一种低极性人参皂苷药物组合物及其应用

1.本发明属于药物制剂领域，更具体地说，是涉及一种低极性人参皂苷药物组合物及其应用。


背景技术：

2.类湿性关节炎(ra)是一种受遗传、自身免疫和环境因素影响的慢性炎症性疾病，主要表现为小关节病变和不可逆畸形，严重会导致功能永久性丧失。临床上治疗类风湿关节炎仍然以消炎止痛为主，甲氨蝶呤仍是首要选择性药物但不良反应颇多，比如会造成骨髓抑制、胃肠道反应以及肝肾功能损害。
3.西洋参茎叶中人参皂苷含量、种类与根部相似，但其茎叶很少被利用。从西洋参茎叶中直接提取出来的人参皂苷称极性人参皂苷，其苷元母核携带3至 4个糖基，极性较大，在人体中很难被利用。低糖基的人参皂苷极性较小，称为低极性皂苷，更容易结合到细胞膜系统上被利用。低极性皂苷在西洋参茎叶本身中含量极低，通过对极性人参皂苷的糖基进行改造可以得到低极性人参皂苷，水解转化后的低极性人参皂苷具有更为显著的药理活性。然而，尚未有人参极性皂苷及低极性皂苷对类风湿性关节炎改善效果的比较研究。


技术实现要素：

4.本发明就是为了解决上述背景技术中不足，提供了一种人参皂苷rg6、人参皂苷f4、人参皂苷rg5、人参皂苷rk1以及人参皂苷rh4为基础的、协同增效的、具有抗类风湿活性的低极性人参皂苷药物组合物。此外，本发明的另一目的在于提供上述低极性人参皂苷药物组合物在制备治疗抗类风湿关节炎的药物/保健品中的应用。
5.大量实验结果表明，将人参皂苷rg6、人参皂苷f4、人参皂苷rg5、人参皂苷rk1以及人参皂苷rh4按特定比例进行组合，不仅具有协同增效的抗类风湿关节炎的作用，并且可相应减少肝肾功能损害等不良反应，降低炎症因子的浓度，从而完成了本发明。
6.为此，本发明提供了一种低极性人参皂苷药物组合物，包含低极性人参皂苷组合物和药学可接受的载体，所述低极性人参皂苷组合物包含人参皂苷rg6、人参皂苷f4、人参皂苷rg5、人参皂苷rk1以及人参皂苷rh4。
7.本发明的低极性人参皂苷药物组合物中，可以包含其它人参皂苷，也可以不包含其它人参皂苷。在本发明的药物组合物中包含其它人参皂苷的情况下，从更好地发挥协同增效作用的角度考虑，本发明的低极性人参皂苷组合物的含量不少于整体质量的70％，以保证本发明的效果。
8.优选的，按质量百分比计，所述人参皂苷rg6、人参皂苷f4的为10％-20％，人参皂苷rg5、人参皂苷rk1的和为50％-60％以及10％人参皂苷rh4。
9.优选的，按质量百分比计，人参皂苷rg6、人参皂苷f4的和为15％、人参皂苷rg5、人参皂苷rk1和和为60％以及10％人参皂苷rh4。
10.其中，人参皂苷rg6的化学结构式为：
[0011][0012]
人参皂苷f4的化学结构式为：
[0013][0014]
人参皂苷rg5的化学结构式为：
[0015][0016]
人参皂苷rk1的化学结构式为：
[0017][0018]
人参皂苷rh4的化学结构式为：
[0019][0020]
对于本发明的药物组合物中的辅料，没有特殊限制，例如可以使用本技术领域通常用于药品或保健品的辅料。具体地，所述辅料为淀粉、糊精、乳糖、甘露醇、羟丙甲纤维素钠、黄原胶、蛋白糖等。
[0021]
将本发明的低极性人参皂苷药物组合物给药于cia大鼠，检测并观察其对 cia大
鼠体重、踝关节肿胀度和关节炎的影响。结果显示，单用组对类风湿关节炎的治疗效果远低于本发明中组合物的治疗效果，本发明的低极性人参皂苷药物组合物在抗类风湿关节炎方面表现出明显的协同效应。因此，本发明将低极性人参皂苷药物组合物用于制备治疗类风湿关节炎的药物中。
[0022]
优选的，低极性人参皂苷药物组合物在制备减少肝肾损伤的类风湿关节炎的药物中的应用。
[0023]
