反应性亲和探针相互作用发现平台
1.相关申请本技术要求2019年10月15日提交的美国临时专利申请序列号62/915,310的优先权利益。
背景技术：
2.鉴定“可投药的（druggable）”靶及其相应的治疗剂是药物发现研究中的两个基本挑战。许多生物分子例如蛋白的药理学仍然难得到，这是因为它们的内源性或外源性调节剂尚未被发现。因此，探索这些生物分子的生理功能和药理潜力的工具，无论它们是内源性和/或替代配体，都是最重要的。
3.对感兴趣的生物大分子的药理调节剂的发现经常是通过对分子文库进行其结合或功能性调节纯化的大分子的能力的筛选来实现的。然而，许多类别的生物大分子，包括多次（multi-pass）跨膜蛋白，难以从细胞中纯化，且必须在其天然细胞环境中进行筛选。这种基于细胞的筛选需要选择替代读出（readout），例如细胞生存力、信号转导或基因表达。使用基于替代细胞的读出的化合物筛选产生了两个挑战：（i）许多命中将通过脱靶（off-target）效应间接发挥其药理学，以及（ii）许多改变大分子功能的其他方面的真正配体将被遗漏。一种使得能够直接鉴定完整细胞中感兴趣的生物大分子的小分子结合物（binder）的技术将处理这些突出的挑战，并代表所述领域的重大进步。
技术实现要素：
4.本发明提供了一种用于筛选生物分子的配体候选物的方法和系统。反应性亲和探针相互作用发现（rapid）技术是针对原位靶的定量结合测定，其回避了靶纯化的挑战，并可能提供一种发现和靶向变构结合位点的系统方法。
5.在某些实施方案中，本文公开了一种鉴定配体的方法，包括：（a）使生物分子和探针分子接触；其中所述探针分子包含结合元件、报道基团和反应性部分；所述探针分子通过所述结合元件与所述生物分子结合；且所述反应性部分与所述生物分子形成共价键，从而形成缀合物；（b）使所述缀合物与包含与所述报道基团反应的功能部分的可检测分子接触，从而形成可检测缀合物；（c）使所述可检测缀合物与固体支持体接触；其中所述固体支持体包含识别部分；且所述识别部分与所述可检测缀合物结合，从而形成结合的可检测缀合物；和（d）检测所述结合的可检测缀合物，从而鉴定作为所述生物分子的配体的所述探针分子。
6.进一步提供了可以应用于本文所述的本发明的任何方面的许多实施方案。例如，在一些实施方案中，结合元件是小分子、肽或核酸（例如rna或dna）。在一些实施方案中，结合元件是包含多个结合元件的文库的组分。在一些实施方案中，文库包括小分子片段文库，其可被定义为满足3规则（rule of 3）：分子量≤300 da，clogp≤3，氢键供体≤3，和氢键受体≤3。示例性文库包括：chembridge片段文库、pyramid platform fragment-based drug discovery、maybridge片段文库、来自analyticon的frgx、来自ancorex的tci-frag、来自asinex的bio building blocks、来自charles river的biofocus 3d、来自emerald bio的
fragments of life (fol)、enamine片段文库、iota diverse 1500、bionet片段文库、life chemicals fragments collection、otava片段文库、prestwick片段文库、selcia片段文库、timtec基于片段的文库、来自vitas-m laboratory的allium或zenobia片段文库。在一些实施方案中，生物分子是蛋白。在一些实施方案中，反应性部分与蛋白的氨基酸形成共价键。在一些实施方案中，生物分子是脂质、碳水化合物或核酸（例如rna或dna）。在一些实施方案中，生物分子包含附加表位，例如，flag、6xhis、ha、c-myc、谷胱甘肽-s-转移酶、strep-标签、麦芽糖结合蛋白、几丁质结合蛋白、s-标签、v5标签或avitag。在一些实施方案中，报道基团包括氮杂二苯并环辛炔、硫醇、烯、炔、叠氮化物、四嗪、反式-环辛烯、(二苯基膦基)芳基、(二苯基膦基)烷基或活化酯（例如，羟基苯并三唑（hobt）酯）。在一些实施方案中，反应性部分是光交联剂基团、磺酰氟、氟代硫酸盐（fluorosulfate）、迈克尔受体部分、离去基团部分或与天然存在的α氨基酸的侧链中的亲核部分（例如，与半胱氨酸的硫醇基、赖氨酸的氨基、丝氨酸或苏氨酸的羟基或酪氨酸的酚基）形成共价键的部分。在一些实施方案中，可检测分子包括洋地黄毒苷、镍nta（次氮基三乙酸）、发色团或发光团。在一些实施方案中，发色团包括非荧光染料发色团、猝灭剂、吸收发色团、荧光团、有机染料、无机染料、金属螯合物或荧光酶底物。在一些实施方案中，可检测分子是生物素。生物素可以与链霉抗生物素蛋白缀合物结合，例如，hrp、sulfotag、荧光团或金属螯合物。在一些实施方案中，功能部分包括氮杂二苯并环辛炔、硫醇、烯、炔、叠氮化物、四嗪、反式-环辛烯、(二苯基膦基)芳基、(二苯基膦基)烷基或活化酯（例如，羟基苯并三唑（hobt）酯）。在一些实施方案中，固体支持体是膜、玻璃、塑料、合成制备的聚合物、eppendorf管、多孔板的孔或表面等离振子共振芯片。在一些实施方案中，识别部分是抗体、dna结合蛋白、rna结合蛋白、碳水化合物结合蛋白或脂质结合蛋白。在一些实施方案中，抗体是针对生物分子和/或附加表位的抗体。
7.在一些实施方案中，步骤（d）包括通过elisa、蛋白印迹、免疫荧光测定、荧光测定、荧光微量测定技术（fmat）或细胞亚细胞染色检测结合的可检测缀合物。在一些实施方案中，方法在包含生物分子的粗细胞提取物上进行、在包含生物分子的蛋白的脂质体制剂上进行、在包含生物分子的分离的细胞器上进行、在包含生物分子的纯化的蛋白制剂上进行或原位进行。在一些实施方案中，方法是基于细胞的测定。在一些实施方案中，生物分子在细胞中表达。在一些实施方案中，细胞被人工改造以表达生物分子。在一些实施方案中，在步骤（b）之前裂解细胞。在一些实施方案中，步骤（d）进一步包括定量结合的可检测缀合物的量。在一些实施方案中，步骤（a）进一步包括生物分子的底物。在一些实施方案中，在有生物分子的底物的情况下形成的结合的可检测缀合物的量小于在没有底物的情况下形成的结合的可检测缀合物的量（即，探针分子是底物竞争探针）。在其他实施方案中，在有生物分子的底物的情况下形成的结合的可检测缀合物的量大于在没有底物的情况下形成的结合的可检测缀合物的量（即，探针分子是底物协同探针）。
附图说明
8.图1举例说明了用于配体发现和靶接合（engagement）的细胞结合测定中的rapid（一种高通量筛选）的一般规程。
9.图2a-2c显示rapid鉴定作为靶占用的起点或探针的正构（orthosteric）和变构配体。图2a显示由rap文库的子集对肌酸转运蛋白的共价修饰程度是高度可重复的。图2b显示
了针对肌酸转运蛋白slc6a8
±
底物类似物β-胍基丙酸（β-gpa）的2000 raps的点阵（screen）。落在对角线外的点要么是底物竞争的，要么是底物协同的。图2c显示了从点阵鉴定的两个raps显示随gpa浓度而变的靶的共价修饰的剂量依赖性抑制或增强。ic50/ec50对应于β-gpa的已知抑制常数（~30 μm）。
10.图3显示了反应性亲和探针jn-1724对肌酸转运蛋白slc6a8的共价灭活和通过与竞争者β-gpa共同给药的保护。细胞用在有或没有1 mm β-gpa的情况下的100 μm jn-1724给药30分钟，且然后用365 nm光照射6分钟。洗涤细胞并通过肌酸摄取测定测量slc6a8的残余转运活性。
11.图4显示了质谱分析法数据，其显示了被与β-gpa共同给药所竞争的通过反应性亲和探针jn-1724对slc6a8的共价修饰。细胞用在有或没有1 mm β-gpa的情况下的20 μm jn-1724给药30分钟，且然后用365 nm光照射6分钟。细胞被裂解；生物素被点击上（clicked on）；且生物素化的蛋白用链霉抗生物素蛋白进行亲和纯化，用胰蛋白酶消化，并通过具有tmt定量的串联质谱分析法进行鉴定。slc6a8（用箭标指出的点）是鉴定的蛋白之一，且与1 mm β-gpa共同给药将富集水平降低80%。
具体实施方式
12.本发明提供了一种用于筛选生物分子的配体候选物的方法和系统。反应性亲和探针相互作用发现（rapid）是针对原位靶的定量结合测定，其回避了靶纯化的挑战，并可能提供一种发现和靶向变构结合位点的系统方法。本文描述的rapid技术使得能够直接鉴定完整细胞中感兴趣的生物大分子的小分子结合物（binder）。
