鱼用饲料添加剂配方及其制备和使用方法与流程

鱼用饲料添加剂配方及其制备和使用方法
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求于2019年8月30日提交的美国临时专利申请no.62/893,832的优先权，其全部内容通过引用并入本文。
技术领域
3.本公开的主题总体上涉及鱼用饲料添加剂配方以及制造和使用该公开配方的方法。


背景技术：

4.几十年来，动物生产一直依赖抗生素生长促进剂(agp)来维持动物健康和提高生产力。随着许多国家将agp从动物生产中去除，生产者尝试使用各种饲料添加剂，例如有机酸、酶和益生菌，但其功效水平不同且结果不一致。特别是，目前市场上使用的许多酶和益生菌产品价格昂贵，并且当用于工业饲料和动物生产过程中时已被证明是不稳定的。此外，牲畜生产者试图通过利用替代饲料成分，或通过补充各种饲料添加剂来替代昂贵的营养物质，以降低饲料成本。在水产生产中受到关注的一种重新配方的策略是减少食粮能量，同时补充糖酶和/或直接饲喂微生物(dfm)，以及可以提高饲料营养价值、消化率和利用率的添加剂。木聚糖酶和dfm的组合使用已被证明可以改善家禽和猪的肠道功能和养分消化率，从而提高生产性能并节省饲料成本。然而，木聚糖酶和dfm的组合尚未被作为鱼饲料或鱼饲料添加剂的成分而使用。当酶和益生菌的组合添加到鱼饲料中时，将有益于改善鱼的生产性能特征。


技术实现要素：

5.在一些实施例中，本公开的主题涉及鱼用饲料的饲料添加剂配方。特别地，该配方包含分离的木聚糖酶和地衣芽孢杆菌(bacillus licheniformis)菌株pwd-1(登录号no.53757)或具有其所有鉴定特征的突变体的生物纯培养物。在一些实施例中，该配方还包含解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)菌株ba-bpd1(登录号no.dsm 21836)或具有其所有鉴定特征的突变体的生物纯培养物。
6.在一些实施例中，本公开的主题涉及鱼用饲料组合物，其包含分离的木聚糖酶和地衣芽孢杆菌菌株pwd-1(登录号no.53757)或具有其所有鉴定特征的突变体的生物纯培养物。在一些实施例中，饲料组合物还包含解淀粉芽孢杆菌菌株ba-bpd1(登录号no.dsm 21836)或具有其所有鉴定特征的突变体的生物纯培养物。
7.在一些实施例中，本公开的主题涉及提高鱼性能的方法。该方法包括向鱼施用有效量的饲料组合物，该饲料组合物包含木聚糖酶和地衣芽孢杆菌菌株pwd-1(登录号no.53757)或具有其所有鉴定特征的突变体的生物纯培养物。在该方法的一些实施例中，饲料组合物还包含解淀粉芽孢杆菌菌株ba-bpd1(登录号no.dsm 21836)或具有其所有鉴定特征的突变体的生物纯培养物。
8.在一些实施例中，本公开的主题涉及制备鱼用饲料组合物的方法。特别地，该方法包括向饲料组合物中添加以下配方：包含木聚糖酶和地衣芽孢杆菌菌株pwd-1(登录号no.53757)或具有其所有鉴定特征的突变体的生物纯培养物。在该方法的一些实施例中，该配方还包含解淀粉芽孢杆菌菌株ba-bpd1(登录号no.dsm 21836)或具有其所有鉴定特征的突变体的生物纯培养物。
附图说明
9.图1a是3次琼脂扩散试验的照片，显示了无害李斯特菌和地衣芽孢杆菌菌株pwd-1之间的相互作用。
10.图1b是3次琼脂扩散试验的照片，显示了肠沙门氏菌和地衣芽孢杆菌菌株pwd-1之间的相互作用。
11.图2a是3次琼脂扩散试验的照片，显示了大肠杆菌和解淀粉芽孢杆菌菌株ba-bpd1之间的相互作用。
