一种秦岭大熊猫人工采精及授精方法与流程

1.本发明属于秦岭大熊猫繁殖技术领域，具体涉及一种秦岭大熊猫人工采精及授精方法。


背景技术：

2.秦岭是中国大熊猫纬度最高的分布区，种群密度居全国之首。秦岭大熊猫是大熊猫的重要种群，具有独特的分布格局和种群进化史。秦岭大熊猫繁育的新生仔在出生时发育相当的不成熟，体重仅仅是它母亲体重的0.1％，初生幼仔体重很轻，初生重平均为145克左右，约为成年大熊猫体重的千分之一，最轻的为51克，最重的为225克，而且成长周期极为缓慢。最重要的是，秦岭大熊猫的自身繁殖能力很弱，自然发情期一年只有一次，期间主动交配时间为1-3天，进一步的降低了大熊猫的繁殖率。
3.因此，为了提高大熊猫的繁殖率，需要人工进行大熊猫的采精和授精，可以有效的提高秦岭大熊猫的繁殖率，同时可以培育更加优良的秦岭大熊猫品种。


技术实现要素：

4.针对上述存在的技术问题，本发明提供了一种秦岭大熊猫人工采精及授精方法，通过人工采集大熊猫精液并进行冷冻，雌性大熊猫发情期解冻冷藏精液进行人工授精，抓住短暂的授精时间，提高授精成功率。
5.为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：
6.一种秦岭大熊猫人工采精及授精方法，包括如下步骤：
7.步骤1：雄性秦岭大熊猫麻醉保定，并对生殖器官检查，然后采用直肠电刺激方法采精并收集；
8.步骤2：对步骤1收集的雄性秦岭大熊猫精液品质检查；
9.步骤3：将步骤2检查后的雄性秦岭大熊猫精液颗粒冷冻或细管冷冻储存；
10.步骤4：使用步骤3储存的雄性秦岭大熊猫精液，进行雌性秦岭大熊猫的人工授精。
11.优选地，所述步骤1的具体操作为：
12.步骤1.1：发情期雄性秦岭大熊猫禁食12h，促使胃内食物排空；
13.步骤1.2：使用氯胺酮4mg/kg-8mg/kg，辅助以异氟烷0.3mg/kg-0.5mg/kg或隆朋0.3mg/kg-0.5mg/kg，于大熊猫颈部或臀部进行肌肉注射麻醉；
14.步骤1.3：对步骤1.2麻醉后的雄性秦岭大熊猫的生殖器官检查；
15.步骤1.4：使用洁净纱布清理雄性秦岭大熊猫包皮内污物，使用37℃0.1％新洁尔灭多次清洗包皮内外，最后使用37℃灭菌生理盐水冲洗至无消毒剂残留；
16.步骤1.5：连接电刺激采精器，根据雄性秦岭大熊猫的后肢收缩程度，由低至高缓慢增加电压，连续刺激雄性秦岭大熊猫直肠20-30次，每次2s，直至精液流出；
17.步骤1.6：如果第1次没有刺激出精液或精液量太少，则间隔5min后再重复1.5步骤1次；
18.步骤1.7：持38℃预温的集精杯，待精液流出后，迅速接取，直到精液不再流出。
19.优选地，所述步骤2的雄性秦岭大熊猫精液品质检查包括：精液气味检查、精液密度检查、精液ph值检查、精液精子活力检查、精液精子活率检查、精液精子运动状态检查、精液精子顶体完整性检查、精液精子形态检查、精液精子质膜完整性检查。
20.优选地，所述步骤2的精液精子顶体完整性检查为：吸取1μl精液 9μlpope染液，染色90s后涂片，待涂片干后用100
×
油镜观察并评级。
21.优选地，所述步骤3的颗粒冷冻具体操作为：
22.步骤3.1.1：将步骤2检查合格的雄性秦岭大熊猫精液用冷冻稀释液稀释，其中精液和稀释液比为1:3；
23.步骤3.1.2：将步骤3.1.1稀释后的大熊猫精液在4℃冰箱中平衡4h。
24.步骤3.1.3：将冻精板放入装有液氮的金属槽中浸泡3次，将冻精板提升到距液氮面5cm处，用温度计测量冻精板的温度，当温度下降到-80℃时，用微量吸管快速地把平衡好的精液以40-80μl/粒滴在冻精板上。
