免疫测定方法及免疫测定工具与流程

1.本发明涉及一种免疫测定方法及免疫测定工具。


背景技术：

2.目前，市场上销售利用各种抗体的检查试剂。然而，在通过例如现有的rs病毒检查试剂来检测rs病毒的情况下，灵敏度不充分(专利文献1)。
3.现有技术文献
4.专利文献
5.专利文献1：日本专利第6454274号说明书


技术实现要素：

6.鉴于上述现状，本发明的目的在于提供一种高灵敏度免疫测定方法、及使用其的检查试剂。
7.本发明人等发现，通过在固定化抗原、抗体或其抗原结合性片段时添加二糖类及糖醇类，可以提高检测灵敏度，从而完成了本发明。
8.即，本发明如下所述。
9.[1]一种免疫测定方法，通过使用固定化有抗原、抗体或其抗原结合性片段的载体的免疫测定方法对测定对象进行检测，其中，向包含抗原、抗体或其抗原结合性片段的溶液中添加二糖类及糖醇类，将抗原、抗体或其抗原结合性片段固定化于载体，通过使用该载体提高检测灵敏度而对测定对象进行检测。
[0010]
[2]根据[1]所述的方法，其中，向包含抗原、抗体或其抗原结合性片段的溶液中添加1～4％(w/v)的二糖类及0.5～4％(w/v)的糖醇类，将抗原、抗体或其抗原结合性片段固定化于载体。
[0011]
[3]根据[1]或[2]所述的方法，其中，二糖类为海藻糖或麦芽糖。
[0012]
[4]根据[1]～[3]中任一项所述的方法，其中，糖醇类为甘露醇或山梨糖醇。
[0013]
[5]根据[1]～[4]中任一项所述的方法，其中，所述方法为免疫层析法。
[0014]
[6]根据[1]～[5]中任一项所述的方法，其中，抗体或其抗原结合性片段为抗rs病毒n蛋白质抗体或其抗原结合性片段。
[0015]
[7]一种提高了检测灵敏度的检测用试剂，固定化有抗原、抗体或其抗原结合性片段，在包含抗原、抗体或其抗原结合性片段的检测区域包含二糖类及糖醇类。
[0016]
[8]根据[7]所述的检测用试剂，其中，二糖类为海藻糖或麦芽糖。
[0017]
[9]根据[7]或[8]所述的检测用试剂，其中，糖醇类为甘露醇或山梨糖醇。
[0018]
[10]根据[7]～[9]中任一项所述的检测用试剂，其中，所述检测用试剂为免疫层析法试剂。
[0019]
[11]根据[7]～[10]中任一项所述的检测用试剂，其中，抗体或其抗原结合性片段为抗rs病毒n蛋白质抗体或其抗原结合性片段。
[0020]
[12]一种检测用试剂的制造方法，是检测灵敏度提高的固定化有抗原、抗体或其抗原结合性片段的检测用试剂的制造方法，所述制造方法向包含抗原、抗体或其抗原结合性片段的溶液中添加二糖类及糖醇类而固定化抗原、抗体或其抗原结合性片段。
[0021]
[13]根据[12]所述的制造方法，其中，向包含抗原、抗体或其抗原结合性片段的溶液中添加1～4％(w/v)的二糖类及0.5～4％(w/v)的糖醇类，将抗原、抗体或其抗原结合性片段固定化于载体。
[0022]
[14]根据[12]或[13]所述的制造方法，其中，二糖类为海藻糖或麦芽糖。
[0023]
[15]根据[12]～[14]中任一项所述的制造方法，其中，糖醇类为甘露醇或山梨糖醇。
[0024]
[16]根据[12]～[15]中任一项所述的制造方法，其中，检测用试剂为免疫层析法试剂。
[0025]
[17]根据[12]～[16]中任一项所述的制造方法，其中，抗体或其抗原结合性片段为抗rs病毒n蛋白质抗体或其抗原结合性片段。
[0026]
本说明书包括作为本技术的优先权的基础的日本专利申请号2019-224865号的公开内容。
[0027]