12.图2b是3次琼脂扩散试验的照片，显示了肠沙门氏菌和解淀粉芽孢杆菌菌株ba-bpd1之间的相互作用。
13.图2c是3次琼脂扩散试验的照片，显示了无害李斯特菌和解淀粉芽孢杆菌菌株ba-bpd1之间的相互作用。
14.图3a是说明地衣芽孢杆菌菌株pwd-1在ph 3.0下孵育0、1、2或3小时后的24小时生长线图。
15.图3b是说明解淀粉芽孢杆菌菌株ba-bpd1在ph 3.0下孵育0、1、2或3小时后的24小时生长线图。
具体实施方式
16.现将在下文中参考附图更全面地描述本公开的主题，其中示出了一些(但不是全部)实施例。本领域技术人员受益于前文描述和相关附图中呈现的教导，将想到本文阐述的本公开主题的许多修改和其他实施例。因此，应当理解，本公开的主题不限于公开的具体实施例，并且修改和其他实施例也旨在包括在所附权利要求的范围内。
17.除非另有定义，否则本文使用的所有技术术语与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。
18.遵循长期存在的专利法惯例，术语“一个(a)”、“一个(an)”和“该(the)”在本技术中包括在权利要求中使用时是指一个或多个。因此，例如，提及“一种蛋白质”包括了多种蛋白质，除非上下文明显矛盾。
19.为了本说明书和所附权利要求的目的，术语“约(about)”在与一个或多个数值或数值范围结合使用时，应理解为指所有这些数值，包括范围内的所有数值，以及通过扩展该数值的上下边界来修改的数值范围。通过端点陈述的数值范围包括包含在该范围内的所有数值，例如整数，包括其分数(例如，1至5的引用包括1、2、3、4和5，以及其分数，例如1.5、2.25、3.75、4.1等)和该范围内的任何范围。
20.在整个本说明书和权利要求中，术语“包括(comprise)”、“包括(comprises)”和“包括(comprising)”以非排他的意义使用，除非上下文另有要求。同样，术语“含有
(include)”和“具有(have)”以及其语法变体旨在为非限制性的，使得列表中陈述的项目不排除其他类似的项目，这些项目可以替换或添加到所列项目中。
21.本公开的主题涉及用于鱼饲料的饲料添加剂配方。特别地，该公开的配方包含分离的木聚糖酶和至少一种微生物益生菌菌株地衣芽孢杆菌pwd-1(登录号no.53757)，或其具有其所有鉴定特征的突变体。配方的实施例在no.wo 2018/165252的国际申请公开文本中有所描述，其通过引用整体并入本文。该公开的配方可以添加到鱼饲料中，从而产生意想不到的对鱼特性的协同改善，详见下文的描述。
22.wo 2018/165252描述了使用其描述的配方作为动物饲料的添加剂，特别是单胃动物饲料的添加剂。令人惊讶的是，如本文所述，相同的配方可用于补充鱼饲料以改善鱼的特性。鱼类的解剖结构与哺乳动物有很大不同。例如，鱼类缺乏在哺乳动物中发现的几种器官，例如胰腺、明显的肾上腺、淋巴结、肺、骨髓和甲状旁腺。鱼类中可能存在其他器官，但在形式和功能上与其在哺乳动物的对应物明显不同，例如肾脏、性腺、皮肤、心脏。此外，鱼类中还存在其他解剖特征，但不存在于哺乳动物或鸟类中。这些包括鳍、侧线器官、鱼鳔和鳃。因此，出乎意料的是，在兽类中提供改善特征的配方也会在鱼中提供改善特征。
23.鳃和肾脏构成了鱼类的主要排泄器官。鱼类氮代谢的最终产物是氨。鳃可以排出高达75％的氨负荷。有些鱼也有膀胱。虽然有些鱼有功能齐全的胃，但其他一些鱼的胃缺乏组织学分化，只纯粹用作储存器官。一般来说，草食性鱼的胃肠道比肉食性鱼更长。由于鱼是变温动物，因此其消化非常依赖于环境(水)温度。
