一种番石榴叶提取物的制备方法及应用

1.本发明属于天然药物领域，具体涉及一种番石榴叶提取物的制备方法及其应用。


背景技术：

2.炎症(inflammation)是具有血管系统的活体组织对刺激的一种防御反应。炎症只发生于脊椎动物和人类，以发红、肿胀、疼痛等为主要征候，即以血管系统为中心的局部和全身防御反应。血管反应导致局部血管扩张、血流缓慢，血管内的血浆及中性白细胞等血液成分渗出进入组织内：局限和杀灭损伤因子，清除、吸收坏死组织。血管反应是炎症过程的主要特征和防御的中心环节。
3.通常情况下，炎症是有益的，是机体的自主防御机制，但是有的时候炎症也是有害的。目前，恶性肿瘤仍然是威胁人类生命和健康的主要疾病。而炎症与肿瘤之间关系密切，机体内的炎症可促进肿瘤发生和发展，并降低肿瘤的治疗效果，更有甚者慢性炎症还是肿瘤转移的“帮凶”。因此，从天然产物中寻找新的活性物质，并进而研制新的安全有效的抗炎药物仍为当今的重要任务和使命。
4.番石榴（psidium guajava l.）属桃金娘科（myrtaceae juss.）植物，为常绿灌木或小乔木，约3000种，分属于130个属，原产于南美洲热带地区。约17世纪末传入中国，台湾、海南和广东等省均有栽培，有的地方已逸为野生果树。番石榴叶和果均可入药，在《岭南草药志》、《福建药物志》和《台湾药用植物志》中均有记载，民间常用于涩肠止泻、燥湿健脾、止血、辅助降糖、治疗痢疾等。现代研究表明，番石榴叶中含有萜类、黄酮类、多酚及挥发油类等成分。
5.中国专利cn 201110100466.5介绍了“具有降血糖作用的番石榴叶提取物及其制备方法与应用”，该专利涉及番石榴叶中总三萜酸部位预防与治疗 ii 型糖尿病的用途，而总三萜酸部位的制取方法主要使用了醇提水沉的纯化工艺，该工艺对药材质量要求高，得到的有效部位杂质较多，部分有效成分流失。还有文献报道番石榴叶提取物可以减轻链脲佐菌素诱发的糖尿病大鼠的炎症负担，大鼠的炎症表达有所改善，作用机制是由于它能够抑制促炎介质（如粘附分子、细胞因子、类花生酸和 c 反应蛋白）的形成（jayachandran m， eta1.biomed res int，2018；2018：4601649），推测其活性成分是总酚类和类黄酮,但未给予证实。中国专利cn 201610013336.0介绍了“具有抗肿瘤作用的番石榴叶有效部位及其制备方法和应用”，该专利涉及番石榴叶中总三萜酸部位抗肿瘤活性方面的用途，而总三萜酸部位的制取方法主要使用了硅胶柱层析进行纯化。而使用硅胶柱层析大量制备样品时费时费力，成本高，周期长。并且番石榴叶中总三萜酸部位的抗炎活性未见报道。


