鲟鱼龙筋咀嚼片及其制备方法

1.本发明涉及一种鲟鱼龙筋咀嚼片及其制备方法，属于水产品加工技术领域。


背景技术：

2.鲟鱼又被称为鲟龙鱼，具有极高的经济价值和科研价值，其种类繁多，包括西伯利亚鲟、达氏鲟、史氏鲟、中华鲟等，市面上较常见的食用鲟鱼为杂交鲟。鲟鱼龙筋是鲟鱼的脊髓，其晶莹剔透，伸缩性强，弹性足，故而得名“龙筋”。鲟鱼龙筋脂肪含量少，含有大量胶质和蛋白质，还含有多种营养因子，具有补血、益气，强肾开胃、清热解毒、滋阴养颜、明目清心、润燥理肺等功效，对防止骨质疏松，增强机体免疫力也非常有效，是绝佳的滋补品，可以和人参、鹿茸相媲美，是我国的传统美味。
3.目前我国的鲟鱼养殖产业较为繁荣，但鲟鱼的主要加工方向仍为鱼子酱产品，对鲟鱼加工废弃物的利用率比较低，大多是加工成低附加值的饲料或直接当作垃圾进行处理。对于鲟鱼龙筋，通常是作为食品原料直接炖煮在菜品中，这不利于鲟鱼龙筋产品的开发和利用。cn 108813427a的中国发明专利申请公开了一种干制鲟鱼龙筋的制作方法，其在温度40～80℃，湿度0～40％，风速8～25m/s条件下对鲟鱼龙筋进行干燥，在降低鲟鱼龙筋水分含量与水分活度的同时，保持鲟鱼龙筋硬度、弹性、咀嚼度和回复性，制得的干制鲟鱼龙筋经水发后味道鲜美，口感良好，安全健康；但是，其采用低温（低于水的沸点）方式处理鲟鱼龙筋，既没有改变鲟鱼龙筋的食用方式，也没有改善鲟鱼龙筋的风味，更没有形成一种新的产品形式。
4.骨质疏松症（osteoporosis, op）是常见的慢性病之一，老年人和绝经后妇女是骨质疏松的高发人群，并且年龄较大的老年人跌倒时更易并发骨质疏松骨折；年龄的增长和骨质的流失也导致了退行性关节疾病骨关节炎（osteoarthritis，oa）的产生。随着人口老龄化趋势的日渐增加，骨质疏松症等骨疾病严重影响人们的健康和生活。
[0005]“药食同源、药食同理、药食同用”的传统思想在我国有悠久历史，食疗是中国自古以来就行之有效的预防疾病的方法之一。咀嚼片是一种常见的口服片剂，既可作为药物，也可作为保健品，经咀嚼后药片的表面积增大，便于药片快速溶解和吸收，可以减少药物对胃肠道的负担，尤其适合胃肠功能差的患者。


技术实现要素：

[0006]
针对上述现有技术，本发明提供了一种鲟鱼龙筋咀嚼片，及其制备方法，以及在制备具有减缓关节炎症疼痛和促进成骨细胞分化功效的保健品中的应用。
[0007]
本发明是通过以下技术方案实现的：一种鲟鱼龙筋咀嚼片，包括以下组分：鲟鱼龙筋粉10份，奶粉0份或45～60份，椰子粉0份或30～60份，硬脂酸镁0份或1～5份。
[0008]
所述鲟鱼龙筋粉是通过以下方法制备得到的：鲟鱼龙筋在105～110℃下烘干60～110 min，然后加入水中，在121℃条件下处理15～25 min，得鲟鱼龙筋液，过滤得过滤液，喷
雾干燥，即得鲟鱼龙筋粉。
[0009]
进一步地，所述鲟鱼龙筋粉是通过以下方法制备得到的：取鲟鱼龙筋，清洗干净，在105～110℃下烘干60～110 min，此时鲟鱼龙筋呈现出金黄色，且具有浓郁的焦香味；将鲟鱼龙筋切割成小块，加入水中（料液比为1:8～12），在103.43 kpa、121℃条件下处理15～25 min，得鲟鱼龙筋液，静置至常温，过滤得过滤液，喷雾干燥，即得鲟鱼龙筋粉，过60目筛。
[0010]
所述奶粉选自全脂乳粉；所述全脂乳粉是现有技术中已有的商品化产品，是现有技术中已有的商品化产品。
[0011]
