一种有助于增强免疫力的组合物及其制备方法

1.本发明属于海洋生物技术领域，特别涉及一种有助于增强免疫力的组合物及其制备方法。


背景技术：

2.由于生活节奏的加快、工作压力的增加及不良饮食和睡眠习惯等因素，亚健康状态已成为非常常见的公共健康问题。长时间处于亚健康状态，将导致机体免疫力下降。免疫是人体至关重要的保护性生理功能，可识别“自己”和“非己”物质，抵御外来病原微生物的入侵并清除体内有害物质，维持着自身内环境的稳定状态。免疫力一旦下降，机体的抵抗能力也将随之降低，容易引起疾病的发生。因此，增强免疫力是“克疫”之本，有助于维持人体健康。
3.水母属于腔肠动物，我国已记录的水母400多种，约占全球已记录种类的三分之一。水母资源丰富，分布广，从海南岛、广东沿海一直到山东、辽宁沿海均有分布。近年来，由于受全球气候变化等因素影响，水母暴发已成为除赤潮之外，最严重的海洋生物灾害。水母中含有丰富的蛋白，现阶段对水母中蛋白的研究，主要集中于通过酸、碱、热水或酶法促溶提取胶原蛋白，将胶原蛋白酶解为胶原蛋白肽。在水母胶原蛋白的提取过程中，有大量的酸溶性或碱溶性蛋白被弃除，导致水母蛋白的利用率低。如何高效的利用水母中的蛋白，是建立水母资源高值化利用及水母防灾减灾技术的核心。
4.虽然现有技术中也有公开一些利用水母肽的相关技术。然而公开的资料中具体的生物对象相对单一，而应用成分的提取技术复杂、提取率低。


