荜茇酰胺在抑制NLRP3炎症小体活化中的应用的制作方法

荜茇酰胺在抑制nlrp3炎症小体活化中的应用
技术领域
1.本发明涉及生物及医药领域，特别涉及荜茇酰胺在抑制nlrp3炎症小体活化中的应用。


背景技术：

2.固有免疫是机体抵御病原体感染的第一道防线，其主要通过一系列模式识别受体引发炎症并保护机体。当一些模式识别受体被病原微生物感染或者“危险信号”激活时，将作为传感器分子，与衔接蛋白asc(apoptosis-associated speck-like proein containing a card，细胞凋亡相关斑点样蛋白)及半胱氨酸蛋白酶caspase-1组成胞质蛋白复合物，即炎症小体(inflammation)。活化后的炎症小体介导caspase-1自剪切活化，活化后的caspase-1一方面促进il-1β和il-18等促炎因子成熟和分泌，另一方面剪切gsdmd诱导细胞焦亡，促进炎症反应的发生。因而炎症小体在固有免疫和炎症反应中起着非常关键的作用。在目前已经研究的炎症小体中，nlrp3(nacht，lrr and pyd domains-containing protein 3)炎症小体的研究最为广泛。
3.nlrp3炎症小体可被多种病原体和危险信号活化，适度激活有利于清除病原体或有害物质，维持机体的免疫反应平衡；若异常活化则导致疾病的发生发展。因此，nlrp3的活化需要精确调控。nlrp3炎症小体的异常活化与多种复杂性疾病的发生密切相关，如：ii型糖尿病动脉粥样硬化、痛风、风湿性关节炎，帕金森多发性硬化症，阿尔兹海默病等疾病。nlrp3炎症小体是上述疾病的潜在干预靶点，靶向抑制nlrp3炎症小体是治疗相关疾病的新思路。
4.荜茇酰胺(piperlongumine，pl)是从长柄胡椒的根中提取的具有生物活性的小分子生物碱，其药用植物在传统医学中主要被用来治疗肠道和呼吸道疾病。近年来多研究发现荜茇酰胺可以选择性杀伤多种肿瘤细胞，而对正常细胞作用不明显，并对作用机制进行了深入探究，然而对于荜茇酰胺对nlrp3炎症小体活化的影响未见报道。因此，探索荜茇酰胺在nlrp3炎症小体活化中的作用及机制对于治疗nlrp3炎症小体相关炎症性疾病来说具有非常重要的研究意义。


技术实现要素：

5.本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供荜茇酰胺在抑制nlrp3炎症小体活化中的应用。
6.本发明的另一目的在于提供荜茇酰胺在制备抑制nlrp3炎症小体活化的药物中的应用。
7.本发明的再一目的在于提供荜茇酰胺在制备nlrp3炎症小体抑制剂中的应用。
8.本发明的目的通过下述技术方案实现：
9.荜茇酰胺在抑制nlrp3炎症小体活化中的应用；所述的应用的环境为体外环境。
10.荜茇酰胺在制备抑制nlrp3炎症小体活化的药物中的应用。
11.荜茇酰胺在制备用于预防和/或治疗nlrp3炎症小体异常活化相关疾病的药物中的应用，其中，所述的nlrp3炎症小体异常活化相关疾病为腹膜炎、ii型糖尿病动脉粥样硬化、痛风、风湿性关节炎，帕金森多发性硬化症和阿尔兹海默病中的至少一种。
12.所述的腹膜炎包括尿酸盐结晶诱导的腹膜炎等。
13.荜茇酰胺在制备抑制nlrp3炎症小体活化引起的细胞焦亡的药物中的应用，nlrp3炎症小体活化介导gsdmd剪切而引起的细胞焦亡，而荜茇酰胺可以抑制nlrp3炎症小体活化介导gsdmd剪切而引起的细胞焦亡。
14.所述的荜茇酰胺通过抑制nlrp3炎症小体的组装，抑制炎症小体活化过程中的衔接蛋白asc的寡聚和斑点形成，nlrp3蛋白自身的寡聚，和/或nlrp3蛋白与衔接蛋白asc的相互作用实现抑制nlrp3炎症小体的活化的目的。
15.所述的nlrp3炎症小体活化包括经典的nlrp3炎症小体活化和非经典的nlrp3炎症小体的活化。
16.所述的经典的nlrp3炎症小体活化为由nlrp3炎症小体活化激活剂诱导的nlrp3炎症小体活化；包括由尼日利亚菌素、尿酸盐结晶和氢氧化铝佐剂(明矾佐剂)中的至少一种诱导的nlrp3炎症小体的活化。