13.小分子是用于研究蛋白功能的强大工具，且可以充当新治疗法的引导。然而，大多数人类蛋白缺乏小分子配体，并且整个蛋白类别被认为是不可投药的（undruggable）。本文公开的方法可以鉴定生物分子（例如蛋白）的小分子探针，所述生物分子（例如蛋白）已经被证明难以使用复杂化合物文库的高通量筛选进行靶向。尽管通常追求可逆结合配体，但共价片段为小分子探针提供了备择的途径，包括可以接近仅通过结合亲和力难以靶向的蛋白区域的那些。
14.在某些实施方案中，本文公开了一种鉴定配体的方法，包括：（a）使生物分子和探针分子接触；其中所述探针分子包含结合元件、报道基团和反应性部分；所述探针分子通过所述结合元件与所述生物分子结合；且所述反应性部分与所述生物分子形成共价键，从而形成缀合物；（b）使所述缀合物与包含与所述报道基团反应的功能部分的可检测分子接触，从而形成可检测缀合物；（c）使所述可检测缀合物与固体支持体接触；其中所述固体支持体包含识别部分；且所述识别部分与所述可检测缀合物结合，从而形成结合的可检测缀合物；和（d）检测所述结合的可检测缀合物，从而鉴定作为所述生物分子的配体的所述探针分子。
15.在一些实施方案中，探针分子依赖于与蛋白残基的先天化学反应性。探针分子可以具有反应性部分，例如光反应元件，其在紫外线照射时将可逆的小分子-蛋白相互作用转化为稳定的共价加合物。探针分子还可以具有报道基团，例如炔，其充当空间上最小化的替代报道分子，从而允许通过铜催化的叠氮化物-炔环加成（cuaak或“点击（click）”）化学与叠氮化物标签的后期缀合。探针分子还可以具有将探针指向识别特定结构特征的蛋白的结合元件。
16.美国公开的专利申请2017/0115303和2016/0252509描述了探针分子的例子；这些公开物中的每一个都特此整体引入作为参考，且特别是对于其中描述的补体途径的抑制剂。
17.定义除非本文另有定义，否则本技术中使用的科学技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。通常，本文描述的在化学、细胞和组织培养、分子生物学、细胞和癌症生物学、神经生物学、神经化学、病毒学、免疫学、微生物学、药理学、遗传学和蛋白和核酸化学方面使用的命名法及其技术，是本领域众所周知和通常使用的那些。
18.术语“培养”指细胞或生物在各种种类的培养基上或中的体外繁殖。要理解的是，培养中生长的细胞的后代可能与亲代细胞不完全相同（即，形态、遗传或表型）。“扩充的”意指细胞的任何增殖或分裂。
19.术语“减少”、“降低的”、“降低”或“抑制”在本文中均用于意指统计学显著量的减少。在一些实施方案中，“降低”、“降低”或“减少”或“抑制”一般指与参考水平（例如，不存在给定配体）相比减少至少10%并且可以包括，例如，减少至少约10%、至少约20%、至少约25%、至少约30%、至少约35%、至少约40%、至少约45%、至少约50%、至少约55%、至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约98%、至少约99%或更多。如本文所使用的，“降低”或“抑制”不包括与参考水平相比的完全抑制或降低。“完全抑制”是与参考水平相比100%的抑制。
20.术语“增加的”、“增加”或“增强”或“激活”在本文中均用于一般意指统计学显著量的增加；为避免任何疑问，术语“增加的”、“增加”或“增强”或“激活”意指与参考水平相比增加至少10%，例如与参考水平相比增加至少约20%，或至少约30%，或至少约40%，或至少约50%，或至少约60%，或至少约70%，或至少约80%，或至少约90%或最多到并包括100%增加或10-100%之间的任何增加，或与参考水平相比至少约2-倍，或至少约3-倍，或至少约4-倍，或至少约5-倍或至少约10-倍增加，至少约20-倍增加，至少约50-倍增加，至少约100-倍增加，至少约1000-倍增加或更多。
21.冠词“一个（a）”和“一种（an）”在本文中用于指冠词的语法对象中的一个或不止一个（即至少一个）。作为例子，“一个元件”意指一个元件或不止一个元件。
22.如本文所用的，在提及两个分子之间的相互作用时，术语“相互作用”指分子彼此之间的物理接触（例如，结合）。通常，这种相互作用导致所述分子中的一种或两者的活性（其产生生物学效应）。活性可以是分子之一或两者的直接活性（例如，信号转导）。
23.如本文所用的，“分离的蛋白”指在从细胞分离或通过重组dna技术产生时基本上不含其他蛋白、细胞材料、分离培养基和培养基，或在化学合成时基本上不含化学前体或其他化学药品的蛋白。“分离的”或“纯化的”蛋白或其生物活性部分基本上不含来自得到抗体、多肽、肽或融合蛋白的细胞或组织来源的细胞材料或其他污染蛋白，或基本上不含在化学合成时的化学前体或其他化学药品。措辞“基本上不含细胞材料”包括靶多肽（例如，免疫球蛋白）或其片段的制剂，其中蛋白与分离或重组产生所述蛋白的细胞的细胞组分分离。在一个实施方案中，措辞“基本上不含细胞材料”包括靶蛋白或其片段的制剂，其具有小于约30％（以干重计）的非靶蛋白（在本文中也称为“污染蛋白”），更优选小于约20％的非靶蛋白，仍然更优选小于约10％的非靶蛋白，且最优选小于约5％的非靶蛋白。当重组产生抗体、
多肽、肽或融合蛋白或其片段，例如，其生物活性片段时，其还优选基本上不含培养基，即，培养基相当于小于约20%，更优选小于约10％，且最优选小于约5％的蛋白制剂体积。
24.如本文所用的，术语“核酸分子”意图是包括dna分子和rna分子。核酸分子可以是单链或双链的，但优选是双链dna。
25.当核酸与另一个核酸序列放置到功能关系中时，它是“可操作地连接”的。例如，如果启动子或增强子影响序列的转录，则它与编码序列可操作地连接。关于转录调节序列，可操作地连接的意指被连接的dna序列是邻接的，并且在必须要连接两个蛋白编码区的场合，是邻接的并且在阅读框中。对于开关序列，可操作地连接的表示所述序列能够实现开关重组。
26.筛选测定本发明提供了一种用于筛选生物分子的配体候选物的方法和系统。反应性亲和探针相互作用发现（rapid）是针对原位靶的定量结合测定，其回避了靶纯化的挑战，并可能提供一种发现和靶向变构结合位点的系统方法。
27.在某些实施方案中，本文公开了一种鉴定配体的方法，包括：（a）使生物分子和探针分子接触；其中所述探针分子包含结合元件、报道基团和反应性部分；所述探针分子通过所述结合元件与所述生物分子结合；且所述反应性部分与所述生物分子形成共价键，从而形成缀合物；（b）使所述缀合物与包含与所述报道基团反应的功能部分的可检测分子接触，从而形成可检测缀合物；（c）使所述可检测缀合物与固体支持体接触；其中所述固体支持体包含识别部分；且所述识别部分与所述可检测缀合物结合，从而形成结合的可检测缀合物；和（d）检测所述结合的可检测缀合物，从而鉴定作为所述生物分子的配体的所述探针分子。
28.进一步提供了可以应用于本文所述的本发明的任何方面的许多实施方案。例如，在一些实施方案中，结合元件是小分子、肽或核酸（例如rna或dna）。在一些实施方案中，结合元件是包含多个结合元件的文库的组分。在一些实施方案中，文库包括chembridge片段文库、pyramid platform fragment-based drug discovery、maybridge片段文库、来自analyticon的frgx、来自ancorex的tci-frag、来自asinex的bio building blocks、来自charles river的biofocus 3d、来自emerald bio的fragments of life (fol)、enamine片段文库、iota diverse 1500、bionet片段文库、life chemicals fragments collection、otava片段文库、prestwick片段文库、selcia片段文库、timtec基于片段的文库、来自vitas-m laboratory的allium或zenobia片段文库。在一些实施方案中，生物分子是蛋白。在一些实施方案中，反应性部分与蛋白的氨基酸形成共价键。在一些实施方案中，生物分子是脂质、碳水化合物或核酸（例如rna或dna）。在一些实施方案中，生物分子包含附加表位，例如，flag、6xhis、ha、c-myc、谷胱甘肽-s-转移酶、strep-标签、麦芽糖结合蛋白、几丁质结合蛋白、s-标签、v5标签或avitag。在一些实施方案中，报道基团包括氮杂二苯并环辛炔、硫醇、烯、炔、叠氮化物、四嗪、反式-环辛烯、(二苯基膦基)芳基、(二苯基膦基)烷基或活化酯（例如，羟基苯并三唑（hobt）酯）。在一些实施方案中，反应性部分是光交联剂基团、磺酰氟、氟代硫酸盐（fluorosulfate）、迈克尔受体部分、离去基团部分或与天然存在的α氨基酸的侧链中的亲核部分（例如，与半胱氨酸的硫醇基、赖氨酸的氨基、丝氨酸或苏氨酸的羟基或酪氨酸的酚基）形成共价键的部分。在一些实施方案中，可检测分子包括洋地黄毒苷、镍nta（次氮基三乙酸）、发色团或发光团。在一些实施方案中，发色团包括非荧光染料发色团、猝