25.步骤3.1.4：步骤3.1.3完成2min后，把冻精板快速侵入-196℃液氮中，用平衡好的镊子把冷冻精粒装入玻璃小瓶中，放进液氮罐长期保存。
26.优选地，所述步骤3的细管冷冻具体操作为：
27.步骤3.2.1：将步骤2检查合格的雄性秦岭大熊猫精液用test或sfs作1:3稀释；
28.步骤3.2.2：将步骤3.1稀释后的大熊猫精液在4℃冰箱中平衡4h。
29.步骤3.2.3：步骤3.2.2平衡后的大熊猫精液吸入细塑料管中，每管0.25ml，一端塞有棉花，另一端在注入精液后封闭，用在酒精灯上烧热的钳子融化塑料封闭。
30.步骤3.2.4：将步骤3.2.3封闭后的细塑料管放置于平衡好的试管架上层，温度为-20℃，离液氮7.5cm，时间为1min；然后将细塑料管移至试管架下层，此时离液氮2.5cm，-80℃，时间为1min；最后将细塑料管放入液氮中2min，之后装入纸筒中，放进液氮罐长期保存。
31.优选地，所述步骤3的试管冷冻具体操作为：
32.步骤3.3.1：取200μl采集的大熊猫精液加入400μl稀释液中；
33.步骤3.3.2：将稀释后的大熊猫精液装入1.5ml的塑料试管中，在4℃的冰箱中平衡4h；
34.步骤3.3.3：将步骤3.3.2平衡后的塑料试管置于离液氮7.5cm高的平板上冷冻10min，然后放入液氮中进行长期保存。
35.优选地，所述步骤4的具体操作为：
36.步骤4.1：使用37℃0.1％新洁尔灭清洗雌性秦岭大熊猫的外阴和肛门部，然后使用37℃灭菌生理盐水冲洗至无消毒剂残留；
37.步骤4.2：将球式玻璃输精器用于颗粒冷冻精液的输精，将金属输精器用于细管冷冻精液的输精；
38.步骤4.3：透明玻璃制成的量筒状开腔器插入雌性秦岭大熊猫阴道端的端口平滑部；
39.步骤4.4：将输精器插入开腔器，缓慢注入精液；
40.步骤4.5：做好人工授精记录，详细准确记录雌性雄性信息、使用精液信息、精液来源大熊猫信息、日期、授精次数。
41.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
42.1.用石蜡油润滑的手指伸入直肠内在输精管壶腹部区域反复前后按摩，可以提升采精量和采精成活率，避免或肠电刺激未采出精液；
43.2.采用阶梯温度冷冻保存，避免了之间冷冻对精子活性的降低，提高了冷冻保存的成功率；
44.3.本发明整体技术完整，可以有效提高大熊猫采精和授精的成功率，进而提高秦岭大熊猫的繁殖率。
附图说明
45.附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。
46.在附图中：
47.图1为本发明的方法流程图。
具体实施方式
48.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。通常在此处附图中描述和示出的本发明实施例的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。
49.因此，以下对在附图中提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
50.实施例：
51.参照附图1，为本发明的方法流程图，一种秦岭大熊猫人工采精及授精方法，包括如下步骤：
52.步骤1：雄性秦岭大熊猫麻醉保定，并对生殖器官检查，然后采用直肠电刺激方法采精并收集，具体操作为：
53.步骤1.1：成年(5.5-20岁)、处于发情季节(一般为春季2-5月)、体格正常的健康雄性秦岭大熊猫。雄性秦岭大熊猫应在本场内饲养30d以上，具有依照ly/t 2896-2017建立的种群遗传档案，并具有详细完整的基本资料、免疫、驱虫和检查检疫记录。在雄性秦岭大熊猫自然状态下，定期观察运动、精神、呼吸、饮食状况，检查粪便情况。