17.所述的非经典的nlrp3炎症小体的活化包括由脂多糖(lps)诱导的nlrp3炎症小体的活化。
18.荜茇酰胺在制备nlrp3炎症小体活化抑制剂中的应用。
19.本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
20.1、本发明中首次发现荜茇酰胺能够抑制小鼠巨噬细胞和人单核巨噬细胞中尼日利亚菌素诱导的nlrp3炎症小体活化。除此之外，荜茇酰胺不仅能够抑制尼日利亚菌素、尿酸盐结晶、铝等不同的nlrp3炎症小体激活剂引起的经典的nlrp3炎症小体活化，也能够抑制细胞内lps引起的非经典的nlrp3炎症小体的活化，而不影响沙门氏菌感染引起的nlrc4炎症小体活化和细胞内poly(da:dt)引起的aim2炎症小体的活化。
21.2、本发明中发现荜茇酰胺抑制nlrp3炎症小体活化是通过抑制nlrp3炎症小体的组装，抑制炎症小体活化过程中的asc的寡聚和斑点形成，nlrp3自身的寡聚，及nlrp3与asc的相互作用。除此之外，说明荜茇酰胺能够缓解尿酸盐结晶诱导的腹膜炎，可为nlrp3炎症小体相关炎症性疾病的治疗提供一种有效途径。
附图说明
22.图1是实施例1中荜茇酰胺在小鼠巨噬细胞中抑制尼日利亚菌素诱导的nlrp3炎症小体的活化图；其中，a为il-1β前体的剪切以及caspase-1的自我剪切情况；b为il-1β的分泌情况。
23.图2是实施例1中荜茇酰胺在人单核巨噬细胞中抑制尼日利亚菌素诱导的nlrp3炎症小体的活化图；其中，a为il-1β前体的剪切以及caspase-1的自我剪切情况；b为il-1β的分泌情况。
24.图3是实施例2中荜茇酰胺抑制lps诱导的非经典的nlrp3炎症小体的活化图；其中，a为il-1β前体的剪切以及caspase-1的自我剪切情况；b为il-1β的分泌情况。
25.图4是实施例2中荜茇酰胺抑制不同nlrp3炎症小体激活剂诱导的经典的nlrp3炎
症小体的活化图；其中，a为il-1β前体的剪切以及caspase-1的自我剪切情况；b为il-1β的分泌情况。
26.图5是实施例3中荜茇酰胺对nlrc4炎症小体活化的影响图；其中，a为il-1β前体的剪切以及caspase-1的自我剪切情况；b为il-1β的分泌情况。
27.图6是实施例3中荜茇酰胺对aim2炎症小体活化的影响图；其中，a为il-1β前体的剪切以及caspase-1的自我剪切情况；b为il-1β的分泌情况。
28.图7是实施例4中荜茇酰胺抑制caspase-1活化介导的gsdmd的剪切图。
29.图8是实施例4中荜茇酰胺抑制nlrp3炎症小体活化介导gsdmd剪切引起的细胞焦亡图。
30.图9是实施例5中荜茇酰胺抑制尼日利亚菌素引起的nlrp3炎症小体活化过程中的asc的寡聚图。
31.图10是实施例5中荜茇酰胺可以抑制尼日利亚菌素引起的nlrp3炎症小体活化过程中的asc的斑点形成图；其中，a为免疫荧光检测的照片；b为免疫荧光检测的统计学结果。
32.图11是实施例6中荜茇酰胺抑制nlrp3与asc蛋白的相互作用的western blotting检测结果图。
33.图12是实施例7中荜茇酰胺抑制尼日利亚菌素引起的nlrp3的自身寡聚的western blotting检测结果图。
34.图13是实施例8中荜茇酰胺对尿酸盐结晶诱导小鼠腹膜炎后对腹腔浸润的中性粒细胞数影响图。
35.图14是实施例8中荜茇酰胺对尿酸盐结晶诱导小鼠腹膜炎后对血清中il-1β浓度的影响图。
36.图15是实施例8中荜茇酰胺对尿酸盐结晶诱导小鼠腹膜炎后对腹水中il-1β浓度的影响图。
具体实施方式
37.下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。除非特别说明，本发明所用试剂和原材料均可通过市售获得。
38.实施列1
39.本实施例用于说明荜茇酰胺(pl)在巨噬细胞中抑制nlrp3炎症小体活化