灭剂、吸收发色团、荧光团、有机染料、无机染料、金属螯合物或荧光酶底物。在一些实施方案中，可检测分子是生物素。生物素可以与链霉抗生物素蛋白缀合物结合，例如，hrp、sulfotag、荧光团或金属螯合物。在一些实施方案中，功能部分包括氮杂二苯并环辛炔、硫醇、烯、炔、叠氮化物、四嗪、反式-环辛烯、(二苯基膦基)芳基、(二苯基膦基)烷基或活化酯（例如，羟基苯并三唑（hobt）酯）。在一些实施方案中，固体支持体是膜、玻璃、塑料、合成制备的聚合物、eppendorf管、多孔板的孔或表面等离振子共振芯片。在一些实施方案中，识别部分是抗体、dna结合蛋白、rna结合蛋白、碳水化合物结合蛋白或脂质结合蛋白。在一些实施方案中，抗体是针对生物分子和/或附加表位的抗体。
29.在一些实施方案中，步骤（d）包括通过elisa、蛋白印迹、免疫荧光测定、荧光测定、荧光微量测定技术（fmat）或细胞亚细胞染色检测结合的可检测缀合物。在一些实施方案中，方法在包含生物分子的粗细胞提取物上进行、在包含生物分子的蛋白的脂质体制剂上进行、在包含生物分子的分离的细胞器上进行、在包含生物分子的纯化的蛋白制剂上进行或原位进行。在一些实施方案中，方法是基于细胞的测定。在一些实施方案中，生物分子在细胞中表达。在一些实施方案中，细胞被人工改造以表达生物分子。在一些实施方案中，在步骤（b）之前裂解细胞。在一些实施方案中，步骤（d）进一步包括定量结合的可检测缀合物的量。在一些实施方案中，步骤（a）进一步包括生物分子的底物。在一些实施方案中，在有生物分子的底物的情况下形成的结合的可检测缀合物的量小于在没有底物的情况下形成的结合的可检测缀合物的量（即，探针分子是底物竞争探针）。在其他实施方案中，在有生物分子的底物的情况下形成的结合的可检测缀合物的量大于在没有底物的情况下形成的结合的可检测缀合物的量（即，探针分子是底物协同探针）。
30.如本文所用的，术语“探针”或“测试化合物”或“候选试剂”指待进行其对细胞具有影响的能力的筛选的试剂或试剂集合（例如，化合物）。测试化合物可以包括多种不同的化合物，包括化合物，化合物的混合物，例如，多糖，小的有机或无机分子（例如，具有小于2000道尔顿、小于1000道尔顿、小于1500道尔顿、小于1000道尔顿或小于500道尔顿的分子量的分子），生物大分子，例如，肽，蛋白，肽类似物及其类似物和衍生物，肽模拟物（peptidomimetics），核酸，核酸类似物和衍生物，由生物材料制备的提取物，例如，细菌，植物，真菌或动物细胞或组织，天然存在的或合成的组合物。
31.取决于正在实践的特定实施方案，探针可以在溶液中游离提供，或者可以附着到载体或固体支持体例如珠上。可以使用许多合适的固体支持体用于固定探针。合适的固体支持体的例子包括琼脂糖、纤维素、葡聚糖（作为下述可商购获得的，即，葡聚糖凝胶（sephadex），琼脂糖凝胶（sepharose））羧甲基纤维素、聚苯乙烯、聚乙二醇（peg）、滤纸、硝化纤维素、离子交换树脂、塑料膜、多胺甲基乙烯基醚马来酸共聚物、玻璃珠、氨基酸共聚物、乙烯-马来酸共聚物、尼龙、丝等。此外，对于本文所述的方法，可以单独或成组地筛选探针。在预期有效探针的命中率低以致于人们对于给定的组将不会预期不止一个阳性结果的场合，组筛选是特别有用的。
32.与良好的先导化合物（lead compound）有关的小分子的性质是本领域已知的。lipinski的五规则（rule of five）为开发口服可生物利用的药物候选物提供了原始框架。随着可旋转键数目（nrot）是一个重要参数（对于口服生物利用率，7的最大值看来似乎是最佳的）的发现，这些规则已得到了加强。极性表面积（polar surface area）（psa）可能是另
一个关键性质；具有110-140
ꢀå
2的psa的被动吸收的分子被认为具有低口服生物利用率。最近，对于从hts运动中鉴定的适合于最优化并且与lipinski值相比具有相对
‘
按比例缩小’的性质的分子，引入了术语
‘
先导样（lead-like）’。很多文献正在处理面临通过筛选药物大小的化合物文库发现的化合物的问题。最近已出现了一种新的备择方法，且其被称为
‘
基于片段的’发现（carr, r.和jhoti, h. (2002) structure-based screening of low-affinity compounds. drug discov. today 7, 522
–
527；erlanson, d.a.等人(2000) site-directed ligand discovery. proc. natl. acad. sci. u. s. a. 97, 9367
–
72；vetter, d. (2002) chemical microarrays, fragment diversity, label-free imaging by plasmon resonance-a chemical genomics approach. j. cell. biochem. 39, 79
–
84）。使用所述方法，鉴定的命中通常遵守
‘
三规则（rule of three）’，且这可能是构建用于先导生成的片段文库的有用规则。
33.所述方法从使用高通量x射线晶体学筛选的片段文库（mw 100-250 da）开始。这些片段探测蛋白中的关键结合相互作用，但小到足以把将阻止它们有效结合的不利相互作用（电子或空间）的机会减至最小（hann, m.等人(2001) molecular complexity and its impact on the probability of finding leads for drug discovery. j. chem. inf. comput. sci. 41, 856
–
864）。然后通过解释电子密度图来定义蛋白中这些小配体的结合模式。由于x射线晶体学在鉴定弱相互作用（μm-mm）方面非常有效，所以可以鉴定在生物测定中没有可测量活性的片段命中。可以构建片段文库以采样化学多样性或靶向蛋白上的特定相互作用。筛选针对激酶和蛋白酶的两种类型的片段文库，以及随后将命中最优化为有效的先导化合物，表明成功的命中表现出特定的物理化学性质。
34.对一组不同的片段命中的分析表明，这种命中看来似乎平均遵守
‘
三规则’，其中分子量《300，氢键供体的数目≤3，氢键受体的数目≤3，且clogp≤3。此外，结果提示nrot（≤3）和psa（≤60）也可能是用于片段选择的有用标准。这些数据意味着，在构建用于有效的先导发现的片段文库时，
‘
三规则’可能是有用的。
35.许多小分子文库是本领域已知的并且可商购获得。可以使用本文所述的筛选方法筛选这些小分子文库。化学文库或化合物文库是可以与本文所述的方法一起使用以对候选试剂进行特定效果的筛选的贮存的化学药品的集合。化学文库包含关于每种化合物的化学结构、纯度、量和物理化学特征的信息。化合物文库可从例如除了别的以外的enzo life sciences、aurora fine chemicals、exclusive chemistry ltd.、chemdiv、chembridge、timtec inc.、asischem和princeton biomolecular research商购获得。
36.在不受限制的情况下，可以在适当的时间段内以相对于对照可对细胞产生影响的任何浓度测试化合物。在一些实施方案中，化合物以约0.01 nm至约100 mm、约0.1 nm至约500μm、约0.1μm至约20μm、约0.1μm至约10μm或约0.1μm至约5μm的浓度进行测试。
37.化合物筛选测定可用于高通量筛选中。高通量筛选是测试化合物文库的给定活性的过程。高通量筛选力图快速且平行筛选大量化合物。例如，使用微量滴定板和自动测定设备，实验室可以平行执行多达每天100,000次测定或更多。
38.筛选测定可以继之以后来的测定，以进一步鉴定所鉴定的测试化合物是否具有对于预期用途所期望的性质。例如，筛选测定可以继之以选自下述任一种的测量的第二测定：生物利用率、毒性或药物代谢动力学，但不限于这些方法。