所述椰子粉，是现有技术中已有的商品化产品。
[0012]
进一步地，所述鲟鱼龙筋咀嚼片是由以下组分组成的：鲟鱼龙筋粉10份，奶粉45～60份，椰子粉30～60份，硬脂酸镁1～5份。
[0013]
更进一步地，是由以下组分组成的：鲟鱼龙筋粉10份，奶粉60份，椰子粉30份，硬脂酸镁3份。
[0014]
所述鲟鱼龙筋咀嚼片的制备方法，包括以下步骤：（1）混合、造粒：将鲟鱼龙筋粉、奶粉和椰子粉混合混匀，加入适量乙醇溶液得湿混料，湿混料过筛造粒，干燥，得颗粒；（2）压片：向上述颗粒中加入硬脂酸镁，混合混匀，通过压片机压片，即得鲟鱼龙筋咀嚼片，紫外辐照灭菌，包装。
[0015]
进一步地，所述乙醇溶液的体积浓度为70%～90%。
[0016]
进一步地，所述干燥的条件为：在45～65℃下干燥1～2小时。
[0017]
所述鲟鱼龙筋咀嚼片在制备具有减缓关节炎症疼痛或促进成骨细胞分化功效的保健品中的应用。
[0018]
利用上述方法制备的鲟鱼龙筋粉在制备鲟鱼龙筋咀嚼片中的应用，在制备具有减缓关节炎症疼痛或促进成骨细胞分化功效的保健品中的应用。
[0019]
本发明的鲟鱼龙筋咀嚼片，主要由奶粉和鲟鱼龙筋粉组成，具有减缓关节炎症疼痛和促进成骨细胞分化的功效，可作为具有减缓关节炎症疼痛和促进成骨细胞分化功效的保健品食用。辅以椰子粉调味，是一款老少皆宜、风味良好的促骨健骨食品，可部分代替5～15岁青少年所食用的奶粉、奶片等形式的乳制品。
[0020]
本发明在105～110℃下烘干处理鲟鱼龙筋（烘干60～110 min），不仅可去除鲟鱼龙筋中的水分，还赋予了其独特的风味（焦香味）（这是鲟鱼龙筋所特有的风味），无需添加调味料（酱油、桂皮、大葱、良姜、大料、小茴香、花椒等），鲟鱼龙筋的质地柔软。与传统的炭烤（温度在600℃以上）、高温烘烤（温度在200℃以上）相比，温度更低，鲟鱼龙筋中活性肽等成分未被高温所破坏（本发明的咀嚼片在经过体内消化系统后，仍有对成骨细胞的增殖和分化有明显的促进作用），也不会糊化，产生鱼腥味和臭味。与低温烘干（100℃以下）相比，低温烘干无法去除内部结合水，且不会使鲟鱼龙筋产生独特的风味，本发明则可以去除内部结合水，且使鲟鱼龙筋产生独特的风味。
[0021]
本发明以高温烘干的方式处理鲟鱼龙筋，然后喷雾干燥（直接粉碎的龙筋的颗粒度较大，口感较差），再将其制成咀嚼片的形式，丰富了鲟鱼龙筋产品的形式，使鲟鱼龙筋这种传统的珍贵食材可以走进千家万户供普通人群食用。并且，本发明的鲟鱼龙筋咀嚼片具有良好的保健功效，可抑制关节炎，减缓疼痛，维持和保护膝关节软骨，对于成骨细胞的增
殖和分化有明显的促进作用。本发明对于鲟鱼龙筋产品的开发和利用具有重要意义。
附图说明
[0022]
图1：鲟鱼龙筋的基本成分测定示意图。
[0023]
图2：鲟鱼鱼骨的基本成分测定示意图。
[0024]
图3：烘干时间对鲟鱼龙筋的影响示意图。
[0025]
图4：烘干时间对鲟鱼鱼骨的影响示意图。
[0026]
图5：烘干温度和时间对鲟鱼龙筋的影响示意图。
[0027]
图6：硬脂酸镁添加量对咀嚼片硬度的影响示意图。
[0028]
图7：不同样品的感官评分结果示意图。
[0029]
图8：不同浓度的样品对mc3t3-e1细胞的增殖活性的影响示意图。
[0030]
图9：mc3t3-e1细胞的光学显微镜分析示意图。
[0031]
图10：mc3t3-e1细胞中akp活性示意图。
[0032]
图11：第4周时各实验组大鼠的膝关节切片vg染色图。
