一种可视化的前药激活化合物、前药体系及其制备方法和应用与流程

1.本发明属于化学医药技术领域，具体涉及一种可视化的前药激活化合物、前药体系及其制备方法和应用。


背景技术：

2.生物正交反应是指与生物环境中的细胞、组织中的生化反应相互正交的化学反应，不会对生物体的生理代谢产生影响，具有高特异性的优势。目前，生物正交反应已被广泛用于药物递送设计、特异性分子标记、合成生物学等领域，成为生物医学研究中极具前景的化学工具。
3.生物正交前药激活介导的抗肿瘤治疗在减轻药物不良反应及扩大治疗指数方面显示出独特优势。然而，具体的生物正交前药激活的行为仍然是不可见的，这限制了生物正交前药激活策略的应用。因此，开发可视化的生物正交前药激活具有重要的意义。
4.肿瘤细胞由于其高代谢水平和基因突变，产生高活性氧环境。因此，基于活性氧响应的多肽超分子自组装可以在肿瘤细胞中表现出高特异性累积，靶向定位到肿瘤部位。荧光信号由于具有无创性、实时性、检测手段简单的优点，已经被广泛用于生物体内的标记、指示生物体内的分子活动、协助手术治疗等方面，在个性化医疗、诊疗结合等领域展示出极大的应用前景。
5.因此如何实现生物正交前药激活过程的荧光可视化成为目前亟待解决的问题。


技术实现要素：

6.针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种可视化的前药激活化合物、前药体系及其制备方法和应用。本发明是基于肿瘤细胞中的高活性氧，设计合成肿瘤靶向累积的可激活的自组装多肽(前药激活化合物)，在肿瘤细胞中形成组装体(前药激活化合物)，经过生物正交反应激活前药，同时激发荧光信号，实现生物正交前药激活过程的荧光可视化。
7.为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
8.第一方面，本发明提供一种可视化的前药激活化合物，所述可视化的前药激活化合物包括多肽片段，以及通过化学键连接到所述多肽片段上的荧光基团和四嗪基团，所述多肽片段至少含有一个赖氨酸。
9.在本发明中，所述多肽片段中的氨基酸包括赖氨酸、甘氨酸和苯丙氨酸。
10.优选地，所述多肽片段为赖氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸。
11.在本发明中，kgggff指的是lys-gly-gly-gly-phe-phe，即赖氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸。
12.在本发明中，通过荧光分子与所述多肽片段形成酰胺键在多肽片段上引入荧光基团。
13.优选地，所述荧光分子中含有羧基。
14.优选地，所述荧光分子包括bqa，所述bqa具有如下式i所示结构：
[0015][0016]
在本发明中，通过四嗪衍生物与所述多肽片段形成酰胺键在多肽片段上引入四嗪基团。
[0017]
在本发明中，四嗪缩写为tz。
[0018]
优选地，所述四嗪衍生物中含有羧基。
[0019]
优选地，所述四嗪衍生物具有如下式ii所示结构：
[0020][0021]
优选地，所述可视化的前药激活化合物，具有如下式iii所示结构：
[0022][0023]
在本发明中前药激活化合物bqa-k(tz)gggff(式iii所示化合物)由荧光基团、多肽序列kgggff和生物正交四嗪(tz)基团组成。bqa作为可视化报告和活性氧响应分子，多肽序列kgggff作为连接结构和组装单元，生物正交四嗪(tz)基团与前药发生逆电子需求的diels
–
alder反应，开启荧光信号，释放毒性药物。
[0024]
在本发明中，多肽序列kgggff在引入荧光基团bqa时，bqa中的会发生水解，生成表示基团的连接位点，因此“bqa-k(tz)gggff”中“bqa”实际为水解产物。
[0025]
第二方面，本发明提供一种根据第一方面所述可视化的前药激活化合物的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