同时，所述低极性人参皂苷药物组合物也可以用于制备预防类风湿关节炎的保健品。
[0024]
在本发明中，低极性人参皂苷药物组合物用做的药物和/或保健食品的施用对象可以是哺乳动物，例如人、大鼠、兔、羊等，优选为人。
[0025]
优选的，所述低极性人参皂苷药物组合物用作药物和/或保健食品上的剂量为按体重8-32mg/kg。
[0026]
优选的，所述低极性人参皂苷药物组合物用作药物和/或保健食品上的剂量为按体重32mg/kg。
[0027]
本发明的低极性人参皂苷药物组合物用作的药物和/或保健食品的剂型为口服、注射或局部用药剂型。
[0028]
其中，口服剂型为片剂、粉剂、悬浊液、乳浊液、胶囊、颗粒剂、药丸、醋剂、散剂或糖浆剂；注射剂型为悬浊液或溶液；局部用药剂型为软膏、固体、悬浊液、水剂、醋剂、糊剂、气溶胶、泥敷剂、涂抹剂或乳剂。
[0029]
用作药物时，其施用量因症状程度、患者年龄、性别、体重、敏感性差异、施用方法、施用时期、施用间隔、药物制剂的性质、有效成分的种类等而异，无特殊限制。
[0030]
本发明的有益效果：
[0031]
本发明提供一种低极性人参皂苷药物组合物，其包含低极性人参皂苷组合物和药学可接受的载体，低极性人参皂苷组合物包含人参皂苷rg6、人参皂苷 f4、人参皂苷rg5、人参皂苷rk1以及人参皂苷rh4，人参皂苷若干寡糖基团通过醚或酯键与苷元相连，糖的类型、数量和附着位置提供了不同的活性的皂苷, 极性皂苷通过水解反应减少糖基后转化为本发明中的低极性人参皂苷，本发明中的低极性人参皂苷具有更加广泛的药理活性和生物活性。
[0032]
本发明中的低极性人参皂苷具有多成分、多靶点、多途径的优势。本发明将代谢组学与炎症因子信号通路相结合，发现低极性人参皂苷主要通过肉碱合成、植酸过氧化物酶体氧化、支链脂肪酸的氧化通路、儿茶酚胺生物合成、维生素b6代谢降低tnf-α、il-1β、il-18、il-6水平，而极性人参皂苷仅仅发挥其部分作用。本发明的低极性人参皂苷组合物中，人参皂苷rg6、人参皂苷 f4、人参皂苷rg5、人参皂苷rk1以及人参皂苷rh4是协同增效的，下调il-1 β、il-18、il-6和tnf-a含量，极大地降低il-1β、il-18、tnf-α、il-6 等促炎因子的表达而减轻类风湿关节炎微环境缺氧的程度。因此，本发明的低极性人参皂苷药物组合物在治疗和/或预防类风湿关节炎上具有与传统药物甲氨蝶呤持平的优异效果，能在降低炎症因子的浓度的同时，相应减少肝肾功能损害等不良反应，具有较好的药理活性，对类风湿性关节炎的治疗更有效。
附图说明
[0033]
为了更清楚地说明本技术实施例中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0034]
图1为人参皂苷药物组合物含量的筛选；
[0035]
图2为mtt法检测人参皂苷对lps诱导的fls细胞的影响；
[0036]
图3a为cia大鼠体重参数随时间变化的疗效评估图；
[0037]
图3b为cia大鼠踝关节肿胀度随时间变化的疗效评估图；
[0038]
图3c为cia大鼠关节炎评分参数随时间变化的疗效评估图；
[0039]
图3d为cia大鼠第50天各组代表性足部肿胀程度对比图；
[0040]
图4a为ra诊断血沉(esr)指标定量分析图；
[0041]
图4b为ra诊断血清中类风湿因子(rf)含量水平指标定量分析图；
[0042]
图5a为il-1β炎症因子定量分析图；
[0043]
图5b为il-18炎症因子定量分析图；
[0044]
图5c为tnf-α炎症因子定量分析图；
[0045]
图5d为il-6炎症因子定量分析图；
[0046]
图5e为各组踝关节滑膜he染色图(200x，标尺50um)；