24.鳃是主要的排泄器官之一。鳃排出大部分氨，而其余的废物则通过肾脏排出。所有鱼的代谢废物排泄都相似；然而，肾脏和鳃在淡水鱼中的作用与它们在咸水鱼中的作用不同。
25.与环境相比，淡水鱼是高渗的。直接的后果是，水不断地通过鳃进入鱼的身体并稀释血液。因此，在淡水鱼中，肾脏的主要作用是清除循环系统中多余的水分。此外，在消除过程中必须保存电解质。因此淡水鱼的肾脏内有相对较大的肾小球。海洋鱼类的情况正好相反。与海洋环境相比，咸水鱼是低渗的。海鱼经常需要喝水，因为水不断地从鳃中流失到环境中。因此，肾脏的主要工作是保存水分和消除电解质。出于该原因，某些海鱼肾脏的肾小球退化。
26.因此，该公开的饲料添加剂配方包含作为基本组分的分离的木聚糖酶。本文使用的术语“木聚糖酶”是指一类将线性多糖β-1,4-木聚糖降解成木糖从而分解半纤维素(植物细胞壁主要组分之一)的酶。在一些实施例中，木聚糖酶是内切-1,4-β-木聚糖酶。本文使用的术语“分离的”是指基本上纯的(即，不含杂质分子)的酶。
27.适用于该公开配方的木聚糖酶可以使用本领域已知的方法生产。例如，在一些实施例中，木聚糖酶可以通过固体或液体培养产生，包括分批、补料分批和连续流加工艺。可选地或额外地，木聚糖酶可以是任何可商购的木聚糖酶。木聚糖酶可以作为液体或干燥(粉末)制剂提供。
28.木聚糖酶可以从本领域已知或使用的任何合适的来源获得，例如从选自芽孢杆菌属(bacillus)、链霉菌属(streptomyces)、梭菌属(clostridium)、高温单孢菌属(thermonospora)、木霉属(trichoderma)、嗜热菌属(thermomyces)、曲霉属(aspergillus)、青霉属(penicillium)、小四孢菌属(microtetra-spora)、瘤胃球菌属
(ruminococcus)等的细菌获得。可选地或作为补充额外地，木聚糖酶可以从选自木霉属(trichoderma)、曲霉属(aspergillus)、腐质霉属(humicola)、新美鞭菌属(neocallimastix)等的真菌获得。
29.在一些实施例中，木聚糖酶在鱼胃肠道中的ph和温度下或接近的条件下是稳定和有活性的。
30.该公开的配方还包含地衣芽孢杆菌菌株pwd-1(登录号no.53757)或具有其所有鉴定特征的突变体的生物纯培养物。地衣芽孢杆菌菌株pwd-1在美国专利no.4,908,220和no.4,959,311中有所描述，其全部公开内容通过引用并入本文。在一些实施例中，该公开的配方还包含解淀粉芽孢杆菌菌株ba-bpd1(登录号no.dsm 21836)或具有其所有鉴定特征的突变体的生物纯培养物。解淀粉芽孢杆菌菌株ba-bpd1在美国专利申请no.2010/0143316中有所描述，其全部内容通过引用并入本文。
31.术语“生物纯培养物”是指在物理上从不同特性的微生物中分离的培养物。如本文所用，短语“细菌菌株的生物纯培养物”是指以下的一种或组合：细菌菌株的生物纯发酵培养物的孢子、细菌菌株的生物纯发酵培养物的营养细胞、细菌菌株生物纯发酵培养物的一种或多种产物、细菌菌株生物纯发酵培养物的培养固体、细菌菌株生物纯发酵培养物的培养上清液、细菌菌株生物纯发酵培养物的提取物、以及细菌菌株生物纯发酵培养物的一种或多种代谢物。
32.如本文所用，术语“突变体”是指源自亲本菌株(即地衣芽孢杆菌菌株pwd-1或解淀粉芽孢杆菌菌株ba-bpd1)的遗传变体。在一些实施例中，突变体表现得与亲本菌株一样好或更好(例如，与亲本菌株一样或更好地维持或改善动物的生长)。