[0026]
(1)将活化的荧光分子与末端氨基被保护的多肽片段进行酰胺缩合反应，得到保护基修饰的带有荧光基团的多肽片段；
[0027]
(2)将步骤(1)得到的保护基修饰的带有荧光基团的多肽片段进行脱保护反应，得到脱保护的带有荧光基团的多肽片段；
[0028]
(3)将步骤(2)得到的脱保护的带有荧光基团的多肽片段和活化的四嗪衍生物进行酰胺缩合反应，生成所述可视化前药激活化合物。
[0029]
在本发明中，步骤(1)中，所述活化的荧光分子中活化基团包括n-羟基丁二酰亚胺。
[0030]
优选地，步骤(1)中，所述末端氨基被保护的多肽片段中末端氨基的保护基为boc保护基。
[0031]
优选地，步骤(1)中，所述活化的荧光分子与末端氨基被保护的多肽片段的摩尔比为1:(0.8-1.2)；
[0032]
其中，“0.8-1.2”可以是0.8、0.9、1、1.1、1.2等。
[0033]
优选地，步骤(1)中，所述酰胺缩合采用的缩合剂包括n,n-二异丙基乙胺。
[0034]
优选地，步骤(1)中，所述活化的荧光分子与缩合剂的摩尔比为1:(15-25)；
[0035]
其中，“15-25”可以是15、20、25等。
[0036]
优选地，步骤(1)中，所述酰胺缩合反应在溶剂中进行，所述溶剂包括n,n-二甲基甲酰胺。
[0037]
优选地，步骤(1)中，所述酰胺缩合反应的温度为25-35℃(例如可以是25℃、27℃、29℃、31℃、33℃、35℃等)，时间为1-3h(例如可以是1h、2h、3h等)。
[0038]
优选地，步骤(2)中，所述脱保护反应在溶剂中进行，所述溶剂包括三氟乙酸；所述保护基修饰的带有荧光基团的多肽片段与溶剂的摩尔比为1:(8-15)；
[0039]
其中，“8-15”可以是8、9、10、11、12、13、14、15等。
[0040]
优选地，步骤(2)中，所述脱保护反应的温度为25-35℃(例如可以是25℃、27℃、29℃、31℃、33℃、35℃等)，时间为0.4-0.6h(例如可以是0.4h、0.5h、0.6h)。
[0041]
优选地，步骤(2)中，所述脱保护反应后需要将产物进行冻干，所述冻干的温度为-85～-75℃(例如可以是-85℃、-80℃、-75℃等)，时间为2-4天(例如可以是2天、3天、4天等)。
[0042]
在本发明中，步骤(3)中，所述活化的四嗪衍生物中活化基团包括n-羟基丁二酰亚胺。
[0043]
优选地，步骤(3)中，所述脱保护的带有荧光基团的多肽片段与活化的四嗪衍生物的摩尔比为1:(1.8-2.2)；
[0044]
其中，“1.8-2.2”可以是1.8、1.9、2、2.1、2.2等。
[0045]
优选地，步骤(3)中，所述酰胺缩合采用的缩合剂包括n,n-二异丙基乙胺。
[0046]
优选地，步骤(3)中，所述脱保护的带有荧光基团的多肽片段与缩合剂的摩尔比为1:(35-45)；
[0047]
其中，“35-45”可以是35、37、39、41、43、45等。
[0048]
优选地，步骤(3)中，所述酰胺缩合反应在溶剂中进行，所述溶剂包括体积比为1:(0.8-1.2)(其中，“0.8-1.2”可以是0.8、1.0、1.2等)的水和乙腈。
[0049]
优选地，步骤(3)中，所述酰胺缩合反应的温度为25-35℃(例如可以是25℃、27℃、29℃、31℃、33℃、35℃等)，时间为1-3h(例如可以是1h、2h、3h等)。
[0050]
第三方面，本发明提供一种前药体系，所述前药体系包括根据第一方面所述的可视化的前药激活化合物和抗肿瘤前药分子。
[0051]
在本发明中，将荧光分子和生物正交四嗪分子连接到自组装多肽序列上，形成组装前体分子。反式环辛烯修饰药物得到前药分子，与组装体上的四嗪分子反应释放荧光和药物，实现前药激活的可视化。
[0052]
优选地，所述抗肿瘤前药分子为反式环辛烯改性的母药分子。
[0053]
优选地，所述母药分子选自紫杉醇、阿霉素、顺铂或喜树碱中的任意一种或至少两种的组合。
[0054]