39.本发明还包括用于鉴定如本文所述的配体的试剂盒。本发明的试剂盒还可以包括说明书材料，其公开或描述所公开的本发明的试剂盒或探针在如本文所提供的所公开的本发明的方法中的用途。试剂盒还可以包括额外的组分以促进试剂盒被设计的特定应用。例如，试剂盒可以额外含有检测标记的工具（例如，用于酶促标记的酶底物，用于检测荧光标记的滤色片组，适当的第二标记，例如绵羊抗小鼠-hrp等）和对于对照所必需的试剂（例如，对照生物样品或标准物）。试剂盒可额外包括缓冲液和其他公认的供所公开的本发明方法之用的试剂。非限制性实例包括减少非特异性结合的试剂，例如载体蛋白或去污剂。
[0040]“试剂盒”是包括用于特异性检测和/或影响本发明标记的表达的至少一种试剂如探针或小分子的任何制品（例如，包装或容器）。试剂盒可以作为用于执行本发明方法的单元进行推销、分配或销售。试剂盒可以包括一种或多种表达用于本发明方法中的组合物所必需的试剂。在某些实施方案中，试剂盒可进一步包括参考标准物。本领域技术人员可以想像许多这种对照，包括，但不限于，通用分子。试剂盒中的试剂可以在单独的容器中提供，或者作为在单个容器中的两种或更多种试剂的混合物提供。此外，可以包括描述试剂盒内的组合物的用途的说明书材料。
[0041]
实施例实施例1：用于针对亲和标记的靶筛选rap文库的rapid规程捕获平板制备：greiner hibind平板（sigma aldrich cat. no. m4561-40ea）用捕获抗体包被。a蛋白（thermo, cat. no. 101100）通过将其用50%甘油/pbs重构至5 mg/ml，并将其以1:500稀释到包被缓冲液（thermo, buph
™
碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液包（carbonate-bicarbonate buffer packs））中进行制备。将平板用 100 ul包被缓冲液洗涤1x，并以六个一组放置在一边。向每个平板的每个孔中添加50 μl a蛋白。将打印记的（stamped）平板放置在4℃deli冰箱中过夜。第二天早晨，用 100 μl包被缓冲液将a蛋白包被的平板洗涤2x。将200 μl superblock（thermo fisher cat. no. 37515）添加到每个平板的每个孔中，并于室温温育1小时。在捕获平板已被封闭2小时后，所有平板均用pbs/t洗涤3x。制备135 ml在superblock缓冲液中的1 μg/ml捕获抗体。在每个捕获平板的每个孔中添加50 μl制备的抗体，并于室温温育1小时。
[0042]
裂解物平板制备：对于hek293t细胞系，使用每96-孔平板7.5m细胞。24个96-孔平板用聚-d-赖氨酸（sigma aldrich cat. no. p7280-5mg）包被，并洗涤。然后，每孔平板接种75k细胞并温育过夜以允许细胞附着。用细胞成像培养基将rap给药平板重构为所期望的终浓度的4x。对每个细胞平板一次一个，去除培养基并分配200 μl细胞成像培养基（cim）（thermo, cat. no. a14291dj）。紧接着对于每个平板，去除200 μl cim，并立即添加75 μl cim。一旦洗涤细胞并在每个平板中分配75 μl cim，就添加25 μl重构的rap，并将细胞于37℃细胞培养箱中温育30分钟。在细胞温育时，通过添加12.5 ml的20% ddm（anatrace cat. no. d310 25 gm）、250 ml的hepes 缓冲盐水和5片完整蛋白酶片剂（sigma aldrich cat. no. 4693132001）制备裂解缓冲液（~10 ml/平板）。平板在紫外线交联剂（spectrolinker cat. no. 1195t76）中照射。一旦照射3分钟，就去除培养基并用200 μl cim 洗涤细胞以去除过量的rap。然后从每个平板中去除cim，并添加 100 μl裂解缓冲液。将平板于室温温育1小时以完
成裂解。
[0043]
通过对于总数为140 ml的点击混合物（click mix）制备30 ml每种试剂，使用铜催化的叠氮化物炔环加成将报道分子生物素附着到rap的炔上。这对应于600 mg thpta（click chemistry tools cat. no. 1010-5g）、600 mg抗坏血酸（sigma aldrich cat. no. 11140-50g）和120 mg硫酸铜（sigma aldrich cat. no. 451657-10g），和750 μl的10 mm吡啶甲基-生物素-叠氮化物（click chemistry tools cat. no. 1167-100）。每种试剂单独溶解在30 ml水中，然后恰好在开始点击反应之前，将试剂以下述顺序混合在一起：ting
ꢀ‑
》 thpta
ꢀ‑
》铜（变为蓝色）-》抗坏血酸（变为透明）。将40 μl的点击混合物添加到每个平板的每个孔中。温育1小时后，用300 μl pbs-t（boston bioproducts cat. no. ibb-171）的3次洗涤将捕获抗体从捕获平板洗掉。点击反应通过添加每孔10 μl 0.5m edta（sigma aldrich cat. no. 324506-100ml）猝灭。将100 μl裂解物转移到每个相应的捕获平板中，并于室温温育至少1小时。在1小时捕获温育后，用300 μl pbs/t将平板洗涤5次。
[0044]
链霉抗生物素蛋白-hrp（cell signaling technologies cat. no. 3999s）通过1:1000稀释cell signaling technologies (p/n)材料在pbs/t中制备。将50 μl制备的链霉抗生物素蛋白-hrp添加到每个孔中，并于室温温育30分钟。在30分钟链霉抗生物素蛋白温育后，用300 μl pbs/t将平板洗涤5x。最后一次洗涤物保持保存在平板中以防止干燥。
[0045]
tecan装备有200 ul管尖和tmb。tecan的槽装满至少135 ul的tmb（thermo fisher cat. no. n301）并打开stamp 50 ul方法。将平板排空并以适当的顺序放置在tecan中，且运行所述方法。重复所述过程，直到所有平板都收到tmb为止。每个平板用50 μl的0.2n 硫酸猝灭。在平板阅读器上顺序读取平板，从而定量450 nm处的吸光度。
[0046]
鉴定肌酸转运蛋白slc6a8的底物敏感性结合物：表达标记的肌酸转运蛋白slc6a8的细胞用于筛选底物敏感性结合物。图1中举例说明了用于配体发现和靶接合的细胞结合测定中的rapid（一种高通量筛选）的一般规程。
[0047]
rapid鉴定作为靶占用的起点或探针的正构和变构配体。由rap文库的子集对肌酸转运蛋白的共价修饰程度是高度可重复的（图2a）。针对肌酸转运蛋白slc6a8
±
底物类似物胍基丙酸（gpa）的2000 raps的点阵鉴定了底物敏感性结合物（图2b）。落在对角线外的点要么是底物竞争的，要么是底物协同的。从点阵鉴定的两个raps显示随gpa浓度而变的靶的共价修饰的剂量依赖性抑制或增强（图2c）。ic50/ec50对应于gpa的已知抑制常数（~30 μm）。细胞用在有或没有1 mm β-gpa的情况下的100 μm jn-1724给药30分钟，且然后用365 nm光照射6分钟。洗涤细胞并通过肌酸摄取测定测量slc6a8的残余转运活性。图3中显示了反应性亲和探针jn-1724对肌酸转运蛋白slc6a8的共价灭活和通过与竞争者β-gpa共同给药的保护。
[0048]
用底物竞争rap处理细胞定量地抑制肌酸转运蛋白。30分钟100 μm剂量的jn-1724继之以在365 nm交联6分钟足以将slc6a8肌酸转运抑制至正常转运的5.7%。为了通过加合物组（adductome）的无偏质谱分析法确认靶接合，细胞用在有或没有1 mm β-gpa的情况下的20 μm jn-1724给药30分钟，且然后用365 nm光照射6分钟。细胞被裂解；生物素被点击上；且生物素化的蛋白用链霉抗生物素蛋白进行亲和纯化，用胰蛋白酶消化，并通过具有tmt定量的串联质谱分析法进行鉴定。slc6a8（用箭标指出的点）是鉴定的蛋白之一，且与1 mm β-gpa共同给药将富集水平降低80%（图4）。
[0049]
引入作为参考本文提及的所有公开物和专利都特此整体引入作为参考，就好像每个单独的公开物或专利被具体地和单独地指示引入作为参考一样。在冲突的情况下，以本技术（包括本文中的任何定义）为准。
[0050]
等同方案尽管已经讨论了本发明的特定实施方案，但上述说明书是举例说明性的而不是限制性的。在阅读本说明书和以下权利要求时，本发明的许多变化对于本领域技术人员将变得显而易见。本发明的全部范围应通过参考权利要求及其等同方案的全部范围和说明书以及这种变化来确定。
1.相关申请本技术要求2019年10月15日提交的美国临时专利申请序列号62/915,310的优先权利益。