40.(1)本实施例采用的细胞为小鼠骨髓来源巨噬细胞(bmdms)和人单核巨噬细胞(thp-1)；其中，bmdms的培养和分化:取7～8周龄雄性c57bl/6小鼠分离出骨髓细胞，用dmem培养基 10％(v/v)胎牛血清 20％(v/v)l929(成纤维细胞；atcc)培养上清(含巨噬细胞集落刺激因子m-csf)分化5～6天，获得小鼠骨髓来源的巨噬细胞。thp-1(购于atcc)用ripm1640培养基 10％(v/v)胎牛血清培养。
41.(2)将分化后的细胞(即小鼠骨髓来源的巨噬细胞)接种到24孔板中，每孔2
×
105(个)的细胞密度。培养过夜后，将培养基换成opti-mem，并添加100ng/ml lps(sigma公司，l2880)预处理3小时，接着分别加入不同浓度的pl(0μm,2.5μm,5μm,10μm；cayman公司，
11006)处理1小时，再将每个浓度处理后的细胞都分成两组，两组同样地处理组，然后其中一组加入5μm的尼日利亚菌素(nigericin，生工生物工程(上海)股份有限公司，a606687)刺激30分钟，另一组不加尼日利亚菌素。刺激结束后裂解细胞，并收集细胞培养上清和细胞裂解液。western blotting检测il-1β前体(pro-il-1β)及il-1β的切体(p17)，caspase-1前体(pro-caspasse-1)及caspasse-1的剪切体(p20)，结果如图1a所示；elisa检测il-1β分泌情况，结果如图1b所示。由图1的结果可以看出：荜茇酰胺可以剂量依赖地抑制小鼠巨噬细胞中尼日利亚菌素引起的nlrp3炎症小体活化后的caspase-1的自剪切和il-1β前体的剪切以及il-1β的释放。
42.(3)将悬浮细胞thp-1接种到24孔板中，每孔4
×
105个，并添加100nm佛波酯(phorbol myristate acetate,pma,invivogen,tlrl-pma)培养过夜以诱导thp-1分化。第二天，将培养基换成opti-mem，并添加100ng/ml lps预处理3小时，接着加入不同浓度的pl(0μm,2.5μm,5μm,10μm)处理1小时，之后用5μm尼日利亚菌刺激30分钟(以不加入尼日利亚菌为对照)。刺激结束后裂解细胞，并收集细胞培养上清和细胞裂解液。western blotting检测il-1β前体(pro-il-1β)及il-1β的切体(p17)，caspase-1前体(pro-caspasse-1)及caspasse-1的剪切体(p20)，结果如图2a所示；elisa检测il-1β分泌情况，结果如图2b所示。由图2的结果可以看出：荜茇酰胺可以剂量依赖地抑制人单核巨噬细胞中尼日利亚菌素引起的nlrp3炎症小体活化后的caspase-1的自剪切和il-1β前体的剪切以及il-1β的释放。
43.实施列2
44.本实施例用于说明荜茇酰胺特异性地抑制nlrp3炎症小体活化。
45.(1)小鼠骨髓来源巨噬细胞(bmdms)的培养和分化：同实施例1步骤(1)。
46.(2)将分化后的细胞接种到12孔板中，每孔5
×
105的细胞密度。培养过夜后，将培养基换成opti-mem，并添加400ng/ml pam3csk(invivogen公司，tlrl-pms)预处理3小时，接着加入不同浓度的pl(0μm,2.5μm,5μm,10μm)处理1小时，然后用lipofectamine 3000转染1μg/ml的lps处理16小时。裂解细胞并收集细胞培养上清和细胞裂解液。western blotting检测il-1β前体(pro-il-1β)及il-1β的剪切体(p17)，caspase-1前体(pro-caspasse-1)及caspasse-1的剪切体(p20)，结果如图3a所示；elisa检测il-1β分泌情况，结果如图3b所示。由图3的结果可以看出：荜茇酰胺可以剂量依赖地抑制lps引起的非经典nlrp3炎症小体活化后的caspase-1的自剪切和il-1β前体的剪切以及il-1β的释放。
47.(3)将分化后的细胞接种到24孔板中，每孔2
×