[0047]
图6a为大鼠尿酸(ua)定量分析图；
[0048]
图6b为大鼠肌酐(cr)定量分析图；
[0049]
图6c为大鼠肾he染色切片图(200x，标尺：50um)。
具体实施方式
[0050]
为了使本技术所要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本技术，并不用于限定本技术。
[0051]
实施例1低极性人参皂苷药物组合物含量的筛选
[0052]
将人参皂苷rh4、人参皂苷rg6和人参皂苷f4、人参皂苷rg5和人参皂苷 rk1分别按照10/10/50、10/10/55、10/10/60、10/15/50、10/15/55、10/15/60、 10/20/50、10/20/55、10/20/60的百分含量配制低极性人参皂苷药物组合物，采用mtt法分别在浓度100ug/ml和200ug/ml的条件下检测上述9组不同百分含量的人参皂苷组合物对lps诱导的成纤维滑膜细胞(fls)的存活率的影响，成纤维滑膜细胞(fls)是导致机体类风湿关节炎发生的重要因素，因此通过对 fls细胞的抑制作用来验证人参皂苷对类风湿关节炎的治疗作用，如图1所示。
[0053]
实验结论：通过图1可知，以上9组百分含量的低极性人参皂苷药物组合物均对fls有抑制作用，且10/15/60的百分含量抑制作用最大。
[0054]
实施例2低极性人参皂苷组合物间的协同作用
[0055]
本发明的低极性人参皂苷组合物包含人参皂苷rg6、人参皂苷f4、人参皂苷rg5、人参皂苷rk1以及人参皂苷rh4，由于人参皂苷rg6和人参皂苷f4、人生皂苷rg5和人参皂苷rk1
之间存在相互转化的情况，因此人参皂苷rg6和人参皂苷f4效果相似，人生皂苷rg5和人参皂苷rk1效果相似。
[0056]
准备单组分人参皂苷rg6、单组分人参皂苷rg5、单组分人参皂苷rh4和 10/15/60的低极性人参皂苷组合物，空白对照组仅为fls细胞，在浓度分别为 6.25ug/ml、12.5ug/ml、25ug/ml、50ug/ml、100ug/ml和200ug/ml的条件下，采用mtt法测试人参皂苷对lps诱导的fls细胞的影响，观察并记录fls 细胞存活情况，检测结果如图2所示。
[0057]
实验结果：通过图2可知，相同浓度下，加入单组分(人参皂苷rg6和人参皂苷f4、人参皂苷rg5和人参皂苷rk1、人参皂苷rh4)的fls细胞存活率抑制效果远低于低极性人参皂苷药物组合物的抑制效果；而且当浓度为50 ug/ml，低极性人参皂苷组合物中fls细胞的存活率已经降低到50％以下。由此可以证明，本发明中的人参皂苷rg6和人参皂苷f4、人参皂苷rg5和人参皂苷 rk1、人参皂苷rh4之间存在协同作用，从而对fls细胞的抑制作用最大。
[0058]
实施例3低极性人参皂苷药物组合物体内治疗效果测试
[0059]
(1)实验对象：以cia大鼠模型，购自济南朋悦实验动物有限公司的wistar 大鼠(动物认证号为scxk2019003，动物实验伦理审查表编号为2020sdl185)。
[0060]
(2)治疗效果测试：准备相同数量的8组cia大鼠，其中1组作为空白对照组(blank组)，其余7组作为实验组，分别标记为甲氨蝶呤组(mtx组)、低极性人参皂苷药物组合物1组(tsag.h组)、低极性人参皂苷药物组合物2 组(tsag.m组)、低极性人参皂苷药物组合物3组(tsag.l组)、极性人参皂苷组合物1组(sag.h组)、极性人参皂苷组合物2组(sag.m组)和模型组(model 组)，其中，甲氨蝶呤组(mtx组)作为阳性对照组，模型组(model组)作为阴性对照组。(下同)