背景技术：
2.鉴定“可投药的（druggable）”靶及其相应的治疗剂是药物发现研究中的两个基本挑战。许多生物分子例如蛋白的药理学仍然难得到，这是因为它们的内源性或外源性调节剂尚未被发现。因此，探索这些生物分子的生理功能和药理潜力的工具，无论它们是内源性和/或替代配体，都是最重要的。
3.对感兴趣的生物大分子的药理调节剂的发现经常是通过对分子文库进行其结合或功能性调节纯化的大分子的能力的筛选来实现的。然而，许多类别的生物大分子，包括多次（multi-pass）跨膜蛋白，难以从细胞中纯化，且必须在其天然细胞环境中进行筛选。这种基于细胞的筛选需要选择替代读出（readout），例如细胞生存力、信号转导或基因表达。使用基于替代细胞的读出的化合物筛选产生了两个挑战：（i）许多命中将通过脱靶（off-target）效应间接发挥其药理学，以及（ii）许多改变大分子功能的其他方面的真正配体将被遗漏。一种使得能够直接鉴定完整细胞中感兴趣的生物大分子的小分子结合物（binder）的技术将处理这些突出的挑战，并代表所述领域的重大进步。
技术实现要素：
4.本发明提供了一种用于筛选生物分子的配体候选物的方法和系统。反应性亲和探针相互作用发现（rapid）技术是针对原位靶的定量结合测定，其回避了靶纯化的挑战，并可能提供一种发现和靶向变构结合位点的系统方法。
5.在某些实施方案中，本文公开了一种鉴定配体的方法，包括：（a）使生物分子和探针分子接触；其中所述探针分子包含结合元件、报道基团和反应性部分；所述探针分子通过所述结合元件与所述生物分子结合；且所述反应性部分与所述生物分子形成共价键，从而形成缀合物；（b）使所述缀合物与包含与所述报道基团反应的功能部分的可检测分子接触，从而形成可检测缀合物；（c）使所述可检测缀合物与固体支持体接触；其中所述固体支持体包含识别部分；且所述识别部分与所述可检测缀合物结合，从而形成结合的可检测缀合物；和（d）检测所述结合的可检测缀合物，从而鉴定作为所述生物分子的配体的所述探针分子。
6.进一步提供了可以应用于本文所述的本发明的任何方面的许多实施方案。例如，在一些实施方案中，结合元件是小分子、肽或核酸（例如rna或dna）。在一些实施方案中，结合元件是包含多个结合元件的文库的组分。在一些实施方案中，文库包括小分子片段文库，其可被定义为满足3规则（rule of 3）：分子量≤300 da，clogp≤3，氢键供体≤3，和氢键受体≤3。示例性文库包括：chembridge片段文库、pyramid platform fragment-based drug discovery、maybridge片段文库、来自analyticon的frgx、来自ancorex的tci-frag、来自asinex的bio building blocks、来自charles river的biofocus 3d、来自emerald bio的
fragments of life (fol)、enamine片段文库、iota diverse 1500、bionet片段文库、life chemicals fragments collection、otava片段文库、prestwick片段文库、selcia片段文库、timtec基于片段的文库、来自vitas-m laboratory的allium或zenobia片段文库。在一些实施方案中，生物分子是蛋白。在一些实施方案中，反应性部分与蛋白的氨基酸形成共价键。在一些实施方案中，生物分子是脂质、碳水化合物或核酸（例如rna或dna）。在一些实施方案中，生物分子包含附加表位，例如，flag、6xhis、ha、c-myc、谷胱甘肽-s-转移酶、strep-标签、麦芽糖结合蛋白、几丁质结合蛋白、s-标签、v5标签或avitag。在一些实施方案中，报道基团包括氮杂二苯并环辛炔、硫醇、烯、炔、叠氮化物、四嗪、反式-环辛烯、(二苯基膦基)芳基、(二苯基膦基)烷基或活化酯（例如，羟基苯并三唑（hobt）酯）。在一些实施方案中，反应性部分是光交联剂基团、磺酰氟、氟代硫酸盐（fluorosulfate）、迈克尔受体部分、离去基团部分或与天然存在的α氨基酸的侧链中的亲核部分（例如，与半胱氨酸的硫醇基、赖氨酸的氨基、丝氨酸或苏氨酸的羟基或酪氨酸的酚基）形成共价键的部分。在一些实施方案中，可检测分子包括洋地黄毒苷、镍nta（次氮基三乙酸）、发色团或发光团。在一些实施方案中，发色团包括非荧光染料发色团、猝灭剂、吸收发色团、荧光团、有机染料、无机染料、金属螯合物或荧光酶底物。在一些实施方案中，可检测分子是生物素。生物素可以与链霉抗生物素蛋白缀合物结合，例如，hrp、sulfotag、荧光团或金属螯合物。在一些实施方案中，功能部分包括氮杂二苯并环辛炔、硫醇、烯、炔、叠氮化物、四嗪、反式-环辛烯、(二苯基膦基)芳基、(二苯基膦基)烷基或活化酯（例如，羟基苯并三唑（hobt）酯）。在一些实施方案中，固体支持体是膜、玻璃、塑料、合成制备的聚合物、eppendorf管、多孔板的孔或表面等离振子共振芯片。在一些实施方案中，识别部分是抗体、dna结合蛋白、rna结合蛋白、碳水化合物结合蛋白或脂质结合蛋白。在一些实施方案中，抗体是针对生物分子和/或附加表位的抗体。
7.在一些实施方案中，步骤（d）包括通过elisa、蛋白印迹、免疫荧光测定、荧光测定、荧光微量测定技术（fmat）或细胞亚细胞染色检测结合的可检测缀合物。在一些实施方案中，方法在包含生物分子的粗细胞提取物上进行、在包含生物分子的蛋白的脂质体制剂上进行、在包含生物分子的分离的细胞器上进行、在包含生物分子的纯化的蛋白制剂上进行或原位进行。在一些实施方案中，方法是基于细胞的测定。在一些实施方案中，生物分子在细胞中表达。在一些实施方案中，细胞被人工改造以表达生物分子。在一些实施方案中，在步骤（b）之前裂解细胞。在一些实施方案中，步骤（d）进一步包括定量结合的可检测缀合物的量。在一些实施方案中，步骤（a）进一步包括生物分子的底物。在一些实施方案中，在有生物分子的底物的情况下形成的结合的可检测缀合物的量小于在没有底物的情况下形成的结合的可检测缀合物的量（即，探针分子是底物竞争探针）。在其他实施方案中，在有生物分子的底物的情况下形成的结合的可检测缀合物的量大于在没有底物的情况下形成的结合的可检测缀合物的量（即，探针分子是底物协同探针）。
附图说明
8.图1举例说明了用于配体发现和靶接合（engagement）的细胞结合测定中的rapid（一种高通量筛选）的一般规程。
9.图2a-2c显示rapid鉴定作为靶占用的起点或探针的正构（orthosteric）和变构配体。图2a显示由rap文库的子集对肌酸转运蛋白的共价修饰程度是高度可重复的。图2b显示
了针对肌酸转运蛋白slc6a8
±
底物类似物β-胍基丙酸（β-gpa）的2000 raps的点阵（screen）。落在对角线外的点要么是底物竞争的，要么是底物协同的。图2c显示了从点阵鉴定的两个raps显示随gpa浓度而变的靶的共价修饰的剂量依赖性抑制或增强。ic50/ec50对应于β-gpa的已知抑制常数（~30 μm）。
10.图3显示了反应性亲和探针jn-1724对肌酸转运蛋白slc6a8的共价灭活和通过与竞争者β-gpa共同给药的保护。细胞用在有或没有1 mm β-gpa的情况下的100 μm jn-1724给药30分钟，且然后用365 nm光照射6分钟。洗涤细胞并通过肌酸摄取测定测量slc6a8的残余转运活性。
11.图4显示了质谱分析法数据，其显示了被与β-gpa共同给药所竞争的通过反应性亲和探针jn-1724对slc6a8的共价修饰。细胞用在有或没有1 mm β-gpa的情况下的20 μm jn-1724给药30分钟，且然后用365 nm光照射6分钟。细胞被裂解；生物素被点击上（clicked on）；且生物素化的蛋白用链霉抗生物素蛋白进行亲和纯化，用胰蛋白酶消化，并通过具有tmt定量的串联质谱分析法进行鉴定。slc6a8（用箭标指出的点）是鉴定的蛋白之一，且与1 mm β-gpa共同给药将富集水平降低80%。
具体实施方式
12.本发明提供了一种用于筛选生物分子的配体候选物的方法和系统。反应性亲和探针相互作用发现（rapid）是针对原位靶的定量结合测定，其回避了靶纯化的挑战，并可能提供一种发现和靶向变构结合位点的系统方法。本文描述的rapid技术使得能够直接鉴定完整细胞中感兴趣的生物大分子的小分子结合物（binder）。
