gdf-5突变体用于治疗疼痛和软骨破坏的用途
1.发明背景。
发明领域
2.本发明涉及gdf-5突变体(r399e)、其制剂和治疗组合物用于在患有骨关节炎(oa)或其他炎性关节疾病的患者体内注射以减轻疼痛和炎症的用途。
3.骨关节炎为最常见的关节炎形式，影响着全世界数百万人。当缓冲骨末端的保护性软骨随着时间的推移而磨损时，就会发生这种情况。尽管骨关节炎可损伤任何关节，但这种障碍最常影响手部、膝盖、髋部和脊柱的关节。
4.无论其原因(衰老、遗传易感性、创伤或代谢障碍)是什么，软骨稳态的破裂均诱发软骨细胞深刻的表型改变，这随后促进诱导软骨损伤和靶向其他关节组织的因子的子集的合成。有趣的是，在这些因素中存在多种炎症途径的成分。软骨细胞产生细胞因子、趋化因子、警报素、前列腺素和脂肪因子，并且表达细胞因子和趋化因子的多种细胞表面受体以及toll样受体。这些受体激活参与oa关节中软骨细胞的炎症和应激反应的细胞内信号传导通路(houard等人，curr.reumathol rep., 2013, nov; 15(11):375)。
5.oa的症状仅能通过止痛药控制一段时间，但对关节的损伤无法被逆转。保持活动并维持健康的体重可减缓疾病的进展，并助于改善疼痛和关节功能。然而，没有可用的有效治疗可以阻止甚至逆转这种疾病，并且在大多数情况下，受影响关节的破坏和疼痛两者均会进展并且显著影响患者的活动能力、生活质量和工作能力。全关节置换手术通常为患髋部或膝盖oa的患者不可避免和唯一的治疗选择，而疼痛控制通常为其他关节的唯一选择。
6.最近的出版物显示，射线影像学的膝盖oa与心血管疾病、糖尿病和肾脏死亡率的较高风险相关，尤其是在疾病早期发作或肥胖的人群中(mendy等人，int. j. epidemiol. 2018, dec. 1; 47(6):1821)。
7.2015年，10.5% (2560万)的非住院美国成年人报告患有oa。患有oa的成年人带来了3184亿美元的医疗保健费用，相当于美国非住院成年人总医疗保健费用的22.5%，并造成101亿美元的工资损失。oa患病率因年龄(》65岁，25.3%)、性别(女性，13.3%；男性，7.5%)和种族/族群(白人，13.3%；非裔美国人，7.5%；拉丁裔，4.2%；其他，5.3%；p《0.001)而有明显差异。几乎三分之一患有oa的成年人(32.7%)接受处方阿片类药物，而在未患oa者中这一比例为13.8% (p《0.001)。回归分析表明，患有oa的成年人比未患oa者明显更可能报告中度(调整后的优势比[aor]=1.99 [95% ci: 1.65-2.40])或重度(aor=2.59 [2.21-3.04]) pia、任何功能限制(aor=2.51 [2.21-2.85])以及在sf-12身体部分总体评分(sf-12 physical component summary)上较差的hrqol (调整后的β =-3.88 [se: 0.357]; p《0.001)。患有oa的成年人中调整后的年度总医疗保健费用和工资损失相对于未患oa者的增量分别为每人1778美元(7585美元相对于5807美元)和189美元(740美元相对于551美元)，导致估计的全国直接费用增量为450亿美元和间接费用增量为17亿美元(doi: https://doi.org/10.1016/j.jval.2018.04.012)。
[0008]
目前没有既对组织结构病理学(软骨、骨、滑膜、半月板、韧带)具有有益作用，又对
疼痛(无论是急性还是慢性)具有快速缓解作用的可用的骨关节炎治疗。
[0009]
gdf-5 (hotten等人，1994, biochem. biophys res. commun. 204, 646-652, ncbi登录号nm_000557, np_000548)为形态发生素，其已显示在几种组织中促进细胞增殖、分化和/或组织形成。该蛋白也被称为骨形态发生蛋白-14 (bmp-14)或软骨源性形态发生蛋白-1 (cdmp-1)。gdf-5显示软骨形成活性，并且先天性gdf-5突变导致小鼠和人类的指/趾、腕和踝关节的缺陷(storm等人，1994；thomas等人，1997)。gdf-5的表达最显著地局限于关节将在其中发育的区域，并且为关节形成的最早标志物之一(storm和kingsley，1999)。bmp受体信号传导为产后维持关节软骨所需要的(rountree, 2004, plos biol. 2004 november, 2(1))。
[0010]
野生型gdf5处理诱导软骨和骨的形成。因此，设计了gdf5单点突变体，其中氨基酸残基399精氨酸被谷氨酸交换。以下命名为r399e。与具有持续软骨形成潜力的gdf5野生型相比较，r399e显示出降低的骨形成潜力。r399e (gdf5突变体)增加原代猪和人类骨关节炎软骨细胞中的基质产生(t. mang, k. kleinschmidt-doerr, f. ploeger, s. lindemann, a. gigout, doi: https://doi.org/10.1016/j.joca.2018.02.176. april 2018volume 26, supplement 1, page s82)。
[0011]
r399e在wo2013083649a1中被要求保护并且具有改善的诱导软骨形成的能力。该发明的重组gdf-5相关蛋白特别适用于治疗其中期望形成软骨但不期望形成骨的疾病。因此，该发明的另一方面为所述蛋白、核酸、载体或宿主细胞在治疗这些疾病中的用途。特别是，蛋白、核酸、载体或宿主细胞用于治疗软骨缺损或用于治疗创伤性软骨破裂或脱离，包括骨关节炎。
[0012]
gdf-5的领域gdf-5相关蛋白具有改善的诱导软骨形成能力和降低的诱导骨形成能力。新的蛋白在治疗软骨缺损中特别有用，其中骨组织的形成为不期望的。
[0013]
滑膜关节对于骨骼的生物力学功能至关重要。如关节炎疾病中观察到的不当功能直接导致严重的生活质量损失。因此，关节生物学多年来已为广泛研究的重点，这带来了对关节解剖学和组织学以及关节软骨和其他组件在关节功能和维护中的生物力学特性和作用的了解。
[0014]
gdf-5 (hoetten等人，1994, biochem. biophys res. commun. 204, 646-652)为形态发生素，其已显示在几种组织中促进细胞增殖、分化和/或组织形成。该蛋白也被称为形态发生蛋白mp52、骨形态发生蛋白-14 (bmp-14)或软骨源性形态发生蛋白-1 (cdmp-1)。gdf-5显示软骨形成活性，并且先天性gdf-5突变导致小鼠和人类的指/趾、腕和踝关节的缺损(storm等人，1994；thomas等人，1997)。gdf-5的表达最显著地局限于关节将在其中发育的区域，并且为关节形成的最早标志物之一(storm和kingsley，1999)。bmp受体信号传导为产后维持关节软骨所需要的(rountree, 2004, plos biol. 2004 november, 2(11))。gdf-5与gdf-6和gdf-7密切相关。这三种蛋白形成tgf-β超家族的不同亚组，因此显示出类似的生物特性和极高程度的氨基酸序列同一性(参见即wolfman等人，1997, j. clin. invest. 100, 321-330)。所有家族成员最初均被合成为较大的前体蛋白，所述前体蛋白随后在距c-末端约110-140个氨基酸的碱性残基簇处经受蛋白水解切割，从而从n-末端原结构域释放c-末端成熟蛋白部分。成熟多肽在结构上相关并含有包含六或七个典型的
半胱氨酸残基的保守的生物活性结构域，所述半胱氨酸残基负责这些蛋白的特征性三维“胱氨酸结”基序。天然gdf-5相关蛋白为同型二聚体分子，并且主要通过与由i型和ii型丝氨酸/苏氨酸受体激酶组成的特定受体复合物相互作用而发挥作用。受体激酶随后激活smad蛋白，然后smad蛋白将信号传递到细胞核中以调节靶基因的表达。
[0015]
已经反复证明gdf-5/-6/-7亚组的成员为骨和软骨最重要的诱导剂和调节剂(cheng等人，2003, j. bone and joint surg. 85a, 1544-1552; settle等人，2003, developm. biol. 254, 116-130 )。gdf-5和相关蛋白与两种类型的膜结合丝氨酸-苏氨酸激酶受体(被称为i型和ii型)结合并使其寡聚体化。在配体结合后，这些复合物通过使smad转录因子家族的成员磷酸化来转导信号，这些成员在激活后进入细胞核并调节响应基因的转录(massague, 1996)。最近的实验已表明骨骼模式形成中的两种不同的i型受体，bmpr-ia和bmpr-ib。在正常发育期间，两种受体均以动态模式表达。在几种肢体结构中，例如在关节间带和软骨膜中，观察到bmpr-ia和bmpr-ib的重叠表达(mishina等人，1995；zou等人，1997；baur等人，2000)。关于bmpr-ia和bmpr-ib表达模式，gdf-5信号转导应通过与bmpr-ia和bmpr-ib两者的相互作用来完成(chang等人，1994；zou等人，1997)。bmpr-lb基因的无效突变产生具有骨和关节形成缺陷的存活小鼠，所述缺陷与缺失gdf-5的小鼠中所观察到的非常相似(storm和kingsley，1996；yi等人，2000)，而bmpr-ia/小鼠已知在胚胎发生早期死亡(mishina等人，1995)。然而，bmpr-ia在gdf-5-cre驱动因素控制下的条件性敲除会绕过胚胎致命性，并产生具有正常形成的关节的存活小鼠。但是，出生之后关节内的关节软骨在让人想起骨关节炎的过程中磨损，表明此受体在软骨稳态和修复中的重要性(rountree等人，2004)。
[0016]
gdf-5相关蛋白家族的野生型蛋白的活性通常导致软骨和骨的形成。然而，存在不同的医学状况，其中期望形成软骨然而不期望形成骨组织。例如，显然在关节缺损的情况下期望形成软骨，而应当避免骨化。
[0017]
出人意料的是，发现了可提供具有改善的诱导软骨形成能力和降低的诱导骨形成能力的gdf-5相关蛋白的变体。这可通过修饰gdf-5相关蛋白(r399e)使得其对bmpr-ib具有增加的亲和力和/或对bmpr-ia具有降低的亲和力来实现，并且这为最接近的现有技术wo2013083649a1的主题。
[0018]
野生型gdf-5在体外结合bmpr-ib的亲和力比bmpr-ia (kd ~1-1.1 nm)高约40-120倍(kd ~8-27 pm)。发现了通过改变gdf-5相关蛋白的结合亲和力使得对bmpr-ib的亲和力增加而对bmpr-ia的亲和力降低，促进了软骨形成而减少了骨形成。这可通过在gdf-5相关蛋白的氨基酸序列中与bmpr-ib和/或bmpr-ia结合位点相关的一个或多个氨基酸残基的特定取代来实现。
[0019]
将具有特定取代的gdf-5相关蛋白的结合亲和力与人类野生型gdf-5相关蛋白，特别是人类野生型gdf-5的结合亲和力进行比较。
[0020]
为避免误解和歧义，本文对一些常用术语进行定义和举例说明如下：如本文所使用的，术语“胱氨酸结结构域”意指存在于tgf-β超家族蛋白(比如，即人类gdf-5)成熟部分中并形成被称为胱氨酸结的三维蛋白结构的众所周知且保守的富含半胱氨酸的氨基酸区域。在此结构域中，半胱氨酸残基彼此的相应位置是重要的，并且仅允许略微地变化以免失去生物活性。已经证明，单独的胱氨酸结结构域足以实现该蛋白的生
物功能(schreuder等人，(2005), biochem biophys res commun. 329, 1076-86)。胱氨酸结结构域的共有序列在现有技术中为众所周知的。根据本文定义的定义，蛋白的胱氨酸结结构域以参与相应蛋白的胱氨酸结的第一个半胱氨酸残基开始，并以参与相应蛋白的胱氨酸结的最后一个半胱氨酸之后的残基结束。
[0021]
如本文所使用的，术语“gdf-5相关蛋白”意指与人类生长/分化因子5 (hgdf-5)非常密切相关的任何天然存在的或人工产生的蛋白。所有gfd-5相关蛋白的共同特征为存在与人类gdf-5的102个aa的胱氨酸结结构域(氨基酸400-501)具有至少60%氨基酸同一性的胱氨酸结结构域，这足以实现该蛋白的生物功能。术语“gdf-5相关蛋白”包括属于来自脊椎动物或哺乳动物物种的gdf-5、gdf-6和gdf-7蛋白组的蛋白及其重组变体，只要这些蛋白显示与人类gdf-5的胱氨酸结结构域具有上述百分比的同一性。60%的限值非常适合于将gdf-5/-6/-7蛋白组的成员及其变体与其他蛋白(比如关系更远的gdf和bmp)分开。人类gdf-5、人类gdf-6和人类gdf-7的102个aa的胱氨酸结结构域的比较揭示这些蛋白之间的高度氨基酸同一性。人类gdf-6与人类gdf-5的胱氨酸结结构域共享87个(85%)相同的残基，以及人类gdf-7与人类gdf-5的胱氨酸结结构域共享83个(81%)相同的残基。当与人类gdf-5相比较时，迄今为止已鉴定的来自其他脊椎动物和哺乳动物物种的gdf-5/-6/-7分子的相应结构域也显示出非常高的同一性百分比，至少为75% (在79%-99%之间)。相比之下，不属于gdf-5/-6/-7亚组的gdf和bmp显示低于60%的低得多的同一性值。
[0022]
脊椎动物和哺乳动物gdf-5相关蛋白的非限制性实例为人类gdf-5的前体和成熟蛋白(在wo95/04819中公开为mp52和在hotten等人，1994, biochem. biophys res. commun. 204, 646-652中公开为人类gdf-5)、重组人类(rh) gdf-5/mp52 (wo96/33215)、mp52 arg (wo97/06254)；hmw人类mp52 (w097/04095)、cdmp-1 (w096/14335)、小鼠(小家鼠) gdf-5 (us 5,801,014)、兔(家兔) gdf-5 (sanyal等人，2000, mol biotechnol. 16, 203-210)、鸡(红原鸡) gdf-5 (ncbi登录号np_989669)、非洲爪蛙(非洲爪蟾) gdf-5 (ncbi登录号aat99303)、单体gdf-5 (wo 01/1 1041和wo 99/6161 1)、人类gdf-6/bmp-13 (us 5,658,882)、小鼠gdf-6 (ncbi登录号np_038554)、gdf-6/cdmp-2 (wo96/14335)、人类gdf-7/bmp-12 (us 5,658,882)、小鼠gdf-7 (ncbi登录号aap97721)、gdf-7/cdmp-3 (wo96/143335)。本发明还涵盖具有另外的突变(比如取代、添加和缺失)的gdf-5相关蛋白，只要这些另外的突变并不完全消除生物蛋白活性。
[0023]
发明背景的讨论没有药物可用于在oa患者体内既快速和持久地治疗疼痛和炎症，又同时可持续地治疗关节组织和形态(软骨、骨、滑膜、半月板、韧带)的结构变化。
[0024]
可助于缓解骨关节炎症状并且主要是疼痛但对结构没有或者甚至具有负面影响的药物包括：对乙酰氨基酚. 对乙酰氨基酚(泰诺等)已显示可帮助一些具有轻度至中度疼痛的骨关节炎患者。服用超过推荐剂量的对乙酰氨基酚会导致肝损伤。
[0025]
非甾体抗炎药(nsaid). 以推荐剂量服用的非处方nsaid，比如布洛芬(雅维(advil)、美林ib (motrin ib)等)和萘普生钠(爱利福(aleve)等)，通常缓解骨关节炎疼痛。更强的nsaid可通过处方获得。nsaid可导致胃部不适、心血管问题、出血问题以及肝肾损伤。nsaid作为涂抹于受影响关节的皮肤上的凝胶具有较少副作用，并且也可缓解疼痛。
[0026]
度洛西汀(欣百达(cymbalta)). 通常被用作抗抑郁药，这种药物也被批准用于治疗慢性疼痛，包括骨关节炎疼痛。
[0027]
可的松注射液. 注射皮质类固醇药物可缓解关节疼痛。患者每年可接受的可的松注射次数通常限于3-4次注射，因为该药物可随着时间的推移使关节损伤恶化。
[0028]
一种抗ngf (神经生长因子)抗体(他尼组单抗(tanezumab)，pfizer)目前正处于临床开发中用于oa。该化合物对治疗oa患者的疼痛高度有效，但与其他止痛药一样，对疾病的根本原因没有有益作用。相比之下，在接受抗ngf治疗的大量患者中，疾病进展明显加快(rpoa=快速进展的oa)。rpoa总体发生率在他尼组单抗5 mg组中为6.3%，在他尼组单抗2.5 mg组中为3.2%和在nsaid组中为1.2%。我们在大鼠和兔的oa动物模型中证实了抗ngf治疗的这些负面影响。
[0029]
可用于治疗oa疼痛的止痛药具有显著的副作用和不良事件。它们均不减缓或阻止疾病进展或者对关节结构具有有益作用。它们均没有对软骨基质的产生具有治愈性或有益的生物活性，也没有重新平衡关节稳态的病理变化。一些(他尼组单抗)甚至加快了oa患者的疾病进展。
[0030]
其他可用的oa疗法为外科手术或没有疾病改善作用：润滑注射. 注射透明质酸可通过在膝盖中提供一些缓冲来提供疼痛缓解，尽管研究表明这些注射并不比安慰剂提供更多的缓解，并且对结构变化和组织病理学根本没有影响。
[0031]
关节置换. 在关节置换手术(关节成形术)中，外科医生去除受损的关节表面并用塑料和金属部件置换它们。手术风险包括感染和血栓。人工关节可能会磨损或松动，并且最终可能需要更换。
[0032]
存在正处于临床开发中用于oa的结构修饰剂，但这种分子对oa疼痛没有有益的作用。成纤维细胞生长因子18 (fgf18，司瑞菲敏(sprifermin)，merck)显示了诱导软骨细胞增殖。在ii期试验中，司瑞菲敏使oa患者的股胫关节软骨总厚度在2年之后增加0.5 mm。与安慰剂相比较，任何司瑞菲敏组的总womac疼痛评分相对于基线的平均绝对变化没有统计学显著差异。
[0033]
