥，得到氨基功能化核壳上转换纳米材料；
55.步骤四，适配体互补dna1链1(dna1)功能化的核壳上转换纳米材料：将20mg步骤三得到的氨基功能化核壳上转换纳米材料溶解在10ml磷酸盐缓冲液(10mm，ph＝7.4)中；然后加入2.5ml戊二醛(25％)，搅拌反应2h；用磷酸盐缓冲溶液清洗后溶于10ml磷酸盐缓冲溶液(10mm，ph＝7.4)中，加入0.1ml亲和素(1mg/ml)在37℃孵育反应12h；最后加入0.1ml的dna1(60nm)，dna1链为5
’‑
biotin-tttttttttt aat cgc tga atg aaa tcc acg tgg cca cac act cat cca cca ccc ggg tgg ggt ggg gtg ggg-3’，在37℃孵育2h得到dna1链功能化的核壳上转换纳米材料；
56.步骤五，特异性检测体系的建立：将20mg步骤四得到的dna1链功能化的核壳上转换纳米材料溶解于10ml磷酸盐缓冲液中，加入0.1ml丙烯酰胺适配体(60nm)，适配体为5
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cag tcc agg aca gat tcg cga gtg gtc gtg gtg agg tgc gtg tat ggg tgg tgg atg agt gtg tgg cca cgt gga ttt cat tca gcg att-3’，加入0.1mldna2链(60nm)，dna2为5
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ccc tta atc ccc ata cac gca cct cac cac gac cac tcg cga atc tgt cct gga ctg-3’，在37℃孵育10min，得到丙烯酰胺的特异性检测体系。
57.步骤六，丙烯酰胺检测标准曲线的建立：在0.65ml步骤五中制备得特异性检测体系中分别加入不同浓度的丙烯酰胺标准溶液，孵育5min得到不同浓度的检测液，一种浓度的丙烯酰胺溶液对应一份特异性检测体系，两者为一一对应关系；在对丙烯酰胺孵育后的核壳上转换纳米材料用磷酸盐缓冲液进行清洗，再次分散于0.65ml磷酸盐缓冲液中，加入0.16ml硝酸银溶液(1.2μm)在4℃静置反应15min后，加入0.16ml硼氢化钠溶液(1.2μm)巨烈震荡30s以合成银纳米簇；然后在980nm激发光激发下，测定加入不同浓度的丙烯酰胺溶液
agt gtg tgg cca cgt gga ttt cat tca gcg att-3’，加入0.1mldna2链(60nm)，dna2为5
’‑
ccc tta atc ccc ata cac gca cct cac cac gac cac tcg cga atc tgt cct gga ctg-3’，在37℃孵育60min，得到丙烯酰胺的特异性检测体系。
66.步骤六，丙烯酰胺检测标准曲线的建立：在0.65ml步骤五中制备得特异性检测体系中分别加入不同浓度的丙烯酰胺标准溶液，孵育60min得到不同浓度的检测液，一种浓度的丙烯酰胺溶液对应一份特异性检测体系，两者为一一对应关系；在对丙烯酰胺孵育后的核壳上转换纳米材料用磷酸盐缓冲液进行清洗，再次分散于0.65ml磷酸盐缓冲液中，加入0.16ml硝酸银溶液(1.2μm)在4℃静置反应15min后，加入0.16ml硼氢化钠溶液(1.2μm)巨烈震荡30s以合成银纳米簇；然后在980nm激发光激发下，测定加入不同浓度的丙烯酰胺溶液的特异性检测体系的在450nm荧光强度信号特征值y，建立丙烯酰胺浓度(c)与荧光强度信号特征值y的关系，得到丙烯酰胺检测标准曲线，y＝7146.15log(c) 5893.7，决定系数r2＝0.9702，检测限为0.014μm，线性范围为0.001-100μm。
67.步骤七：食品样本中丙烯酰胺含量的检测：将1g食品样本粉碎，加入1ml去离子水震荡并超声处理60min；然后将上清液净化，加入到特异性检测体系中，测定特异性检测体系的荧光强度信号特征值，通过步骤六所构建的丙烯酰胺检测标准曲线，计算出食品样本中丙烯酰胺的含量。
68.检测：鉴于实施例1是最优实施例，因此本发明采用实施例1所述方法和步骤，对4个食品标准样品中丙烯酰胺含量进行测定，其中样品1为薯片、样品2为曲奇、样品3为咖啡、样品4为面包。测定结果表1所示，可以看出本发明方法与标准高效液相色谱法的检测结果无显著性差异，表明本发明方法可高精度检测食品中丙烯酰胺含量。
69.表1本发明方法与标准方法检测食品标准样品中丙烯酰胺含量的结果(单位，μm)
[0070][0071]
t＝0.55＜t
0.05(3)
＝3.182,p＞0.05
[0072]
将所构建的检测方法用于其他结构类似物标准液的检测时，如l-天门冬酰胺、甲基丙烯酰胺、甲基丙烯酸、丙烯酸、乙酸和丙酸等不会引起体系荧光信号的变化，只有在体系中加入丙烯酰胺溶液时体系的荧光信号值才会有明显的变化。并且在上所述类似物存在的情况下向特异性检测体系中加入丙烯酰胺的抗干扰性实验，加入丙烯酰胺都会引起荧光信号值的明显变化，结果表明，所构建的特异性检测体系在检丙烯酰胺醛时几乎不受其他共存类似物的影响，表明所构建的检测方法对丙烯酰胺具有高特异性、高选择性。
[0073]
说明：以上实施例仅用以说明本发明而并非限制本发明所描述的技术方案；因此，尽管本说明书参照上述的各个实施例对本发明已进行了详细的说明，但是本领域的普通技术人员应当理解，仍然可以对本发明进行修改或等同替换；而一切不脱离本发明的精神和范围的技术方案及其改进，其均应涵盖在本发明的权利要求范围内。