13.小分子是用于研究蛋白功能的强大工具，且可以充当新治疗法的引导。然而，大多数人类蛋白缺乏小分子配体，并且整个蛋白类别被认为是不可投药的（undruggable）。本文公开的方法可以鉴定生物分子（例如蛋白）的小分子探针，所述生物分子（例如蛋白）已经被证明难以使用复杂化合物文库的高通量筛选进行靶向。尽管通常追求可逆结合配体，但共价片段为小分子探针提供了备择的途径，包括可以接近仅通过结合亲和力难以靶向的蛋白区域的那些。
14.在某些实施方案中，本文公开了一种鉴定配体的方法，包括：（a）使生物分子和探针分子接触；其中所述探针分子包含结合元件、报道基团和反应性部分；所述探针分子通过所述结合元件与所述生物分子结合；且所述反应性部分与所述生物分子形成共价键，从而形成缀合物；（b）使所述缀合物与包含与所述报道基团反应的功能部分的可检测分子接触，从而形成可检测缀合物；（c）使所述可检测缀合物与固体支持体接触；其中所述固体支持体包含识别部分；且所述识别部分与所述可检测缀合物结合，从而形成结合的可检测缀合物；和（d）检测所述结合的可检测缀合物，从而鉴定作为所述生物分子的配体的所述探针分子。
15.在一些实施方案中，探针分子依赖于与蛋白残基的先天化学反应性。探针分子可以具有反应性部分，例如光反应元件，其在紫外线照射时将可逆的小分子-蛋白相互作用转化为稳定的共价加合物。探针分子还可以具有报道基团，例如炔，其充当空间上最小化的替代报道分子，从而允许通过铜催化的叠氮化物-炔环加成（cuaak或“点击（click）”）化学与叠氮化物标签的后期缀合。探针分子还可以具有将探针指向识别特定结构特征的蛋白的结合元件。
16.美国公开的专利申请2017/0115303和2016/0252509描述了探针分子的例子；这些公开物中的每一个都特此整体引入作为参考，且特别是对于其中描述的补体途径的抑制剂。
17.定义除非本文另有定义，否则本技术中使用的科学技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。通常，本文描述的在化学、细胞和组织培养、分子生物学、细胞和癌症生物学、神经生物学、神经化学、病毒学、免疫学、微生物学、药理学、遗传学和蛋白和核酸化学方面使用的命名法及其技术，是本领域众所周知和通常使用的那些。
18.术语“培养”指细胞或生物在各种种类的培养基上或中的体外繁殖。要理解的是，培养中生长的细胞的后代可能与亲代细胞不完全相同（即，形态、遗传或表型）。“扩充的”意指细胞的任何增殖或分裂。
19.术语“减少”、“降低的”、“降低”或“抑制”在本文中均用于意指统计学显著量的减少。在一些实施方案中，“降低”、“降低”或“减少”或“抑制”一般指与参考水平（例如，不存在给定配体）相比减少至少10%并且可以包括，例如，减少至少约10%、至少约20%、至少约25%、至少约30%、至少约35%、至少约40%、至少约45%、至少约50%、至少约55%、至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约98%、至少约99%或更多。如本文所使用的，“降低”或“抑制”不包括与参考水平相比的完全抑制或降低。“完全抑制”是与参考水平相比100%的抑制。
20.术语“增加的”、“增加”或“增强”或“激活”在本文中均用于一般意指统计学显著量的增加；为避免任何疑问，术语“增加的”、“增加”或“增强”或“激活”意指与参考水平相比增加至少10%，例如与参考水平相比增加至少约20%，或至少约30%，或至少约40%，或至少约50%，或至少约60%，或至少约70%，或至少约80%，或至少约90%或最多到并包括100%增加或10-100%之间的任何增加，或与参考水平相比至少约2-倍，或至少约3-倍，或至少约4-倍，或至少约5-倍或至少约10-倍增加，至少约20-倍增加，至少约50-倍增加，至少约100-倍增加，至少约1000-倍增加或更多。
21.冠词“一个（a）”和“一种（an）”在本文中用于指冠词的语法对象中的一个或不止一个（即至少一个）。作为例子，“一个元件”意指一个元件或不止一个元件。
22.如本文所用的，在提及两个分子之间的相互作用时，术语“相互作用”指分子彼此之间的物理接触（例如，结合）。通常，这种相互作用导致所述分子中的一种或两者的活性（其产生生物学效应）。活性可以是分子之一或两者的直接活性（例如，信号转导）。
23.如本文所用的，“分离的蛋白”指在从细胞分离或通过重组dna技术产生时基本上不含其他蛋白、细胞材料、分离培养基和培养基，或在化学合成时基本上不含化学前体或其他化学药品的蛋白。“分离的”或“纯化的”蛋白或其生物活性部分基本上不含来自得到抗体、多肽、肽或融合蛋白的细胞或组织来源的细胞材料或其他污染蛋白，或基本上不含在化学合成时的化学前体或其他化学药品。措辞“基本上不含细胞材料”包括靶多肽（例如，免疫球蛋白）或其片段的制剂，其中蛋白与分离或重组产生所述蛋白的细胞的细胞组分分离。在一个实施方案中，措辞“基本上不含细胞材料”包括靶蛋白或其片段的制剂，其具有小于约30％（以干重计）的非靶蛋白（在本文中也称为“污染蛋白”），更优选小于约20％的非靶蛋白，仍然更优选小于约10％的非靶蛋白，且最优选小于约5％的非靶蛋白。当重组产生抗体、
多肽、肽或融合蛋白或其片段，例如，其生物活性片段时，其还优选基本上不含培养基，即，培养基相当于小于约20%，更优选小于约10％，且最优选小于约5％的蛋白制剂体积。
24.如本文所用的，术语“核酸分子”意图是包括dna分子和rna分子。核酸分子可以是单链或双链的，但优选是双链dna。
25.当核酸与另一个核酸序列放置到功能关系中时，它是“可操作地连接”的。例如，如果启动子或增强子影响序列的转录，则它与编码序列可操作地连接。关于转录调节序列，可操作地连接的意指被连接的dna序列是邻接的，并且在必须要连接两个蛋白编码区的场合，是邻接的并且在阅读框中。对于开关序列，可操作地连接的表示所述序列能够实现开关重组。
26.筛选测定本发明提供了一种用于筛选生物分子的配体候选物的方法和系统。反应性亲和探针相互作用发现（rapid）是针对原位靶的定量结合测定，其回避了靶纯化的挑战，并可能提供一种发现和靶向变构结合位点的系统方法。
27.在某些实施方案中，本文公开了一种鉴定配体的方法，包括：（a）使生物分子和探针分子接触；其中所述探针分子包含结合元件、报道基团和反应性部分；所述探针分子通过所述结合元件与所述生物分子结合；且所述反应性部分与所述生物分子形成共价键，从而形成缀合物；（b）使所述缀合物与包含与所述报道基团反应的功能部分的可检测分子接触，从而形成可检测缀合物；（c）使所述可检测缀合物与固体支持体接触；其中所述固体支持体包含识别部分；且所述识别部分与所述可检测缀合物结合，从而形成结合的可检测缀合物；和（d）检测所述结合的可检测缀合物，从而鉴定作为所述生物分子的配体的所述探针分子。
28.进一步提供了可以应用于本文所述的本发明的任何方面的许多实施方案。例如，在一些实施方案中，结合元件是小分子、肽或核酸（例如rna或dna）。在一些实施方案中，结合元件是包含多个结合元件的文库的组分。在一些实施方案中，文库包括chembridge片段文库、pyramid platform fragment-based drug discovery、maybridge片段文库、来自analyticon的frgx、来自ancorex的tci-frag、来自asinex的bio building blocks、来自charles river的biofocus 3d、来自emerald bio的fragments of life (fol)、enamine片段文库、iota diverse 1500、bionet片段文库、life chemicals fragments collection、otava片段文库、prestwick片段文库、selcia片段文库、timtec基于片段的文库、来自vitas-m laboratory的allium或zenobia片段文库。在一些实施方案中，生物分子是蛋白。在一些实施方案中，反应性部分与蛋白的氨基酸形成共价键。在一些实施方案中，生物分子是脂质、碳水化合物或核酸（例如rna或dna）。在一些实施方案中，生物分子包含附加表位，例如，flag、6xhis、ha、c-myc、谷胱甘肽-s-转移酶、strep-标签、麦芽糖结合蛋白、几丁质结合蛋白、s-标签、v5标签或avitag。在一些实施方案中，报道基团包括氮杂二苯并环辛炔、硫醇、烯、炔、叠氮化物、四嗪、反式-环辛烯、(二苯基膦基)芳基、(二苯基膦基)烷基或活化酯（例如，羟基苯并三唑（hobt）酯）。在一些实施方案中，反应性部分是光交联剂基团、磺酰氟、氟代硫酸盐（fluorosulfate）、迈克尔受体部分、离去基团部分或与天然存在的α氨基酸的侧链中的亲核部分（例如，与半胱氨酸的硫醇基、赖氨酸的氨基、丝氨酸或苏氨酸的羟基或酪氨酸的酚基）形成共价键的部分。在一些实施方案中，可检测分子包括洋地黄毒苷、镍nta（次氮基三乙酸）、发色团或发光团。在一些实施方案中，发色团包括非荧光染料发色团、猝