本发明的方法中，向包含抗原、抗体或其抗原结合性片段的溶液中添加二糖类及糖醇类，将抗原、抗体或其抗原结合性片段固定化于载体，免疫测定时使用该载体，因此灵敏度高。另外，本发明还提供用于本发明的新型检测方法的免疫测定工具。
具体实施方式
[0028]
本发明是对测定对象进行检测的免疫测定方法，在载体上固定化抗原、抗体或其抗原结合性片段，通过经固定化的载体捕捉待测蛋白质，并检测捕捉到的待测蛋白质。
[0029]
作为通过本发明的方法进行检测的测定对象，可列举：流感病毒抗原、腺病毒抗原、rs病毒抗原、ha抗原、hbc抗原、hcv抗原、hiv抗原、ebv抗原、nlv抗原等病毒抗原、沙眼衣原体抗原、链球菌抗原、百日咳菌抗原、幽门螺旋杆菌抗原、钩端螺旋体抗原、梅毒螺旋菌抗原、弓形虫抗原、疏螺旋体抗原、炭疽菌抗原、mrsa抗原等细菌抗原、支原体脂质抗原、人绒毛膜促性腺激素等肽激素；类固醇激素等类固醇；肾上腺素及吗啡等生物活性胺类；维生素b类等维生素类；前列腺素类、四环素等抗生素；细菌等所产生的的毒素、各种肿瘤标志物、农药、抗大肠杆菌抗体、抗沙门氏菌抗体、抗葡萄球菌抗体、抗弯曲杆菌抗体、抗产气荚膜梭菌抗体、抗副溶血性弧菌抗体、抗维罗毒素抗体、抗人转铁蛋白抗体、抗人白蛋白抗体、抗人免疫球蛋白抗体、抗微球蛋白抗体、抗crp抗体、抗肌钙蛋白抗体、抗hcg抗体、抗沙眼衣原体抗体、抗链球菌溶血素o抗体、抗幽门螺旋杆菌抗体、抗β-葡聚糖抗体、抗hbe抗体、抗hbs抗体、抗腺病毒抗体、抗hiv抗体、抗轮状病毒抗体、抗流感病毒抗体、抗细小病毒抗体、抗rs病毒抗体、抗rf抗体、与来自病原微生物的核酸成分互补的核苷酸等，但并不限定于此。
[0030]
下面，列举rs病毒作为测定对象进行说明。
[0031]
在测定对象为例如rs病毒的情况下，作为抗体或其抗原结合性片段，使用抗rs病毒抗体。
[0032]
在本发明中，抗rs病毒抗体是特异性识别rs病毒的抗体，具体而言，将rs病毒的蛋白质特别性识别作抗原并与其结合。作为rs病毒的蛋白质，可列举与细胞融合相关的f蛋白
质、n蛋白质等。n蛋白质也被称作核蛋白质，由391个氨基酸残基构成。n蛋白质是被称为核衣壳的核糖核蛋白复合物的构成成分，围绕rs病毒的基因组rna形成螺旋结构。优选使用针对抗rs病毒抗体n蛋白质的抗体。
[0033]
本发明中，在将抗rs病毒抗体固定化于载体时添加二糖类及糖醇类，由此可以提高rs病毒的检测灵敏度。
[0034]
作为二糖类，可列举：海藻糖、麦芽糖。
[0035]
作为糖醇类，可列举：甘露醇、山梨糖醇。
[0036]
向用于固相化的抗rs病毒抗体溶液中添加二糖类及糖醇类即可。抗rs病毒抗体溶液通过将抗体溶解于磷酸缓冲液、磷酸缓冲生理盐水(pbs)等缓冲液来制备。此时抗体浓度为数十pg/ml～数g/ml。二糖类的浓度为0.5～10％(w/v)，优选为1～5％(w/v)，进一步优选为1～4％(w/v)，特别优选为1～3％(w/v)。糖醇的浓度为0.2～10％(w/v)，优选为0.5～5％(w/v)，进一步优选为0.5～4％(w/v)，特别优选为0.5～3％(w/v)。将这些溶液作为线形涂布在载体上并将干燥即可。
[0037]
通过向抗体溶液中添加二糖类及糖醇并固定化，与不添加二糖类及糖醇的情况相比，rs病毒抗原的检测灵敏度提高1.5倍以上，优选1.75倍以上，进一步优选2倍以上。
[0038]
本发明中，基于rs病毒抗体仅将抗原结合位点分离而得到的抗原结合性片段也可以用于本发明的方法。即，在使用通过公知的方法制作的fab、fab’、f(ab’)2、单链抗体(scfv)、dsfv、双特异性抗体即diabody、微型抗体即minibody等具有特异性抗原结合性的片段(抗原结合性片段)的情况下，这些片段也包括在单克隆抗体中，属于本发明的范围。另外，单克隆抗体的类别不限定于igg，也可以为igm及igy。