[0061]
8组cia大鼠均在恒温环境中适应性饲养7天，固定黑暗光照各12小时，室温23
±
2℃，自由摄食饮水。第一次免疫，将牛ⅱ型胶原蛋白溶解在冰乙酸溶液中，并将混合物在振荡过夜。12小时后与完全弗氏佐剂(cfa)以1:1的比例乳化，直到乳剂液滴保持在水中未扩散才算成功，在大鼠尾部皮内注射0.2 毫升。14天后，用上述同样方法将牛ⅱ型胶原蛋白与不完全弗氏佐剂(ifa)乳化并按照0.2ml/只尾部注射进行二次免疫。空白对照组的大鼠两次免疫均注射相同体积的生理盐水。第二次免疫7天后对所有大鼠进行灌胃治疗。鉴于实验对象为cia大鼠，实验给药量调整为50-200mg/kg。
[0062]
mtx组以浓度为0.4mg/kg的甲氨蝶呤进行给药治疗。tsag.h组、tsag.m 组、tsag.l组分别以200mg/kg、100mg/kg、50mg/kg的浓度进行给药治疗。其中，低极性人参皂苷组合物的成分为：15％人参皂苷rg6和人参皂苷f4、60％份人参皂苷rg5以及10％人参皂苷rh4。
[0063]
sag.h组、sag.m组分别以200mg/kg、100mg/kg的浓度进行给药治疗，极性人参皂苷组合物的成分为：人参皂苷re(0.41
±
0.01mg/mg)、人参皂苷rg2 (0.07
±
0.01mg/mg)、人参皂苷rb2(0.16
±
0.01mg/mg)、人参皂苷rd(0.16
ꢀ±
0.01mg/mg)。blank组与model组均给以生理盐水治疗。
[0064]
对8组大鼠均施以10ml/kg的浓度剂量等容积一次性灌胃治疗30天，利用cia大鼠的体重、踝关节肿胀度和关节炎评分来评估低极性人参皂苷药物组合物治疗效果。
[0065]
(a)大鼠第一次免疫后，每5天评估一次体重和关节炎评分，第10天起每5天评估一次踝关节肿胀度。cia大鼠的体重测试结果如图3a所示。
[0066]
(b)踝关节肿胀度的计算：用记号笔在其踝关节下1mm处进行标记。用游标卡尺测
量踝关节肿胀处的直径并记录，得出的数据按以下公式计算出大鼠踝关节肿胀度(paw swelling)：踝关节肿胀度＝(造模后踝关节直径－造模前踝关节直径)/造模前踝关节直径
×
100％。踝关节肿胀度测试结构如图3b所示。
[0067]
(c)关节炎评分(arthritis score)的计算：每只大鼠的足爪炎症分5级： 0分：正常；1分：1个或1个以上趾关节红肿；2分：整个足爪红肿；3分：踝关节以下红肿；4分：包括踝关节在内的全部足爪红肿。每只大鼠4只足爪的最大积分为16分，四分及以上才能进入实验。关节炎评分测试结果如图3c 所示。
[0068]
由图3b和图3c可知，第一次免疫后10天，cia大鼠出现踝关节和脚趾炎症，并表现出食物摄入量减少和活动障碍。当进行灌胃治疗后，从图3a-3c中可以看出，在体重、踝关节肿胀度和关节炎评分的降低方面，tsag.h组、tsag.m 组、tsag.l组的效果优于sag.h组、sag.m组和mtx组。
[0069]
(d)第一次免疫起第50天开始对8组中的大鼠右足进行ct扫描，根据 ct结果评判足部肿胀程度。8组cia大鼠第50天代表性足部肿胀程度对比图如图3d所示：
[0070]
图3d中(a)-(h)分别代表：(a)为mtx组，(b)为tsag.h组，(c) 为tsag.m组，(d)tsag.l组，(e)为sag.h组，(f)为sag.m组，(g) 为blank组，(h)为model组。
[0071]