没有减缓或阻止oa疾病进展，对软骨基质的产生具有治愈性或有益的生物活性，或重新平衡关节稳态的病理变化，并同时影响oa疼痛的可用治疗。
[0034]
作为有效改善疾病的oa治疗，尤其是当与全身或解剖学变化相关时，会需要反复给予并且作为终身治疗，其必须为安全的。全身治疗之后的高度全身药物暴露会增加不需要的全身效应或对非患病关节中的软骨、滑膜和骨的影响的风险。另一方面，推荐关节内注射的频次不超过每年6次。
[0035]
没有对oa的结构和疼痛具有有益作用并且对间歇治疗有效的可用化合物。
[0036]
r399e为第一种对疼痛具有快速和持久的作用，并且同时通过以相同剂量在oa动物模型和人体组织中减少软骨破坏、诱导软骨基质产生和使关节稳态正常化而阻止疾病进展的治疗方法。r399e对体内oa疼痛的有益作用已在2个物种体内得到证实(图1和2)。此外，r399e对oa软骨结构的有益作用已在2个物种体内得到证实(图15、16、17)。没有其他已知的分子、蛋白或现有技术的组合显示对oa中的疼痛和软骨结构具有有益作用。此外，r399e在使用来自健康动物的组织和原代细胞和人类oa关节置换手术的相关体外实验中减少炎症
和细胞因子释放，从而实现关节稳态的正常化(图8、9、10、11、13)。r399e抑制相关健康动物和人类oa体内实验中的pge2释放，并且此外ngf诱导oa半月板细胞中pge2的产生(图8、12)。pge2为软骨退化和疼痛的重要介质(lee等人，gene. 2013 sept 25; 527(2):440-7)。r399e通过在人体oa组织和细胞培养物以及健康猪细胞的体外实验中阻止gag的释放(chun等人，tissue eng. regen med 2019 jul 5; 16(4):385-393)以及释放并降低adamts5、mmp13和mmp1的表达而显示抗分解代谢作用(图8、13、14)。作为adamts5的金属蛋白酶和作为mmp13的基质金属蛋白酶在oa的发生中起重要作用(bondeson等人，clin exp rheumatol. 2008 jan-feb; 26(1):139-45和xie等人，chemmedchem. 2017 aug 8;12(15):1157-1168)。r399e在健康动物及人类oa组织和细胞培养物中显示促合成代谢作用(图18、19、20、21、22)。r399e显示免疫组织学和基因表达分析糖胺聚糖和羟脯氨酸合成的诱导以及胶原蛋白-ii、胶原蛋白-vi、sox9和聚集蛋白聚糖的基因表达(图21)。用r399e处理人类oa的软骨细胞培养物也显示对软骨形成的影响，即使不常给予r399e。
[0037]
r399e的促合成代谢作用也表现在生物标志物的上调，所述标志物被认为在oa中显示出积极趋势如proc2、proc6和cilp-2。图23显示人类oa组织的情况。
[0038]
r399e易于穿透软骨，并且可在ia注射之后7天在靠近细胞的软骨基质内找到。在ia兔pk研究中，在滑液和软骨中发现了r399e，由此6 μg注射的r399e直到第三天都可被检测到。注射60 μg r399e可在滑液中持续14天和在软骨中持续长达7天被检测到。尽管与gdf5野生型相比较该分子的稳定性增加，但血清半衰期不超过3.20小时，并且在小型猪和兔中可量化持续长达72小时，且在药代动力学和非临床安全性研究中于大鼠、小型猪和兔中进行ia和iv应用之后安全性也是清晰的。连同生理ph下生物液体中约1 μg/ml的低溶解度一起，我们不认为稳定性增加会增加安全风险。
[0039]
用r399e进行的间歇性局部(关节内)治疗足以对疼痛和结构具有有益作用，并导致全身暴露低且非常短。相比之下，对于gdf5野生型，如果存在软骨，则r399e会快速地从周围液体中被吸收。这使得接受r399e的关节内治疗不仅高度有效而且安全。
[0040]
以对结构产生有益作用的相同剂量和方案，r399e对转化性骨关节炎模型的疼痛具有快速和持久的作用。使用其中可将药效学效果与临床上对疼痛(抗ngf抗体、曲安西龙)或结构(司瑞菲敏)有效的药物进行比较的模型。
[0041]
发明概述本发明的优选实施方案为将r399e ia注射到具有和不具有关节炎症的骨关节炎患者的关节中，以减轻炎症和疼痛并改善关节组织结构。
[0042]
此外，r399e将减少局部细胞因子和前列腺素e2的产生，并从而减少关节炎症和疼痛。r399e将减少局部adamts5和mmp-13的产生，并从而不仅防止软骨裂开，而且通过防止damp释放来进一步减轻关节炎症和疼痛，这也可防止神经元对damp的敏化。减少细胞因子产生也可通过减少对bmpr表达的下调作用来恢复对内源性bmp和治疗本身的反应性。r399e直接诱导骨关节炎软骨细胞的细胞外基质形成，并从而可支持骨关节炎关节的结构修复。
[0043]
在创伤事件之后将r399e ia注射到关节中以防止软骨或半月板退化并减轻炎症。这将降低后期骨关节炎发展的风险。
[0044]
本发明基于发明人发现可通过在gdf-5相关蛋白的氨基酸序列中参与结合至bmpr-ib和/或bmpr-ia的区域中的特定修饰来改变蛋白，由此使其具有提高的诱导软骨形
成能力和降低的诱导骨形成能力。
[0045]
发现对bmpr-ib具有增加的亲和力的蛋白和/或对bmpr-ia具有降低的亲和力的蛋白能够更好地诱导软骨形成而骨的形成减少。这些特性在显示对bmpr-ib亲和力增加和对bmpr-ia亲和力降低两者的蛋白尤其明显。
[0046]
本发明的gdf-5相关蛋白可通过化学修饰或基因工程技术获得，且重组蛋白是优选的。可通过替换与gdf-5相关蛋白的氨基酸序列中的bmpr-ib和/或bmpr-ia结合位点相关的至少一个氨基酸残基来获得该蛋白。
[0047]
用于在患有oa或其他炎症性疾病的患者中注射的蛋白为人类gdf-5的变体，由此399位的精氨酸残基与谷氨酸交换(r399e)。参考gdf-5的成熟序列，这对应于第18位的取代。出人意料的是，发现这种蛋白变体对bmpr-ia的亲和力明显降低。相比之下，对bmpr-ib的亲和力几乎未受影响。
[0048]
优选地，本发明的gdf-5相关蛋白(r399e)作为“分离的”蛋白存在。这意味着本发明的蛋白基本上与所分离蛋白的天然来源中存在的其他蛋白和肽分子(例如天然来源蛋白的其他多肽)分开。例如，重组表达的肽被认为是分离的。根据本发明的优选实施方案，变体蛋白为重组蛋白。进一步地，如果肽已通过人类干预而改变或由并非其天然来源的生物体表达，则其也被认为是分离的。此外，当通过重组技术或化学前体或其他化学品在化学合成时产生时，“分离的”蛋白不含与其天然相关的一些其他细胞材料或细胞培养基。从“分离的”蛋白的定义中特别排除的为未纯化的混合物或组合物。
[0049]
本技术的进一步的主题内容为包含根据本发明的重组gdf-5相关蛋白或核酸或载体或宿主细胞的药用组合物。原则上，在gdf-5相关蛋白的上下文中任何已经公开的药用组合物均为合适的。可认为表达载体或宿主细胞作为药用组合物中的活性物质为有利的。此外，根据本发明的蛋白与其他蛋白的组合可用于优选的药用组合物中。当然，本发明还包括含有进一步的物质(例如药理学上可接受的添加剂或载剂)的药用组合物。制剂可包括抗氧化剂、防腐剂、着色剂、矫味和乳化剂、悬浮剂、溶剂、填充剂、膨胀剂、缓冲剂、递送媒介物、赋形剂和/或药用佐剂。例如，合适的载剂或媒介物可为注射用水、生理盐水溶液或与合适的载体蛋白(比如血清白蛋白)混合的盐水溶液。用于制备本发明组合物的优选抗氧化剂为抗坏血酸。
[0050]
药用组合物的溶剂或稀释剂可为水性或非水性的，并且可含有能够改变和/或维持制剂的ph、渗透压、粘度、澄明度、规模、无菌性、稳定性、溶出速率或气味的其他药学上可接受的赋形剂。类似地，根据本发明的药用组合物中可包括其他组分以改变和/或维持药学上有效物质的释放速率。这种改变组分为本领域通常采用的物质，以配制呈单位剂量或多剂量形式的用于肠胃外给予的剂量。
[0051]
根据本发明制备的最终配制的药用组合物可呈溶液剂、混悬剂、凝胶剂、乳剂、固体或脱水或冻干粉剂的形式储存于无菌小瓶中。这些制剂可呈即用形式或呈例如如果是冻干粉剂(需要在给予之前重构成)的形式储存。以上和进一步合适的药用制剂为本领域已知的并且描述于例如gus remington's pharmaceutical sciences (第18版, mack publishing co., eastern, pa., 1990, 1435-1712)中。这种制剂可影响药用有效成分的物理状态、稳定性、体内释放速率和体内清除速率。
[0052]
其他有效的给予形式包括肠胃外缓释(即延迟)制剂、吸入雾剂或口服活性制剂。
例如，缓释制剂可包含结合或掺入到聚合化合物(比如聚乳酸、聚乙醇酸等)或脂质体的颗粒制剂中的蛋白。
[0053]
根据本发明的药用物组合物还可被配制为用于肠胃外给予，例如通过输注或注射，并且还可包括缓释或持续循环制剂。此类肠胃外给予的治疗组合物一般呈无热原、肠胃外可接受的水溶液剂的形式，其包含在药学上可接受的载剂和/或稀释剂中的药学上有效的成分。
[0054]
药用组合物可包含基质材料，例如在其中预期再生软骨的情况下。当蛋白、核酸、表达载体或宿主细胞被应用于生物相容性基质材料中和/或之上时，对它们是有利的。如本文所使用的，基质材料意指充当用于细胞募集、附着、增殖和分化的支架和/或充当本发明的重组gdf-5相关蛋白的潜在递送和储存装置的载剂或基质。与固体基质形成对比，载剂由没有确定的表面并且缺乏特定的形状无定形材料组成，所述材料即烷基纤维素、普朗尼克、明胶、聚乙二醇、糊精、植物油、糖及其他液体和粘性物质。
[0055]
示例性的基质材料例如描述于wo 98/21972中。这些基质材料同样适合于根据本发明的蛋白。基质材料可例如通过外科手术而被移植到患者体内，其中蛋白或编码蛋白的dna可从基质材料中缓慢释放，并然后在长时间段内有效。根据本发明，所有类型的基质材料均为有用的，只要其为生物相容的并且被选择用于预期区域或用途指示。基质材料可为天然材料、改性天然材料以及合成材料。涵盖所有已知的用于形态发生蛋白的基质。细胞外基质包含例如各种胶原蛋白，例如i、ii、v、ix、x、xi和xiii型；进一步的蛋白聚糖和糖胺聚糖，例如硫酸软骨素、双糖链蛋白聚糖、饰胶蛋白聚糖(decorine)和/或透明质酸；或非胶原蛋白，例如骨桥蛋白、层粘连蛋白、纤连蛋白、玻连蛋白和软骨基质蛋白。所有提及的天然材料也可以人工改性的形式使用。对于有用载剂和基质的非限制性列表(进一步参见kirker-head, 2000, advanced drug delivery 43, 65-92)。
[0056]
进一步的可能性涉及包含根据本发明的重组gdf-5相关蛋白的脂质体制剂。用于所述制剂的脂质体为本领域技术人员通常已知的。特别是，优选的脂质体制剂公开于wo 2008/049588中。更优选的脂质体制剂描述于wo 2008/049588的第9-13页。
[0057]
此外，本发明的gdf-5变体蛋白(r399e)可与其他药用活性物质组合给予。所述药用活性物质可为例如止痛药(比如局部有效的止痛药)或对其中期望形成软骨的疾病具有积极作用的其他物质(如蛋白酶抑制剂)。这些仅为可能的添加剂的实例，并且本领域的技术人员可易于添加用于药用制剂或通常认为安全的其他赋形剂。
[0058]
本发明的重组gdf-5变体蛋白由于其改善的诱导软骨形成的能力而特别适用于治疗其中期望形成软骨但不期望形成骨的疾病。
[0059]
因此，本发明的另一方面为本蛋白(r399e)、核酸、载体或宿主细胞在治疗这些疾病中的用途。特别是，本蛋白、核酸、载体或宿主细胞是用于治疗软骨缺损或用于治疗软骨的创伤性破裂或脱离的，特别是年龄相关的软骨缺损(例如由磨损引起)、骨关节炎、类风湿性关节炎、运动疾病相关的损伤(如半月板损伤或韧带断裂)、可影响软骨的疾病(如软骨营养障碍)、特征为生长障碍和随后的软骨骨化的疾病、软骨发育不全、肋软骨炎、椎间盘突出和椎间盘修复、复发性多软骨炎、与肿瘤(无论是良性还是恶性的，如软骨瘤或软骨肉瘤)相关的软骨缺损修复。
[0060]
另一方面为用于治疗其中期望形成软骨但不期望形成骨的疾病的方法，包括将根
据本发明的蛋白、核酸、载体或宿主细胞给予需要此类治疗的患者的步骤。
[0061]
如本文所使用的，术语“治疗”是指逆转、减轻或抑制这种术语适用的疾病、障碍或病症或此类疾病、障碍或病症的一种或多种症状的进展。如本文所使用的，治疗还可指与未治疗的对照群体相比较或与治疗之前的相同哺乳动物相比较，降低哺乳动物中疾病、障碍或病症发生的可能性或发生率。例如，如本文所使用的，治疗可指预防疾病、障碍或病症并且可包括延迟或预防疾病、障碍或病症的发作或者延迟或预防与疾病、障碍或病症相关的症状。如本文所使用的，治疗还可指在哺乳动物患有疾病、障碍或病症之前降低疾病、障碍或病症或与这种疾病、障碍或病症相关的症状的严重性。在患病之前疾病、障碍或病症的此类预防或降低严重性涉及将如本文所述的本发明组合物给予在给予时未患有疾病、障碍或病症的受试者。如本文所使用的，治疗还可指预防疾病、障碍或病症或与这种疾病、障碍或病症相关的一种或多种症状的复发。
[0062]
附图和表的简述图1. 大鼠骨关节炎模型中的疼痛读数在手术大鼠骨关节炎模型的慢性晚期阶段在数天内对疼痛的显著影响。
[0063]
图2. 大鼠骨关节炎模型中的疼痛读数在大鼠aclt pmx oa模型中，当在手术后1周的早期阶段开始治疗时，每6周的ia治疗方案优于每4周或每2周的治疗方案(b)。
[0064]
图3. 兔骨关节炎模型中的疼痛读数首次ia注射r399e之后6小时在兔aclt pmx骨关节炎模型中对疼痛的显著影响在手术之前进行2次基线失能测量。在第0周，通过aclt pmx膝盖手术在兔的右膝关节中诱导oa。在第1周关节内(ia)注射r399e，并在6小时后测量静态承重。使用非接触式静态失能测量来测量承重，由此平板测量与未手术的左后肢相比较施加于手术和注射的右后肢上的压力。数据为施加于右后肢的重量比左后肢的百分比，由此50%对应于两腿的相同负荷，和0%对应于负荷仅在未手术的左肢上。
[0065]
图4. 兔骨关节炎模型中的疼痛读数在第二项独立研究中证实了第一次注射之后6小时在兔aclt pmx骨关节炎模型中对疼痛的显著影响，并将一次r399e注射的效果与临床有效的曲安西龙进行比较在手术之前进行2次基线失能测量。在第0周，通过aclt pmx膝盖手术在兔的右膝关节中诱导oa。在第1周关节内(ia)注射r399e，并在6小时后测量静态承重。使用非接触式静态失能测量来测量承重，由此平板测量与未手术的左后肢相比较施加于手术和注射的右后肢上的压力。数据为施加于右后肢的重量比左后肢的百分比，由此50%对应于两腿的相同负荷，和0%对应于负荷仅在未手术的左肢上。效果大小与临床有效的曲安西龙治疗进行比较。1.41 mg曲安西龙对应于基于代谢体重、滑液体积和软骨表面积计算的人体等效剂量。
[0066]
图5. 兔骨关节炎模型中的疼痛读数在第一次注射之后的前2周期间，一次r399e注射或曲安西龙治疗在兔oa模型中对oa疼痛的影响。
[0067]
在手术之前进行2次基线失能测量。在第0周，通过aclt pmx膝盖手术在兔的右膝关节中诱导oa。在第1和第3周关节内(ia)注射r399e，并且总是在注射之前和第一次注射之后6小时测量静态承重。使用非接触式静态失能测量来测量承重，由此平板测量与未手术的
左后肢相比较施加于手术和注射的右后肢上的压力。数据为施加于右后肢的重量比左后肢的百分比，由此50%对应于两腿的相同负荷，和0%对应于负荷仅在未手术的左肢上。效果大小与临床有效的曲安西龙治疗进行比较。1.41 mg曲安西龙对应于基于代谢体重、滑液体积和软骨表面积计算的人体等效剂量。
[0068]
图6. 兔骨关节炎模型中的疼痛读数在兔的手术oa模型中，一次ia r399e注射对oa疼痛的显著影响持续至少2周，直至下一次注射。此外，在模型的慢性期，r399e对疼痛具有持久的显著影响。
[0069]
在手术之前进行2次基线失能测量。在第0周，通过aclt pmx膝盖手术在兔的右膝关节中诱导oa。在手术后第1、3、5、7、9和11周关节内(ia)注射r399e，并且总是在注射之前和第一次注射之后6小时测量静态承重。使用非接触式静态失能测量来测量承重，由此平板测量与未手术的左后肢相比较施加于手术和注射的右后肢上的压力。数据为施加于右后肢的重量比左后肢的百分比，由此50%对应于两腿的相同负荷，和0%对应于负荷仅在未手术的左肢上。r399e的所有测试的剂量对关节疼痛均具有快速显著的有益作用，持续至少14天，直至下一次注射和直至研究结束。
[0070]
图7. 兔骨关节炎模型中的疼痛读数兔aclt pmx oa模型中在慢性期期间，r399e对疼痛的长期影响与临床有效的抗ngf抗体治疗的效果大小相当在手术之前进行2次基线失能测量。在第0周，通过aclt pmx膝盖手术在兔的右膝关节中诱导oa。在手术后第1、3、5、7、9和11周关节内(ia)注射r399e，并且总是在注射之前和第一次注射之后6小时测量静态承重。使用非接触式静态失能测量来测量承重，由此平板测量与未手术的左后肢相比较施加于手术和注射的右后肢上的压力。数据为施加于右后肢的重量比左后肢的百分比，由此50%对应于两腿的相同负荷，和0%对应于负荷仅在未手术的左肢上。r399e的所有测试的剂量对关节疼痛均具有快速显著的有益作用，持续至少14天，直至下一次注射和直至研究结束。将对慢性疼痛的效果大小与oa进展慢性期第5和第9周用临床有效的抗ngf-ab治疗所达到的效果大小进行比较。在第1周对接受曲安西龙的相同动物给予两次抗ngf-ab。
[0071]
图8. 人类骨关节炎滑膜和软骨外植体的共培养在人类骨关节炎滑膜和软骨共培养物中，r399e减少基质gag损失、白细胞介素-1和前列腺素2释放。
[0072]