[0039]
使用公知的免疫学方法，用包含目标抗原的复合物及提取物、或者抗原或其部分肽对被免疫动物进行免疫，使用被免疫动物的细胞制作杂交瘤，由此能够获得本发明的方法中使用的单克隆抗体。用于免疫的肽的长度不受特别限定，可以使用优选为5氨基酸以上，更优选为10氨基酸以上的肽作为免疫原。免疫原也可以从培养液中获得，还可以通过将复制任意抗原的dna整合于质粒载体，并将其导入宿主细胞并表达来获得免疫原。还可以将作为免疫原的任意的抗原或其部分肽与如下所示的蛋白质形成融合蛋白质并表达，精制后或未精制直接用作免疫原。制作融合蛋白质时，能够利用本领域技术人员常用作“蛋白质表达/精制标签”的谷胱甘肽s-转移酶(gst)、麦芽糖结合蛋白质(mbp)、硫氧还蛋白(trx)、nus标签、s标签、hsv标签、frag标签、多组氨酸标签等。优选地，与这些的融合蛋白质可以在使用消化酶将任意的抗原或者其部分肽部分与此外的标签部分切断并分离精制后用作免疫原。
[0040]
从经免疫的动物中制备单克隆抗体时，能够通过熟知的凯氏法(kohler et al.,nature,vol,256,p495-497(1975))容易地来进行。即，从经免疫的动物中回收脾细胞及淋巴细胞等产抗体细胞，通过常规方法将这些细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合，制得杂交瘤，通过极限稀释法等克隆所得到的杂交瘤，从所克隆的各杂交瘤产生的单克隆抗体中选择会与用于动物免疫的抗原产生抗原抗体反应的单克隆抗体。
[0041]
从腹水及培养上清中精制单克隆抗体时，能够使用公知的免疫球蛋白精制法。可列举例如：利用硫酸铵及硫酸钠通过盐析所进行的分离法、peg分离法、乙醇分离法、deae离子交换色谱法、凝胶过滤法等。另外，根据免疫动物物种和单克隆抗体的类别，也可以使用
亲和层析法来精制，其中，亲和层析法中使用结合有蛋白质a、蛋白质g、蛋白质l中任意一种的载体。
[0042]
在本发明的免疫测定方法中，通过免疫测定进行测定，所述免疫测定利用了如上制作的单克隆抗体或其抗原结合性片段(下面，在实施例之前的叙述中，只要上下文中没有明显相反的说明，则“抗体”表示“抗体或其抗原结合性片段”)与标本中的抗原之间的抗原抗体反应。作为用于其的免疫测定法，也可以使用竞争法、凝聚法、蛋白质印迹法、免疫染色法、夹心法等本领域技术人员熟知的任意方法。需要指出，在本发明中，定量、半定量、检测均属于“测定”。
[0043]
免疫测定优选夹心法。在夹心法中，通过两个抗体夹持抗原的形式形成复合物，并检测该复合物。夹心法本身是免疫测定领域熟知的方法，能够通过例如免疫层析法及elisa法来进行。这些夹心法本身都是熟知的方法，本发明的方法除使用上述的将n蛋白质识别作抗原的单克隆抗体之外，还可以通过熟知的夹心法来进行。
[0044]
夹心法使用识别抗原的一种或两种以上抗体(固定化于固相的抗体和标记抗体)。在使用两种以上抗体的情况下，以上两种抗体中的至少任意一种是上述的将n蛋白质识别作抗原的单克隆抗体。另外，也可以通过相同的两个抗体夹持抗原来形成复合物。
[0045]
在以夹心法为检测原理的免疫测定中，作为供抗体固定化的固相，可以使用能够通过公知技术固定抗体的任意物品，例如，可以任意选择具有毛细管作用的多孔薄膜(膜片)、粒子状物质、试管、树脂平板等公知的物品。另外，作为标记抗体的物质，能够使用酶、放射性同位素、荧光物质、发光物质、有色粒子、胶体粒子等。在利用前述各种材料的免疫测定法中，特别是从临床检查的简便性和快速性的观点出发，优选免疫层析法，即利用膜片的侧流式免疫测定法。