在本发明中，tco-ptx指的是反式环辛烯-紫杉醇，ptx指的是紫杉醇，tco指的是反式环辛烯。
[0055]
优选地，所述抗肿瘤前药分子具有如下式iv所示结构：
[0056][0057]
在本发明中，所述抗肿瘤前药分子的制备方法包括以下步骤：将反式环辛烯硝基苯酯和母药分子发生缩合反应，生成所述抗肿瘤前药分子。
[0058]
优选地，所述反式环辛烯硝基苯酯和母药分子的摩尔比为1:(1.8-2.2)(其中，“1.8-2.2”可以是1.8、2、2.2等)。
[0059]
优选地，所述缩合反应采用的缩合剂包括4-二甲氨基吡啶，所述反式环辛烯硝基苯酯和缩合剂的摩尔比为1:(0.8-1.2)(其中，“0.8-1.2”可以是0.8、1、1.2等)。
[0060]
优选地，所述缩合反应在溶剂中进行，所述溶剂包括二氯甲烷。
[0061]
优选地，所述缩合反应在避光条件下进行，所述缩合反应的温度为25-35℃(例如可以是25℃、27℃、29℃、31℃、33℃、35℃等)，时间为8-15h(例如可以是8h、9h、10h、11h、12h、13h、14h、15h等)。
[0062]
第四方面，本发明提供一种根据第一方面所述可视化的前药激活化合物或根据第三方面所述的前药体系在制备治疗肿瘤药物中的应用。
[0063]
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
[0064]
(1)在本发明中前药激活化合物通过生物正交反应，高效特异性地激活反式环辛烯改性的抗肿瘤前药，使得抗肿瘤前药释放毒性药物杀伤肿瘤细胞；同时产生荧光开启，使药物递送过程中的释药行为可视化；
[0065]
(2)前药激活化合物在肿瘤细胞中产生特异性累积，使后续的前药激活不会发生在正常细胞中，实现特异性杀伤肿瘤而保护非肿瘤细胞，降低治疗过程中的不良反应；
[0066]
(3)本发明提供了具有广泛通用性的可视化药物递送平台。
附图说明
[0067]
图1为3d肿瘤模型上含bqa-k(tz)gggff与tco-ptx的前药体系荧光释放的激光共聚焦显微镜图。
[0068]
图2为3d肿瘤模型上含bqa-k(tz)gggff与tco-ptx的前药体系杀伤毒性的激光共聚焦显微镜图。
具体实施方式
[0069]
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明
了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
[0070]
以下实施例中，原料的来源如下所示：
[0071][0072][0073]
制备例1
[0074]
本制备例提供一种多肽片段k(boc)gggff，所述多肽片段k(boc)gggff的制备方法包括以下步骤：
[0075]
固相合成法制备多肽k(boc)gggff：
[0076]
(1)在固相合成管中，将1.0g 2-氯-三苯甲基氯树脂(2-chlorotrityl resin)在10ml超干二氯甲烷中溶胀30min。将1.16g(3.0mmol)fmoc-l-苯丙氨酸(f)和992μl(6.0mmol)n,n-二异丙基乙胺(dipea)溶解于5ml超干dmf中，并加到树脂中，通氮气，室温反应2h，过滤，dmf清洗。
[0077]
(2)10ml甲醇/二氯甲烷(v/v＝1:4)加入到树脂中，室温反应30min，过滤，dmf清洗。
[0078]
(3)10ml哌啶/dmf(v/v＝1:4)加入到树脂中，室温反应30min，过滤，dmf清洗。
[0079]
(4)将1.16g(3.0mmol)fmoc-l-苯丙氨酸(f)，1.14g(3.0mmol)苯并三氮唑-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯(hbtu)和992μl(6.0mmol)dipea溶解于5mldmf中，并加到树脂中，通氮气，室温反应2h。过滤，dmf清洗。
[0080]