[0033]
图12：第12周时各实验组大鼠的膝关节切片vg染色图。
[0034]
图13：ngf的平均荧光强度示意图。
[0035]
图14：sp的平均荧光强度示意图。
具体实施方式
[0036]
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域技术人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。
[0037]
下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法、检测方法，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法、检测方法。
[0038]
本发明所用全脂乳粉是购买自安佳新西兰进口全脂乳粉，其商品号为16371792258。本发明所用椰子粉是购买自海南春光食品有限公司的椰子粉，其生产许可证编号为sc11346900500128。
[0039]
实验1：鲟鱼龙筋和鲟鱼鱼骨基本成分的测定实验方法：鲟鱼龙筋和鲟鱼鱼骨用去离子水洗去表面杂质后备用，采用《gb5009.3—2016食品中水分的测定》中的方法测定样品中水分的含量，采用《gb5009.4—2016食品中灰分的测定》中的方法测定样品中灰分的含量，采用《gb5009.5—2016食品中蛋白质的测定》中的方法测定样品中蛋白质的含量，采用《gb5009.6—2016食品中脂肪酸的测定》中的方法测定样品中脂肪的含量，参考《gb/t 9695.31 肉制品总糖含量的测定》中的方法测定样品中总糖的含量。结果如图1和图2所示，在鲟鱼龙筋和鲟鱼鱼骨的成分中水分占据大部分，因此在加工过程中脱除二者的水分是提高产品质量的关键控制点之一；在鲟鱼龙筋的干物质中蛋白质占据绝大部分，不同的是鲟鱼鱼骨中除了含有蛋白质外，糖类也占据很大的一部分，以上数据表明鲟鱼龙筋和鲟鱼鱼骨虽然共同构成鲟鱼的脊柱，但其主要的成分含量相差较大，主要表现在糖分和蛋白含量的区别，鱼骨含有较多的糖类，龙筋中糖
类仅占有很小的部分。
[0040]
实验2：不同烘干温度和时间对鲟鱼龙筋、鱼骨的影响实验方法：将鲟鱼龙筋、鲟鱼鱼骨用去离子水洗去表面杂质，切割成一定长度后在不同温度下烘干120 min。将一定长度的鲟鱼龙筋在110℃下的烘箱烘干0 min、30 min、60 min、90 min、120 min、150 min、180 min，观察并拍照记录烘干的状态。
[0041]
结果如图3、图4所示，鲟鱼龙筋和鲟鱼鱼骨在不同温度下烘干，由于水分的损失，长度都呈现出了不同程度的萎缩，二者在105℃以上与100℃以下在颜色上都呈现出了显著的差异，在105℃以上时二者的颜色开始呈现出黄色，并且伴随着颜色的改变，二者风味也发生了变化，鲟鱼鱼骨在105℃以上时，可以明显的嗅闻到鱼腥味和臭味，这可能与鲟鱼鱼骨本身的组成和脂肪的氧化有关，并且烘干后的鱼骨质地坚硬，形成一层坚固的外壳，不利于加工利用。而鲟鱼龙筋则呈现出风味良好的“焦香味”，可能是高温导致了鲟鱼龙筋中呈味因子的释放，并且鲟鱼龙筋中蛋白质占据干物质绝大部分，没有发生类似于鱼骨的复杂反应，因此并没有鱼腥味和臭味；并且烘干后的鲟鱼龙筋质地柔软，未像鲟鱼鱼骨般坚硬，食用口感佳，且加工利用方便。
[0042]