[0046]
本发明中，本发明人等还提供一种免疫测定工具，该工具能够进行侧流式免疫测定，侧流式免疫测定可以通过在固定化抗rs病毒抗体时添加二糖类及糖醇类来提高rs病毒的检测灵敏度。本发明提供的免疫测定工具由下述组件构成：载体，具有固定化有抗体(抗体1)的检测区域，抗体用于捕捉测定对象物(抗原)；标记体区域，具有可移动的标记抗体(抗体2)；样品垫，标本滴加于样品垫；吸收带，吸收展开后的标本液；及衬背板，用于将以上部件贴合为一体，抗体1及抗体2中的至少一者是将本发明的n蛋白质识别作抗原的单克隆抗体。该免疫测定工具也称为免疫层析试件。
[0047]
载体是具有固定化用于捕捉被检测物质(抗原)的抗体的性能的材料，并具有不会妨碍液体沿水平方向通行的性能。优选为具有毛细管作用的多孔薄膜，其材料可以通过吸收来输送液体及分散于液体中的成分。组成载体的材质不受特别限定，可列举例如：纤维素、硝基纤维素、纤维素乙酸酯、聚偏二氯乙烯(pvdf)、玻璃纤维、尼龙、聚酮等。其中，更优选使用硝基纤维素制成薄膜。将固定化有抗体的膜片称为抗体固定化膜片。
[0048]
标记体区域由包含标记抗体的多孔基材构成，基材的材质能够使用常用的玻璃纤维及无纺布等。该基材要含浸大量的标记抗体，故优选为厚度0.3mm～0.6mm左右的垫状。将将含浸标记抗体并使其干燥后的多孔基材称为干燥垫。
[0049]
标记抗体的标记多使用诸如碱性磷酸酶及辣根过氧化物酶之类的酶、诸如金胶体之类的金属胶体、二氧化硅粒子、纤维素粒子、着色聚苯乙烯粒子及着色胶乳粒子等。在使用金属胶体粒子、着色聚苯乙烯粒子及着色胶乳粒子等着色粒子的情况下，由于这些标记
试剂凝聚而产生着色，因此测定该着色。将固定化有抗体的粒子称为抗体固定化粒子。抗体的固定化量不受特别限定，在标记区域内存在数ng～数十μg即可。
[0050]
检测区域是指固定化有捕捉被检测物质(抗原)的抗体的载体的部分区域。检测区域至少设置一个固定化有用于捕捉抗原的抗体的区域。检测区域只要包含于载体即可，并且只要在载体上固定化抗体即可。如山所述，在检测区域固定化抗rs病毒抗体时，向抗rs病毒抗体溶液中添加二糖类及糖醇类。抗体的固定化量不受特别限定，检测区域内固定化数ng～数十μg即可。本发明的检测区域以可检测方式包含有二糖类及糖醇。
[0051]
样品垫是用于滴加标本的部位，采用多孔材料。样品垫是位于免疫测定工具的最上游的部位。该材料能够使用常用的滤纸、玻璃纤维、无纺布等。为了将大量标本用于免疫测定，优选为厚度0.3mm～1mm左右的垫状。标本中也包括使用标本所制备的样本，例如将标本悬浮于其它溶液中而得到的样本等。
[0052]
吸收带是用于吸收供给至载体但在检测区域不参与反应的成分的部件。吸收带的材料能够使用由普通天然高分子化合物、合成高分子化合物等构成的保水性较高的滤纸、海绵等，但为了促进标本展开，优选吸水性较高的材料。
[0053]
衬背板是供前述的全部材料、即载体、样品垫、标记体区域、吸收带等部分的重叠地粘贴、固定的部件。只要这些材料按照最佳的间隔配置、固定即可，衬背板并不是必须的，但从制造或者的便利性考虑，通常优选使用衬背板。
[0054]
本发明的免疫测定工具中还可以进一步存在对照显示区域(部件)。对照显示区域是显示已正确实施试验的部位。例如，对照显示区域存在于检测区域的下游，当标本样本通过检测区域并到达对照显示区域时，通过着色等发出信号。对照显示区域中可以预先固相化有与结合有标记载体的抗体结合的物质，也可以预先固相化有标本达到后颜色产生变化的ph指示剂等试剂。在结合有标记载体的抗体为小鼠单克隆抗体的情况下，使用抗小鼠igg抗体即可。