(5)10ml哌啶/dmf(v/v＝1:4)加入到树脂中，室温反应30min。过滤，dmf清洗。
[0081]
(6)将0.89g(3.0mmol)fmoc-l-甘氨酸(g)，1.14g(3.0mmol)hbtu和992μl(6.0mmol)dipea溶解于5ml dmf中，并加到树脂中，通氮气，室温反应2h。过滤，dmf清洗。
[0082]
(7)10ml哌啶/dmf(v/v＝1:4)加入到树脂中，室温反应30min。过滤，dmf清洗。
[0083]
(8)将0.89g(3.0mmol)fmoc-l-甘氨酸(g)，1.14g(3.0mmol)hbtu和992μl(6.0mmol)dipea溶解于5ml dmf中，并加到树脂中，通氮气，室温反应2h。过滤，dmf清洗。
[0084]
(9)10ml哌啶/dmf(v/v＝1:4)加入到树脂中，室温反应30min。过滤，dmf清洗。
[0085]
(10)将0.89g(3.0mmol)fmoc-l-甘氨酸(g)，1.14g(3.0mmol)hbtu和992μl(6.0mmol)dipea溶解于5ml dmf中，并加到树脂中，通氮气，室温反应2h。过滤，dmf清洗。
[0086]
(11)10ml哌啶/dmf(v/v＝1:4)加入到树脂中，室温反应30min。过滤，dmf清洗。
[0087]
(12)将1.41g(3.0mmol)fmoc-叔丁氧羰基-l-赖氨酸(k)，1.14g(3.0mmol)hbtu和992μl(6.0mmol)dipea溶解于5ml dmf中，并加到树脂中，通氮气，室温反应2h。过滤，dmf清洗。
[0088]
(13)10ml哌啶/dmf(v/v＝1:4)加入到树脂中，室温反应30min。过滤，dmf清洗。
[0089]
(14)将5ml三氟乙酸加到树脂中，通氮气，室温反应2h。过滤得到滤液。将滤液逐滴加入到30ml冰乙醚中，过滤得到白色固体。
[0090]
(15)所得粗产物用半制备hplc提纯得到多肽k(boc)gggff，产率：71.8％。
[0091]
实施例1
[0092]
本实施例提供一种可视化的前药激活化合物bqa-k(tz)gggff，所述k(tz)gggff的制备方法包括以下步骤：
[0093][0094]
(1)bqa-k(boc)gggff的制备：
[0095]
将51.2mg(0.1mmol)bqa-nhs、71.1mg(0.1mmol)k(boc)gggff和0.032ml(1.9mmol)n,n-二异丙基乙胺(dipea)溶于0.5mln,n-二甲基甲酰胺(dmf)中。30℃搅拌2小时，产物通过高效液相色谱分离提纯(产率：83.4％)。
[0096]
(2)bqa-k(tz)gggff的制备：
[0097]
①
：在bqa-k(boc)gggff(0.1mmol)中加入三氟乙酸(1mmol)脱boc，产物bqa-kgggff在-80℃冻干3天。
[0098]
②
：50.5mg(0.05mmol)bqa-kgggff，32.7mg(0.1mmol)tz，0.032ml(1.9mmol)n,n-二异丙基乙胺(dipea)溶于0.5ml水和0.5ml乙腈中。30℃搅拌2小时，产物通过高效液相色谱分离提纯(产率：78.9％)。
[0099]
bqa-k(tz)gggff的1h-nmr及基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(maldi-tof-ms)分析结果如下：
[0100]1h nmr(dmso-d6,400mhz)δ(ppm):8.55(d,1h),8.40-8.20(m,5h),8.17-7.96(m,6h),7.87-7.80(m,1h),7.75(t,3h),7.50(td,5h),7.36(d,1h),7.32-7.05(m,9h),5.28(s,2h),4.49(m,4h),3.73(m,5h),3.57(s,3h),3.11-2.88(m,8h),2.71(m,1h),1.83-1.71(m,2h),1.50-1.14(m,6h).