以110℃为例，进一步探究了烘干时间对产品品质的影响，结果如图5所示，随着烘干时间的增加，鲟鱼龙筋的长度出现了明显的缩小，鲟鱼龙筋的长度在110℃下烘干60 min之前的变化较大，在60 min后的变化较小，说明大部分水分的蒸干发生在60 min之前。同时鲟鱼龙筋的颜色也由最开始的白色转变为焦黄色，但鲟鱼龙筋烘干时间在120 min时出现了焦黑色，并且随着时间的推移越发严重，焦黑色可能是由于过度的高温，导致龙筋中的蛋白质发生了碳化，引起了黑色的产生。因此，对于龙筋的烘干温度和时间最后确定为105～110℃烘干60～110 min，最佳的温度和时间为：110℃下烘干90 min。
[0043]
实验3：鲟鱼龙筋的氨基酸组成实验方法：参考gb5009.124-2016，使用氨基酸分析仪测定鲟鱼龙筋中氨基酸的含量和分布。根据fao/who建议的氨基酸评分标准模式及全鸡蛋蛋白质的化学评分基准，计算必需氨基酸指数（essential amino acid index, eaai），公式如下：测定结果如表1所示。
[0044]
表1鲟鱼龙筋的氨基酸组成，每列中不同的字母表示各组之间存在显著性差异（p《0.05）名称含量（mg/g）名称含量（mg/g）名称含量（mg/g）asp7.55
±
0.14dglu12.72
±
1.6bcys0.00
±
0.00gthr2.92
±
0.36fgly16.55
±
2.03aval2.52
±
0.34fser3.65
±
0.43fala5.62
±
0.73emet1.26
±
0.17gile1.87
±
0.51gtyr0.92
±
0.81glys3.13
±
0.43fleu5.52
±
1.16ephe1.87
±
0.54ghis1.39
±
0.18garg6.79
±
1.04depro9.01
±
0.92cꢀꢀ
由表1可知，鲟鱼龙筋含有20种氨基酸中的16种（色氨酸此方法不能检出），包括了
8种人体必须的氨基酸，必需氨基酸指数得分为41.25，是一种优质的蛋白来源，氨基酸中含量最丰富的是gly，这与鲟鱼龙筋表面的胶原蛋白有关，其次含量较多的是glu，glu作为一种众所周知的鲜味氨基酸，是鲟鱼龙筋炖煮时呈现的特殊鲜味的直接来源，推测glu是高温烘干的龙筋呈现出焦香味的因素之一。
[0045]
实验4：硬脂酸镁添加量对鲟鱼龙筋咀嚼片的影响制备鲟鱼龙筋粉：取鲟鱼龙筋，清洗干净，在110℃下烘干90 min；将鲟鱼龙筋切割成小块，加入水中，料液比为1:10，在103.43 kpa、121℃条件下处理20 min，得鲟鱼龙筋液，静置至常温，过滤得过滤液，喷雾干燥，即得鲟鱼龙筋粉，过60目筛。
[0046]
将全脂乳粉、椰子粉和鲟鱼龙筋粉（全脂乳粉、椰子粉、鲟鱼龙筋粉三者的重量比为6:3:1）混合均匀，向混料中缓慢加入浓度为90%的乙醇溶液，并不断用手搅拌直至可轻捏成团即停，得湿混料，过筛造粒得60目的湿混料，在55℃条件下干燥2小时，先过100目筛，再过200目筛，得200目颗粒。向200目颗粒中加入不同含量的硬脂酸镁，具体为：0%、1%、2%、3%、4%、5%；待压片成型后，采用质构仪测定其硬度，结果如图6所示，当硬脂酸镁的添加量为1%及以下时硬度显著低于高添加量（p＜0.05），且压片基本不成型，即使成型后也很难维持片状形态；随着硬脂酸镁添加量的增加，咀嚼片的外形、光泽度、硬度也逐步上升，当添加量超过4%时，咀嚼片的硬度无明显变化（p＞0.05），咀嚼片的外形、光泽度与添加量3%的差异不大，结合考虑，硬脂酸镁添加量为3%为最适比例。