图9. 人类oa软骨细胞3d海藻酸盐珠粒培养用脂多糖(lps)、白细胞介素-1β (il1β)、肿瘤坏死因子-α(tnfα)或白细胞介素-6 (il6)永久处理的原代人类oa软骨细胞(海藻酸盐珠粒培养，380 mosm，300 ng/ml，7天)显示受损的骨形态发生蛋白受体(bmpr)表达。bmpr为软骨、骨和半月板稳态的关键。它们为骨形态发生蛋白(如bmp2或7)的主要信息接收者，也为gdf5和r399e的主要信息接收者。
[0073]
ag-algin-17-008：5个供体的单层人类oa软骨细胞，48 h内用il1β 10 ng/ml、tnfα 10 ng/ml、il6 100 ng/ml或lps 1 μg/ml。统计学：单因素anova然后是dunnet检验(校正用于多重比较)。*意指具有统计学差异，p《0.05。
[0074]
图10. 猪半月板培养物r399e可减少猪半月板培养物中的基质损失和细胞因子产生。
[0075]
图11. 滑膜细胞系sw982和原代人类骨关节炎滑膜细胞培养il-1 (a)和-6 (b)在滑膜细胞系sw982和原代oa滑膜细胞中的释放(c、d)sw982 (滑膜细胞系)细胞用3种不同浓度的r399e处理72小时。r399e在300 ng/ml下显著降低il-1β (a)和il6 (b)水平。将收获自从全膝置换手术中获得的滑膜样品中的原代oa滑膜细胞用3种不同浓度的r399e处理72小时。r399e在900 ng/ml下显著降低il-1β (c)并降低il6水平(d)。
[0076]
图12. 原代人类骨关节炎半月板细胞培养r399e在体外抑制原代人类半月板细胞中ngf刺激的pge2释放。
[0077]
图13. 原代猪健康软骨细胞培养r399e抑制il-1β刺激的猪软骨细胞中adamts5 (a)表达和mmp1 (b)释放的上调。
[0078]
图14. 原代人类骨关节炎软骨细胞培养r399e降低在380 mosm下2周海藻酸盐珠粒培养中的人类oa软骨细胞中的mmp13和adamts5表达。两种蛋白酶均为通过切割胶原蛋白和聚集蛋白聚糖而导致oa疾病进展的主要驱动因素。所得damp (损伤相关分子模式)与介导疼痛(rosenberg等人，mol cell biochem. 2017 dec;436(1-2):59-69. doi: 10.1007/s11010-017-3078-x. epub 2017 jun 1.)和炎症的toll样受体(miller等人，arthritis rheumatol.作者原稿；可得于pmc 2016 nov 1.以最终编辑形式出版为：arthritis rheumatol. 2015 nov; 67(11): 2933-2943.doi: 10.1002/art.39291)结合。
[0079]
图15. 兔骨关节炎模型中的结构读数r399e在组织学(a)和微型ct (b、c)读数中对兔aclt pmx oa模型中的软骨结构具有显著的有益作用。在微型ct中，软骨厚度和体积通过对比增强的关节腔的分割来量化。
[0080]
图16. 绵羊骨关节炎模型中的结构读数在组织学中，r399e在绵羊oa关节不稳定性初步研究中对软骨结构具有显著的有益作用。从手术后1周开始，每4周注射3次r399e。
[0081]
图17. 绵羊骨关节炎模型中的结构读数在mri中，r399e在绵羊oa关节不稳定性初步研究中对软骨结构具有有益作用(无统计显著性)。从手术后1周开始，每4周注射3次r399e。
[0082]
图18. 原代猪健康软骨细胞培养380 mosm下猪健康软骨细胞的软骨组织类似物(cta) 3d培养中的细胞外基质的产生，无论是否用永久性r399e处理，均显示出显著的促合成代谢作用。
[0083]
原代猪健康软骨细胞(4周3d培养软骨组织类似物, 380 mosm, 300 ng/ml)。
[0084]
图19. 原代人类骨关节炎软骨细胞3d海藻酸盐珠粒培养r399e剂量依赖性地增加人类oa软骨细胞gag、hpro、proc2的细胞外基质产生。
[0085]
图20. 原代人类骨关节炎软骨细胞3d海藻酸盐珠粒培养r399e剂量依赖性地增加人类oa软骨细胞的聚集蛋白聚糖产生。
[0086]
化合物对人类oa软骨细胞海藻酸盐珠粒中聚集蛋白聚糖的产生的影响。从3个独立的供体中分离软骨细胞。在7天内用不同浓度的化合物刺激细胞。在珠粒解聚合之后于区间基质中测量聚集蛋白聚糖，并与第7天的对照水平进行比较。
[0087]
图21. 原代人类骨关节炎软骨细胞3d海藻酸盐珠粒培养
在380 mosm下，在有或没有r399e的情况下，两周海藻酸盐包封3d培养的人类oa软骨细胞中的细胞外基质产生原代人类oa软骨细胞(2周海藻酸盐珠粒培养, 380 mosm, 300 ng/ml)图22. 原代人类骨关节炎软骨细胞3d海藻酸盐珠粒培养用r399e进行间歇性治疗随着时间的推移足以达到显著的促合成代谢作用。如前所述在海藻酸盐中培养人类oa软骨细胞，并且每月用300 ng/ml的r399e处理1周、2周、3周或4周或者不进行处理，且最后量化gag含量。
[0088]
原代人类oa软骨细胞(海藻酸盐珠粒培养, 380 mosm, 300 ng/ml)；细胞=软骨细胞的数量，gag =聚集蛋白聚糖的成分，hpro (羟脯氨酸) = ii型胶原蛋白的成分，proc2 = ii型胶原蛋白产生的生物标志物。
[0089]
图23. 原代人类骨关节炎软骨细胞3d海藻酸盐珠粒培养在380 mosm下，在有或没有r399e的情况下，4周海藻酸盐包封3d培养的人类oa软骨细胞中的proc2 (a)、proc6 (b)和cilp-2 (c)的促合成代谢生物标志物测量。
[0090]
表1. kk-大鼠-14-09的治疗方案和研究大纲在大鼠aclt pmx oa模型中测试3种不同的方案和9种剂量。研究以每组n = 10只动物推动。灰色区域中的数字表示在30
ꢀµ
l总注射体积中以ng为单位的关节内(ia)应用的剂量。每2周进行步态分析，并在第15或第16周进行vonfrey超敏反应测试。
[0091]
表2. 大鼠骨关节炎模型中的疼痛读数不同剂量和方案的ia r399e治疗在大鼠oa不稳定性模型中的症状获益。该表格仅列出了比安慰剂好》 30%的那些效果。在大鼠中每6周注射2次1350 ng见到最为有效和可持续的效果。
实施例
[0092]
实施例1在手术诱导的慢性大鼠oa模型中，当在关节不稳定化手术之后12周给予时，r399e的一次关节内(ia)注射在晚期疾病中在14天内对疼痛具有显著效果(cb-大鼠-14-029，参见图1)。
[0093]
前交叉韧带横切(aclt)及内侧半月板切除(pmx)作为啮齿动物的不稳定性oa模型是在机构内建立的，由于关节中的变化与oa患者中发现的那些(软骨损伤、骨赘、软骨下硬化、步态受损和基于炎症的超敏反应)类似。通过猫步测试确定的步态障碍症状被用作主要读数，类似于要求患者评价他们在平坦表面上行走期间所经历的疼痛的临床问卷调查(参见ferreira-gomes等人，the journal of pain: official journal of the american pain society. 2008 oct; 9(10):945-54. pubmed pmid: 18650131)。aclt pmx手术诱发的关节不稳定性导致胫骨内侧髁上出现点状异常负荷，这已导致在一周内软骨破坏(参见naveen等人，international journal of medical sciences. 2014; 11(1):97-105. pubmed pmid: 24396291. pubmed central pmcid: 3880996)。
[0094]
步态障碍一般发生于手术之后一周内(术后疼痛)，然后是无症状期，并且最后在慢性oa晚期阶段恢复。这种晚期步态障碍阶段被理解为oa疼痛阶段。为了研究单次注射r399e是否可在结构修复效应之前产生症状获益，在cb-大鼠-14-029中，在aclt pmx手术之
后12周，当慢性oa疼痛引起的步态障碍已经完全建立时，r3399e作为单次注射(以3个剂量ia)给予。在对测试设施适应3周之后，大鼠接受假手术(皮肤切口)或aclt pmx手术。为了确定oa疼痛相关的症状，在手术之后10、11和12周时通过猫步测试确定步态障碍。所有显示出步态障碍症状的大鼠被随机分成4个治疗组(用不同剂量r399e的3组和安慰剂对照)，并在aclt pmx手术之后第81天接受一次ia注射。基于在这3周时间段期间对aclt pmx手术最敏感的步态参数，我们确定了8只大鼠为无症状的并将其从研究中排除。剩余的40只大鼠基于其步态障碍随机分成4组，在手术之后第80天接受ia安慰剂或r399e (90 ng、900 ng或9000 ng/关节)。如分析计划中预先规定的，在这种单次注射之后1、3、7和14天通过猫步测试确定治疗效果，并比较组间全部4次测量的平均值。在这段时间内，已确定了6个步态参数在假手术 安慰剂和aclt pmx 安慰剂组之间存在显著差异，并且因此将所述参数用于描述oa疾病相关的症状。我们发现，在注射之后紧接的这段时间内，所有这些疾病相关的步态参数均受到注射r399e的积极影响。所有合格参数的相比于安慰剂的获益百分比揭示，900 ng/关节的r399e为最有效的剂量，其产生60%的症状获益。最低剂量[90 ng/关节]几乎没有效果，并且最高剂量[9000 ng/关节]超过安慰剂产生40%的获益(参见图1)。
[0095]
实施例1.1在实施例1中所使用的相同大鼠模型中，r399e对oa疼痛的效果持续至少6周，直至下一次注射(kk-大鼠-14-009，参见图2及表1和表2)。kk-大鼠-14-009使用相同的手术大鼠oa模型，并且被设计为研究在慢性大鼠骨关节炎疼痛模型中，当以不同剂量和方案不断给予时，慢性关节内(ia)注射r399e是否具有症状获益。基于对软骨基质产生的体外ec
50
为108 ng/ml(参见图20)以及在兔初步研究中有效的每2周2000 ng的剂量(数据未显示)，选择每月0.9-9000 ng的剂量和每6周135 ng、1350 ng以及每2周45 ng和450 ng的相应剂量(参见表1)。大鼠在手术后17周内接受治疗，并用猫步步态分析系统和通过von-frey痛觉过敏测试测量症状。在慢性疾病过程中(手术之后第12-16周)，未经治疗的大鼠发展出症状，所述症状可用猫步系统测量为步态障碍或通过von-frey测试测量为机械性痛觉过敏。根据预先规定的分析计划，我们计算了第12至第16周的猫步测量的平均值，并且与媒介物相比较高于30%的值被认为是相关的。为第16周的von-frey测量规定了相同的与媒介物限制相比较的30%获益。
[0096]
对猫步测试中确定的步态障碍的分析揭示，与aclt pmx 媒介物组相比较，每2周用45 ng的方案导致16%的获益。每2周注射450 ng达到20%的获益，但仍然没有统计显著性或有意义。在4周方案中，0.9 ng与aclt pmx 媒介物相比较导致52%的相关获益，与aclt pmx 媒介物相比较，9 ng没有效果(4.4%)，90 ng显示出82%的统计学显著效果，900 ng没有效果(1.4%)，以及9000 ng没有显示有意义的效果(17%)。与aclt pmx 媒介物相比较，每6周135 ng/注射的方案中相应剂量显示出22%获益的趋势，而1350 ng/注射的较高剂量与aclt pmx 媒介物相比较具有47%的统计显著且有意义的获益(参见图2和表2)。
[0097]
在von-frey痛觉过敏测试中，与aclt pmx 媒介物相比较，每2周注射45 ng导致超敏反应降低104%，在双尾t检验中显著，而450 ng的获益为68%。在4周方案中，同样地，0.9 ng (71%获益)和90 ng (91%获益)显著降低超敏反应，而9 ng (-5%)和9000 ng (-12%)没有效果。然而，在von-frey测试中，与媒介物相比较，900 ng组也达到90%的获益，但没有统计显著性。在每6周的方案中，媒介物(媒介物)组比治疗更频繁的媒介物组显示出更
μg (n = 12)、6 μg (n = 13)和60 μg (n = 13) r399e。另外，实验的第五组(n = 11)注射曲安西龙(在手术后第1周1x ia注射)以比较r399e与曲安西龙的药理作用，曲安西龙已在oa患者中证明了对症疗效。关节内(ia)治疗在手术后一周开始第一次注射。
[0106]
第一次注射之后6小时，曲安西龙和所有测试剂量已经对疼痛具有显著效果(0.6 μg (相对于媒介物38.3%，p《0.01)、6 μg (相对于媒介物48%，p《0.001)和60 μg (相对于媒介物42.7%，p《0.01)) (参见图4)。
[0107]
实施例4在兔oa模型的手术后急性早期阶段期间，将6和60 μg r399e ia注射到手术的膝盖中的疼痛缓解作用持续至少2周，直至下一次注射，而1.41 mg曲安西龙的作用在第一次注射之后1周已经消失(图5)。
[0108]
如上所述，在kk-兔-17-01中，通过在雌性兔中前交叉韧带横切(aclt)和内侧半月板的部分前部切除(pmx)实验性地诱导骨关节炎样软骨退化。
[0109]
在手术后第2周，与安慰剂相比较，6 μg (35.7%，p=0.0802)和60 μg (40.8%，p=0.0417) r399e导致对症效果》30%，而曲安西龙的对症效果(-11.6%，p=0.89)完全消失，并且在这一时间点动物比安慰剂治疗的动物显示出甚至更加缓解性的姿势(参见图5)。
[0110]
实施例5r399e ia注射对兔手术诱导的oa模型的慢性阶段期间的疼痛也具有有益作用(图6)。
[0111]
在上述kk-兔-16-01的整个实验中，6 μg的中等剂量随着时间推移具有最高的观察到的平均效果，并在第2周发挥49%的益处，在第3周57%，在第5周55%，第7周60%，第9和第11周69%以及第12周72% (所有时间点p = 0.0001)。0.6 μg (p=0.0027)和60 μg (p=0.0001)组在第5和第7周之间已达到其最大效果水平，相对于媒介物为约40%。然后此效果大小在研究结束之前是稳定的，而在第9周开始的稍后的时间点，0.6 μg的效果(~50%获益)略高于用60 μg 的效果(~40%) (参见图6)。
[0112]
实施例6在手术诱导的兔oa模型中，在疾病进展慢性阶段期间，r399e在一次关节内注射之后对疼痛的效果与临床有效的抗ngf抗体治疗相当(图7)。
[0113]
与kk-兔-17-01的实施例5 (kk-兔-16-01的时间进程)中一样，r399e ia治疗的对症获益在整个研究中持续。手术之后一周开始注射，并然后每隔一周进行注射，总共6次。该研究中的第1-3组用r399e ia治疗，和第4组用安慰剂ia治疗。在第5组中，如上所述，曲安西龙在第1周进行ia注射。在曲安西龙的作用完全消失之后的第5和第9周，相同的动物iv以人体等效剂量接受临床有效的抗ngf抗体。另外，在第3、5、7、9和11周给予该组安慰剂ia注射。在第一次注射之后6小时之前，并然后每隔一周总是在注射之前，如实施例中一样进行观察者独立的无接触失能测量。
[0114]
用1 mg/kg抗ngf抗体进行iv治疗导致对疼痛的效果高达56% (p=0.0195)，效果大小与在同一时间点用3种剂量的r399e对疼痛达到的47.1% (p=0.0426)、57.8% (p=0.0091)和75.7% (p=0.0011)效果相当(参见图7)。
[0115]
实施例7在人类滑膜加软骨外植体培养物中，r399e可减少基质损失(gag释放)，并从而助
于关节稳态的显著正常化。另外，r399e减少造成oa疼痛和炎症并损害关节稳态的细胞因子(il1和pge2)的释放(图8)。这些细胞因子不仅直接引起oa患者的疼痛和炎症，而且还下调软骨细胞中的bmp受体表达。所得软骨细胞对bmp的反应性降低可加快疾病进展(图9)。
[0116]
在人类oa共培养模型中研究r399e对基质调节(gag释放)、pge2和促炎性细胞因子的影响，所述模型由软骨外植体加滑膜组成，或由单独的滑膜组成。将组织共培养7天，在1、4、7天之后取样。oa软骨外植体与oa滑膜的共培养显著诱导gag释放到上清液中。用r399e (100和300 ng/ml)处理可抑制gag释放，用300 ng/ml达到统计显著性(p=0.016)。单独培养滑膜没有诱导gag释放，表明oa软骨为共培养系统中gag的主要来源(图8)。
[0117]
oa软骨与oa滑膜一起共培养强健地诱导il1β和pge2释放到上清液中。r399e抑制共培养系统中il1β (对于100 ng/ml为p=0.0245和对于300 ng/ml为p=0.0159，参见图11)和pge2 (对于100 ng/ml为p=0.9872和对于300 ng/ml为p=0.0057)的产生。单独培养滑膜导致上清液中的pge2明显高于单独培养外植体(p=0.0001)，表明滑膜为此系统中pge2的主要来源。测试的两种r399e剂量均抑制滑膜的未受刺激的pge2释放(对于100 ng/ml为p=0.007和对于300 ng/ml为p=0.027)。
[0118]
总之，r399e在人类oa软骨和滑膜的共培养物中抑制基质降解。另外，r399e干扰oa软骨和oa滑膜之间的自分泌和/或旁分泌信号传导，表现为抑制炎性细胞因子和介导疼痛的pge2。
[0119]
实施例8在用tnfα加抑瘤素刺激的半月板组织培养物中，r399e减少了造成oa中的疼痛和炎症并损害关节稳态的此类细胞因子的释放(tnfα、il6)并其防止基质损失(gag，图10)。
[0120]