105的细胞密度。培养过夜后，将培养基换成opti-mem，并添加100ng/ml lps预处理3小时，接着将其分为两大组，分别加入不同浓度的pl(0μm,10μm)处理1小时，再将pl处理后的细胞按每个大组分为四小组，每组分别为：不刺激作为对照，用5μm的尼日利亚菌素刺激30分钟，200μg/ml尿酸盐结晶(msu，themor scientific公司，u 2875)刺激6小时及300μg/ml氢氧化铝佐剂(明矾佐剂)(imject alum，themor scientific，77161；简称铝)刺激6小时。裂解细胞并收集细胞培养上清和细胞裂解液。western blotting检测il-1β前体(pro-il-1β)及il-1β的剪切体(p17)，caspase-1前体(pro-caspasse-1)及caspasse-1的剪切体(p20)，结果如图4a所示；elisa检测il-1β分泌情况，结果如图4b所示。图4的结果可以得出：荜茇酰胺可以抑制不同nlrp3炎症小体激活剂引起的经典nlrp3炎症小体活化后的caspase-1的自剪切和il-1β前体的剪切以及il-1β的释放。
48.实施例3
49.本实施例用于说明荜茇酰胺不影响nlrc4炎症小体和aim2炎症小体的活化
50.(1)小鼠骨髓来源巨噬细胞(bmdms)的培养和分化：同实施例1步骤(1)。
51.(2)将分化后的细胞接种到24孔板中，每孔2
×
105的细胞密度。培养过夜后，将培养基换成opti-mem，并添加100ng/ml lps预处理3小时，接着将其分为两大组，分别加入不同浓度的pl(0μm,10μm)处理1小时，再将pl处理后的细胞按每大组分为三小组，每组分别为：不刺激作为对照组；用5μm的尼日利亚菌素刺激30分钟；鼠伤寒沙门氏菌bncc124795(北纳生物)感染0.5h后进行清洗，然后加入含有50μg/ml庆大霉素的opti-mem培养基刺激4小时。裂解细胞并收集细胞培养上清和细胞裂解液。western blotting检测il-1β前体(pro-il-1β)及il-1β的切体(p17)，caspase-1前体(pro-caspasse-1)及caspasse-1的剪切体(p20)，结果如图5a所示；elisa检测il-1β分泌情况，结果如图5b所示。由图5的结果可以看出：荜茇酰胺不影响沙门氏菌引起的nlrc4炎症小体活化后的caspase-1的自剪切和il-1β前体的剪切以及il-1β的释放。
52.(3)将分化后的细胞接种到12孔板中，每孔5
×
105的细胞密度。培养过夜后，将培养基换成opti-mem，并添加100ng/ml lps预处理3小时，接着将其分为两大组，分别加入不同浓度的pl(0μm,10μm)处理1小时，再将pl处理后的细胞按每大组分为三小组，每组分别为：不刺激作为对照组，用尼日利亚菌素(5μm)刺激30分钟，用lipofectamine 3000转染0.5μg/ml poly(da:dt)(invivogen公司，tlrl-patn)刺激4小时。收集细胞培养上清和细胞裂解液。western blotting检测il-1β前体(pro-il-1β)及il-1β的切体(p17)，caspase-1前体(pro-caspasse-1)及caspasse-1的剪切体(p20)，结果如图6a所示；elisa检测il-1β分泌情况，结果如图6b所示。由图6的结果可以看出：荜茇酰胺不影响poly(da:dt)引起的aim2炎症小体活化后的caspase-1的自剪切和il-1β前体的剪切以及il-1β的释放。
53.实施列4
54.本实施例用于说明荜茇酰胺可以抑制nlrp3炎症活化引起的细胞焦亡。
55.(1)小鼠骨髓来源巨噬细胞(bmdms)的培养和分化：同实施例1步骤(1)。
56.(2)将分化后的细胞接种到24孔板中，每孔2
×