[0047]
实验5：奶粉与椰子粉添加比例对鲟鱼龙筋咀嚼片的影响实验方法：将一定比例的（具体比例详见表2）鲟鱼龙筋粉（制备方法同实验4）、全脂乳粉、椰子粉混合均匀，向混料中缓慢加入浓度为90%的乙醇溶液，并不断用手搅拌直至可轻捏成团即停，得湿混料，过筛造粒得60目的湿混料，在55℃条件下干燥2小时，先过100目筛，再过200目筛，得200目颗粒；加入3%的硬脂酸镁并混合均匀，压片机压片，紫外辐照灭菌，包装，即得鲟鱼龙筋咀嚼片产品。
[0048]
邀请20名经过培训的感官评价人员，在食品感官评价室内对产品进行感官评价并记录感官得分，去掉最高得分和最低得分后，取平均值作为感官评分结果，感官评分细则如表3所示，结果如图7所示。由图7可知，奶粉添加量为60%（以全脂乳粉、椰子粉、鲟鱼龙筋粉三者的总重量为100%计）、椰子粉添加量为30%时，评分最高，样品4的评分达到了96分。
[0049]
表2 全脂乳粉（克）椰子粉（克）龙筋粉（克）硬脂酸镁样品16030100%样品26030101%样品36030102%样品46030103%样品56030104%样品66030105%样品77020103%样品86535103%样品95535103%样品105040103%
样品114545103%表3 感官评分细则实验6：鲟鱼龙筋模拟消化产物的体外实验6.1 模拟消化实验方法：以10 g样品（样品分别为：实施例5制备的鲟鱼龙筋咀嚼片样品4；鲟鱼鱼骨咀嚼片）（鲟鱼鱼骨咀嚼片的制备方法同实施例5的样品4，不同之处在于以鲟鱼鱼骨粉替换鲟鱼龙筋粉）为例，将样品加入到40 ml模拟胃液电解质溶液中，添加胃蛋白酶8000 u，盐酸调至ph至2.0，在37℃下反应2 h，用氢氧化钠溶液调节ph至7.0终止反应。然后加入到40 ml的模拟肠液电解质溶液中，加入胰蛋白酶4000 u、脂肪酶800 u，在37℃下反应2 h，在100℃沸水浴中灭活10 min，静置至常温后，通过冷冻干燥得到模拟消化后的鱼骨样品和龙筋样品。所述模拟胃液电解质溶液、模拟肠液电解质溶液的组分组成如表4所示。
[0050]
所述鲟鱼鱼骨粉的制备方法为：将鲟鱼头骨和脊骨于100℃下煮10 min，捞出并清洗干净，切割成小块，按照1:5的料液比添加纯净水，加入鱼骨质量2%的复合蛋白酶（由木瓜蛋白酶和乳清蛋白酶组成，二者重量比为1:3），ph调整为7.0，在55℃下酶解3 h，得酶解液；然后将酶解液在103.43 kpa、121℃下高温处理20 min，得鲟鱼鱼骨液，静置至常温后过滤去除杂质得澄清滤液，喷雾干燥制成鲟鱼鱼骨粉，过60目筛。
[0051]
表4 模拟胃液电解质溶液和模拟肠液电解质溶液配方药品名称药品浓度/mol模拟胃液电解质模拟肠液电解质氯化钾0.5m16.09%8.84%磷酸氢二钾0.5m2.10%1.04%
碳酸氢钠1m29.15U.25%氯化镁0.15m0.93%1.43%碳酸氢铵0.5m1.17%0.00%氯化钙0.3m0.01%0.05%盐酸6m3.03%0.91%氢氧化钠2m27.52.48%6.2 细胞培养实验方法：mc3t3-e1细胞（小鼠胚胎成骨细胞前体细胞）培养在含有5ml的完全α-mem培养基（内含10%的胎牛血清和1%的青霉素、链霉素抗体）的t
25
细胞瓶中，置于37℃、含5%co2的恒温培养箱中培养，每2天更换一次培养基。待细胞生长至t
25
细胞瓶的90%时传代，传代时吸出培养瓶内原有培养基，用2 ml无菌pbs（1