[0101]
moldi-tof ms(m/z):calcd.1193.472；found[m h]

,1194.629.
[0102]
实施例2
[0103]
本实施例提供一种抗肿瘤前药分子tco-ptx，所述tco-ptx的制备方法包括以下步骤：
[0104][0105]
将200mg(0.687mmol)反式环辛烯硝基苯酯(tco-no2)、1.173g(1.374mmol)紫杉醇(ptx)和10mg(0.687mmol)4-二甲氨基吡啶(dmap)溶于5ml二氯甲烷中，在30℃下避光搅拌12小时。混合物通过柱层析分离提纯，(产率：77.1％)。
[0106]
tco-ptx的1h-nmr分析结果如下：
[0107]1h nmr(400mhz,chloroform-d)δ(ppm)8.15(d,2h),7.76(d,2h),7.61(t,1h),7.55-7.33(m,11h),6.96(q,1h),6.28(d,2h),5.99(m,1h),5.68(d,1h),5.54-5.43(m,2h),4.97(d,1h),4.32(d,1h),4.20(d,1h),3.81(d,1h),2.54(m,2h),2.45(d,3h),2.39(m,2h),2.23(s,3h),2.20-1.96(m,5h),1.91(d,3h),1.68(s,3h),1.66-1.40(m,4h),1.24(s,3h),1.13(s,3h),1.08(m,1h),0.84-0.75(m,1h).
[0108]
实施例3
[0109]
本实施例测试实施例1制备的前药激活化合物bqa-k(tz)gggff用于激活实施例2制备的反式环辛烯改性的紫杉醇前药(tco-ptx)的激活性能，具体方法包括以下步骤：
[0110]
(1)细胞球在1ml含有100μm的bqa-k(tz)gggff的dmem培养基中培养8h，再用20μm的tco-ptx培养0.5h，采用激光共聚焦显微镜测得bqa荧光信号。
[0111]
如图1所示，“ ”指的加入tco-ptx，
“‑”
指的是不加入tco-ptx。加入反式环辛烯紫杉醇激活后有荧光信号产生，未激活组只有背景荧光强度。
[0112]
(2)细胞球在1ml含有100μm的bqa-k(tz)gggff的dmem培养基中培养8h，再用20μm的tco-ptx培养72h，再加入1μm的钙黄绿素/碘化丙啶染料染色20min，采用激光共聚焦显微
镜测得荧光信号。
[0113]
如图2所示，“ ”指的加入tco-ptx，
“‑”
指的是不加入tco-ptx。前药体系可以使得前药激活，释放毒性药物产生毒性导致细胞死亡，pi荧光增强，未激活组几乎没有pi信号。
[0114]
实施例4
[0115]
本实施例测试前药(tco-ptx)、活性药(ptx)和前药体系(bqa-k(tz)gggff和tco-ptx)在mcf-7或mcf-10a中的细胞毒性，具体方法包括以下步骤：
[0116]
前药测试：5000个mcf-7或mcf-10a细胞在0.1ml含有20μm的tco-ptx培养72h，采用mtt法检测细胞毒性。
[0117]
活性药测试：5000个mcf-7或mcf-10a细胞在0.1ml含有20μm的ptx培养72h，采用mtt法检测细胞毒性。
[0118]
前药体系：5000个mcf-7或mcf-10a细胞在0.1ml含有100μm的bqa-k(tz)gggff的dmem培养基中培养8h，再用20μm的tco-ptx培养72h，采用mtt法检测细胞毒性。
[0119]
测试结果如下表1所示：
[0120]
表1
[0121][0122]
由表1数据可知，在mcf-7和mcf-10a细胞的毒性测试显示前药tco-ptx有显著的减毒效应；前药体系可以激活前药，显示出与活性药ptx相似的毒性；同时前药体系使治疗指数增大的5倍以上，提高用药安全性。
[0123]
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的工艺方法，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。