由图3d可知，blank组、tsag.h组、tsag.m组、tsag.l组、mtx组、model 组的足部肿胀程度依次增加，且tsag.h组、tsag.m组、tsag.l组的足部肿胀程度轻于sag.h组、sag.m组，ct扫描显示blank组和tsag.h组、tsag.m组、 tsag.l组的状况良好，mtx组、sag.h组、sag.m组和model组的指间关节出现关节畸形、关节肿胀，掌指关节有锯齿状病变，骨组织边缘模糊，不规则。由3a-3d可知，本发明的低极性人参皂苷药物组合物具有较好的药理活性，对类风湿性关节炎的治疗更有效。
[0072]
实施例4类风湿关节炎诊断指标定量分析
[0073]
8组大鼠灌胃30天结束后眼眶静脉采集血样，并在室温下保持1小时。通过离心以获得血清-40℃冻存，血清用于试剂盒测量炎症因子(tnf-α、il-1 β、il-6、il-18)、血沉和类风湿因子。
[0074]
(1)血沉和类风湿因子定量分析：如图4所示，其中图4a横坐标代表8 个组别的血沉(esr)，纵坐标代表浓度(concentration)，图4b横坐标代表 8个组别的血清中类风湿因子(rf)含量水平，纵坐标代表浓度 (concentration)，以上所有数值均表示为平均值
±
标准差(n＝6)。#vs. blank，p《0.05；##vs.blank，p《0.01；*vs.model，p《0.05；**vs. model，p《0.01。(下同)
[0075]
model组与blank组均具有统计学意义(p《0.01)，说明cia模型的构建成功。图4a中，与model组相比，tsag.h组、tsag.m组和tsag.l组的效果 (p《0.05)好于同剂量的sag.h组、sag.m组(p》0.05)。图4b中，与blank 组相比，tsag.h组、tsag.m组、tsag.l组的效果(p《0.05)优于sag.h组、 sag.m组(p》0.05)。从图4b中看出，低极性人参皂苷药物组合物对血清中类风湿因子(rf)的效果与甲氨蝶呤的作用效果接近，说明低极性人参皂苷药物组合物对血清中类风湿因子(rf)浓度的降低具有促进作用。
[0076]
(2)炎症因子定量分析：如图5所示，图5a横坐标代表8个组别的炎症因子il-1β，纵坐标代表浓度；图5b横坐标代表8个组别的炎症因子il-18，纵坐标代表浓度；图5c横坐标代表8个组别的炎症因子tnf-α，纵坐标代表浓度；图5d横坐标代表8个组别的炎症因子il-6，
纵坐标代表浓度。
[0077]
通过图5a-5d可以看出，model组中的il-1β、il-18、tnf-α、il-6等炎症因子与blank组相比显著升高(p《0.01)。如图5a和图5b所示,tsag.h 组、tsag.m组、model组相比，tsag.l组使得il-1β、il-18水平显著下降(p《0.01)；与blank组相比，tsag.h组、tsag.m组、tsag.l组的治疗效果优于sag.h组、sag.m组，且tsag.h组、tsag.m组、tsag.l组与mtx组的治疗效果相近。
[0078]
如图5d-5e所示，在低极性人参皂苷药物组合物与极性人参皂苷组合物给药后，与model组相比，tsag.h组、tsag.m组中tnf-α与il-6含量水平均明显下降。
[0079]
因此，本发明的低极性人参皂苷药物组合物在治疗和/或预防类风湿关节炎上具有与传统药物甲氨蝶呤持平的优异效果，并且相比于甲氨蝶呤可相应减少肝肾功能损害等不良反应，降低炎症因子的浓度。
[0080]
(3)组织学病理分析：8组大鼠脱颈处死后，将每组中的大鼠的右足以及部分肾脏固定4％多聚甲醛中制作切片进行组织病理学分析，每组大鼠的踝关节滑膜he染色图如图5e所示。
[0081]
图5e中，表示滑膜组织，
↑
表示关节面，(e1)至(e8)分别为mtx组、 tsag.h组、tsag.m组、tsag.l组、sag.h组、sag.m组、blank组model组。