培养了猪半月板，旨在研究r399e对前列腺素e2 (pge2)和细胞因子il1β、il6、il8和tnfα释放的影响。用t o (20 ng/ml tnfα 10 ng/ml osm (抑瘤素a))刺激猪半月板的全片(半月板外植体)。另外，用不同浓度的r399e (300、900、1200 ng/ml)处理半月板外植体。总温育时间为7天，在2、5和7天之后取样。作为对照，半月板外植体受到刺激，但未经处理(t o)或未经刺激(仅外植体)。用t o刺激从猪半月板诱导il6。用r399e的处理抑制t o诱导的il6释放(对于900 ng/ml研究批次为p=0.0001，对于300和1200 ng/ml tox批次为p《0.015，对于300和900 ng/ml gmp批次为p《0.005)。r399e抑制t o诱导的pge2释放，对于gmp批次高达44%，对于研究批次高达72%和对于glp批次高达49%，尽管没有达到p《0.05的统计显著性。未观察到批次之间的显著差异。在该实验环境下，r399e对il
ß
、il-8和tnf-α释放的影响不一致且不为剂量依赖性的(参见图10)。
[0121]
总之，该数据表明半月板助于膝盖oa的炎症环境，并且用r399e的治疗降低来自半月板的促炎性细胞因子和pge2的浓度，这可导致oa动物模型和oa患者体内ia注射之后的疼痛缓解。
[0122]
实施例9此外，在滑膜细胞系(sw982)和原代人类骨关节炎滑膜细胞培养物中，r399e减少细胞因子白细胞介素-6 (图11a、c)和-1(图11b、d)的释放，并从而助于使关节稳态正常化并预防疼痛、炎症和进一步的疾病进展(图11)。
[0123]
实施例10在用神经生长因子(ngf)刺激的原代人类半月板细胞培养物中，r399e减少造成oa
疼痛和炎症的pge2的释放。在手术后一天于伦理许可的框架内新鲜制备来自全膝置换手术的原代半月板细胞。首先，去除皮肤和肌肉以分离半月板。将半月板转移到装有ham’s f12 1% p/s 1%两性霉素b的10 cm皿中。将组织切成约3x3 mm的小块并转移到无菌烧杯中进行消化。在50 ml的ham’s f12 1% p/s 1%两性霉素溶液中的0.4%胶原酶中，在37℃、7.5% co2和不断搅拌下进行16小时的消化。16 h之后，将溶液移液通过100 μm过滤器随后通过40 μm过滤器，并然后以1400 g离心5分钟。将含有细胞的剩余沉淀重新悬浮于20 ml ham’s f12 1% p/s 1%两性霉素 10% fcs中。计数细胞数量，并测定细胞活力。最后，将每孔10,000个细胞接种于96孔板中。将细胞培养长达1周以达到汇合。中间更换一次培养基。当细胞达到汇合时，用10 ng/ml rhngf刺激它们和/或用0.1 μm地塞米松、0.1 μm曲安西龙、375 ng/ml抗βngf抗体、300 ng/ml r399e处理它们，或不处理它们(阴性对照)。将单一化合物的作用与仅用rhngf刺激的细胞进行比较。温育2天之后，去除上清液用于测定培养基中的前列腺素e2 (pge2)。原代半月板细胞用rhngf的处理诱导了pge2，其被所有测试的化合物显著地抑制。r399e的效果与临床有效的地塞米松、曲安西龙和抗ngf抗体治疗的效果相比较(图12)。
[0124]
实施例11r399e降低猪健康软骨细胞(图13)和人类oa软骨细胞(图14)中的adamts5 (具有血小板反应蛋白基序的去整合素和金属蛋白酶5)表达和基质金属蛋白酶(mmp)的释放。adamts5为分解代谢蛋白酶，负责在oa进展期间对软骨基质的病理性切割。因此，r399e防止进一步的软骨破坏并减少产生损伤相关分子模式分子(damp)，比如内源性dna和其他软骨基质分解产物。这些分子与加速oa病理学相关，并负责与oa相关的炎症和疼痛以及神经元的敏化。
[0125]
从获得自当地屠宰场(arras, reichelsheim-beerfurth)的约1岁龄的猪的股骨头分离猪软骨细胞。为去除来自软组织的细胞，将软骨依序在室温下用0.25% w/v胶原酶(serva gmbh，目录号17465)于ham’s f12 (gibco
®
, life technologies，目录号21765)中消化45分钟，和在37℃下用0.1% w/v胶原酶于含有1%青霉素/链霉素的ham’s f12 (gibco
®
, life technologies，目录号21765)中消化过夜。所得细胞悬液先后通过100 μm和40 μm细胞过滤器(becton dickinson gmbh)进行过滤，通过离心洗涤几次并重新悬浮于培养基中。新鲜分离的猪软骨细胞首先在dmemhg、10%胎牛血清(fcs, promocell gmbh)、50 μg/ml抗坏血酸-2-磷酸酯和0.4 mm脯氨酸中以单层培养7天，并然后在24孔板中于添加10 ng/ml il-1β的相同培养基中以15 000个细胞/孔进行培养用于qpcr分析或以200 000个细胞/孔进行培养用于mmp1测量，并以30、300和900 ng/ml用r399e处理或不进行处理，持续3 (mmp1)或7天(qpcr)。
[0126]
对于基因表达，使用来自qiagen的rneasy mini试剂盒分离rna。用来自agilent technologies inc的配有agilent rna 6000 nano chip的agilent bioanalyser分析mrna浓度和质量。用来自invitrogen corp的superscript iii first-strand synthesis supermix实现逆转录，并然后为rna酶h处理。用来自sigma的sybr green jumpstart taq ready mix，使用猪adamts5的引物('tcacactgctcatgacgaaa; gcaagtgtgtggacaaaacc)进行qpcr。60s核糖体蛋白l13a (rpl13a)被用作管家基因。
[0127]
对于mmp1测量，收集上清液并使用人类mmp3-plex超灵敏试剂盒(msd)测量mmp1。
leeds, massachusetts, usa))中1 s，然后为等待3 s的时间段和自来水冲洗3 s。在另外风干15分钟时间段之后，使用discovery v12宏观镜(carl zeiss microscopy gmbh, jena, germany)对表面进行成像，并用axiocam hrc相机和适当的软件axiovision 4.8.2 (carl zeiss microscopy, jena, germany)拍照。放大倍率的选择方式为整个关节表面填满成像幅面。使用电动光学系统用于从获取的z形钉重建3d图像。通过滚动浏览每个关节中感兴趣的区域来手动确定z形钉的高度。在z堆叠中获取10-20个单张图像并组合为最终图像以进行cavaleri分析。
[0134]
使用图像分析软件测量总关节表面积，并使用评分来量化形态变化。通过手术增加了总关节表面积。这一发现为所预期的，并且与使用这一模型还有用其他手术模型和不同物种的其他研究一致。r399e对该参数没有影响。在总体形态总分中，考虑到100%的改善对应于对侧平均水平和0%对应于媒介物平均水平，所有3个治疗组的平均值(与给药无关)均已改善了约30%。在r399e治疗组中仅具有轻微变化的区域(评价为1分)多于在媒介物治疗的动物中。同样，所有3种剂量均达到了比媒介物组的平均值提高30%的有意义的效果。在有2分(代表中等受损软骨的量)的区域中，与媒介物组的平均值相比较，0.6 μg组的平均值显示30%的获益。在查看严重受损的具有裂缝的软骨(3分)的量时见到最明显的结构效应。0.6 μg r399e导致3分的区域减少约40%，6 μg减少具有裂缝的区域，效果大小为50%，达到统计显著性(p=0.0404)，以及与媒介物组的平均值相比较，60 μg的平均值提高30%，未达到统计显著性(图15a)。
[0135]
实施例13在手术诱导的绵羊oa模型中，与安慰剂相比较，在每组仅7只动物的初步研究中每4周给予3次关节内注射r399e在趋势上导致组织学评分显著提高(图16)，并且导致mri评分更好(图17)。
[0136]
在该项实验中，使用内侧半月板横切模型(cake, 2013 osteoarthritis and cartilage 2013; 21: 226-236.)来诱导骨关节炎(oa)样变化，
‘
生命中’阶段为12周。测试项目r399e在手术之后第7天开始以3种不同剂量(12、120和1200 μg/关节)的每月方案进行关节内(ia)给予。这一研究的主要结果量度为：通过组织学切片的定量评分确定的股骨内侧和外侧髁软骨的结构改善。r399e显著改善此结果。在此，r399e以其120 μg/关节的中等剂量最为有效。
[0137]
从股骨外侧和内侧髁以及胫骨近端外侧和内侧髁的承重软骨区域收集骨软骨样品(6 x 6 mm)。每个样品得自关节的中心部分，使用每个关节的测量确定。使用尺子标记髁的中点，并且将该中点用作骨软骨样品的中心。将样品固定于10%缓冲盐水中并在10% edta溶液中脱钙4周，然后在5%甲酸中脱钙一周。制备石蜡包埋切片(厚度5 μm)。将切片用甲苯胺蓝和番红o-固绿染色以突出结构和软骨(schmitz等人，2010 osteoarthrtis and cartilage. 18 s3 s113-116)。使用改良的mankin评分来量化软骨的组织学变化。
[0138]
切片得自手术关节的4个腔室，并使用改良的mankin评分对切片进行评分。当将组织学评分加在一起时，与媒介物对照相比较，接受12、120 μg/关节r399e的动物的损伤存在统计学显著的减少(参见图16)。对mankin评分不同组成部分的子分析显示，损伤的减少不是由于任何一个测量参数，而是该减少分布在所有参数上。
[0139]
使用低场mri (esoate)在死后从每个手术肢体获得磁共振成像(mri)。mr图像由
欧洲影像专家使用改良的smoaks评分进行盲评分(参考moya-angeler, 2016 mar; 23(2):214-20. doi: 10.1016/j.knee.2015.11.017. epub 2016 jan 27)。
[0140]
对于mri，关节被视作3个单元——内侧和外侧股胫关节以及股髌关节。对于关节的每个区域，对以下进行评分：关节软骨损失、骨赘、关节积液、骨髓病变(软骨下骨高信号)。
[0141]
使用低场磁体在死后获得所有手术肢体的mri。mr图像由欧洲影像专家使用改良的smoaks评分进行盲评分。当分析完整关节的所有3个隔室或仅内侧股胫腔室的评分时，与对照相比较，用120 μg和1200 μg r399e/关节治疗的动物的smoak评分存在趋势(参见图17)。
[0142]
实施例14在猪健康软骨细胞培养实验中，r399e显著增加软骨的细胞外基质产生和细胞增殖(图18)。
[0143]
如在别处描述的(gigout等人，2017 osteoarthritis and cartilage, 25:1858-1867)，分离猪软骨细胞并将其在无支架3d培养系统(cartilage tissue analogue, cta)中进行培养。将一百万个细胞/3d构建体接种于补充有10% fcs、0.4 mm脯氨酸和50 μg/ml抗坏血酸-2-磷酸酯的dmem高葡萄糖中，并用300 ng/ml的r399e处理或不进行处理，持续4周(n=3)。
[0144]
在培养结束时，收集3d细胞构建体以通过qpcr评估其dna、gag和羟脯氨酸含量或基因表达。对于每种情况，还将样品固定并包埋于石蜡中用于组织学(n = 3)。在gag、羟脯氨酸和dna测量之前，用木瓜蛋白酶消化3d细胞构建体(用在木瓜蛋白酶缓冲液中的木瓜蛋白酶0.125 mg/ml、l-半胱氨酸5 mm过夜，60℃)。根据制造商的建议，用来自invitrogen的quaint picogreen ds dna试剂盒测量dna。gag用二甲基亚甲基蓝(dmmb)测定进行量化(farndale等人，1986 biochem biophys acta 883:173-177)，以及如gigout等人，2007所述hpro通过hplc进行量化。
[0145]
对于基因表达，用来自qiagen的rneasy mini试剂盒分离rna。用来自agilent technologies inc的配有agilent rna 6000 nano chip的agilent bioanalyser分析mrna浓度和质量。用来自invitrogen corp的superscript iii first-strand synthesis supermix实现逆转录，并然后为rna酶h处理。用sybr-green jumpstart taq ready mix (sigma-aldrich)以200 nm反向和正向引物进行qpcr。ef1α被用作管家基因。
[0146]
对于组织学评估，将3d细胞构建体在室温下用4%多聚甲醛固定30分钟，在pbs中清洗3次，并用番红-o或2型胶原蛋白对细胞外基质进行染色。
[0147]
实施例15在人类oa软骨细胞培养实验中，永久性暴露于r399e显著且剂量依赖性地增加糖胺聚糖(gag)、羟脯氨酸(hpro)和2型前胶原蛋白(proc2)的产生(图19)。
[0148]
从收获自3名经受全膝或髋置换的oa患者的软骨中分离人类软骨细胞。所有患者均签署知情同意书。细胞分离包括用0.25%的胶原酶(ham’s f12中1/10稀释来自serva的胶原酶nbg4 2.5%)消化45分钟。丢弃松散的细胞，并将软骨用0.1%胶原酶(含有1%青霉素/链霉素的ham’s f12中1/25稀释的胶原酶nbg4 2.5%)进一步消化过夜，以提取软骨细胞。每个条件都以n = 4进行。
[0149]
新鲜分离的人类oa软骨细胞首先在含有10% fbs、0.4 mm脯氨酸和50 μg/ml抗坏血酸-2-磷酸酯、1%青霉素/链霉素的dmem高葡萄糖中以单层培养5天，并调整为380 mosm (渗透压用渗压计确认)。然后收获细胞并将2x106个细胞重新悬浮于海藻酸盐溶液(来自fluka的1.25%海藻酸盐在来自applichem的0.2 m hepes和来自merck的1.5 m nacl中，调节至ph 7.4)中并将细胞悬液逐滴倾入含有10 mm hepes (applichem)的120 mm cacl
2 (merck)中。细胞滴液在搅拌下聚合15分钟以形成海藻酸盐珠粒，并用150 mm nacl溶液清洗3次。海藻酸盐珠粒首先不进行处理，在调节至380 mosm的培养基中培养7天。随后，将珠粒在380 mosm下补充有300 ng/ml r399e或12.5 μm hcl (对照)的1 ml培养基中以5个珠粒/孔转移到24孔超低结合板(vwr)中。14天后，使海藻酸盐珠粒在含150 mm nacl的460 μl 55 mm枸橼酸钠(merck) (ph 8)和40 μl 2.5%胶原酶中溶解1小时。接下来，加入500 μl dmem高葡萄糖或pbs并离心溶液：测量溶解的海藻酸盐上清液中的gag、hpro和proc2。如上所述分析gag和hpro。proc2如gudmann等人，2014 int j mol sci, 15:18789-18803中所述进行测量。
[0150]
实施例16在人类oa软骨细胞培养实验中，永久性暴露于r399e显著且剂量依赖性地增加聚集蛋白聚糖的蛋白水平，ec
50
为108 ng/ml (图20)。
[0151]
在全膝关节置换手术期间，从3名人类供体中分离软骨活检组织，并将其切碎和消化。培养细胞直至p1，并在p1将细胞冷冻在液氮(ln)中。将细胞从ln中解冻并以10000个细胞/cm2的细胞密度进行培养，且使细胞生长至汇合。8天后，将处于p2的汇合细胞用胰蛋白酶消化并进行计数，且制成珠粒(第-5天)。培养5天之后(第0天)，将珠粒刺激3次，持续7天(在第0、2和4天)。1周之后收获珠粒并分析聚集蛋白聚糖含量。
[0152]
包括的对照为常规培养基中的第0天珠粒和用媒介物对照培养基(10 mm hcl ph 0.2在常规生长培养基中1:50稀释)的第7天珠粒。
[0153]
使用来自diasource的市售可得的pg-elisa (cat# kap1461)测定样品的聚集蛋白聚糖含量。用空白对照减去实验的od值。基于标准曲线方程计算聚集蛋白聚糖的绝对量。计算并比较了与第7天珠粒(无刺激-仅媒介物对照培养基)相比较的比率。使用3个供体的平均比率的4pl拟合来计算ec
50
值。
[0154]
实施例17在人类oa软骨细胞培养实验中，永久性暴露于r399e随着时间的推移显著增加透明软骨基质的产生(图21)。
[0155]
如上所述，分离、培养人类oa软骨细胞并将其包埋于海藻酸盐中，且用300 ng/ml r399e对其进行处理，或不进行处理。在珠粒溶解之后，用来自beckman coulter的vicell cell分析细胞含量。如上所述，在溶解的海藻酸盐中测量gag、hpro和proc2。如上所述，对细胞进行基因表达分析。
[0156]
实施例18用r399e进行间歇性治疗随着时间的推移足以达到显著的促合成代谢作用。如前所述在海藻酸盐中培养人类oa软骨细胞，并且用300 ng/ml r399e对其每月处理1周、2周、3周或4周或者不进行处理。8周(两个月)之后，对细胞、gag、hpro和proc2含量进行显著性评估(图22)。
[0157]
实施例18在人类oa软骨细胞培养实验中，永久性暴露于r399e显著增加proc2、proc6和cilp-2的促合成代谢生物标志物产生(图23)。
[0158]
如前所述在海藻酸盐中培养人类oa软骨细胞，并用300 ng/ml r399e对其处理4周，或者不进行处理。在不同时间点于培养基中测量proc2、proc6和cilp2。proc2如上所述进行测量，proc6由nordic bioscience测量，以及cilp2用来自abbexa的elisa试剂盒abx151073进行测量。
[0159]
表1 kk-大鼠-14-09的治疗方案和研究大纲表2：
1.发明背景。
发明领域