×
）轻轻冲洗，吸出pbs后用胰酶（内含0.25%的edta）在37℃处理3 min，处理后加入2 ml完全α-mem培养基中和以终止反应，1000 g离心5 min后弃上清，后用1 ml完全α-mem培养基重悬细胞，轻轻吹匀后，取0.5 ml加入到新的含有4.5 ml的完全α-mem培养基t
25
细胞培养瓶中，置于培养箱中继续培养（37℃，5%co2）。
[0052]
6.3 mtt法测定样品对mc3t3-e1细胞的影响选取5～20代内的mc3t3-e1细胞，待细胞培养至细胞瓶的90%时，用胰酶消化离心，轻轻吹匀1 ml的细胞悬液，用血球计数板计数细胞悬液中的细胞个数，调节细胞悬液浓度为1
×
105个/ml，以每孔100 μl的量接种至96孔板内培养24 h，吸出孔内原有培养基，用无菌pbs清洗2遍，最后加入100 μl的含样品（指模拟消化后的鱼骨样品、龙筋样品）的α-mem培养基（样品溶解在不含有胎牛血清培养基中），样品的浓度分别为0 μg/ml、25 μg/ml、50 μg/ml、100 μg/ml、200 μg/ml、400 μg/ml，在培养箱中培养20 h（37℃，5%co2），每孔加入10 μl的浓度为5 mg/ml的mtt，37℃下孵育4 h；孵育后，吸出孔内培养基，加入150 μl的dmso，摇板15 min后于490nm处测定其吸光度a，细胞增殖活性按照如下公式计算（式中a
空白
是样品浓度为0 μg/ml下的吸光度）：细胞增殖活性=（a
样品-a
空白
）/（a
对照-a
空白
）。结果如图8所示。
[0053]
从图8中可以看出，鱼骨组分和龙筋组分的模拟消化产物对于mc3t3-e1细胞的增殖均有促进作用，且随着浓度的增加，增殖促进逐步升高，但在浓度超过100 μg/ml时，增殖促进作用较之前有所下降，但两种模拟消化产物的增殖促进效果趋于稳定，龙筋模拟消化产物对于mc3t3-e1细胞增殖促进作用在100 μg/ml时达到最大18.28
±
2.52%，在该浓度下，龙筋模拟消化产物的增殖促进效果显著高于鱼骨模拟消化组（p＜0.05），在体外模拟消化的情况下，鲟鱼龙筋对于mc3t3-e1细胞增殖促进作用效果优于鲟鱼鱼骨。
[0054]
6.4 mc3t3-e1细胞的光学显微镜分析选取5～20代内的mc3t3-e1细胞，待细胞培养至细胞瓶的90%时，用胰酶消化离心后，轻轻吹匀1 ml的细胞悬液，用血球计数板计数细胞悬液中的细胞个数，调节细胞悬液浓度为1
×
105个/ml，以每孔2500 μl的量接种至6孔板内培养24 h；吸出孔内原有培养基，用无菌pbs轻轻清洗2遍，加入2500 μl的浓度为100 μg/ml的含样品培养基（样品溶解在不含有胎牛血清培养基中）（同时以不含样品的培养基作为空白对照），在培养箱中培养48 h（37℃，5%co2），在第0 h、12 h、24 h、48 h时用普通光学显微镜在相同位置拍照记录，结果如图9所示。
[0055]
从图9中可以看出，两种样品在不同时段均对mc3t3-e1细胞的增殖有促进作用，这与上述mtt实验的结果相统一。在12 h时肉眼可见的观察到龙筋模拟消化产物对mc3t3-e1细胞的增殖促进作用效果最大，同时在24 h和48 h时，细胞数目也远远高于其余两组。鱼骨模拟消化产物在12 h时对mc3t3-e1细胞的增殖促进作用不明显，但在48 h时也呈现出了一定的增殖促进作用。
[0056]