[0055]
免疫测定工具的大小不受限定，例如为长数cm～十数cm、宽数mm～数cm左右。
[0056]
本发明的免疫测定工具可以收纳在储存容器内，通过该储存容器，能够防止例如紫外线及空气中的湿气导致劣化。另外，在使用具有汚染性、感染性的标本样本的情况下，能够通过储存容器来防止进行测定的测试者被汚染或感染。例如只要将适当大小的树脂外壳用作储存容器，并将本发明的工具收纳在该外壳中即可。有时将储存容器和收纳在其中的免疫测定工具整体称为免疫测定器件。
[0057]
本发明的包含抗rs病毒n蛋白质单克隆抗体的rs病毒检测用试剂包括所述免疫测定工具。另外，本发明的包含抗rs病毒n蛋白质单克隆抗体的rs病毒检测用试剂盒包括所述免疫测定工具。该试剂盒还可以包括宣传册、标本采集工具等。
[0058]
该方法中，利用毛细管现象，使抗体2和被检测物质的复合物在固定有抗体1的固相载体上展开，抗体2能够与被检测物质(标记试剂)结合，被检测物质被有色聚苯乙烯粒子及金胶体等适当的标记物质标记。结果，固相载体上形成固定化的物质-被检测物质-标记试剂的复合物，通过检测由该复合物发出的标记试剂的信号(使用金胶体时，固定化有能够与被检测物质结合的物质的固相载体部分变红)，能够检测被检测物质。该免疫测定方法能够在5～35℃、优选室温下进行。
[0059]
通过本发明的方法，能够检测是否感染了rs病毒，在被标本样本中检测到n蛋白质
的情况下，可以判断已感染rs病毒。
[0060]
在使用本发明的识别n蛋白质的抗体的情况下，能够特异性识别rs病毒，识别n蛋白质的抗体不识别例如腺病毒(adenovirus)、克沙奇病毒(coxsackievirus)、埃可病毒(echo virus)、单纯疱疹病毒(herpes simplex virus)、人偏肺病毒(human metapneumovirus)、流感病毒(influenza virus)、麻疹病毒(measles virus)、腮腺炎病毒(mumps virus)、副流感病毒(parainfluenza virus)等其它病毒，因此不会错误地检测到这些病毒。
[0061]
另外，在使用本发明的识别rs病毒的n蛋白质的抗体的情况下，也能够检测使用识别rs病毒的f蛋白质的抗体时检测不到的临床分离株。
[0062]
作为被标本样本，使用喉咙或者鼻腔拭子、喉咙或者鼻腔清洗液、鼻腔吸引液、唾液、血清、直肠拭子、大便、大便悬浮液、尿液、角膜拭子等作为标本即可。
[0063]
实施例
[0064]
下面，基于实施例对本发明进行更具体说明。但是，本发明并不限定于下述实施例。
[0065]
实施例1抗rs病毒n蛋白质单克隆抗体的制作
[0066]
1.rs病毒n蛋白质抗原的制备
[0067]
用rs病毒感染敏感的哺乳类细胞，培养数天后，通过照射紫外线将rs病毒感染细胞的培养液灭活后备用。
[0068]
2.rs病毒n蛋白质单克隆抗体的制作
[0069]
用1.中的rs病毒灭活抗原免疫balb/c小鼠，从饲养一定时间后的小鼠中提取髂骨淋巴结，通过“小鼠髂骨淋巴结法”(sado y et al.,acta histochem.cytochem.39:89-94(2006))得到多个产生抗rs病毒n蛋白质抗体的杂交瘤细胞株。
[0070]