2.本发明涉及gdf-5突变体(r399e)、其制剂和治疗组合物用于在患有骨关节炎(oa)或其他炎性关节疾病的患者体内注射以减轻疼痛和炎症的用途。
3.骨关节炎为最常见的关节炎形式，影响着全世界数百万人。当缓冲骨末端的保护性软骨随着时间的推移而磨损时，就会发生这种情况。尽管骨关节炎可损伤任何关节，但这种障碍最常影响手部、膝盖、髋部和脊柱的关节。
4.无论其原因(衰老、遗传易感性、创伤或代谢障碍)是什么，软骨稳态的破裂均诱发软骨细胞深刻的表型改变，这随后促进诱导软骨损伤和靶向其他关节组织的因子的子集的合成。有趣的是，在这些因素中存在多种炎症途径的成分。软骨细胞产生细胞因子、趋化因子、警报素、前列腺素和脂肪因子，并且表达细胞因子和趋化因子的多种细胞表面受体以及toll样受体。这些受体激活参与oa关节中软骨细胞的炎症和应激反应的细胞内信号传导通路(houard等人，curr.reumathol rep., 2013, nov; 15(11):375)。
5.oa的症状仅能通过止痛药控制一段时间，但对关节的损伤无法被逆转。保持活动并维持健康的体重可减缓疾病的进展，并助于改善疼痛和关节功能。然而，没有可用的有效治疗可以阻止甚至逆转这种疾病，并且在大多数情况下，受影响关节的破坏和疼痛两者均会进展并且显著影响患者的活动能力、生活质量和工作能力。全关节置换手术通常为患髋部或膝盖oa的患者不可避免和唯一的治疗选择，而疼痛控制通常为其他关节的唯一选择。
6.最近的出版物显示，射线影像学的膝盖oa与心血管疾病、糖尿病和肾脏死亡率的较高风险相关，尤其是在疾病早期发作或肥胖的人群中(mendy等人，int. j. epidemiol. 2018, dec. 1; 47(6):1821)。
7.2015年，10.5% (2560万)的非住院美国成年人报告患有oa。患有oa的成年人带来了3184亿美元的医疗保健费用，相当于美国非住院成年人总医疗保健费用的22.5%，并造成101亿美元的工资损失。oa患病率因年龄(》65岁，25.3%)、性别(女性，13.3%；男性，7.5%)和种族/族群(白人，13.3%；非裔美国人，7.5%；拉丁裔，4.2%；其他，5.3%；p《0.001)而有明显差异。几乎三分之一患有oa的成年人(32.7%)接受处方阿片类药物，而在未患oa者中这一比例为13.8% (p《0.001)。回归分析表明，患有oa的成年人比未患oa者明显更可能报告中度(调整后的优势比[aor]=1.99 [95% ci: 1.65-2.40])或重度(aor=2.59 [2.21-3.04]) pia、任何功能限制(aor=2.51 [2.21-2.85])以及在sf-12身体部分总体评分(sf-12 physical component summary)上较差的hrqol (调整后的β =-3.88 [se: 0.357]; p《0.001)。患有oa的成年人中调整后的年度总医疗保健费用和工资损失相对于未患oa者的增量分别为每人1778美元(7585美元相对于5807美元)和189美元(740美元相对于551美元)，导致估计的全国直接费用增量为450亿美元和间接费用增量为17亿美元(doi: https://doi.org/10.1016/j.jval.2018.04.012)。
[0008]
目前没有既对组织结构病理学(软骨、骨、滑膜、半月板、韧带)具有有益作用，又对
疼痛(无论是急性还是慢性)具有快速缓解作用的可用的骨关节炎治疗。
[0009]
gdf-5 (hotten等人，1994, biochem. biophys res. commun. 204, 646-652, ncbi登录号nm_000557, np_000548)为形态发生素，其已显示在几种组织中促进细胞增殖、分化和/或组织形成。该蛋白也被称为骨形态发生蛋白-14 (bmp-14)或软骨源性形态发生蛋白-1 (cdmp-1)。gdf-5显示软骨形成活性，并且先天性gdf-5突变导致小鼠和人类的指/趾、腕和踝关节的缺陷(storm等人，1994；thomas等人，1997)。gdf-5的表达最显著地局限于关节将在其中发育的区域，并且为关节形成的最早标志物之一(storm和kingsley，1999)。bmp受体信号传导为产后维持关节软骨所需要的(rountree, 2004, plos biol. 2004 november, 2(1))。
[0010]
野生型gdf5处理诱导软骨和骨的形成。因此，设计了gdf5单点突变体，其中氨基酸残基399精氨酸被谷氨酸交换。以下命名为r399e。与具有持续软骨形成潜力的gdf5野生型相比较，r399e显示出降低的骨形成潜力。r399e (gdf5突变体)增加原代猪和人类骨关节炎软骨细胞中的基质产生(t. mang, k. kleinschmidt-doerr, f. ploeger, s. lindemann, a. gigout, doi: https://doi.org/10.1016/j.joca.2018.02.176. april 2018volume 26, supplement 1, page s82)。
[0011]
r399e在wo2013083649a1中被要求保护并且具有改善的诱导软骨形成的能力。该发明的重组gdf-5相关蛋白特别适用于治疗其中期望形成软骨但不期望形成骨的疾病。因此，该发明的另一方面为所述蛋白、核酸、载体或宿主细胞在治疗这些疾病中的用途。特别是，蛋白、核酸、载体或宿主细胞用于治疗软骨缺损或用于治疗创伤性软骨破裂或脱离，包括骨关节炎。
[0012]
gdf-5的领域gdf-5相关蛋白具有改善的诱导软骨形成能力和降低的诱导骨形成能力。新的蛋白在治疗软骨缺损中特别有用，其中骨组织的形成为不期望的。
[0013]
滑膜关节对于骨骼的生物力学功能至关重要。如关节炎疾病中观察到的不当功能直接导致严重的生活质量损失。因此，关节生物学多年来已为广泛研究的重点，这带来了对关节解剖学和组织学以及关节软骨和其他组件在关节功能和维护中的生物力学特性和作用的了解。
[0014]
gdf-5 (hoetten等人，1994, biochem. biophys res. commun. 204, 646-652)为形态发生素，其已显示在几种组织中促进细胞增殖、分化和/或组织形成。该蛋白也被称为形态发生蛋白mp52、骨形态发生蛋白-14 (bmp-14)或软骨源性形态发生蛋白-1 (cdmp-1)。gdf-5显示软骨形成活性，并且先天性gdf-5突变导致小鼠和人类的指/趾、腕和踝关节的缺损(storm等人，1994；thomas等人，1997)。gdf-5的表达最显著地局限于关节将在其中发育的区域，并且为关节形成的最早标志物之一(storm和kingsley，1999)。bmp受体信号传导为产后维持关节软骨所需要的(rountree, 2004, plos biol. 2004 november, 2(11))。gdf-5与gdf-6和gdf-7密切相关。这三种蛋白形成tgf-β超家族的不同亚组，因此显示出类似的生物特性和极高程度的氨基酸序列同一性(参见即wolfman等人，1997, j. clin. invest. 100, 321-330)。所有家族成员最初均被合成为较大的前体蛋白，所述前体蛋白随后在距c-末端约110-140个氨基酸的碱性残基簇处经受蛋白水解切割，从而从n-末端原结构域释放c-末端成熟蛋白部分。成熟多肽在结构上相关并含有包含六或七个典型的
半胱氨酸残基的保守的生物活性结构域，所述半胱氨酸残基负责这些蛋白的特征性三维“胱氨酸结”基序。天然gdf-5相关蛋白为同型二聚体分子，并且主要通过与由i型和ii型丝氨酸/苏氨酸受体激酶组成的特定受体复合物相互作用而发挥作用。受体激酶随后激活smad蛋白，然后smad蛋白将信号传递到细胞核中以调节靶基因的表达。
[0015]
已经反复证明gdf-5/-6/-7亚组的成员为骨和软骨最重要的诱导剂和调节剂(cheng等人，2003, j. bone and joint surg. 85a, 1544-1552; settle等人，2003, developm. biol. 254, 116-130 )。gdf-5和相关蛋白与两种类型的膜结合丝氨酸-苏氨酸激酶受体(被称为i型和ii型)结合并使其寡聚体化。在配体结合后，这些复合物通过使smad转录因子家族的成员磷酸化来转导信号，这些成员在激活后进入细胞核并调节响应基因的转录(massague, 1996)。最近的实验已表明骨骼模式形成中的两种不同的i型受体，bmpr-ia和bmpr-ib。在正常发育期间，两种受体均以动态模式表达。在几种肢体结构中，例如在关节间带和软骨膜中，观察到bmpr-ia和bmpr-ib的重叠表达(mishina等人，1995；zou等人，1997；baur等人，2000)。关于bmpr-ia和bmpr-ib表达模式，gdf-5信号转导应通过与bmpr-ia和bmpr-ib两者的相互作用来完成(chang等人，1994；zou等人，1997)。bmpr-lb基因的无效突变产生具有骨和关节形成缺陷的存活小鼠，所述缺陷与缺失gdf-5的小鼠中所观察到的非常相似(storm和kingsley，1996；yi等人，2000)，而bmpr-ia/小鼠已知在胚胎发生早期死亡(mishina等人，1995)。然而，bmpr-ia在gdf-5-cre驱动因素控制下的条件性敲除会绕过胚胎致命性，并产生具有正常形成的关节的存活小鼠。但是，出生之后关节内的关节软骨在让人想起骨关节炎的过程中磨损，表明此受体在软骨稳态和修复中的重要性(rountree等人，2004)。
[0016]
gdf-5相关蛋白家族的野生型蛋白的活性通常导致软骨和骨的形成。然而，存在不同的医学状况，其中期望形成软骨然而不期望形成骨组织。例如，显然在关节缺损的情况下期望形成软骨，而应当避免骨化。
[0017]
出人意料的是，发现了可提供具有改善的诱导软骨形成能力和降低的诱导骨形成能力的gdf-5相关蛋白的变体。这可通过修饰gdf-5相关蛋白(r399e)使得其对bmpr-ib具有增加的亲和力和/或对bmpr-ia具有降低的亲和力来实现，并且这为最接近的现有技术wo2013083649a1的主题。
[0018]
野生型gdf-5在体外结合bmpr-ib的亲和力比bmpr-ia (kd ~1-1.1 nm)高约40-120倍(kd ~8-27 pm)。发现了通过改变gdf-5相关蛋白的结合亲和力使得对bmpr-ib的亲和力增加而对bmpr-ia的亲和力降低，促进了软骨形成而减少了骨形成。这可通过在gdf-5相关蛋白的氨基酸序列中与bmpr-ib和/或bmpr-ia结合位点相关的一个或多个氨基酸残基的特定取代来实现。
[0019]
将具有特定取代的gdf-5相关蛋白的结合亲和力与人类野生型gdf-5相关蛋白，特别是人类野生型gdf-5的结合亲和力进行比较。
[0020]
为避免误解和歧义，本文对一些常用术语进行定义和举例说明如下：如本文所使用的，术语“胱氨酸结结构域”意指存在于tgf-β超家族蛋白(比如，即人类gdf-5)成熟部分中并形成被称为胱氨酸结的三维蛋白结构的众所周知且保守的富含半胱氨酸的氨基酸区域。在此结构域中，半胱氨酸残基彼此的相应位置是重要的，并且仅允许略微地变化以免失去生物活性。已经证明，单独的胱氨酸结结构域足以实现该蛋白的生
物功能(schreuder等人，(2005), biochem biophys res commun. 329, 1076-86)。胱氨酸结结构域的共有序列在现有技术中为众所周知的。根据本文定义的定义，蛋白的胱氨酸结结构域以参与相应蛋白的胱氨酸结的第一个半胱氨酸残基开始，并以参与相应蛋白的胱氨酸结的最后一个半胱氨酸之后的残基结束。
[0021]
如本文所使用的，术语“gdf-5相关蛋白”意指与人类生长/分化因子5 (hgdf-5)非常密切相关的任何天然存在的或人工产生的蛋白。所有gfd-5相关蛋白的共同特征为存在与人类gdf-5的102个aa的胱氨酸结结构域(氨基酸400-501)具有至少60%氨基酸同一性的胱氨酸结结构域，这足以实现该蛋白的生物功能。术语“gdf-5相关蛋白”包括属于来自脊椎动物或哺乳动物物种的gdf-5、gdf-6和gdf-7蛋白组的蛋白及其重组变体，只要这些蛋白显示与人类gdf-5的胱氨酸结结构域具有上述百分比的同一性。60%的限值非常适合于将gdf-5/-6/-7蛋白组的成员及其变体与其他蛋白(比如关系更远的gdf和bmp)分开。人类gdf-5、人类gdf-6和人类gdf-7的102个aa的胱氨酸结结构域的比较揭示这些蛋白之间的高度氨基酸同一性。人类gdf-6与人类gdf-5的胱氨酸结结构域共享87个(85%)相同的残基，以及人类gdf-7与人类gdf-5的胱氨酸结结构域共享83个(81%)相同的残基。当与人类gdf-5相比较时，迄今为止已鉴定的来自其他脊椎动物和哺乳动物物种的gdf-5/-6/-7分子的相应结构域也显示出非常高的同一性百分比，至少为75% (在79%-99%之间)。相比之下，不属于gdf-5/-6/-7亚组的gdf和bmp显示低于60%的低得多的同一性值。
[0022]
脊椎动物和哺乳动物gdf-5相关蛋白的非限制性实例为人类gdf-5的前体和成熟蛋白(在wo95/04819中公开为mp52和在hotten等人，1994, biochem. biophys res. commun. 204, 646-652中公开为人类gdf-5)、重组人类(rh) gdf-5/mp52 (wo96/33215)、mp52 arg (wo97/06254)；hmw人类mp52 (w097/04095)、cdmp-1 (w096/14335)、小鼠(小家鼠) gdf-5 (us 5,801,014)、兔(家兔) gdf-5 (sanyal等人，2000, mol biotechnol. 16, 203-210)、鸡(红原鸡) gdf-5 (ncbi登录号np_989669)、非洲爪蛙(非洲爪蟾) gdf-5 (ncbi登录号aat99303)、单体gdf-5 (wo 01/1 1041和wo 99/6161 1)、人类gdf-6/bmp-13 (us 5,658,882)、小鼠gdf-6 (ncbi登录号np_038554)、gdf-6/cdmp-2 (wo96/14335)、人类gdf-7/bmp-12 (us 5,658,882)、小鼠gdf-7 (ncbi登录号aap97721)、gdf-7/cdmp-3 (wo96/143335)。本发明还涵盖具有另外的突变(比如取代、添加和缺失)的gdf-5相关蛋白，只要这些另外的突变并不完全消除生物蛋白活性。
[0023]
发明背景的讨论没有药物可用于在oa患者体内既快速和持久地治疗疼痛和炎症，又同时可持续地治疗关节组织和形态(软骨、骨、滑膜、半月板、韧带)的结构变化。
[0024]
可助于缓解骨关节炎症状并且主要是疼痛但对结构没有或者甚至具有负面影响的药物包括：对乙酰氨基酚. 对乙酰氨基酚(泰诺等)已显示可帮助一些具有轻度至中度疼痛的骨关节炎患者。服用超过推荐剂量的对乙酰氨基酚会导致肝损伤。
[0025]
非甾体抗炎药(nsaid). 以推荐剂量服用的非处方nsaid，比如布洛芬(雅维(advil)、美林ib (motrin ib)等)和萘普生钠(爱利福(aleve)等)，通常缓解骨关节炎疼痛。更强的nsaid可通过处方获得。nsaid可导致胃部不适、心血管问题、出血问题以及肝肾损伤。nsaid作为涂抹于受影响关节的皮肤上的凝胶具有较少副作用，并且也可缓解疼痛。
[0026]
度洛西汀(欣百达(cymbalta)). 通常被用作抗抑郁药，这种药物也被批准用于治疗慢性疼痛，包括骨关节炎疼痛。
[0027]
可的松注射液. 注射皮质类固醇药物可缓解关节疼痛。患者每年可接受的可的松注射次数通常限于3-4次注射，因为该药物可随着时间的推移使关节损伤恶化。
[0028]
一种抗ngf (神经生长因子)抗体(他尼组单抗(tanezumab)，pfizer)目前正处于临床开发中用于oa。该化合物对治疗oa患者的疼痛高度有效，但与其他止痛药一样，对疾病的根本原因没有有益作用。相比之下，在接受抗ngf治疗的大量患者中，疾病进展明显加快(rpoa=快速进展的oa)。rpoa总体发生率在他尼组单抗5 mg组中为6.3%，在他尼组单抗2.5 mg组中为3.2%和在nsaid组中为1.2%。我们在大鼠和兔的oa动物模型中证实了抗ngf治疗的这些负面影响。
[0029]
可用于治疗oa疼痛的止痛药具有显著的副作用和不良事件。它们均不减缓或阻止疾病进展或者对关节结构具有有益作用。它们均没有对软骨基质的产生具有治愈性或有益的生物活性，也没有重新平衡关节稳态的病理变化。一些(他尼组单抗)甚至加快了oa患者的疾病进展。
[0030]
其他可用的oa疗法为外科手术或没有疾病改善作用：润滑注射. 注射透明质酸可通过在膝盖中提供一些缓冲来提供疼痛缓解，尽管研究表明这些注射并不比安慰剂提供更多的缓解，并且对结构变化和组织病理学根本没有影响。
[0031]
关节置换. 在关节置换手术(关节成形术)中，外科医生去除受损的关节表面并用塑料和金属部件置换它们。手术风险包括感染和血栓。人工关节可能会磨损或松动，并且最终可能需要更换。
[0032]
存在正处于临床开发中用于oa的结构修饰剂，但这种分子对oa疼痛没有有益的作用。成纤维细胞生长因子18 (fgf18，司瑞菲敏(sprifermin)，merck)显示了诱导软骨细胞增殖。在ii期试验中，司瑞菲敏使oa患者的股胫关节软骨总厚度在2年之后增加0.5 mm。与安慰剂相比较，任何司瑞菲敏组的总womac疼痛评分相对于基线的平均绝对变化没有统计学显著差异。
[0033]
没有减缓或阻止oa疾病进展，对软骨基质的产生具有治愈性或有益的生物活性，或重新平衡关节稳态的病理变化，并同时影响oa疼痛的可用治疗。
[0034]