105的细胞密度。培养过夜后，将培养基换成opti-mem，并添加100ng/ml lps预处理3小时，预处理后将其分为三组：一组不处理作对照；一组加5μm的尼日利亚菌素刺激30分钟；一组加10μm的pl处理1小时后加5μm的尼日利亚菌素刺激30分钟。裂解细胞并收集细胞上清和细胞裂解液。western blotting检测gsdmd的剪切情况，结果如图7所示。由图7结果可以看出：荜茇酰胺可以抑制caspase-1活化介导的gsdmd的剪切。
57.(3)将分化后的细胞接种到96孔板中，每孔5
×
105的细胞密度。培养过夜后，将培养基换成opti-mem，并添加100ng/ml lps预处理3小时，预处理后将其分为四组：一组不处理作对照；一组单独加10μm的pl处理1小时；一组单独加5μm的尼日利亚菌素刺激30分钟；一组加10μm的pl处理1小时后加5μm的尼日利亚菌素刺激30分钟。用乳酸脱氢酶(ldh)细胞毒性检测试剂盒(碧云天公司，c0016)检测，评估细胞死亡情况，结果如图8所示。由图8结果可以说明，荜茇酰胺可以抑制nlrp3炎症小体活化介导gsdmd剪切而引起的细胞焦亡。
58.实施列5
59.本实施例用于说明荜茇酰胺对nlrp3炎症小体活化过程中asc的寡聚化和斑点形
buffer(2
×
tbe缓冲液，20％(v/v)甘油，2％(w/v)sds(十二烷基硫酸钠)，0.005％(w/v)溴酚蓝)，混匀，然后进行western blotting检测，结果如图12所示。由图12的结果可以看出：尼日利亚菌素刺激明显引起nlrp3寡聚，而荜茇酰胺的处理则可以抑制这一过程，说明荜茇酰胺可以抑制尼日利亚菌素引起的nlrp3的自身寡聚。
71.实施例8
72.本实施例用于说明荜茇酰胺可以抑制尿酸盐结晶诱导的腹膜炎
73.(1)选取7～8周龄的c57bl/6雄性小鼠(体重相近)，分成三组：第一组先注射二甲基亚砜(dmso)，一小时后注射pbs作为对照组；第二组先注射dmso，一小时后注射0.5mg尿酸盐结晶(msu，themor scientific公司，u 2875)；第三组先注射50mg/kg荜茇酰胺，一小时候后注射0.5mg msu。
74.(2)6个小时后，摘除眼球取血，取完血后颈椎脱臼处理小鼠；用1ml pbs注入腹腔，轻柔腹腔使使其均匀充满腹腔，然后将其吸出，吸出的液体于3000rpm离心3分钟，上清用来检测细胞因子。用1ml pbs进行上述操作后，再用相同的方法冲洗腹腔，以收集腹腔内的细胞，用量大概10ml，可每次用2～4ml冲洗。离心所得沉淀细胞通过流式检测中性粒细胞的浸润情况(标记流式抗体：cd11b(biolegend公司，101263)、ly6g(biolegend公司，127616))结果如图13所示。elisa分别检测血清和腹水中il-1β水平，如图14和15所示。
75.腹腔注射nlrp3炎症小体活化激活剂尿酸盐结晶诱导小鼠患腹膜炎，是一种常见的nlrp3相关的急性疾病模型。腹膜炎发生的过程中，会导致血清和腹腔中炎性因子il-1β的分泌及腹腔中中性粒细胞的浸润增加。在注射尿酸盐结晶一小时前注射荜茇酰胺，腹腔灌洗液中中性粒细胞的浸润减少，小鼠血清和腹腔中的炎性因子il-β分泌也减少，以上结果说明荜茇酰胺能够缓解尿酸盐结晶诱导的腹膜炎，在体内证明荜茇酰胺能够抑制nlrp3炎症小体的活化。
76.综合以上实施例1～8的结果，荜茇酰胺能够抑制小鼠巨噬细胞和人单核巨噬细胞中尼日利亚菌素诱导的nlrp3炎症小体活化。除此之外，荜茇酰胺不仅能够抑制尼日利亚菌素、尿酸盐结晶、铝等不同的nlrp3炎症小体激活剂引起的经典的nlrp3炎症小体活化，也能够抑制细胞内lps引起的非经典的nlrp3炎症小体的活化，而不影响沙门氏菌感染引起的nlrc4炎症小体活化和细胞内poly(da:dt)引起的aim2炎症小体的活化；荜茇酰胺抑制nlrp3炎症小体活化是通过抑制nlrp3炎症小体的组装，抑制炎症小体活化过程中的asc的寡聚和斑点形成，nlrp3自身的寡聚，及nlrp3与asc的相互作用。除此之外，说明荜茇酰胺能够缓解尿酸盐结晶诱导的腹膜炎。
77.上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。