灭剂、吸收发色团、荧光团、有机染料、无机染料、金属螯合物或荧光酶底物。在一些实施方案中，可检测分子是生物素。生物素可以与链霉抗生物素蛋白缀合物结合，例如，hrp、sulfotag、荧光团或金属螯合物。在一些实施方案中，功能部分包括氮杂二苯并环辛炔、硫醇、烯、炔、叠氮化物、四嗪、反式-环辛烯、(二苯基膦基)芳基、(二苯基膦基)烷基或活化酯（例如，羟基苯并三唑（hobt）酯）。在一些实施方案中，固体支持体是膜、玻璃、塑料、合成制备的聚合物、eppendorf管、多孔板的孔或表面等离振子共振芯片。在一些实施方案中，识别部分是抗体、dna结合蛋白、rna结合蛋白、碳水化合物结合蛋白或脂质结合蛋白。在一些实施方案中，抗体是针对生物分子和/或附加表位的抗体。
29.在一些实施方案中，步骤（d）包括通过elisa、蛋白印迹、免疫荧光测定、荧光测定、荧光微量测定技术（fmat）或细胞亚细胞染色检测结合的可检测缀合物。在一些实施方案中，方法在包含生物分子的粗细胞提取物上进行、在包含生物分子的蛋白的脂质体制剂上进行、在包含生物分子的分离的细胞器上进行、在包含生物分子的纯化的蛋白制剂上进行或原位进行。在一些实施方案中，方法是基于细胞的测定。在一些实施方案中，生物分子在细胞中表达。在一些实施方案中，细胞被人工改造以表达生物分子。在一些实施方案中，在步骤（b）之前裂解细胞。在一些实施方案中，步骤（d）进一步包括定量结合的可检测缀合物的量。在一些实施方案中，步骤（a）进一步包括生物分子的底物。在一些实施方案中，在有生物分子的底物的情况下形成的结合的可检测缀合物的量小于在没有底物的情况下形成的结合的可检测缀合物的量（即，探针分子是底物竞争探针）。在其他实施方案中，在有生物分子的底物的情况下形成的结合的可检测缀合物的量大于在没有底物的情况下形成的结合的可检测缀合物的量（即，探针分子是底物协同探针）。
30.如本文所用的，术语“探针”或“测试化合物”或“候选试剂”指待进行其对细胞具有影响的能力的筛选的试剂或试剂集合（例如，化合物）。测试化合物可以包括多种不同的化合物，包括化合物，化合物的混合物，例如，多糖，小的有机或无机分子（例如，具有小于2000道尔顿、小于1000道尔顿、小于1500道尔顿、小于1000道尔顿或小于500道尔顿的分子量的分子），生物大分子，例如，肽，蛋白，肽类似物及其类似物和衍生物，肽模拟物（peptidomimetics），核酸，核酸类似物和衍生物，由生物材料制备的提取物，例如，细菌，植物，真菌或动物细胞或组织，天然存在的或合成的组合物。
31.取决于正在实践的特定实施方案，探针可以在溶液中游离提供，或者可以附着到载体或固体支持体例如珠上。可以使用许多合适的固体支持体用于固定探针。合适的固体支持体的例子包括琼脂糖、纤维素、葡聚糖（作为下述可商购获得的，即，葡聚糖凝胶（sephadex），琼脂糖凝胶（sepharose））羧甲基纤维素、聚苯乙烯、聚乙二醇（peg）、滤纸、硝化纤维素、离子交换树脂、塑料膜、多胺甲基乙烯基醚马来酸共聚物、玻璃珠、氨基酸共聚物、乙烯-马来酸共聚物、尼龙、丝等。此外，对于本文所述的方法，可以单独或成组地筛选探针。在预期有效探针的命中率低以致于人们对于给定的组将不会预期不止一个阳性结果的场合，组筛选是特别有用的。
32.与良好的先导化合物（lead compound）有关的小分子的性质是本领域已知的。lipinski的五规则（rule of five）为开发口服可生物利用的药物候选物提供了原始框架。随着可旋转键数目（nrot）是一个重要参数（对于口服生物利用率，7的最大值看来似乎是最佳的）的发现，这些规则已得到了加强。极性表面积（polar surface area）（psa）可能是另
一个关键性质；具有110-140
ꢀå
2的psa的被动吸收的分子被认为具有低口服生物利用率。最近，对于从hts运动中鉴定的适合于最优化并且与lipinski值相比具有相对
‘
按比例缩小’的性质的分子，引入了术语
‘
先导样（lead-like）’。很多文献正在处理面临通过筛选药物大小的化合物文库发现的化合物的问题。最近已出现了一种新的备择方法，且其被称为
‘
基于片段的’发现（carr, r.和jhoti, h. (2002) structure-based screening of low-affinity compounds. drug discov. today 7, 522
–
527；erlanson, d.a.等人(2000) site-directed ligand discovery. proc. natl. acad. sci. u. s. a. 97, 9367
–
72；vetter, d. (2002) chemical microarrays, fragment diversity, label-free imaging by plasmon resonance-a chemical genomics approach. j. cell. biochem. 39, 79
–
84）。使用所述方法，鉴定的命中通常遵守
‘
三规则（rule of three）’，且这可能是构建用于先导生成的片段文库的有用规则。
33.所述方法从使用高通量x射线晶体学筛选的片段文库（mw 100-250 da）开始。这些片段探测蛋白中的关键结合相互作用，但小到足以把将阻止它们有效结合的不利相互作用（电子或空间）的机会减至最小（hann, m.等人(2001) molecular complexity and its impact on the probability of finding leads for drug discovery. j. chem. inf. comput. sci. 41, 856
–
864）。然后通过解释电子密度图来定义蛋白中这些小配体的结合模式。由于x射线晶体学在鉴定弱相互作用（μm-mm）方面非常有效，所以可以鉴定在生物测定中没有可测量活性的片段命中。可以构建片段文库以采样化学多样性或靶向蛋白上的特定相互作用。筛选针对激酶和蛋白酶的两种类型的片段文库，以及随后将命中最优化为有效的先导化合物，表明成功的命中表现出特定的物理化学性质。
34.对一组不同的片段命中的分析表明，这种命中看来似乎平均遵守
‘
三规则’，其中分子量《300，氢键供体的数目≤3，氢键受体的数目≤3，且clogp≤3。此外，结果提示nrot（≤3）和psa（≤60）也可能是用于片段选择的有用标准。这些数据意味着，在构建用于有效的先导发现的片段文库时，
‘
三规则’可能是有用的。
35.许多小分子文库是本领域已知的并且可商购获得。可以使用本文所述的筛选方法筛选这些小分子文库。化学文库或化合物文库是可以与本文所述的方法一起使用以对候选试剂进行特定效果的筛选的贮存的化学药品的集合。化学文库包含关于每种化合物的化学结构、纯度、量和物理化学特征的信息。化合物文库可从例如除了别的以外的enzo life sciences、aurora fine chemicals、exclusive chemistry ltd.、chemdiv、chembridge、timtec inc.、asischem和princeton biomolecular research商购获得。
36.在不受限制的情况下，可以在适当的时间段内以相对于对照可对细胞产生影响的任何浓度测试化合物。在一些实施方案中，化合物以约0.01 nm至约100 mm、约0.1 nm至约500μm、约0.1μm至约20μm、约0.1μm至约10μm或约0.1μm至约5μm的浓度进行测试。
37.化合物筛选测定可用于高通量筛选中。高通量筛选是测试化合物文库的给定活性的过程。高通量筛选力图快速且平行筛选大量化合物。例如，使用微量滴定板和自动测定设备，实验室可以平行执行多达每天100,000次测定或更多。
38.筛选测定可以继之以后来的测定，以进一步鉴定所鉴定的测试化合物是否具有对于预期用途所期望的性质。例如，筛选测定可以继之以选自下述任一种的测量的第二测定：生物利用率、毒性或药物代谢动力学，但不限于这些方法。
39.本发明还包括用于鉴定如本文所述的配体的试剂盒。本发明的试剂盒还可以包括说明书材料，其公开或描述所公开的本发明的试剂盒或探针在如本文所提供的所公开的本发明的方法中的用途。试剂盒还可以包括额外的组分以促进试剂盒被设计的特定应用。例如，试剂盒可以额外含有检测标记的工具（例如，用于酶促标记的酶底物，用于检测荧光标记的滤色片组，适当的第二标记，例如绵羊抗小鼠-hrp等）和对于对照所必需的试剂（例如，对照生物样品或标准物）。试剂盒可额外包括缓冲液和其他公认的供所公开的本发明方法之用的试剂。非限制性实例包括减少非特异性结合的试剂，例如载体蛋白或去污剂。