作为有效改善疾病的oa治疗，尤其是当与全身或解剖学变化相关时，会需要反复给予并且作为终身治疗，其必须为安全的。全身治疗之后的高度全身药物暴露会增加不需要的全身效应或对非患病关节中的软骨、滑膜和骨的影响的风险。另一方面，推荐关节内注射的频次不超过每年6次。
[0035]
没有对oa的结构和疼痛具有有益作用并且对间歇治疗有效的可用化合物。
[0036]
r399e为第一种对疼痛具有快速和持久的作用，并且同时通过以相同剂量在oa动物模型和人体组织中减少软骨破坏、诱导软骨基质产生和使关节稳态正常化而阻止疾病进展的治疗方法。r399e对体内oa疼痛的有益作用已在2个物种体内得到证实(图1和2)。此外，r399e对oa软骨结构的有益作用已在2个物种体内得到证实(图15、16、17)。没有其他已知的分子、蛋白或现有技术的组合显示对oa中的疼痛和软骨结构具有有益作用。此外，r399e在使用来自健康动物的组织和原代细胞和人类oa关节置换手术的相关体外实验中减少炎症
和细胞因子释放，从而实现关节稳态的正常化(图8、9、10、11、13)。r399e抑制相关健康动物和人类oa体内实验中的pge2释放，并且此外ngf诱导oa半月板细胞中pge2的产生(图8、12)。pge2为软骨退化和疼痛的重要介质(lee等人，gene. 2013 sept 25; 527(2):440-7)。r399e通过在人体oa组织和细胞培养物以及健康猪细胞的体外实验中阻止gag的释放(chun等人，tissue eng. regen med 2019 jul 5; 16(4):385-393)以及释放并降低adamts5、mmp13和mmp1的表达而显示抗分解代谢作用(图8、13、14)。作为adamts5的金属蛋白酶和作为mmp13的基质金属蛋白酶在oa的发生中起重要作用(bondeson等人，clin exp rheumatol. 2008 jan-feb; 26(1):139-45和xie等人，chemmedchem. 2017 aug 8;12(15):1157-1168)。r399e在健康动物及人类oa组织和细胞培养物中显示促合成代谢作用(图18、19、20、21、22)。r399e显示免疫组织学和基因表达分析糖胺聚糖和羟脯氨酸合成的诱导以及胶原蛋白-ii、胶原蛋白-vi、sox9和聚集蛋白聚糖的基因表达(图21)。用r399e处理人类oa的软骨细胞培养物也显示对软骨形成的影响，即使不常给予r399e。
[0037]
r399e的促合成代谢作用也表现在生物标志物的上调，所述标志物被认为在oa中显示出积极趋势如proc2、proc6和cilp-2。图23显示人类oa组织的情况。
[0038]
r399e易于穿透软骨，并且可在ia注射之后7天在靠近细胞的软骨基质内找到。在ia兔pk研究中，在滑液和软骨中发现了r399e，由此6 μg注射的r399e直到第三天都可被检测到。注射60 μg r399e可在滑液中持续14天和在软骨中持续长达7天被检测到。尽管与gdf5野生型相比较该分子的稳定性增加，但血清半衰期不超过3.20小时，并且在小型猪和兔中可量化持续长达72小时，且在药代动力学和非临床安全性研究中于大鼠、小型猪和兔中进行ia和iv应用之后安全性也是清晰的。连同生理ph下生物液体中约1 μg/ml的低溶解度一起，我们不认为稳定性增加会增加安全风险。
[0039]
用r399e进行的间歇性局部(关节内)治疗足以对疼痛和结构具有有益作用，并导致全身暴露低且非常短。相比之下，对于gdf5野生型，如果存在软骨，则r399e会快速地从周围液体中被吸收。这使得接受r399e的关节内治疗不仅高度有效而且安全。
[0040]
以对结构产生有益作用的相同剂量和方案，r399e对转化性骨关节炎模型的疼痛具有快速和持久的作用。使用其中可将药效学效果与临床上对疼痛(抗ngf抗体、曲安西龙)或结构(司瑞菲敏)有效的药物进行比较的模型。
[0041]
发明概述本发明的优选实施方案为将r399e ia注射到具有和不具有关节炎症的骨关节炎患者的关节中，以减轻炎症和疼痛并改善关节组织结构。
[0042]
此外，r399e将减少局部细胞因子和前列腺素e2的产生，并从而减少关节炎症和疼痛。r399e将减少局部adamts5和mmp-13的产生，并从而不仅防止软骨裂开，而且通过防止damp释放来进一步减轻关节炎症和疼痛，这也可防止神经元对damp的敏化。减少细胞因子产生也可通过减少对bmpr表达的下调作用来恢复对内源性bmp和治疗本身的反应性。r399e直接诱导骨关节炎软骨细胞的细胞外基质形成，并从而可支持骨关节炎关节的结构修复。
[0043]
在创伤事件之后将r399e ia注射到关节中以防止软骨或半月板退化并减轻炎症。这将降低后期骨关节炎发展的风险。
[0044]
本发明基于发明人发现可通过在gdf-5相关蛋白的氨基酸序列中参与结合至bmpr-ib和/或bmpr-ia的区域中的特定修饰来改变蛋白，由此使其具有提高的诱导软骨形
成能力和降低的诱导骨形成能力。
[0045]
发现对bmpr-ib具有增加的亲和力的蛋白和/或对bmpr-ia具有降低的亲和力的蛋白能够更好地诱导软骨形成而骨的形成减少。这些特性在显示对bmpr-ib亲和力增加和对bmpr-ia亲和力降低两者的蛋白尤其明显。
[0046]
本发明的gdf-5相关蛋白可通过化学修饰或基因工程技术获得，且重组蛋白是优选的。可通过替换与gdf-5相关蛋白的氨基酸序列中的bmpr-ib和/或bmpr-ia结合位点相关的至少一个氨基酸残基来获得该蛋白。
[0047]
用于在患有oa或其他炎症性疾病的患者中注射的蛋白为人类gdf-5的变体，由此399位的精氨酸残基与谷氨酸交换(r399e)。参考gdf-5的成熟序列，这对应于第18位的取代。出人意料的是，发现这种蛋白变体对bmpr-ia的亲和力明显降低。相比之下，对bmpr-ib的亲和力几乎未受影响。
[0048]
优选地，本发明的gdf-5相关蛋白(r399e)作为“分离的”蛋白存在。这意味着本发明的蛋白基本上与所分离蛋白的天然来源中存在的其他蛋白和肽分子(例如天然来源蛋白的其他多肽)分开。例如，重组表达的肽被认为是分离的。根据本发明的优选实施方案，变体蛋白为重组蛋白。进一步地，如果肽已通过人类干预而改变或由并非其天然来源的生物体表达，则其也被认为是分离的。此外，当通过重组技术或化学前体或其他化学品在化学合成时产生时，“分离的”蛋白不含与其天然相关的一些其他细胞材料或细胞培养基。从“分离的”蛋白的定义中特别排除的为未纯化的混合物或组合物。
[0049]
本技术的进一步的主题内容为包含根据本发明的重组gdf-5相关蛋白或核酸或载体或宿主细胞的药用组合物。原则上，在gdf-5相关蛋白的上下文中任何已经公开的药用组合物均为合适的。可认为表达载体或宿主细胞作为药用组合物中的活性物质为有利的。此外，根据本发明的蛋白与其他蛋白的组合可用于优选的药用组合物中。当然，本发明还包括含有进一步的物质(例如药理学上可接受的添加剂或载剂)的药用组合物。制剂可包括抗氧化剂、防腐剂、着色剂、矫味和乳化剂、悬浮剂、溶剂、填充剂、膨胀剂、缓冲剂、递送媒介物、赋形剂和/或药用佐剂。例如，合适的载剂或媒介物可为注射用水、生理盐水溶液或与合适的载体蛋白(比如血清白蛋白)混合的盐水溶液。用于制备本发明组合物的优选抗氧化剂为抗坏血酸。
[0050]
药用组合物的溶剂或稀释剂可为水性或非水性的，并且可含有能够改变和/或维持制剂的ph、渗透压、粘度、澄明度、规模、无菌性、稳定性、溶出速率或气味的其他药学上可接受的赋形剂。类似地，根据本发明的药用组合物中可包括其他组分以改变和/或维持药学上有效物质的释放速率。这种改变组分为本领域通常采用的物质，以配制呈单位剂量或多剂量形式的用于肠胃外给予的剂量。
[0051]
根据本发明制备的最终配制的药用组合物可呈溶液剂、混悬剂、凝胶剂、乳剂、固体或脱水或冻干粉剂的形式储存于无菌小瓶中。这些制剂可呈即用形式或呈例如如果是冻干粉剂(需要在给予之前重构成)的形式储存。以上和进一步合适的药用制剂为本领域已知的并且描述于例如gus remington's pharmaceutical sciences (第18版, mack publishing co., eastern, pa., 1990, 1435-1712)中。这种制剂可影响药用有效成分的物理状态、稳定性、体内释放速率和体内清除速率。
[0052]
其他有效的给予形式包括肠胃外缓释(即延迟)制剂、吸入雾剂或口服活性制剂。
例如，缓释制剂可包含结合或掺入到聚合化合物(比如聚乳酸、聚乙醇酸等)或脂质体的颗粒制剂中的蛋白。
[0053]
根据本发明的药用物组合物还可被配制为用于肠胃外给予，例如通过输注或注射，并且还可包括缓释或持续循环制剂。此类肠胃外给予的治疗组合物一般呈无热原、肠胃外可接受的水溶液剂的形式，其包含在药学上可接受的载剂和/或稀释剂中的药学上有效的成分。
[0054]
药用组合物可包含基质材料，例如在其中预期再生软骨的情况下。当蛋白、核酸、表达载体或宿主细胞被应用于生物相容性基质材料中和/或之上时，对它们是有利的。如本文所使用的，基质材料意指充当用于细胞募集、附着、增殖和分化的支架和/或充当本发明的重组gdf-5相关蛋白的潜在递送和储存装置的载剂或基质。与固体基质形成对比，载剂由没有确定的表面并且缺乏特定的形状无定形材料组成，所述材料即烷基纤维素、普朗尼克、明胶、聚乙二醇、糊精、植物油、糖及其他液体和粘性物质。
[0055]
示例性的基质材料例如描述于wo 98/21972中。这些基质材料同样适合于根据本发明的蛋白。基质材料可例如通过外科手术而被移植到患者体内，其中蛋白或编码蛋白的dna可从基质材料中缓慢释放，并然后在长时间段内有效。根据本发明，所有类型的基质材料均为有用的，只要其为生物相容的并且被选择用于预期区域或用途指示。基质材料可为天然材料、改性天然材料以及合成材料。涵盖所有已知的用于形态发生蛋白的基质。细胞外基质包含例如各种胶原蛋白，例如i、ii、v、ix、x、xi和xiii型；进一步的蛋白聚糖和糖胺聚糖，例如硫酸软骨素、双糖链蛋白聚糖、饰胶蛋白聚糖(decorine)和/或透明质酸；或非胶原蛋白，例如骨桥蛋白、层粘连蛋白、纤连蛋白、玻连蛋白和软骨基质蛋白。所有提及的天然材料也可以人工改性的形式使用。对于有用载剂和基质的非限制性列表(进一步参见kirker-head, 2000, advanced drug delivery 43, 65-92)。
[0056]
进一步的可能性涉及包含根据本发明的重组gdf-5相关蛋白的脂质体制剂。用于所述制剂的脂质体为本领域技术人员通常已知的。特别是，优选的脂质体制剂公开于wo 2008/049588中。更优选的脂质体制剂描述于wo 2008/049588的第9-13页。
[0057]
此外，本发明的gdf-5变体蛋白(r399e)可与其他药用活性物质组合给予。所述药用活性物质可为例如止痛药(比如局部有效的止痛药)或对其中期望形成软骨的疾病具有积极作用的其他物质(如蛋白酶抑制剂)。这些仅为可能的添加剂的实例，并且本领域的技术人员可易于添加用于药用制剂或通常认为安全的其他赋形剂。
[0058]
本发明的重组gdf-5变体蛋白由于其改善的诱导软骨形成的能力而特别适用于治疗其中期望形成软骨但不期望形成骨的疾病。
[0059]
因此，本发明的另一方面为本蛋白(r399e)、核酸、载体或宿主细胞在治疗这些疾病中的用途。特别是，本蛋白、核酸、载体或宿主细胞是用于治疗软骨缺损或用于治疗软骨的创伤性破裂或脱离的，特别是年龄相关的软骨缺损(例如由磨损引起)、骨关节炎、类风湿性关节炎、运动疾病相关的损伤(如半月板损伤或韧带断裂)、可影响软骨的疾病(如软骨营养障碍)、特征为生长障碍和随后的软骨骨化的疾病、软骨发育不全、肋软骨炎、椎间盘突出和椎间盘修复、复发性多软骨炎、与肿瘤(无论是良性还是恶性的，如软骨瘤或软骨肉瘤)相关的软骨缺损修复。
[0060]
另一方面为用于治疗其中期望形成软骨但不期望形成骨的疾病的方法，包括将根
据本发明的蛋白、核酸、载体或宿主细胞给予需要此类治疗的患者的步骤。
[0061]
如本文所使用的，术语“治疗”是指逆转、减轻或抑制这种术语适用的疾病、障碍或病症或此类疾病、障碍或病症的一种或多种症状的进展。如本文所使用的，治疗还可指与未治疗的对照群体相比较或与治疗之前的相同哺乳动物相比较，降低哺乳动物中疾病、障碍或病症发生的可能性或发生率。例如，如本文所使用的，治疗可指预防疾病、障碍或病症并且可包括延迟或预防疾病、障碍或病症的发作或者延迟或预防与疾病、障碍或病症相关的症状。如本文所使用的，治疗还可指在哺乳动物患有疾病、障碍或病症之前降低疾病、障碍或病症或与这种疾病、障碍或病症相关的症状的严重性。在患病之前疾病、障碍或病症的此类预防或降低严重性涉及将如本文所述的本发明组合物给予在给予时未患有疾病、障碍或病症的受试者。如本文所使用的，治疗还可指预防疾病、障碍或病症或与这种疾病、障碍或病症相关的一种或多种症状的复发。
[0062]
附图和表的简述图1. 大鼠骨关节炎模型中的疼痛读数在手术大鼠骨关节炎模型的慢性晚期阶段在数天内对疼痛的显著影响。
[0063]
图2. 大鼠骨关节炎模型中的疼痛读数在大鼠aclt pmx oa模型中，当在手术后1周的早期阶段开始治疗时，每6周的ia治疗方案优于每4周或每2周的治疗方案(b)。
[0064]
图3. 兔骨关节炎模型中的疼痛读数首次ia注射r399e之后6小时在兔aclt pmx骨关节炎模型中对疼痛的显著影响在手术之前进行2次基线失能测量。在第0周，通过aclt pmx膝盖手术在兔的右膝关节中诱导oa。在第1周关节内(ia)注射r399e，并在6小时后测量静态承重。使用非接触式静态失能测量来测量承重，由此平板测量与未手术的左后肢相比较施加于手术和注射的右后肢上的压力。数据为施加于右后肢的重量比左后肢的百分比，由此50%对应于两腿的相同负荷，和0%对应于负荷仅在未手术的左肢上。
[0065]
图4. 兔骨关节炎模型中的疼痛读数在第二项独立研究中证实了第一次注射之后6小时在兔aclt pmx骨关节炎模型中对疼痛的显著影响，并将一次r399e注射的效果与临床有效的曲安西龙进行比较在手术之前进行2次基线失能测量。在第0周，通过aclt pmx膝盖手术在兔的右膝关节中诱导oa。在第1周关节内(ia)注射r399e，并在6小时后测量静态承重。使用非接触式静态失能测量来测量承重，由此平板测量与未手术的左后肢相比较施加于手术和注射的右后肢上的压力。数据为施加于右后肢的重量比左后肢的百分比，由此50%对应于两腿的相同负荷，和0%对应于负荷仅在未手术的左肢上。效果大小与临床有效的曲安西龙治疗进行比较。1.41 mg曲安西龙对应于基于代谢体重、滑液体积和软骨表面积计算的人体等效剂量。
[0066]
图5. 兔骨关节炎模型中的疼痛读数在第一次注射之后的前2周期间，一次r399e注射或曲安西龙治疗在兔oa模型中对oa疼痛的影响。
[0067]
在手术之前进行2次基线失能测量。在第0周，通过aclt pmx膝盖手术在兔的右膝关节中诱导oa。在第1和第3周关节内(ia)注射r399e，并且总是在注射之前和第一次注射之后6小时测量静态承重。使用非接触式静态失能测量来测量承重，由此平板测量与未手术的
左后肢相比较施加于手术和注射的右后肢上的压力。数据为施加于右后肢的重量比左后肢的百分比，由此50%对应于两腿的相同负荷，和0%对应于负荷仅在未手术的左肢上。效果大小与临床有效的曲安西龙治疗进行比较。1.41 mg曲安西龙对应于基于代谢体重、滑液体积和软骨表面积计算的人体等效剂量。
[0068]
图6. 兔骨关节炎模型中的疼痛读数在兔的手术oa模型中，一次ia r399e注射对oa疼痛的显著影响持续至少2周，直至下一次注射。此外，在模型的慢性期，r399e对疼痛具有持久的显著影响。
[0069]
在手术之前进行2次基线失能测量。在第0周，通过aclt pmx膝盖手术在兔的右膝关节中诱导oa。在手术后第1、3、5、7、9和11周关节内(ia)注射r399e，并且总是在注射之前和第一次注射之后6小时测量静态承重。使用非接触式静态失能测量来测量承重，由此平板测量与未手术的左后肢相比较施加于手术和注射的右后肢上的压力。数据为施加于右后肢的重量比左后肢的百分比，由此50%对应于两腿的相同负荷，和0%对应于负荷仅在未手术的左肢上。r399e的所有测试的剂量对关节疼痛均具有快速显著的有益作用，持续至少14天，直至下一次注射和直至研究结束。
[0070]
图7. 兔骨关节炎模型中的疼痛读数兔aclt pmx oa模型中在慢性期期间，r399e对疼痛的长期影响与临床有效的抗ngf抗体治疗的效果大小相当在手术之前进行2次基线失能测量。在第0周，通过aclt pmx膝盖手术在兔的右膝关节中诱导oa。在手术后第1、3、5、7、9和11周关节内(ia)注射r399e，并且总是在注射之前和第一次注射之后6小时测量静态承重。使用非接触式静态失能测量来测量承重，由此平板测量与未手术的左后肢相比较施加于手术和注射的右后肢上的压力。数据为施加于右后肢的重量比左后肢的百分比，由此50%对应于两腿的相同负荷，和0%对应于负荷仅在未手术的左肢上。r399e的所有测试的剂量对关节疼痛均具有快速显著的有益作用，持续至少14天，直至下一次注射和直至研究结束。将对慢性疼痛的效果大小与oa进展慢性期第5和第9周用临床有效的抗ngf-ab治疗所达到的效果大小进行比较。在第1周对接受曲安西龙的相同动物给予两次抗ngf-ab。
[0071]
图8. 人类骨关节炎滑膜和软骨外植体的共培养在人类骨关节炎滑膜和软骨共培养物中，r399e减少基质gag损失、白细胞介素-1和前列腺素2释放。
[0072]
图9. 人类oa软骨细胞3d海藻酸盐珠粒培养用脂多糖(lps)、白细胞介素-1β (il1β)、肿瘤坏死因子-α(tnfα)或白细胞介素-6 (il6)永久处理的原代人类oa软骨细胞(海藻酸盐珠粒培养，380 mosm，300 ng/ml，7天)显示受损的骨形态发生蛋白受体(bmpr)表达。bmpr为软骨、骨和半月板稳态的关键。它们为骨形态发生蛋白(如bmp2或7)的主要信息接收者，也为gdf5和r399e的主要信息接收者。