将获得的细胞株腹腔给药于经普利司坦处理的balb/c小鼠，约2周后，采集含抗体腹水。使用蛋白质a色谱柱，通过亲和层析法从得到的腹水中精制igg，得到多个精制抗rs病毒n蛋白质单克隆抗体(下面，有时也称为“抗n蛋白质抗体”)。
[0071]
在下面的实施例中，考虑到反应性及特异性，从得到的多个抗rs病毒n蛋白质单克隆抗体中选用抗体。
[0072]
实施例2测定rs病毒的免疫测定工具
[0073]
1.向硝基纤维素膜片固定化抗rs病毒n蛋白质抗体
[0074]
准备实施例1中制作的抗n蛋白质抗体用缓冲液稀释而得到的液体、及抗小鼠igg抗体，在用pet膜支撑的硝基纤维素膜片的样品垫侧线形涂布抗n蛋白质抗体，在吸收体侧线形涂布抗小鼠igg抗体。然后，将硝基纤维素膜片在温风下充分干燥，得到抗n蛋白质抗体固定化膜片。
[0075]
2.向有色聚苯乙烯粒子固定化抗rs病毒n蛋白质抗体
[0076]
将实施例1中制作的抗n蛋白质抗体共价结合于有色聚苯乙烯粒子，并悬浮于浮游液，通过超声波处理将其充分分散，得到抗n蛋白质抗体结合有色聚苯乙烯粒子。在本说明书中，称为抗n蛋白质抗体固定化粒子。
[0077]
3.抗rs病毒n蛋白质抗体结合有色聚苯乙烯粒子的涂布及干燥
[0078]
在玻璃纤维无纺布上涂布规定量2中制作的抗体固定化粒子，用温风充分干燥。在
流感病毒a/北京/262/95(h1n1)-流感病毒a/纽约/55/2004(h3n2)-流感病毒a/广岛/52/2005(h3n2)-流感病毒b/上海361/2002(山形系)-流感病毒b/马来西亚2506/2004(维多利亚系)-麻疹病毒-腮腺炎病毒-副流感病毒1型-副流感病毒2型-副流感病毒3型-副流感病霉4型-[0087]
如表1所示，使用本发明的抗rs病毒n蛋白质抗体的免疫测定工具虽然与rs病毒反应，但相对于其它引发呼吸道感染的病毒不显示交叉反应性，因此，确认其与rs病毒特异性反应。
[0088]
实施例3使用抗rs病毒n蛋白质单克隆抗体的高灵敏度rs病毒检查器件
[0089]
与使用抗rs病毒f蛋白质单克隆抗体(抗f蛋白质抗体)制作的检查器件相比，使用实施例2中制作的抗n蛋白质抗体的rs病毒检查器件的rs病毒抗原检测灵敏度低。
[0090]
通过在实施例21.中向硝基纤维素膜片固定化抗n蛋白质抗体时添加二糖类及糖醇类，获得与使用抗f蛋白质抗体的检查器件相同的灵敏度。
[0091]
1.高灵敏度化抗n蛋白质抗体固定化膜片的制作
[0092]
实施例21.中，向固定化抗n蛋白质抗体时的缓冲液中添加2％(w/v)的海藻糖作为二糖类，并添加1.0～2.0％(w/v)的甘露醇，然后将其线形涂布于硝基纤维素膜片，接着将硝基纤维素膜片在温风下充分干燥，得到高灵敏度化抗n蛋白质抗体固定化膜片。
[0093]
2.高灵敏度化抗n蛋白质抗体固定化膜片的评价
[0094]
使用高灵敏度化抗n蛋白质抗体固定化膜片，通过实施例24.中记载的方法制备rs病毒检查器件，使用rs病毒抗原的2倍系列稀释液，按照实施例2 5.中记载的方法进行试验，并将试验结果示于表2。
[0095]
当在抗小鼠igg抗体及抗n蛋白质抗体两者的涂布位置目测可见显色时，判定为 。当仅在抗小鼠igg抗体的涂布位置目测可见显色、而在抗n蛋白质抗体的涂布位置目测未见显色时，判定为-。另外，当在抗小鼠igg抗体的涂布位置目测未见显色时，判定为无效。
[0096]
[表2]
[0097][0098]
确认通过添加二糖类及甘露醇将灵敏度提升2倍。
[0099]
工业可用性
[0100]
使用本发明的抗体，能够高灵敏度地特异性检测rs病毒感染症。
[0101]
本说明书中引用的所欲出版物、专利及专利申请直接通过引用结合在本说明书中。