33.地衣芽孢杆菌和/或解淀粉芽孢杆菌菌株可以从研究实验室或从培养物保藏中心获得。可以使用本领域已知的方法产生生物纯培养物，例如通过使用无菌技术和在适当条件(即ph、温度、氧水平等)下在特异性培养基中培养。
34.本公开的实施例1和2显示了地衣芽孢杆菌菌株pwd-1和解淀粉芽孢杆菌菌株ba-bpd1抑制人和动物病原体的生长，这些病原体包括无害李斯特菌、大肠杆菌和肠沙门氏菌。图1a和1b分别说明地衣芽孢杆菌菌株pwd-1的生长超过了无害李斯特菌和沙门氏菌。图2a和2b分别说明解淀粉芽孢杆菌菌株ba-bpd1抑制了大肠杆菌和肠沙门氏菌的生长。图2c说明解淀粉芽孢杆菌菌株ba-bpd1的生长超过了无害李斯特菌。
35.本公开的实施例3显示了地衣芽孢杆菌菌株pwd-1和解淀粉芽孢杆菌菌株ba-bpd1对酸性环境具有抗性，这是益生菌微生物的重要特征，因为微生物菌株在进入肠道之前会暴露于动物胃肠道中苛刻的酸性环境。如图3a所示，与中性培养基相比，地衣芽孢杆菌菌株pwd-1暴露于酸性环境中会使其生长延迟3小时。还观察到地衣芽孢杆菌菌株pwd-1暴露于酸性环境1、2和3小时后能够恢复并呈现生长。如图3b所示，解淀粉芽孢杆菌菌株ba-bpd1也能从酸暴露中恢复，但比观察到的地衣芽孢杆菌菌株要慢。
36.本文提供了用于添加到鱼用饲料组合物中的饲料添加剂配方。提供的饲料添加剂配方添加到饲料组合物中，从而改善鱼(例如尼罗罗非鱼)的健康和/或性能。性能上的提高包括以下的一项或组合：改善的体重、改善的生长性能、比生长速率、饲料转化率、蛋白质效率、全身养分保留(包括蛋白质和能量的保留)，以及养分消化率。病原体包括但不限于以下的一种或组合：产气荚膜梭菌(clostridium perfringens)、艾美属球虫(eimeria spp.)、
堆型艾美球虫(eimeria acervulina)、巨型艾美球虫(eimeria maxima)、柔嫩艾美球虫(eimeria tenella)、沙门氏菌(salmonella)或引起球虫病的寄生虫。在一个实施例中，该动物是鱼，并且性能的提高包括以下的一项或多种：改善的体重、改善的生长性能、比生长速率、饲料转化率、蛋白质效率、全身养分保留、蛋白质和能量的保留，以及养分消化率。
37.在一个实施例中，提供了鱼用饲料的饲料添加剂配方，其包含分离的木聚糖酶和地衣芽孢杆菌菌株pwd-1(登录号no.53757)或其具有其所有鉴定特征的突变体的生物纯培养物。该饲料添加剂配方还可包含解淀粉芽孢杆菌菌株ba-bpd1(登录号no.dsm 21836)或其具有其所有鉴定特征的突变体的生物纯培养物。
38.在一个实施例中，提供了鱼用饲料组合物，其包含该公开的饲料添加剂配方。
39.在一个实施例中，提供了制备鱼用饲料组合物的方法，其包括向饲料组合物中添加以下配方：包含木聚糖酶和地衣芽孢杆菌菌株pwd-1(登录号no.53757)或其具有其所有鉴定特征的突变体的生物纯培养物。在该方法中，该配方还可包含解淀粉芽孢杆菌菌株ba-bpd1(登录号no.dsm 21836)或其具有其所有鉴定特征的突变体的生物纯培养物。
40.在一个实施例中，提供了用于提高鱼性能的方法，其包括：向鱼施用有效量的饲料组合物，该饲料组合物包含木聚糖酶和地衣芽孢杆菌菌株pwd-1(登录号no.53757)或其具有其所有鉴定特征的突变体的生物纯培养物。该饲料组合物还可包含解淀粉芽孢杆菌菌株ba-bpd1(登录号no.dsm 21836)或其具有其所有鉴定特征的突变体的生物纯培养物。