[0040]“试剂盒”是包括用于特异性检测和/或影响本发明标记的表达的至少一种试剂如探针或小分子的任何制品（例如，包装或容器）。试剂盒可以作为用于执行本发明方法的单元进行推销、分配或销售。试剂盒可以包括一种或多种表达用于本发明方法中的组合物所必需的试剂。在某些实施方案中，试剂盒可进一步包括参考标准物。本领域技术人员可以想像许多这种对照，包括，但不限于，通用分子。试剂盒中的试剂可以在单独的容器中提供，或者作为在单个容器中的两种或更多种试剂的混合物提供。此外，可以包括描述试剂盒内的组合物的用途的说明书材料。
[0041]
实施例实施例1：用于针对亲和标记的靶筛选rap文库的rapid规程捕获平板制备：greiner hibind平板（sigma aldrich cat. no. m4561-40ea）用捕获抗体包被。a蛋白（thermo, cat. no. 101100）通过将其用50%甘油/pbs重构至5 mg/ml，并将其以1:500稀释到包被缓冲液（thermo, buph
™
碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液包（carbonate-bicarbonate buffer packs））中进行制备。将平板用 100 ul包被缓冲液洗涤1x，并以六个一组放置在一边。向每个平板的每个孔中添加50 μl a蛋白。将打印记的（stamped）平板放置在4℃deli冰箱中过夜。第二天早晨，用 100 μl包被缓冲液将a蛋白包被的平板洗涤2x。将200 μl superblock（thermo fisher cat. no. 37515）添加到每个平板的每个孔中，并于室温温育1小时。在捕获平板已被封闭2小时后，所有平板均用pbs/t洗涤3x。制备135 ml在superblock缓冲液中的1 μg/ml捕获抗体。在每个捕获平板的每个孔中添加50 μl制备的抗体，并于室温温育1小时。
[0042]
裂解物平板制备：对于hek293t细胞系，使用每96-孔平板7.5m细胞。24个96-孔平板用聚-d-赖氨酸（sigma aldrich cat. no. p7280-5mg）包被，并洗涤。然后，每孔平板接种75k细胞并温育过夜以允许细胞附着。用细胞成像培养基将rap给药平板重构为所期望的终浓度的4x。对每个细胞平板一次一个，去除培养基并分配200 μl细胞成像培养基（cim）（thermo, cat. no. a14291dj）。紧接着对于每个平板，去除200 μl cim，并立即添加75 μl cim。一旦洗涤细胞并在每个平板中分配75 μl cim，就添加25 μl重构的rap，并将细胞于37℃细胞培养箱中温育30分钟。在细胞温育时，通过添加12.5 ml的20% ddm（anatrace cat. no. d310 25 gm）、250 ml的hepes 缓冲盐水和5片完整蛋白酶片剂（sigma aldrich cat. no. 4693132001）制备裂解缓冲液（~10 ml/平板）。平板在紫外线交联剂（spectrolinker cat. no. 1195t76）中照射。一旦照射3分钟，就去除培养基并用200 μl cim 洗涤细胞以去除过量的rap。然后从每个平板中去除cim，并添加 100 μl裂解缓冲液。将平板于室温温育1小时以完
成裂解。
[0043]
通过对于总数为140 ml的点击混合物（click mix）制备30 ml每种试剂，使用铜催化的叠氮化物炔环加成将报道分子生物素附着到rap的炔上。这对应于600 mg thpta（click chemistry tools cat. no. 1010-5g）、600 mg抗坏血酸（sigma aldrich cat. no. 11140-50g）和120 mg硫酸铜（sigma aldrich cat. no. 451657-10g），和750 μl的10 mm吡啶甲基-生物素-叠氮化物（click chemistry tools cat. no. 1167-100）。每种试剂单独溶解在30 ml水中，然后恰好在开始点击反应之前，将试剂以下述顺序混合在一起：ting
ꢀ‑
》 thpta
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》铜（变为蓝色）-》抗坏血酸（变为透明）。将40 μl的点击混合物添加到每个平板的每个孔中。温育1小时后，用300 μl pbs-t（boston bioproducts cat. no. ibb-171）的3次洗涤将捕获抗体从捕获平板洗掉。点击反应通过添加每孔10 μl 0.5m edta（sigma aldrich cat. no. 324506-100ml）猝灭。将100 μl裂解物转移到每个相应的捕获平板中，并于室温温育至少1小时。在1小时捕获温育后，用300 μl pbs/t将平板洗涤5次。
[0044]
链霉抗生物素蛋白-hrp（cell signaling technologies cat. no. 3999s）通过1:1000稀释cell signaling technologies (p/n)材料在pbs/t中制备。将50 μl制备的链霉抗生物素蛋白-hrp添加到每个孔中，并于室温温育30分钟。在30分钟链霉抗生物素蛋白温育后，用300 μl pbs/t将平板洗涤5x。最后一次洗涤物保持保存在平板中以防止干燥。
[0045]
tecan装备有200 ul管尖和tmb。tecan的槽装满至少135 ul的tmb（thermo fisher cat. no. n301）并打开stamp 50 ul方法。将平板排空并以适当的顺序放置在tecan中，且运行所述方法。重复所述过程，直到所有平板都收到tmb为止。每个平板用50 μl的0.2n 硫酸猝灭。在平板阅读器上顺序读取平板，从而定量450 nm处的吸光度。
[0046]
鉴定肌酸转运蛋白slc6a8的底物敏感性结合物：表达标记的肌酸转运蛋白slc6a8的细胞用于筛选底物敏感性结合物。图1中举例说明了用于配体发现和靶接合的细胞结合测定中的rapid（一种高通量筛选）的一般规程。
[0047]
rapid鉴定作为靶占用的起点或探针的正构和变构配体。由rap文库的子集对肌酸转运蛋白的共价修饰程度是高度可重复的（图2a）。针对肌酸转运蛋白slc6a8
±
底物类似物胍基丙酸（gpa）的2000 raps的点阵鉴定了底物敏感性结合物（图2b）。落在对角线外的点要么是底物竞争的，要么是底物协同的。从点阵鉴定的两个raps显示随gpa浓度而变的靶的共价修饰的剂量依赖性抑制或增强（图2c）。ic50/ec50对应于gpa的已知抑制常数（~30 μm）。细胞用在有或没有1 mm β-gpa的情况下的100 μm jn-1724给药30分钟，且然后用365 nm光照射6分钟。洗涤细胞并通过肌酸摄取测定测量slc6a8的残余转运活性。图3中显示了反应性亲和探针jn-1724对肌酸转运蛋白slc6a8的共价灭活和通过与竞争者β-gpa共同给药的保护。
[0048]
用底物竞争rap处理细胞定量地抑制肌酸转运蛋白。30分钟100 μm剂量的jn-1724继之以在365 nm交联6分钟足以将slc6a8肌酸转运抑制至正常转运的5.7%。为了通过加合物组（adductome）的无偏质谱分析法确认靶接合，细胞用在有或没有1 mm β-gpa的情况下的20 μm jn-1724给药30分钟，且然后用365 nm光照射6分钟。细胞被裂解；生物素被点击上；且生物素化的蛋白用链霉抗生物素蛋白进行亲和纯化，用胰蛋白酶消化，并通过具有tmt定量的串联质谱分析法进行鉴定。slc6a8（用箭标指出的点）是鉴定的蛋白之一，且与1 mm β-gpa共同给药将富集水平降低80%（图4）。
[0049]
引入作为参考本文提及的所有公开物和专利都特此整体引入作为参考，就好像每个单独的公开物或专利被具体地和单独地指示引入作为参考一样。在冲突的情况下，以本技术（包括本文中的任何定义）为准。
[0050]
等同方案尽管已经讨论了本发明的特定实施方案，但上述说明书是举例说明性的而不是限制性的。在阅读本说明书和以下权利要求时，本发明的许多变化对于本领域技术人员将变得显而易见。本发明的全部范围应通过参考权利要求及其等同方案的全部范围和说明书以及这种变化来确定。
再多了解一些
本文用于企业家、创业者技术爱好者查询，结果仅供参考。