技术实现要素：

6.本发明主要解决的技术问题是提供了一种成本低、操作方便、易于工业化生产的番石榴叶提取物的制备方法，能从番石榴叶中提取出具有抗炎药效活性的提取物。
7.本发明是通过下述的技术方案来实现的：
一种番石榴叶提取物的制备方法，包括下述的步骤：（a）提取：以新鲜番石榴叶为原料，晒干后用60-80%乙醇回流提取2-3次，合并过滤提取液，减压浓缩蒸干至无醇味得到浓缩液，浓缩液依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，减压浓缩得石油醚、乙酸乙酯部位浸膏；（b）分离：将步骤（a）所得乙酸乙酯部位浸膏用中性氧化铝柱层析进行分离，以二氯甲烷-甲醇系统进行梯度洗脱，将二氯甲烷：甲醇=10：2得到的部位浓缩、干燥即得番石榴叶提取物。
8.上述的番石榴叶提取物的制备方法中，所述步骤（a）中回流提取溶剂为 70%乙醇，所述回流提取溶剂的用量为每千克新鲜番石榴叶提取溶剂用量为8-10l。
9.上述的番石榴叶提取物的制备方法中，所述步骤（a）中回流提取时间为每次0.5-1.5小时。
10.上述的番石榴叶提取物的制备方法中，所述步骤（a）中用石油醚萃取的次数为1次，石油醚体积用量为浓缩液的1倍。
11.上述的番石榴叶提取物的制备方法中，述步骤（a）中用乙酸乙酯萃取的次数为3-4次，乙酸乙酯体积用量为浓缩液的0.5-0.7倍。
12.上述的番石榴叶提取物的制备方法中，所述步骤（b）中柱层析采用干法上样，所述浸膏与中性氧化铝的质量比为1：0.5-5。
13.上述的番石榴叶提取物的制备方法中，所述步骤（b）中干法上样操作步骤为：将浸膏与中性氧化铝混合后，再真空干燥、研磨后，再上样。真空干燥的温度为不高于50℃。
14.上述的番石榴叶提取物的制备方法中，所述步骤（b）中二氯甲烷-甲醇系统梯度洗脱为，100%二氯甲烷，二氯甲烷：甲醇为10：1，二氯甲烷：甲醇为10：2，二氯甲烷：甲醇为2：1，二氯甲烷：甲醇为1：1；每千克新鲜番石榴叶对应的各个梯度的洗脱剂用量为5l。
15.本发明中，所述60-80%乙醇是指质量百分比浓度为60-80%的乙醇、70%乙醇是指是指质量百分比浓度为70%的乙醇。
16.上述的番石榴叶提取物在制备抗炎药物中的应用。
17.本发明的有益效果在于，（1）本发明制备的番石榴叶提取物，具有来源充足、成本低、适合工业化生产的优点，同时具有抗炎活性，拥有广阔的市场前景和开发价值。
18.（2）经药理实验证明，本发明的制备方法制备的番石榴叶提取物具有优异的抗炎活性。对于小鼠巨噬细胞raw264.7的ic
50
均小于1μg/ml。
19.（3）本发明的番石榴叶提取物的制备方法中，采用氧化铝柱层析，氧化铝柱层析方法具有吸附性能强、分离效果好、溶液透过速率快、工艺简单、投资少、处理量大等优点。
附图说明
20.图1为本发明各实施例1及对比例的番石榴叶提取物分离流程图。
具体实施方式
21.下面结合具体实施例对本发明作更进一步的说明，以便本领域的技术人员更了解本发明，但并不因此限制本发明。
22.下列实施例中所述试验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
23.下列实施例中，干法上样操作步骤为：将浸膏与中性氧化铝混合后，再真空干燥、研磨后，再上样。其中，真空干燥的温度为不高于50℃。
24.实施例1新鲜番石榴叶3kg晒干后，分别用10倍量70%乙醇回流提取2次，每次1小时，合并2次提取液，过滤，减压浓缩至无醇，得到浓缩液3l；用1倍量石油醚萃取1次，后用0.5倍量乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯部位，减压浓缩得乙酸乙酯部位浸膏50g。
25.取上述方法制备的得到的乙酸乙酯部位浸膏，与硅胶中性氧化铝按照质量比1:3混合均匀，经50℃真空干燥、研磨后，干法上样进行中性氧化铝柱层析，依次用100%二氯甲烷，二氯甲烷：甲醇为10：1，二氯甲烷：甲醇为10：2，二氯甲烷：甲醇为2：1，二氯甲烷：甲醇为1：1洗脱，每千克新鲜番石榴叶对应的各个梯度的洗脱剂用量为5l，将二氯甲烷：甲醇=10：2得到的部位浓缩、干燥即得番石榴叶提取物4.8g。
26.对比例1新鲜番石榴叶3kg晒干后，分别用10倍量70%乙醇回流提取2次，每次1小时，合并2次提取液，过滤，减压浓缩，干燥得到总提取物120g。
27.对比例2新鲜番石榴叶3kg晒干后，分别用10倍量70%乙醇回流提取2次，每次1小时，合并2次提取液，过滤，减压浓缩至无醇，得到浓缩液3l；用1倍量石油醚萃取1次，后用0.5倍量乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯部位，减压浓缩得乙酸乙酯部位浸膏50g。
28.取上述方法制备的得到的乙酸乙酯部位浸膏，与中性氧化铝按照质量比1:3混合均匀，经50℃真空干燥、研磨后，干法上样进行中性氧化铝柱层析，依次用100%二氯甲烷，二氯甲烷：甲醇为10：1，二氯甲烷：甲醇为10：2，二氯甲烷：甲醇为2：1，二氯甲烷：甲醇为1：1洗脱，每千克新鲜番石榴叶对应的各个梯度的洗脱剂用量为5l，将100%二氯甲烷得到的部位浓缩、干燥得到提取物12g。