技术实现要素：

5.为解决上述技术问题，本发明提供了一种有助于增强免疫力的组合物及其制备方法，以达到提高水母中蛋白的利用率，并将水母多肽和牛磺酸复配，制备有助于增强免疫力的组合物的目的。
6.为达到上述目的，本发明的技术方案如下：
7.一种有助于增强免疫力的组合物，包括水母多肽和牛磺酸，所述水母多肽的质量分数为 70～80％，牛磺酸的质量分数为20～30％，所述水母多肽为脱盐水母伞部或口腕部的酶解物。
8.上述方案中，所述水母多肽中蛋白含量高于70％，所述蛋白中的多肽含量占总量的60％以上，上述含量均以干基计；其中分子量》5000da的多肽小于5％，分子量3000da《m《5000 da的多肽小于15％，分子量1000da《m《3000da的多肽占25-55％，分子量m《1000da的多肽占35-60％。
9.上述方案中，所述水母多肽的制备方法如下：取脱盐水母的伞部或口腕部，清洗干净后匀浆，取匀浆物按照固液比1:3～6加水，然后加酶进行酶解，按匀浆物计的加酶量为1500～3000 u/g，酶解温度45～65℃，酶解时间3～8小时，在ph 5～7的酶解体系下进行酶
解，酶解结束后，在100℃下煮沸10分钟灭酶；离心，除去残渣，上清液旋转蒸发浓缩至初始体积的1/4～1/5 后，冷冻干燥，得到水母多肽。
10.上述方案中，所述酶为木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、风味蛋白酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶、胶原蛋白酶中的一种或几种组合。
11.一种如上所述的有助于增强免疫力的组合物的制备方法，将水母多肽按照质量分数 70～80％、牛磺酸按照质量分数20～30％混合均匀，即得到组合物。
12.通过上述技术方案，本发明提供的一种有助于增强免疫力的组合物及其制备方法具有如下有益效果：
13.本发明提供的有助于增强免疫力的组合物，将水母多肽和牛磺酸两者组合，效果好、易吸收、无毒、无副作用，两者组合后可发生很好的配伍作用。本发明提供的水母多肽的制备方法对水母蛋白的利用率高，且操作简便、无污染。本发明从水母原料的利用率和产品高附加值两方面提高了水母资源的价值。
具体实施方式
14.下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
15.水母多肽的制备：
16.实施例1
17.取脱盐沙海蜇的伞部，清洗干净后匀浆，取匀浆物按照固液比1:6加水，然后加入菠萝蛋白酶，按匀浆物计的加酶量为2500u/g，酶解温度50℃，酶解时间4小时，酶解体系ph 6，酶解结束后100℃煮沸10分钟灭酶。离心，除去残渣，上清液旋转蒸发浓缩至初始体积的 1/4～1/5后，冷冻干燥，得到水母多肽。
18.实施例2
19.取脱盐白色霞水母的伞部，清洗干净后匀浆，取匀浆物按照固液比1:3加水，然后加入碱性蛋白酶，按匀浆物计的加酶量为1500u/g，酶解温度65℃，酶解时间6小时，酶解体系ph 7，酶解结束后100℃煮沸10分钟灭酶。离心，除去残渣，上清液旋转蒸发浓缩至初始体积的1/4～1/5后，冷冻干燥，得到水母多肽。
20.实施例3
21.取脱盐黄斑海蜇的伞部，清洗干净后匀浆，取匀浆物按照固液比1:5加水，然后加入糜蛋白酶，按匀浆物计的加酶量为3000u/g，酶解温度55℃，酶解时间5小时，酶解体系ph6.5，酶解结束后100℃煮沸10分钟灭酶。离心，除去残渣，上清液旋转蒸发浓缩至初始体积的 1/4～1/5后，冷冻干燥，得到水母多肽。
22.实施例4
23.取脱盐沙海蜇的伞部，清洗干净后匀浆，取匀浆物按照固液比1:4加水，然后加入中性蛋白酶和胰蛋白酶，按匀浆物计的加酶总量为2000u/g，其中中性蛋白酶1000u/g，胰蛋白酶1000u/g，酶解温度50℃，酶解时间3小时，酶解体系ph 6，酶解结束后100℃煮沸10 分钟灭酶。离心，除去残渣，上清液旋转蒸发浓缩至初始体积的1/4～1/5后，冷冻干燥，得到水母多肽。
24.实施例5
25.取脱盐白色霞水母的伞部，清洗干净后匀浆，取匀浆物按照固液比1:3加水，然后
加入木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶，按匀浆物计的加酶总量为2800u/g，其中木瓜蛋白酶1200u/g，碱性蛋白酶1600u/g，酶解温度50℃，酶解时间5小时，酶解体系ph 6，酶解结束后100℃煮沸10分钟灭酶。离心，除去残渣，上清液旋转蒸发浓缩至初始体积的1/4～1/5后，冷冻干燥，得到水母多肽。
26.实施例6
27.取脱盐黄斑海蜇的伞部，清洗干净后匀浆，取匀浆物按照固液比1:4加水，然后加入风味蛋白酶和胶原蛋白酶，按匀浆物计的加酶总量为1600u/g，其中风味蛋白酶1000u/g，胶原蛋白酶600u/g，酶解温度60℃，酶解时间5小时，酶解体系ph7，酶解结束后100℃煮沸 10分钟灭酶。离心，除去残渣，上清液旋转蒸发浓缩至初始体积的1/4～1/5后，冷冻干燥，得到水母多肽。
28.上述实施例中，对离心、浓缩、冻干条件不做限制，根据本领域常规的方法即可。
29.根据国标gb/t 22492(大豆肽粉)中的方法对水母多肽蛋白含量、多肽含量及分子量分布进行测定，结果见表1。
30.表1 水母多肽蛋白含量、多肽含量及分子量分布
[0031][0032]
组合物的制备：
[0033]
上述实施例制得的水母多肽和牛磺酸按照表2所示混合均匀后，即得到组合物。本发明中所用牛磺酸从市面上购买获得，质量符合gb14759-2010(食品安全国家标准食品添加剂牛磺酸)的相关规定。本发明组合物的混匀方法不做限制，根据本领域常规的方法即可。
[0034]
表2 组合物的制备实施例及对比例
[0035][0036]
上述组合物中，组合物1-6为在本发明所限定的范围内的实施例，组合物7-9为超出本发明所限定的范围的对比例。
[0037]
有助于增强免疫力功效评价：
[0038]
1.细胞免疫功能测定：cona诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验