41.在一个实施例中，木聚糖酶在该公开的配方中以约10,000-200,000u/g的量存在。木聚糖酶在该公开的配方中可以以约30,000-200,000u/g的量存在。因此，木聚糖酶可以以约10,000；20,000；30,000；40,000；50,000；60,000；70,000；80,000；90,000；100,000；110,000；120,000；130,000；140,000；150,000；160,000；170,000；180,000；190,000；或200,000u/g的量存在。一个单位u的木聚糖酶活性定义为在50℃下在50mm柠檬酸三钠缓冲液(ph 6.0)中每秒从0.5％木聚糖(sima x4252，购自beechwood)中释放1纳摩尔还原糖(木糖当量)所需的酶量。
42.在一些实施例中，在该公开的配方中地衣芽孢杆菌菌株以约108至10
12
cfu/g(菌落形成单位/克)的量存在。在一些实施例中，在该公开的配方中地衣芽孢杆菌菌株以至少约109cfu/g的量存在。在一些实施例中，在该公开的配方中解淀粉芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌菌株以约108至10
12
cfu/g的量存在。在一些实施例中，在该公开的配方中解淀粉芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌菌株以至少约109cfu/g的量存在。因此，在该公开的配方中菌株可以以至少约108、109、10
10
、10
11
、10
12
或10
13
cfu/g的量存在。
43.除了木聚糖酶和细菌菌株之外，该公开的配方还可以包含载体，以提高产量、稳定性和/或性能特征。如本文所用的术语“载体”是指可食用材料，将成分添加至该食用材料可促进成分均匀掺入该公开的配方中。合适的载体可以包括(但不限于)石灰石、麦芽糊精、环糊精、小麦及其组合。在一些实施例中，活性成分与载体的比例可以是约1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1或9:1。
44.该公开的配方可以是任何所需的形式，其包括(但不限于)固体、粉末、悬浮浓缩物、液体或颗粒。
45.在一些实施例中，该公开的配方可在高达约70℃、80℃、85℃、90℃或95℃且长达约1、5、10、15、30或60分钟的热处理中保持热稳定。如本文所用，术语“热稳定”表示在加热
至指定温度之前存在于配方中的至少75％的组分在冷却至室温后仍然存在。
46.在一些实施例中，该公开的配方可以具有大于30、40、50、60、70或80周的保质期。应该理解，所需的时间长度和正常的保质期可以根据储存温度、加工条件、包装材料、包装设备等而变化。
47.该公开的配方可以添加到供鱼食用的饲料组合物中。该配方可以直接与鱼饲料混合和/或可以与饲料添加剂(即维生素饲料添加剂、矿物质饲料添加剂、氨基酸饲料添加剂等)混合，然后再与鱼饲料混合。