[0082]
如图5e所示，blank组大鼠踝关节结构完整，关节面和滑膜层光滑，关节腔内未见增生纤维组织。model组踝关节结构异常，滑膜炎症细胞增生和紊乱，关节腔内纤维结缔组织增生，关节骨和软骨组织严重破坏。这种损伤在mtx组的程度较小。从tsag.h组、tsag.m组、tsag.l组中看出，随着低极性人参皂苷药物组合物剂量的递减，损伤逐渐增加，从滑膜组织增生发展到炎性细胞浸润，再过渡到关节腔内纤维结缔组织增生。从sag.h组、sag.m组中看出，关节腔内充满纤维组织增生和血管翳，关节内骨组织逐渐出现损伤。由此可以看出，mtx组、tsag.h组的治疗效果最好。
[0083]
实施例5低极性人参皂苷药物组合物护肾作用
[0084]
将上述8组大鼠的肾脏进行肾损伤的血清生化指标ua、cr检测，检测结果如图6a-6b所示。将上述8组大鼠的肾脏进行肾病理组织切片，切片结果如图 6c所示。
[0085]
图6a横坐标代表8个组别的尿酸(ua)，纵坐标代表浓度；图6b横坐标代表8个组别的肌酐(cr)，纵坐标代表浓度；图6c代表肾he染色切片，图中代表炎症细胞浸润，
↑
代表空泡，
○
代表肾he染色片中的肾小球。
[0086]
如图6a和图6b所示，与blank组相比，cia建模均造成肾损伤。与model 组相比，tsag.h组有利于肾脏修复。如图6a和图6b所示，虽然mtx组可显著改善ra的进展，但其加重了肾毒性，图6c中mtx组肾病理性切片组织也验证了这一点。由图6c的染色结果显示，blank组的肾小球形态完整，形状均匀，无明显的病理损伤。tsag.h组、tsag.m组可见肾间质炎症细胞浸润，提示肾脏有轻度损害。sag.h均表现为肾小球萎缩，提示肾脏出现严重损伤。sag和model 组显示肾小球消失，表明肾脏器发生了质性病变损伤。由此可以说明本发明的低极性人参皂苷药物组合物可以用于制备减少肾损伤的类风湿关节炎的药物。
[0087]
综上所述，本发明提供一种低极性人参皂苷药物组合物，其包含低极性人参皂苷组合物和药学可接受的载体，低极性人参皂苷组合物包含人参皂苷rg6、人参皂苷f4、人参皂苷rg5、人参皂苷rk1以及人参皂苷rh4，人参皂苷若干寡糖基团通过醚或酯键与苷元相
连，糖的类型、数量和附着位置提供了不同的活性的皂苷,极性皂苷通过水解反应减少糖基后转化为本发明中的低极性人参皂苷，本发明中的低极性人参皂苷具有更加广泛的药理活性和生物活性。
[0088]
本发明中的低极性人参皂苷具有多成分、多靶点、多途径的优势。本发明将代谢组学与炎症因子信号通路相结合，发现低极性人参皂苷主要通过肉碱合成、植酸过氧化物酶体氧化、支链脂肪酸的氧化通路、儿茶酚胺生物合成、维生素b6代谢降低tnf-α、il-1β、il-18、il-6水平，而极性人参皂苷仅仅发挥其部分作用。本发明的低极性人参皂苷组合物中，人参皂苷rg6、人参皂苷 f4、人参皂苷rg5、人参皂苷rk1以及人参皂苷rh4是协同增效的，下调il-1 β、il-18、il-6和tnf-a含量，极大地降低il-1β、il-18、tnf-α、il-6 等促炎因子的表达而减轻类风湿关节炎微环境缺氧的程度。因此，本发明的低极性人参皂苷药物组合物在治疗和/或预防类风湿关节炎上具有与传统药物甲氨蝶呤持平的优异效果，能在降低炎症因子的浓度的同时，相应减少肝肾功能损害等不良反应，具有较好的药理活性，对类风湿性关节炎的治疗更有效。
[0089]
以上所述仅为本技术的较佳实施例而已，并不用以限制本技术，凡在本技术的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本技术的保护范围之内。