[0039]
1.1受试物
[0040]
制备的组合物1-组合物9。
[0041]
1.2实验动物
[0042]
昆明种小鼠48只，雄性，体重为18-22克，随机分为4组，每组12只。
[0043]
1.3剂量设计和分组
[0044]
受试物的推荐剂量为成人(按体重60kg计算)2.1g/d，按人体推荐量的10倍即350mg/kg.d 对小鼠进行灌胃给药，空白对照组灌胃蒸馏水，给药频率为1次/日，给药时间为30天。
[0045]
1.4实验步骤
[0046]
小鼠脱颈处死，无菌取脾，置于盛有适量无菌hank's液平皿中，用镊子轻轻将脾磨碎，制成单个细胞悬液。经200目筛网过滤，用hank's液洗2次，每次离心10min(1000r/min)。然后将细胞悬浮于1ml的完全培养液中，用台酚兰染色计数活细胞数(应在95％以上)，调整细胞浓度为3
×
106个/ml。
[0047]
将每一份脾细胞悬液分两孔加入24孔培养板中(每孔1ml)，一孔加75μl cona液(相当于7.5μg/ml)，另一孔作为对照，置5％co2，37℃co2孵箱中培养72h。培养结束前4h，每孔轻轻吸去上清液0.7ml，加入0.7ml不含胎牛血清的rpmi1640培养液，同时加入cck-8 100μl/孔，继续培养4h。培养结束后，然后分装到96孔培养板中，每个孔作3个平行孔，用酶标仪，以450nm波长测定光密度值。用加cona孔的光密度值减去不加cona孔的光密度值代表淋巴细胞的增殖能力。
[0048]
1.5数据处理
[0049]
数据以均值
±
sd表示，用spss对数据进行方差分析(anova)和显著性差异分析 (duncan's)，p《0.05判定为有显著性差异。
[0050]
2.nk细胞活性测定：乳酸脱氢酶(ldh)测定法
[0051]
2.1受试物
[0052]
制备的组合物1-组合物9。
[0053]
2.2实验动物
[0054]
昆明种小鼠48只，雄性，体重为18-22克，随机分为4组，每组12只。
[0055]
2.3剂量设计和分组
[0056]
受试物的推荐剂量为成人(按体重60kg计算)2.1g/d，按人体推荐量的10倍即 350mg/kg.d对小鼠进行灌胃给药，空白对照组灌胃蒸馏水，给药频率为1次/日，给药时间为 30天。
[0057]
2.4实验步骤
[0058]
小鼠脱颈处死，无菌取脾，置于盛有适量无菌hank's液的小平皿中，用镊子轻轻将脾磨碎，制成单细胞悬液(效应细胞)。经200目筛网过滤，用hank's液洗2次，每次离心10min (1000r/min)，弃上清将细胞浆弹起，加入0.5ml红细胞裂解液20秒，裂解红细胞后再加入 0.5ml2倍hank's液及8mlhank's液，1000r/min，10min离心，用1ml含10％胎牛血清的 rpmi1640完全培养液重悬，用1％冰醋酸稀释后计数(活细胞数应在95％以上)，用台酚兰染色计数活细胞数(应在95％以上)，最后用rpmi1640完全培养液调整细胞浓度为2
×
107个 /ml。
[0059]
实验前24h将靶细胞(yac-1细胞)进行传代培养。用前以hank's液洗3次，用rpmi1640 完全培养液调整细胞浓度为4
×
105个/ml。
[0060]
取靶细胞和效应细胞各100μl(效靶比50:1)，加入u型96孔培养板中：靶细胞自然释放孔加靶细胞和培养液各100μl，靶细胞最大释放孔加靶细胞和1％np40或2.5％triton各 100μl；上述各项均设三个平行孔，于37℃、5％co2培养箱中培养4h，然后将96孔培养板以1500r/min离心5min，每孔吸取上清120μl置平底96孔培养板中，再加入60μlldh检测工作液，混匀，室温避光孵育30min，然后在酶标仪490nm处测定光密度值(od)。
[0061]
nk细胞的活性按照下列公式计算：
[0062]
nk细胞活性(％)＝(反应孔od-自然释放孔od)
×
100％/(最大释放孔od-自然释放孔od)
[0063]
2.5数据处理
[0064]
数据以均值
±
sd表示，用spss对数据进行方差分析(anova)和显著性差异分析 (duncan's)，p《0.05判定为有显著性差异。nk细胞活性需进行数据转化，式中a为nk细胞活性，用小数表示，然后再进行方差分析。
[0065]
3.实验结果
[0066]
表3为各组合物对cona诱导的小鼠脾淋巴细胞转化的影响，表4为各组合物对小鼠nk细胞活性的影响。
[0067]
表3各组合物对cona诱导的小鼠脾淋巴细胞转化的影响(n＝10)
[0068]
组别剂量(mg/kg.d)动物数(只)δa(od值差)空白对照
‑‑
100.030
±
0.013组合物1350100.106
±
0.037*
#
组合物2350100.112
±
0.025*
#
组合物3350100.090
±
0.015*
#
组合物4350100.116
±
0.023*
#
组合物5350100.107
±
0.018*
#
组合物6350100.099
±
0.010*
#
组合物7350100.046
±
0.012组合物8350100.042
±
0.010组合物9350100.038
±
0.009
[0069]
*表示实施例与对照相比，p《0.05，存在显著性差异；
#
表示实施例与对比例相比，p《0.05，存在显著性差异。
[0070]
表4各组合物对小鼠nk细胞活性的影响(n＝10)
[0071][0072]
*表示实施例与对照相比，p《0.05，存在显著性差异；
#
表示实施例与对比例相比，p《0.05，存在显著性差异。
[0073]
从表3、表4可以看出，本发明组合物与空白对照组相比，能够增强cona诱导的小鼠脾淋巴细胞转化能力和小鼠nk细胞活性，并且，本发明与超出本发明所限定的范围的对比例组合物7-9相比，也能够增强cona诱导的小鼠脾淋巴细胞转化能力和小鼠nk细胞活性，说明在本发明所限定的保护范围内形成的组合物有助于增强免疫力。
[0074]
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。