48.如本文所用的“鱼饲料”或“饲料”是指适合或旨在供鱼摄入的任何化合物、制剂、混合物或组合物。在一些实施例中，饲料可包含鱼饲料组合物。如本文所用的术语“鱼”包括具有鳃和一般覆盖有鳞片的细长身体的各种冷血水生脊椎动物中的任何一种。在实施例中，鱼可以包括那些适用于水产养殖的鱼，例如养鱼业的鱼。在一些实施例中，合适的鱼可以包括(但不限于)适合于封闭再循环系统的鱼种，例如：罗非鱼，包括尼罗罗非鱼和蓝罗非鱼；条纹鲈鱼(morone saxatilis)，又称为大西洋条纹鲈鱼、线鱼、岩鱼或岩礁鱼；澳洲肺鱼或澳大利亚鲈鱼(lates calcarifer)；黄鲈(perca flavescens)，又称鲈鱼、条纹鲈鱼、美洲鲈鱼或传教士；鲟鱼(鲟科)和鳗鱼(鳗鲡目)。通常在室外池塘系统中饲养的其他合适的鱼种可以包括罗非鱼(例如尼罗罗非鱼oriochromis niloticus)；黄鲈；大眼鱼(sander vitreus)，也称为黄梭鱼或黄小梭鱼；鳟鱼(如布鲁克鳟鱼(salvelinus fontinalis)、褐鳟和虹鳟)；鲶鱼(鲶形目)；大口黑鲈(micropterus salmoides)；锦鲤/鲤鱼；闪光鱼，包括普通闪光鱼(luxilus cornutus)和金色闪光鱼(notemigonus crysoleucas)；蓝鳃太阳鱼(lepomis macrochirus)，又称为鲷鱼、边鱼、阳光鱼或铜鼻鱼；太阳鱼(太阳鱼科)。合适的鱼种还包括鲑鱼(salmo salar)。
49.在一些实施例中，该公开的配方可以添加到鱼饲料中。因此，可以将该公开的配方添加到鱼饲料中以制备含有所需量的木聚糖酶和该公开的细菌菌株的饲料。如本领域普通技术人员所理解，稀释量可以由鱼的饲料需求、鱼的年龄和预期用途来确定。例如，在一些实施例中，木聚糖酶的浓度范围为约5至30u/g饲料。在一些实施例中，木聚糖酶的浓度范围为约7.5至30u/g饲料(即，约5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、11.5、12、12.5、13、13.5、14、14.5、15、15.5、16、16.5、17、17.5、18、18.5、19、19.5、20、20.5、21、21.5、22、22.5、23、23.5、24、24.5、25、25.5、26、26.5、27、27.5、28、28.5、29、29.5或30u/g饲料)。在一些实施例中，饲料组合物中地衣芽孢杆菌的量范围为至少约5
×
104cfu/g饲料。在一些实施例中，饲料组合物中地衣芽孢杆菌的量范围为至少约105cfu/g。在一些实施例中，饲料组合物中地衣芽孢杆菌的量范围为至少约106cfu/g。在一些实施例中，饲料组合物还包含浓度为至少约105cfu/g饲料的该公开的解淀粉芽孢杆菌菌株。在一些实施例中，饲料组合物包含总浓度为至少约105cfu/g饲料的两种菌株。在一些实施例中，饲料组合物包含总浓度为至少约2.0
×
105cfu/g的两种菌株。
50.当施用于鱼时，与不含该公开配方的饲料组合物相比，有效量的包含该公开配方的饲料组合物已显示出能提高动物的性能。术语“有效量”是指足以提高鱼的性能而不导致任何显着不良副作用的饲料量。
51.在一些实施例中，提高的性能包括以下的一项或多项：改善的体重、改善的生长性能、比生长速率、饲料转化率、蛋白质效率、全身养分保留、蛋白质和能量的保留，以及养分
消化率。改善的体重是指一段时间内所有鱼的总重量增加。
52.实施例
53.包括以下实施例在内用于为本领域普通技术人员提供指导，以实践本公开主题的代表性实施例。鉴于本发明和本领域的一般技术技能水平，技术人员可以理解以下实施例仅是示例性的，并且在不背离目前该公开的主题范围的情况下可以进行多种变化、修改和变更。
54.实施例1
55.地衣芽孢杆菌菌株pwd-1益生菌特性的体外评估