6.5 mc3t3-e1细胞中碱性磷酸酶活性（akp）的测定选取5～20代内的mc3t3-e1细胞，待细胞培养至细胞瓶的90%时，用胰酶消化离心，轻轻吹匀1 ml的细胞悬液，用血球计数板计数细胞悬液中的细胞个数，调节细胞悬液浓度为1
×
105个/ml，以每孔2500 μl的量接种至6孔板内培养24 h；吸出孔内原有培养基，用无菌pbs轻轻清洗2遍，最后加入2500 μl的浓度为100μg/ml的含样品培养基（样品溶解在不含有胎牛血清培养基中），孵育24 h，吸出孔内原有培养基，用无菌pbs轻轻清洗2遍，添加1 ml无菌pbs，用细胞刮板将孔板内细胞收集，1000 g离心5min后弃上清，加入200 μl裂解液，在冰上裂解30 min，根据碱性磷酸酶测定试剂盒（南京建成）的描述测量细胞中的akp活性，结果如图10所示。
[0057]
碱性磷酸酶是成骨细胞分化的代表性标志物之一，它可直接反应细胞向成骨细胞的分化，从图10中可以看出，两种样品均对成骨细胞的分化有促进作用，且龙筋模拟消化产物有显著的促进成骨细胞细胞分化作用（p＜0.05）。
[0058]
综合以上体外实验，可以得出结论：鲟鱼龙筋和鲟鱼龙筋在经过体外模拟消化后，对于成骨细胞的增殖和分化有明显的促进作用。
[0059]
实验7：鲟鱼龙筋咀嚼片缓解骨关节炎疼痛的体内试验7.1 动物培养本实验所使用动物为雌性sd大鼠（150
±
5g，8周龄），购自济南朋悦实验动物繁育有限公司，所有程序均按照中国海洋大学（青岛）实验动物伦理委员会提供的指导原则进行。本实验所使用的大鼠饲料均为南通特洛菲饲料科技有限公司提供的棒状ain-93g基础饲料。本实验小鼠饮用水均为去离子水。动物饲养条件：sd大鼠单独分笼喂养，动物房照明维持在光/暗循环12 h，温度恒定为22℃
±
1℃，湿度为50%
±
5%，通风良好，换气为每小时20次，动物房定期消毒杀菌。本实验所用动物笼盒和大鼠饮用水瓶均由不锈钢及聚碳酸酯塑料组成，使用灭菌处理的玉米芯垫料，每2天更换一次垫料。48只sd大鼠在适应性喂养1周后，根据体重“之字形”分布随机分为空白对照组（normal）、模型组（model）、鲟鱼龙筋咀嚼片产品组（product）、阳性对照组（drug）、胶原蛋白组（collagen）、硫酸软骨素组（cs），每组8只。根据大鼠给药剂量与正常人给药量换算系数 6.3，参考大鼠胃容积每百克0.9 ml灌胃干预。
[0060]
鲟鱼龙筋咀嚼片灌胃剂制备：将鲟鱼龙筋咀嚼片粉（具体的组分组成对应实验5中的样品4）与水混合，以蒸馏水控制灌胃剂浓度为1 mg/ml，按照大鼠与人体的受药量公式换算每只动物的灌胃量为每日250 mg/kg。
[0061]
胶原蛋白组灌胃剂制备：将从鲟鱼龙筋中提取的胶原蛋白冻干粉以蒸馏水溶解，浓度及剂量同上。
[0062]
硫酸软骨素组灌胃剂制备：将从鲟鱼龙筋中提取的硫酸软骨素冻干粉以蒸馏水溶解，浓度及剂量同上。
[0063]
阳性对照组灌胃剂制备：将健力多ⅱ型胶原氨糖软骨素片磨碎成粉状，使用蒸馏水溶解，浓度及剂量同上。
[0064]
空白对照组和模型组灌胃剂制备：用同体积的0.9%生理盐水灌胃。
[0065]