29.对比例3新鲜番石榴叶3kg晒干后，分别用10倍量70%乙醇回流提取2次，每次1小时，合并2次提取液，过滤，减压浓缩至无醇，得到浓缩液3l；用1倍量石油醚萃取1次，后用0.5倍量乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯部位，减压浓缩得乙酸乙酯部位浸膏50g。
30.取上述方法制备的得到的乙酸乙酯部位浸膏，与中性氧化铝按照质量比1:3混合均匀，经50℃真空干燥、研磨后，干法上样进行中性氧化铝柱层析，依次用100%二氯甲烷，二氯甲烷：甲醇为10：1，二氯甲烷：甲醇为10：2，二氯甲烷：甲醇为2：1，二氯甲烷：甲醇为1：1洗脱，每千克新鲜番石榴叶对应的各个梯度的洗脱剂用量为5l，将二氯甲烷：甲醇=10：1得到的部位浓缩、干燥即得番石榴叶提取物8.8g。
31.对比例4新鲜番石榴叶3kg晒干后，分别用10倍量70%乙醇回流提取2次，每次1小时，合并2次提取液，过滤，减压浓缩至无醇，得到浓缩液3l；用1倍量石油醚萃取1次，后用0.5倍量乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯部位，减压浓缩得乙酸乙酯部位浸膏50g。
32.取上述方法制备的得到的乙酸乙酯部位浸膏，与中性氧化铝按照质量比1:3混合
均匀，经50℃真空干燥、研磨后，干法上样进行中性氧化铝柱层析，依次用100%二氯甲烷，二氯甲烷：甲醇为10：1，二氯甲烷：甲醇为10：2，二氯甲烷：甲醇为2：1，二氯甲烷：甲醇为1：1洗脱，每千克新鲜番石榴叶对应的各个梯度的洗脱剂用量为5l，将二氯甲烷：甲醇=2：1得到的部位浓缩、干燥即得番石榴叶提取物4.8g。
33.对比例5新鲜番石榴叶3kg晒干后，分别用10倍量70%乙醇回流提取2次，每次1小时，合并2次提取液，过滤，减压浓缩至无醇，得到浓缩液3l；用1倍量石油醚萃取1次，后用0.5倍量乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯部位，减压浓缩得乙酸乙酯部位浸膏50g。
34.取上述方法制备的得到的乙酸乙酯部位浸膏，与中性氧化铝按照质量比1:3混合均匀，经50℃真空干燥、研磨后，干法上样进行中性氧化铝柱层析，依次用100%二氯甲烷，二氯甲烷：甲醇为10：1，二氯甲烷：甲醇为10：2，二氯甲烷：甲醇为2：1，二氯甲烷：甲醇为1：1洗脱，每千克新鲜番石榴叶对应的各个梯度的洗脱剂用量为5l，将二氯甲烷：甲醇=1:1得到的部位浓缩、干燥即得番石榴叶提取物4g。
35.本发明各实施例1及对比例的番石榴叶提取物分离流程图见图1。实施例21）细胞系与试剂：raw264.7（小鼠巨噬细胞）。胎牛血清、dmem培养基、rpmi-1640培养基购自上海浩然生物技术有限公司。edta胰蛋白酶、pbs缓冲液购自中国上海碧云天试剂公司。mtt试剂购自上海恩夷生物科技有限公司。lps（脂多糖）购自北京索莱宝科技有限公司。
36.2）受试药物：本发明的实施例1制得的番石榴叶提取物；对比例1-5制备的番石榴叶提取物。阳性对照药物为氢化可的松。
37.3）细胞培养及药物作用：小鼠巨噬细胞raw264.7为贴壁细胞，将细胞复苏后，用dmem培养基（含10%胎牛血清）在37℃条件下含有5%二氧化碳培养箱中对细胞进行培养，取对数生长期的细胞，用胰蛋白酶消化后调整悬液密度5
×
105个/ml，每个孔200μl接种于96孔板中，同样在37℃条件下在含有5%二氧化碳培养箱中培养1小时后，待细胞贴壁后给药，0.4μl/孔，设阳性对照氢化可的松、lps对照和含有dmso的空白对照，除空白组之外的其余组分别加入lps2μl/孔，设5个梯度，终浓度分别为100、30、10、3、1μg/ml，并且设有三个平行孔，继续在37℃条件下在含有5%二氧化碳培养箱中对细胞进行培养24小时。
38.待细胞孵育1小时后，然后将细胞与被测样品（终浓度为1、3、10、30和100μg/ml）一起培养24小时（在lps终浓度为1μg/ml），以地塞米松为阳性对照，将100μl每种上清液与相同体积的griess试剂（a和b等体积混合，a：含3%冰醋酸的0.1%1
–
萘胺溶液，b:1%的对氨基苯磺酸溶液）混合，并在室温下温育10分钟。然后用酶标仪在紫外540nm波长处测得吸光度（通过用griess试剂测定培养的小鼠巨噬细胞raw264.7上清液中的亚硝酸盐的浓度来评估no的量）。
39.用浓度分别为 6.25、12.5、25、50、100 μmol/l的nano2绘制标准曲线，通过绘制的nano2标准曲线计算no
2-的浓度以及对no释放的抑制率，最终得到ic
50
值。
40.no释放抑制率(%)=
×
100改良寇式法: lgic
50 = xm-i(p-(3-pm-pn)/4)
其中，xm：lg给药最大浓度；i：lg(给药最大浓度/相临浓度)；p：抑制率之和；pm：最大抑制率；pn：最小抑制率。
41.结果见表1表1 番石榴叶提取物及对比例1-5的外抗炎活性实验结果。