56.通过一系列琼脂孔扩散测试，测试地衣芽孢杆菌菌株pwd-1抵抗病原体代表物大肠杆菌(e.coli)、肠沙门氏菌(salmonella enterica)、无害李斯特菌(listeria innocua)和猪肠弯曲杆菌(campylobacter hyointestinalis)。在每次测试中，将病原体代表物中的一种涂在3个琼脂平板上，并将地衣芽孢杆菌菌株pwd-1放入每个平板的孔中。然后将平板在37℃下孵育过夜并拍照以显示病原体和地衣芽孢杆菌之间的相互作用。
57.图1a和1b分别说明地衣芽孢杆菌菌株pwd-1的生长超过了无害李斯特菌和沙门氏菌。
58.实施例2
59.解淀粉芽孢杆菌菌株ba-bpd1益生菌特性的体外评估
60.使用解淀粉芽孢杆菌菌株ba-bpd1代替地衣芽孢杆菌菌株pwd-1重复实施例1的实验。
61.图2a和2b分别说明解淀粉芽孢杆菌菌株ba-bpd1抑制大肠杆菌和肠沙门氏菌的生长。图2c说明解淀粉芽孢杆菌菌株ba-bpd1的生长超过了无害李斯特菌。
62.实施例3
63.地衣芽孢杆菌菌株pwd-1和解淀粉芽孢杆菌菌株ba-bpd1的耐酸性研究
64.益生菌微生物对酸性环境的抗性是一个重要特征，因为益生菌在进入肠道之前会暴露于动物胃肠道中苛刻的酸性条件。地衣芽孢杆菌菌株pwd-1在ph 3.0的lb培养基中处理0、1、2和3小时。然后将培养基中和至ph 7.0，并通过600nm处的吸光度监测其生长。对解淀粉芽孢杆菌菌株ba-bpd1重复该实验。
65.如图3a所示，与中性培养基相比，地衣芽孢杆菌菌株pwd-1暴露于酸性环境中会使其生长延迟3小时。还观察到地衣芽孢杆菌菌株pwd-1暴露于酸性环境1、2和3小时后能够恢复并呈现生长。如图3b所示，解淀粉芽孢杆菌菌株ba-bpd1也能从酸暴露中恢复，但比观察到的地衣芽孢杆菌菌株要慢。
66.实施例4
67.添加木聚糖酶和地衣芽孢杆菌菌株pwd-1至幼年尼罗罗非鱼(oreochromis niloticus)食粮中的效果调查
68.评估了内切木聚糖酶和多菌株芽孢杆菌属的直接饲喂微生物dfm(ep)对幼年尼罗罗非鱼(oreochromis niloticus)生长性能、全身养分保留和养分消化率的影响。
69.600条幼年罗非鱼，平均初始体重(bw)为12.3
±
0.7g，被随机分配3种食粮处理中的1种，每种处理有4个重复水族箱，每个水族箱有50条鱼，并在500l循环淡水池中饲养至61日龄。第一种食粮处理是标准能量实用食粮(阳性对照，pc)，配制为总能量(ge)4326kcal/
kg，粗蛋白32.8％，粗脂肪8.6％。在第二种处理(nc)中，与pc相比，食粮能量减少了120kcal/kg ge(粗脂肪减少了2.1％)。在第三种处理中，在nc食粮的基础上添加了100g/mt的木聚糖酶-dfm混合物(nc ep)。所有食粮都含有鱼粉(占饮食的5％)和作为蛋白质和纤维来源的植物基成分。每天3次手工饲喂至饱足。表1显示了三种食粮处理的详细信息。
70.表1实验食粮的计算分析
[0071][0072]
61天后，在nc饮食中添加ep的第三种食粮处理显著改善了(p《0.05)测试鱼的最终体重、比生长速率、饲料转化率、蛋白质效率、蛋白质和能量的全身保留以及能量表观消化率。在nc食粮中添加100g/mt ep可提高生长性能、饲料效率和关键营养素的消化率，提高率与第一种食粮处理(标准能量pc食粮)相似或超过。因此，在测试中，第三种食粮处理(在nc饮食中添加ep)在幼年罗非鱼食粮中补偿了至少120kcal/kg ge。测试结果如表2所示。
[0073]
表2喂饲61天后罗非鱼的生长性能、全身营养保留和能量表观消化率。同一行带有不同字母的平均值之间差异显着(p《0.05)。
[0074]