将48只sd大鼠通过受试物灌胃给药2周后，除空白对照组外，采用内侧半月板和内侧副韧带前路切除术诱导大鼠左膝骨关节炎。通过10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，使用酒精棉球擦拭大鼠的左膝关节处消毒并使用剃毛器去除左膝毛。铺无菌巾单，逐层切开皮肤及筋膜，剪断内侧副韧带，沿膝盖内侧在关节处开0.5 cm的切口，使内侧半月板显露出来，摘取后以抗生素注射液冲洗关节腔，逐层缝合。术后以受试物喂养大鼠12周，按照骨关节炎诱导程序，每天运动30 min诱导骨关节炎发生。术后第4周，随机采集大鼠标本进行组织学分析，术后12周采集其他大鼠标本进行分析。
[0066]
7.2 组织学观察每日在受试物灌胃前先对大鼠的食量、毛发、伤口状况、行动能力等进行观察记录，分别于4周和12周后随机采集大鼠膝关节标本，将标本浸泡于4%的甲醛溶液中，静置48 h，用10%的edta脱钙液脱钙6周，每周换液，使用常规石蜡进行包埋，并制作切片，切片高度为5 μm，二甲苯脱蜡，于无水、95%、85%、75%乙醇溶液梯度脱水，以酸性复红（vangieson, vg）染液对切片进行染色，显微镜下观察并拍照记录，结果如图11、12所示。
[0067]
由图11和图12可知，空白对照组的胶原纤维排列有序，网状结构完整且分布均匀。与正常组相比，骨关节炎模型组的胶原纤维排列杂乱，网状结构被破坏。第12周时，除空白对照组外，其余各组大鼠膝关节胶原纤维结构情况均比第4周更严重。与模型组相比，鲟鱼龙筋咀嚼片产品组、胶原蛋白组及硫酸软骨素组的胶原纤维网状结构均较为完整，说明鲟鱼龙筋咀嚼片产品具有维持和保护膝关节软骨处胶原纤维结构的作用。
[0068]
7.3 免疫荧光检测 ngf和sp的表达通过7.2 的方法制作大鼠膝关节组织切片，组织切片通过pbs洗液清洗，添加4%的多聚甲醛溶液，静置15 min，再以pbs冲洗切片，再添加0.5%的聚乙二醇辛基苯基醚溶液，于25℃下通透 20 min，pbs清洗后，添加封闭液浸泡0.5 h，弃去液体后添加一抗（ngf antibody，affinity）于4℃下静置24 h，洗液洗涤3次以上，添加二抗（兔抗，affinity）于25℃下静置1 h，洗液洗涤切片，添加封片液（含荧光淬灭剂）封片，使用倒置荧光显微镜观察切片染色结果，并通过image j软件测量平均免疫荧光强度，各组大鼠的免疫荧光检测ngf和sp结果如图13、图14所示。
[0069]
由图13、图14可知，模型组大鼠膝关节组织中ngf和sp的表达水平与空白对照组相比，呈现出显著的上升趋势（p《0.05）。与模型组相比，受试各组的表达量显著降低（p《0.05），说明通过受试物干预可以有效降低动物膝关节组织中ngf和sp的表达。组间除阳性对照组外，各组别ngf的表达无显著性差异（p＞0.05），胶原蛋白组的sp表达明显升高。
[0070]
骨关节炎的主要病症现象为关节处疼痛，缓解关节疼痛成为治疗骨关节炎的关键。神经生长因子（ngf）广泛存在于生物体组织内，在发生炎症和组织受损时，ngf可以通过介导神经末梢敏感化和痛觉感受器增加等方式产生疼痛感，同时ngf还会导致部分炎症因子的进一步表达而加重炎症。p物质（sp）是一种分布于神经周边的具有促炎作用的神经肽，可以提高血管通透性促进神经敏感化，从而引起疼痛。本实验中，鲟鱼龙筋咀嚼片可以有效抑制ng和sp的表达，从而缓解骨关节炎带来的关节疼痛，同时也控制了炎症因子的进一步
增加，可以有效抑制因关节炎产生的疼痛感。
[0071]
给本领域技术人员提供上述实施例，以完全公开和描述如何实施和使用所主张的实施方案，而不是用于限制本文公开的范围。对于本领域技术人员而言显而易见的修饰将在所附权利要求的范围内。