[0073]
ag-algin-17-008：5个供体的单层人类oa软骨细胞，48 h内用il1β 10 ng/ml、tnfα 10 ng/ml、il6 100 ng/ml或lps 1 μg/ml。统计学：单因素anova然后是dunnet检验(校正用于多重比较)。*意指具有统计学差异，p《0.05。
[0074]
图10. 猪半月板培养物r399e可减少猪半月板培养物中的基质损失和细胞因子产生。
[0075]
图11. 滑膜细胞系sw982和原代人类骨关节炎滑膜细胞培养il-1 (a)和-6 (b)在滑膜细胞系sw982和原代oa滑膜细胞中的释放(c、d)sw982 (滑膜细胞系)细胞用3种不同浓度的r399e处理72小时。r399e在300 ng/ml下显著降低il-1β (a)和il6 (b)水平。将收获自从全膝置换手术中获得的滑膜样品中的原代oa滑膜细胞用3种不同浓度的r399e处理72小时。r399e在900 ng/ml下显著降低il-1β (c)并降低il6水平(d)。
[0076]
图12. 原代人类骨关节炎半月板细胞培养r399e在体外抑制原代人类半月板细胞中ngf刺激的pge2释放。
[0077]
图13. 原代猪健康软骨细胞培养r399e抑制il-1β刺激的猪软骨细胞中adamts5 (a)表达和mmp1 (b)释放的上调。
[0078]
图14. 原代人类骨关节炎软骨细胞培养r399e降低在380 mosm下2周海藻酸盐珠粒培养中的人类oa软骨细胞中的mmp13和adamts5表达。两种蛋白酶均为通过切割胶原蛋白和聚集蛋白聚糖而导致oa疾病进展的主要驱动因素。所得damp (损伤相关分子模式)与介导疼痛(rosenberg等人，mol cell biochem. 2017 dec;436(1-2):59-69. doi: 10.1007/s11010-017-3078-x. epub 2017 jun 1.)和炎症的toll样受体(miller等人，arthritis rheumatol.作者原稿；可得于pmc 2016 nov 1.以最终编辑形式出版为：arthritis rheumatol. 2015 nov; 67(11): 2933-2943.doi: 10.1002/art.39291)结合。
[0079]
图15. 兔骨关节炎模型中的结构读数r399e在组织学(a)和微型ct (b、c)读数中对兔aclt pmx oa模型中的软骨结构具有显著的有益作用。在微型ct中，软骨厚度和体积通过对比增强的关节腔的分割来量化。
[0080]
图16. 绵羊骨关节炎模型中的结构读数在组织学中，r399e在绵羊oa关节不稳定性初步研究中对软骨结构具有显著的有益作用。从手术后1周开始，每4周注射3次r399e。
[0081]
图17. 绵羊骨关节炎模型中的结构读数在mri中，r399e在绵羊oa关节不稳定性初步研究中对软骨结构具有有益作用(无统计显著性)。从手术后1周开始，每4周注射3次r399e。
[0082]
图18. 原代猪健康软骨细胞培养380 mosm下猪健康软骨细胞的软骨组织类似物(cta) 3d培养中的细胞外基质的产生，无论是否用永久性r399e处理，均显示出显著的促合成代谢作用。
[0083]
原代猪健康软骨细胞(4周3d培养软骨组织类似物, 380 mosm, 300 ng/ml)。
[0084]
图19. 原代人类骨关节炎软骨细胞3d海藻酸盐珠粒培养r399e剂量依赖性地增加人类oa软骨细胞gag、hpro、proc2的细胞外基质产生。
[0085]
图20. 原代人类骨关节炎软骨细胞3d海藻酸盐珠粒培养r399e剂量依赖性地增加人类oa软骨细胞的聚集蛋白聚糖产生。
[0086]
化合物对人类oa软骨细胞海藻酸盐珠粒中聚集蛋白聚糖的产生的影响。从3个独立的供体中分离软骨细胞。在7天内用不同浓度的化合物刺激细胞。在珠粒解聚合之后于区间基质中测量聚集蛋白聚糖，并与第7天的对照水平进行比较。
[0087]
图21. 原代人类骨关节炎软骨细胞3d海藻酸盐珠粒培养
在380 mosm下，在有或没有r399e的情况下，两周海藻酸盐包封3d培养的人类oa软骨细胞中的细胞外基质产生原代人类oa软骨细胞(2周海藻酸盐珠粒培养, 380 mosm, 300 ng/ml)图22. 原代人类骨关节炎软骨细胞3d海藻酸盐珠粒培养用r399e进行间歇性治疗随着时间的推移足以达到显著的促合成代谢作用。如前所述在海藻酸盐中培养人类oa软骨细胞，并且每月用300 ng/ml的r399e处理1周、2周、3周或4周或者不进行处理，且最后量化gag含量。
[0088]
原代人类oa软骨细胞(海藻酸盐珠粒培养, 380 mosm, 300 ng/ml)；细胞=软骨细胞的数量，gag =聚集蛋白聚糖的成分，hpro (羟脯氨酸) = ii型胶原蛋白的成分，proc2 = ii型胶原蛋白产生的生物标志物。
[0089]
图23. 原代人类骨关节炎软骨细胞3d海藻酸盐珠粒培养在380 mosm下，在有或没有r399e的情况下，4周海藻酸盐包封3d培养的人类oa软骨细胞中的proc2 (a)、proc6 (b)和cilp-2 (c)的促合成代谢生物标志物测量。
[0090]
表1. kk-大鼠-14-09的治疗方案和研究大纲在大鼠aclt pmx oa模型中测试3种不同的方案和9种剂量。研究以每组n = 10只动物推动。灰色区域中的数字表示在30
ꢀµ
l总注射体积中以ng为单位的关节内(ia)应用的剂量。每2周进行步态分析，并在第15或第16周进行vonfrey超敏反应测试。
[0091]
表2. 大鼠骨关节炎模型中的疼痛读数不同剂量和方案的ia r399e治疗在大鼠oa不稳定性模型中的症状获益。该表格仅列出了比安慰剂好》 30%的那些效果。在大鼠中每6周注射2次1350 ng见到最为有效和可持续的效果。
实施例
[0092]
实施例1在手术诱导的慢性大鼠oa模型中，当在关节不稳定化手术之后12周给予时，r399e的一次关节内(ia)注射在晚期疾病中在14天内对疼痛具有显著效果(cb-大鼠-14-029，参见图1)。
[0093]
前交叉韧带横切(aclt)及内侧半月板切除(pmx)作为啮齿动物的不稳定性oa模型是在机构内建立的，由于关节中的变化与oa患者中发现的那些(软骨损伤、骨赘、软骨下硬化、步态受损和基于炎症的超敏反应)类似。通过猫步测试确定的步态障碍症状被用作主要读数，类似于要求患者评价他们在平坦表面上行走期间所经历的疼痛的临床问卷调查(参见ferreira-gomes等人，the journal of pain: official journal of the american pain society. 2008 oct; 9(10):945-54. pubmed pmid: 18650131)。aclt pmx手术诱发的关节不稳定性导致胫骨内侧髁上出现点状异常负荷，这已导致在一周内软骨破坏(参见naveen等人，international journal of medical sciences. 2014; 11(1):97-105. pubmed pmid: 24396291. pubmed central pmcid: 3880996)。
[0094]
步态障碍一般发生于手术之后一周内(术后疼痛)，然后是无症状期，并且最后在慢性oa晚期阶段恢复。这种晚期步态障碍阶段被理解为oa疼痛阶段。为了研究单次注射r399e是否可在结构修复效应之前产生症状获益，在cb-大鼠-14-029中，在aclt pmx手术之
后12周，当慢性oa疼痛引起的步态障碍已经完全建立时，r3399e作为单次注射(以3个剂量ia)给予。在对测试设施适应3周之后，大鼠接受假手术(皮肤切口)或aclt pmx手术。为了确定oa疼痛相关的症状，在手术之后10、11和12周时通过猫步测试确定步态障碍。所有显示出步态障碍症状的大鼠被随机分成4个治疗组(用不同剂量r399e的3组和安慰剂对照)，并在aclt pmx手术之后第81天接受一次ia注射。基于在这3周时间段期间对aclt pmx手术最敏感的步态参数，我们确定了8只大鼠为无症状的并将其从研究中排除。剩余的40只大鼠基于其步态障碍随机分成4组，在手术之后第80天接受ia安慰剂或r399e (90 ng、900 ng或9000 ng/关节)。如分析计划中预先规定的，在这种单次注射之后1、3、7和14天通过猫步测试确定治疗效果，并比较组间全部4次测量的平均值。在这段时间内，已确定了6个步态参数在假手术 安慰剂和aclt pmx 安慰剂组之间存在显著差异，并且因此将所述参数用于描述oa疾病相关的症状。我们发现，在注射之后紧接的这段时间内，所有这些疾病相关的步态参数均受到注射r399e的积极影响。所有合格参数的相比于安慰剂的获益百分比揭示，900 ng/关节的r399e为最有效的剂量，其产生60%的症状获益。最低剂量[90 ng/关节]几乎没有效果，并且最高剂量[9000 ng/关节]超过安慰剂产生40%的获益(参见图1)。
[0095]
实施例1.1在实施例1中所使用的相同大鼠模型中，r399e对oa疼痛的效果持续至少6周，直至下一次注射(kk-大鼠-14-009，参见图2及表1和表2)。kk-大鼠-14-009使用相同的手术大鼠oa模型，并且被设计为研究在慢性大鼠骨关节炎疼痛模型中，当以不同剂量和方案不断给予时，慢性关节内(ia)注射r399e是否具有症状获益。基于对软骨基质产生的体外ec
50
为108 ng/ml(参见图20)以及在兔初步研究中有效的每2周2000 ng的剂量(数据未显示)，选择每月0.9-9000 ng的剂量和每6周135 ng、1350 ng以及每2周45 ng和450 ng的相应剂量(参见表1)。大鼠在手术后17周内接受治疗，并用猫步步态分析系统和通过von-frey痛觉过敏测试测量症状。在慢性疾病过程中(手术之后第12-16周)，未经治疗的大鼠发展出症状，所述症状可用猫步系统测量为步态障碍或通过von-frey测试测量为机械性痛觉过敏。根据预先规定的分析计划，我们计算了第12至第16周的猫步测量的平均值，并且与媒介物相比较高于30%的值被认为是相关的。为第16周的von-frey测量规定了相同的与媒介物限制相比较的30%获益。
[0096]
对猫步测试中确定的步态障碍的分析揭示，与aclt pmx 媒介物组相比较，每2周用45 ng的方案导致16%的获益。每2周注射450 ng达到20%的获益，但仍然没有统计显著性或有意义。在4周方案中，0.9 ng与aclt pmx 媒介物相比较导致52%的相关获益，与aclt pmx 媒介物相比较，9 ng没有效果(4.4%)，90 ng显示出82%的统计学显著效果，900 ng没有效果(1.4%)，以及9000 ng没有显示有意义的效果(17%)。与aclt pmx 媒介物相比较，每6周135 ng/注射的方案中相应剂量显示出22%获益的趋势，而1350 ng/注射的较高剂量与aclt pmx 媒介物相比较具有47%的统计显著且有意义的获益(参见图2和表2)。
[0097]
在von-frey痛觉过敏测试中，与aclt pmx 媒介物相比较，每2周注射45 ng导致超敏反应降低104%，在双尾t检验中显著，而450 ng的获益为68%。在4周方案中，同样地，0.9 ng (71%获益)和90 ng (91%获益)显著降低超敏反应，而9 ng (-5%)和9000 ng (-12%)没有效果。然而，在von-frey测试中，与媒介物相比较，900 ng组也达到90%的获益，但没有统计显著性。在每6周的方案中，媒介物(媒介物)组比治疗更频繁的媒介物组显示出更
μg (n = 12)、6 μg (n = 13)和60 μg (n = 13) r399e。另外，实验的第五组(n = 11)注射曲安西龙(在手术后第1周1x ia注射)以比较r399e与曲安西龙的药理作用，曲安西龙已在oa患者中证明了对症疗效。关节内(ia)治疗在手术后一周开始第一次注射。
[0106]
第一次注射之后6小时，曲安西龙和所有测试剂量已经对疼痛具有显著效果(0.6 μg (相对于媒介物38.3%，p《0.01)、6 μg (相对于媒介物48%，p《0.001)和60 μg (相对于媒介物42.7%，p《0.01)) (参见图4)。
[0107]
实施例4在兔oa模型的手术后急性早期阶段期间，将6和60 μg r399e ia注射到手术的膝盖中的疼痛缓解作用持续至少2周，直至下一次注射，而1.41 mg曲安西龙的作用在第一次注射之后1周已经消失(图5)。
[0108]
如上所述，在kk-兔-17-01中，通过在雌性兔中前交叉韧带横切(aclt)和内侧半月板的部分前部切除(pmx)实验性地诱导骨关节炎样软骨退化。
[0109]
在手术后第2周，与安慰剂相比较，6 μg (35.7%，p=0.0802)和60 μg (40.8%，p=0.0417) r399e导致对症效果》30%，而曲安西龙的对症效果(-11.6%，p=0.89)完全消失，并且在这一时间点动物比安慰剂治疗的动物显示出甚至更加缓解性的姿势(参见图5)。
[0110]
实施例5r399e ia注射对兔手术诱导的oa模型的慢性阶段期间的疼痛也具有有益作用(图6)。
[0111]
在上述kk-兔-16-01的整个实验中，6 μg的中等剂量随着时间推移具有最高的观察到的平均效果，并在第2周发挥49%的益处，在第3周57%，在第5周55%，第7周60%，第9和第11周69%以及第12周72% (所有时间点p = 0.0001)。0.6 μg (p=0.0027)和60 μg (p=0.0001)组在第5和第7周之间已达到其最大效果水平，相对于媒介物为约40%。然后此效果大小在研究结束之前是稳定的，而在第9周开始的稍后的时间点，0.6 μg的效果(~50%获益)略高于用60 μg 的效果(~40%) (参见图6)。
[0112]
实施例6在手术诱导的兔oa模型中，在疾病进展慢性阶段期间，r399e在一次关节内注射之后对疼痛的效果与临床有效的抗ngf抗体治疗相当(图7)。
[0113]
与kk-兔-17-01的实施例5 (kk-兔-16-01的时间进程)中一样，r399e ia治疗的对症获益在整个研究中持续。手术之后一周开始注射，并然后每隔一周进行注射，总共6次。该研究中的第1-3组用r399e ia治疗，和第4组用安慰剂ia治疗。在第5组中，如上所述，曲安西龙在第1周进行ia注射。在曲安西龙的作用完全消失之后的第5和第9周，相同的动物iv以人体等效剂量接受临床有效的抗ngf抗体。另外，在第3、5、7、9和11周给予该组安慰剂ia注射。在第一次注射之后6小时之前，并然后每隔一周总是在注射之前，如实施例中一样进行观察者独立的无接触失能测量。
[0114]
用1 mg/kg抗ngf抗体进行iv治疗导致对疼痛的效果高达56% (p=0.0195)，效果大小与在同一时间点用3种剂量的r399e对疼痛达到的47.1% (p=0.0426)、57.8% (p=0.0091)和75.7% (p=0.0011)效果相当(参见图7)。
[0115]
实施例7在人类滑膜加软骨外植体培养物中，r399e可减少基质损失(gag释放)，并从而助
于关节稳态的显著正常化。另外，r399e减少造成oa疼痛和炎症并损害关节稳态的细胞因子(il1和pge2)的释放(图8)。这些细胞因子不仅直接引起oa患者的疼痛和炎症，而且还下调软骨细胞中的bmp受体表达。所得软骨细胞对bmp的反应性降低可加快疾病进展(图9)。
[0116]
在人类oa共培养模型中研究r399e对基质调节(gag释放)、pge2和促炎性细胞因子的影响，所述模型由软骨外植体加滑膜组成，或由单独的滑膜组成。将组织共培养7天，在1、4、7天之后取样。oa软骨外植体与oa滑膜的共培养显著诱导gag释放到上清液中。用r399e (100和300 ng/ml)处理可抑制gag释放，用300 ng/ml达到统计显著性(p=0.016)。单独培养滑膜没有诱导gag释放，表明oa软骨为共培养系统中gag的主要来源(图8)。
[0117]
oa软骨与oa滑膜一起共培养强健地诱导il1β和pge2释放到上清液中。r399e抑制共培养系统中il1β (对于100 ng/ml为p=0.0245和对于300 ng/ml为p=0.0159，参见图11)和pge2 (对于100 ng/ml为p=0.9872和对于300 ng/ml为p=0.0057)的产生。单独培养滑膜导致上清液中的pge2明显高于单独培养外植体(p=0.0001)，表明滑膜为此系统中pge2的主要来源。测试的两种r399e剂量均抑制滑膜的未受刺激的pge2释放(对于100 ng/ml为p=0.007和对于300 ng/ml为p=0.027)。
[0118]
总之，r399e在人类oa软骨和滑膜的共培养物中抑制基质降解。另外，r399e干扰oa软骨和oa滑膜之间的自分泌和/或旁分泌信号传导，表现为抑制炎性细胞因子和介导疼痛的pge2。
[0119]
实施例8在用tnfα加抑瘤素刺激的半月板组织培养物中，r399e减少了造成oa中的疼痛和炎症并损害关节稳态的此类细胞因子的释放(tnfα、il6)并其防止基质损失(gag，图10)。
[0120]
培养了猪半月板，旨在研究r399e对前列腺素e2 (pge2)和细胞因子il1β、il6、il8和tnfα释放的影响。用t o (20 ng/ml tnfα 10 ng/ml osm (抑瘤素a))刺激猪半月板的全片(半月板外植体)。另外，用不同浓度的r399e (300、900、1200 ng/ml)处理半月板外植体。总温育时间为7天，在2、5和7天之后取样。作为对照，半月板外植体受到刺激，但未经处理(t o)或未经刺激(仅外植体)。用t o刺激从猪半月板诱导il6。用r399e的处理抑制t o诱导的il6释放(对于900 ng/ml研究批次为p=0.0001，对于300和1200 ng/ml tox批次为p《0.015，对于300和900 ng/ml gmp批次为p《0.005)。r399e抑制t o诱导的pge2释放，对于gmp批次高达44%，对于研究批次高达72%和对于glp批次高达49%，尽管没有达到p《0.05的统计显著性。未观察到批次之间的显著差异。在该实验环境下，r399e对il
ß
、il-8和tnf-α释放的影响不一致且不为剂量依赖性的(参见图10)。
[0121]
总之，该数据表明半月板助于膝盖oa的炎症环境，并且用r399e的治疗降低来自半月板的促炎性细胞因子和pge2的浓度，这可导致oa动物模型和oa患者体内ia注射之后的疼痛缓解。
[0122]
实施例9此外，在滑膜细胞系(sw982)和原代人类骨关节炎滑膜细胞培养物中，r399e减少细胞因子白细胞介素-6 (图11a、c)和-1(图11b、d)的释放，并从而助于使关节稳态正常化并预防疼痛、炎症和进一步的疾病进展(图11)。
[0123]
实施例10在用神经生长因子(ngf)刺激的原代人类半月板细胞培养物中，r399e减少造成oa
疼痛和炎症的pge2的释放。在手术后一天于伦理许可的框架内新鲜制备来自全膝置换手术的原代半月板细胞。首先，去除皮肤和肌肉以分离半月板。将半月板转移到装有ham’s f12 1% p/s 1%两性霉素b的10 cm皿中。将组织切成约3x3 mm的小块并转移到无菌烧杯中进行消化。在50 ml的ham’s f12 1% p/s 1%两性霉素溶液中的0.4%胶原酶中，在37℃、7.5% co2和不断搅拌下进行16小时的消化。16 h之后，将溶液移液通过100 μm过滤器随后通过40 μm过滤器，并然后以1400 g离心5分钟。将含有细胞的剩余沉淀重新悬浮于20 ml ham’s f12 1% p/s 1%两性霉素 10% fcs中。计数细胞数量，并测定细胞活力。最后，将每孔10,000个细胞接种于96孔板中。将细胞培养长达1周以达到汇合。中间更换一次培养基。当细胞达到汇合时，用10 ng/ml rhngf刺激它们和/或用0.1 μm地塞米松、0.1 μm曲安西龙、375 ng/ml抗βngf抗体、300 ng/ml r399e处理它们，或不处理它们(阴性对照)。将单一化合物的作用与仅用rhngf刺激的细胞进行比较。温育2天之后，去除上清液用于测定培养基中的前列腺素e2 (pge2)。原代半月板细胞用rhngf的处理诱导了pge2，其被所有测试的化合物显著地抑制。r399e的效果与临床有效的地塞米松、曲安西龙和抗ngf抗体治疗的效果相比较(图12)。
[0124]
实施例11r399e降低猪健康软骨细胞(图13)和人类oa软骨细胞(图14)中的adamts5 (具有血小板反应蛋白基序的去整合素和金属蛋白酶5)表达和基质金属蛋白酶(mmp)的释放。adamts5为分解代谢蛋白酶，负责在oa进展期间对软骨基质的病理性切割。因此，r399e防止进一步的软骨破坏并减少产生损伤相关分子模式分子(damp)，比如内源性dna和其他软骨基质分解产物。这些分子与加速oa病理学相关，并负责与oa相关的炎症和疼痛以及神经元的敏化。
[0125]
从获得自当地屠宰场(arras, reichelsheim-beerfurth)的约1岁龄的猪的股骨头分离猪软骨细胞。为去除来自软组织的细胞，将软骨依序在室温下用0.25% w/v胶原酶(serva gmbh，目录号17465)于ham’s f12 (gibco
®
, life technologies，目录号21765)中消化45分钟，和在37℃下用0.1% w/v胶原酶于含有1%青霉素/链霉素的ham’s f12 (gibco
®
, life technologies，目录号21765)中消化过夜。所得细胞悬液先后通过100 μm和40 μm细胞过滤器(becton dickinson gmbh)进行过滤，通过离心洗涤几次并重新悬浮于培养基中。新鲜分离的猪软骨细胞首先在dmemhg、10%胎牛血清(fcs, promocell gmbh)、50 μg/ml抗坏血酸-2-磷酸酯和0.4 mm脯氨酸中以单层培养7天，并然后在24孔板中于添加10 ng/ml il-1β的相同培养基中以15 000个细胞/孔进行培养用于qpcr分析或以200 000个细胞/孔进行培养用于mmp1测量，并以30、300和900 ng/ml用r399e处理或不进行处理，持续3 (mmp1)或7天(qpcr)。
[0126]
对于基因表达，使用来自qiagen的rneasy mini试剂盒分离rna。用来自agilent technologies inc的配有agilent rna 6000 nano chip的agilent bioanalyser分析mrna浓度和质量。用来自invitrogen corp的superscript iii first-strand synthesis supermix实现逆转录，并然后为rna酶h处理。用来自sigma的sybr green jumpstart taq ready mix，使用猪adamts5的引物('tcacactgctcatgacgaaa; gcaagtgtgtggacaaaacc)进行qpcr。60s核糖体蛋白l13a (rpl13a)被用作管家基因。
[0127]
对于mmp1测量，收集上清液并使用人类mmp3-plex超灵敏试剂盒(msd)测量mmp1。
leeds, massachusetts, usa))中1 s，然后为等待3 s的时间段和自来水冲洗3 s。在另外风干15分钟时间段之后，使用discovery v12宏观镜(carl zeiss microscopy gmbh, jena, germany)对表面进行成像，并用axiocam hrc相机和适当的软件axiovision 4.8.2 (carl zeiss microscopy, jena, germany)拍照。放大倍率的选择方式为整个关节表面填满成像幅面。使用电动光学系统用于从获取的z形钉重建3d图像。通过滚动浏览每个关节中感兴趣的区域来手动确定z形钉的高度。在z堆叠中获取10-20个单张图像并组合为最终图像以进行cavaleri分析。
[0134]
使用图像分析软件测量总关节表面积，并使用评分来量化形态变化。通过手术增加了总关节表面积。这一发现为所预期的，并且与使用这一模型还有用其他手术模型和不同物种的其他研究一致。r399e对该参数没有影响。在总体形态总分中，考虑到100%的改善对应于对侧平均水平和0%对应于媒介物平均水平，所有3个治疗组的平均值(与给药无关)均已改善了约30%。在r399e治疗组中仅具有轻微变化的区域(评价为1分)多于在媒介物治疗的动物中。同样，所有3种剂量均达到了比媒介物组的平均值提高30%的有意义的效果。在有2分(代表中等受损软骨的量)的区域中，与媒介物组的平均值相比较，0.6 μg组的平均值显示30%的获益。在查看严重受损的具有裂缝的软骨(3分)的量时见到最明显的结构效应。0.6 μg r399e导致3分的区域减少约40%，6 μg减少具有裂缝的区域，效果大小为50%，达到统计显著性(p=0.0404)，以及与媒介物组的平均值相比较，60 μg的平均值提高30%，未达到统计显著性(图15a)。
[0135]
实施例13在手术诱导的绵羊oa模型中，与安慰剂相比较，在每组仅7只动物的初步研究中每4周给予3次关节内注射r399e在趋势上导致组织学评分显著提高(图16)，并且导致mri评分更好(图17)。
[0136]
在该项实验中，使用内侧半月板横切模型(cake, 2013 osteoarthritis and cartilage 2013; 21: 226-236.)来诱导骨关节炎(oa)样变化，
‘
生命中’阶段为12周。测试项目r399e在手术之后第7天开始以3种不同剂量(12、120和1200 μg/关节)的每月方案进行关节内(ia)给予。这一研究的主要结果量度为：通过组织学切片的定量评分确定的股骨内侧和外侧髁软骨的结构改善。r399e显著改善此结果。在此，r399e以其120 μg/关节的中等剂量最为有效。
[0137]
从股骨外侧和内侧髁以及胫骨近端外侧和内侧髁的承重软骨区域收集骨软骨样品(6 x 6 mm)。每个样品得自关节的中心部分，使用每个关节的测量确定。使用尺子标记髁的中点，并且将该中点用作骨软骨样品的中心。将样品固定于10%缓冲盐水中并在10% edta溶液中脱钙4周，然后在5%甲酸中脱钙一周。制备石蜡包埋切片(厚度5 μm)。将切片用甲苯胺蓝和番红o-固绿染色以突出结构和软骨(schmitz等人，2010 osteoarthrtis and cartilage. 18 s3 s113-116)。使用改良的mankin评分来量化软骨的组织学变化。
[0138]
切片得自手术关节的4个腔室，并使用改良的mankin评分对切片进行评分。当将组织学评分加在一起时，与媒介物对照相比较，接受12、120 μg/关节r399e的动物的损伤存在统计学显著的减少(参见图16)。对mankin评分不同组成部分的子分析显示，损伤的减少不是由于任何一个测量参数，而是该减少分布在所有参数上。
[0139]
使用低场mri (esoate)在死后从每个手术肢体获得磁共振成像(mri)。mr图像由
欧洲影像专家使用改良的smoaks评分进行盲评分(参考moya-angeler, 2016 mar; 23(2):214-20. doi: 10.1016/j.knee.2015.11.017. epub 2016 jan 27)。
[0140]
对于mri，关节被视作3个单元——内侧和外侧股胫关节以及股髌关节。对于关节的每个区域，对以下进行评分：关节软骨损失、骨赘、关节积液、骨髓病变(软骨下骨高信号)。
[0141]
使用低场磁体在死后获得所有手术肢体的mri。mr图像由欧洲影像专家使用改良的smoaks评分进行盲评分。当分析完整关节的所有3个隔室或仅内侧股胫腔室的评分时，与对照相比较，用120 μg和1200 μg r399e/关节治疗的动物的smoak评分存在趋势(参见图17)。
[0142]
实施例14在猪健康软骨细胞培养实验中，r399e显著增加软骨的细胞外基质产生和细胞增殖(图18)。
[0143]
如在别处描述的(gigout等人，2017 osteoarthritis and cartilage, 25:1858-1867)，分离猪软骨细胞并将其在无支架3d培养系统(cartilage tissue analogue, cta)中进行培养。将一百万个细胞/3d构建体接种于补充有10% fcs、0.4 mm脯氨酸和50 μg/ml抗坏血酸-2-磷酸酯的dmem高葡萄糖中，并用300 ng/ml的r399e处理或不进行处理，持续4周(n=3)。
[0144]
在培养结束时，收集3d细胞构建体以通过qpcr评估其dna、gag和羟脯氨酸含量或基因表达。对于每种情况，还将样品固定并包埋于石蜡中用于组织学(n = 3)。在gag、羟脯氨酸和dna测量之前，用木瓜蛋白酶消化3d细胞构建体(用在木瓜蛋白酶缓冲液中的木瓜蛋白酶0.125 mg/ml、l-半胱氨酸5 mm过夜，60℃)。根据制造商的建议，用来自invitrogen的quaint picogreen ds dna试剂盒测量dna。gag用二甲基亚甲基蓝(dmmb)测定进行量化(farndale等人，1986 biochem biophys acta 883:173-177)，以及如gigout等人，2007所述hpro通过hplc进行量化。
[0145]
对于基因表达，用来自qiagen的rneasy mini试剂盒分离rna。用来自agilent technologies inc的配有agilent rna 6000 nano chip的agilent bioanalyser分析mrna浓度和质量。用来自invitrogen corp的superscript iii first-strand synthesis supermix实现逆转录，并然后为rna酶h处理。用sybr-green jumpstart taq ready mix (sigma-aldrich)以200 nm反向和正向引物进行qpcr。ef1α被用作管家基因。
[0146]
对于组织学评估，将3d细胞构建体在室温下用4%多聚甲醛固定30分钟，在pbs中清洗3次，并用番红-o或2型胶原蛋白对细胞外基质进行染色。
[0147]
实施例15在人类oa软骨细胞培养实验中，永久性暴露于r399e显著且剂量依赖性地增加糖胺聚糖(gag)、羟脯氨酸(hpro)和2型前胶原蛋白(proc2)的产生(图19)。
[0148]
从收获自3名经受全膝或髋置换的oa患者的软骨中分离人类软骨细胞。所有患者均签署知情同意书。细胞分离包括用0.25%的胶原酶(ham’s f12中1/10稀释来自serva的胶原酶nbg4 2.5%)消化45分钟。丢弃松散的细胞，并将软骨用0.1%胶原酶(含有1%青霉素/链霉素的ham’s f12中1/25稀释的胶原酶nbg4 2.5%)进一步消化过夜，以提取软骨细胞。每个条件都以n = 4进行。
[0149]
新鲜分离的人类oa软骨细胞首先在含有10% fbs、0.4 mm脯氨酸和50 μg/ml抗坏血酸-2-磷酸酯、1%青霉素/链霉素的dmem高葡萄糖中以单层培养5天，并调整为380 mosm (渗透压用渗压计确认)。然后收获细胞并将2x106个细胞重新悬浮于海藻酸盐溶液(来自fluka的1.25%海藻酸盐在来自applichem的0.2 m hepes和来自merck的1.5 m nacl中，调节至ph 7.4)中并将细胞悬液逐滴倾入含有10 mm hepes (applichem)的120 mm cacl
2 (merck)中。细胞滴液在搅拌下聚合15分钟以形成海藻酸盐珠粒，并用150 mm nacl溶液清洗3次。海藻酸盐珠粒首先不进行处理，在调节至380 mosm的培养基中培养7天。随后，将珠粒在380 mosm下补充有300 ng/ml r399e或12.5 μm hcl (对照)的1 ml培养基中以5个珠粒/孔转移到24孔超低结合板(vwr)中。14天后，使海藻酸盐珠粒在含150 mm nacl的460 μl 55 mm枸橼酸钠(merck) (ph 8)和40 μl 2.5%胶原酶中溶解1小时。接下来，加入500 μl dmem高葡萄糖或pbs并离心溶液：测量溶解的海藻酸盐上清液中的gag、hpro和proc2。如上所述分析gag和hpro。proc2如gudmann等人，2014 int j mol sci, 15:18789-18803中所述进行测量。
[0150]
实施例16在人类oa软骨细胞培养实验中，永久性暴露于r399e显著且剂量依赖性地增加聚集蛋白聚糖的蛋白水平，ec
50
为108 ng/ml (图20)。
[0151]
在全膝关节置换手术期间，从3名人类供体中分离软骨活检组织，并将其切碎和消化。培养细胞直至p1，并在p1将细胞冷冻在液氮(ln)中。将细胞从ln中解冻并以10000个细胞/cm2的细胞密度进行培养，且使细胞生长至汇合。8天后，将处于p2的汇合细胞用胰蛋白酶消化并进行计数，且制成珠粒(第-5天)。培养5天之后(第0天)，将珠粒刺激3次，持续7天(在第0、2和4天)。1周之后收获珠粒并分析聚集蛋白聚糖含量。
[0152]
包括的对照为常规培养基中的第0天珠粒和用媒介物对照培养基(10 mm hcl ph 0.2在常规生长培养基中1:50稀释)的第7天珠粒。
[0153]
使用来自diasource的市售可得的pg-elisa (cat# kap1461)测定样品的聚集蛋白聚糖含量。用空白对照减去实验的od值。基于标准曲线方程计算聚集蛋白聚糖的绝对量。计算并比较了与第7天珠粒(无刺激-仅媒介物对照培养基)相比较的比率。使用3个供体的平均比率的4pl拟合来计算ec
50
值。
[0154]
实施例17在人类oa软骨细胞培养实验中，永久性暴露于r399e随着时间的推移显著增加透明软骨基质的产生(图21)。
[0155]
如上所述，分离、培养人类oa软骨细胞并将其包埋于海藻酸盐中，且用300 ng/ml r399e对其进行处理，或不进行处理。在珠粒溶解之后，用来自beckman coulter的vicell cell分析细胞含量。如上所述，在溶解的海藻酸盐中测量gag、hpro和proc2。如上所述，对细胞进行基因表达分析。
[0156]
实施例18用r399e进行间歇性治疗随着时间的推移足以达到显著的促合成代谢作用。如前所述在海藻酸盐中培养人类oa软骨细胞，并且用300 ng/ml r399e对其每月处理1周、2周、3周或4周或者不进行处理。8周(两个月)之后，对细胞、gag、hpro和proc2含量进行显著性评估(图22)。
[0157]
实施例18在人类oa软骨细胞培养实验中，永久性暴露于r399e显著增加proc2、proc6和cilp-2的促合成代谢生物标志物产生(图23)。
[0158]
如前所述在海藻酸盐中培养人类oa软骨细胞，并用300 ng/ml r399e对其处理4周，或者不进行处理。在不同时间点于培养基中测量proc2、proc6和cilp2。proc2如上所述进行测量，proc6由nordic bioscience测量，以及cilp2用来自abbexa的elisa试剂盒abx151073进行测量。
[0159]
表1 kk-大鼠-14-09的治疗方案和研究大纲表2：
再多了解一些
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