54.雄性秦岭大熊猫正常发情时，会出现定期或有规律性地排出白色或黄色的粘稠状液体的生理现象，也会有短暂的发情特征，如活动量增加，叫声多变，睾丸肿大等。雄性秦岭大熊猫发情期可持续约30d左右。然后将发情期雄性秦岭大熊猫禁食12h，促使胃内食物排空；
55.步骤1.2：采精场所空间应充足，安静保暖，地面防滑并清洁整齐。检查电刺激采精器是否运行正常，凡是接触精液的用具均应选取一次性无菌包装或进行清洗和消毒，集精杯置于38℃恒温箱中备用。所有设备和器具须于采精前1天准备充足并妥善贮存，整齐摆
放。
56.然后使用氯胺酮4mg/kg-8mg/kg，辅助以异氟烷0.3mg/kg-0.5mg/kg或隆朋0.3mg/kg-0.5mg/kg，于大熊猫颈部或臀部进行肌肉注射麻醉。麻醉后，测定大熊猫心率、呼吸频率和体温。待大熊猫麻醉状态平稳后，将大熊猫保定四肢于兽医保定手术台上，执行后续采精操作。
57.步骤1.3：对步骤1.2麻醉后的雄性秦岭大熊猫的生殖器官检查，用手触摸已麻醉大熊猫的两侧睾丸，检查其大小、观察有无红肿、结节，阴囊有无外伤，并记录。
58.步骤1.4：操作人员寻找待采精雄性大熊猫阴部，阴毛过长时应适度修剪，使用洁净纱布清理雄性秦岭大熊猫包皮内污物，使用37℃0.1％新洁尔灭多次清洗包皮内外，最后使用37℃灭菌生理盐水冲洗至无消毒剂残留；
59.步骤1.5：使用常规灌肠法清除雄性秦岭大熊猫肠内积粪，用石蜡油润滑的手指伸入直肠内在输精管壶腹部区域反复前后按摩200-400次，该操作可以提升采精量和采精成活率，避免或肠电刺激未采出精液。
60.然后按照使用说明书连接电刺激采精器，使用带有3个不锈钢电极(长6.5cm，宽0.3cm，呈45
°
、90
°
和135
°
排列)和60hz正弦波刺激器的直肠探头(直径为2.6mm)在低电压(2v-8v)条件下，根据雄性大熊猫的后肢收缩程度，由低至高缓慢增加电压，连续刺激雄性大熊猫直肠20-30次，每次2s，直至精液流出。
61.步骤1.6：如果第1次没有刺激出精液或精液量太少，则间隔5min后再重复1.5步骤1次。
62.步骤1.7：操作人员佩戴双层手套，持38℃预温的集精杯，待精液流出后，迅速接取，直到精液不再流出。集精杯温度控制在38-40℃之间，若环境温度过低，可适当提高温度，最高不得超过42℃。将采集精液后的集精杯关闭，放入37℃水浴箱中短暂保存待测，并做好采精记录。
63.采精后，保持采精场所安静温暖，持续观察，待雄性大熊猫自然苏醒。若60min内未苏醒，则通知相关兽医人员及时检查。
64.步骤2：对步骤1收集的雄性秦岭大熊猫精液品质检查，冷冻的精子取出进行人工授精也做同样的检查，主要包括：精液气味检查、精液密度检查、精液ph值检查、精液精子活力检查、精液精子活率检查、精液精子运动状态检查、精液精子顶体完整性检查、精液精子形态检查、精液精子质膜完整性检查。
65.首先，准备使用器械，所有与精液接触的器具均应放在32-37℃的恒温箱中，稀释液放在32-35℃恒温水浴箱中备用，检查过程中注意环境温度。计量设备(温度计、天平、移液器等)准确，定期检查并校准。观察集精杯是否完整无破损，精液颜色、色泽是否正常，是否混用脓性分泌物或血液等异物和污物。对新鲜精子的检查应控制在80min以内，对冷冻精子的检查应控制在120min以内。
66.2.1采精量测定
67.2.1.1精液重量测定
68.预先称取集精杯重量，再将盛有精液的集精杯置于电子天平上称重(精确到0.1g)，两次称重相减即为采精精液重量。
69.2.1.12精液体积测定
70.采用微量移液器直接测定精液体积。
71.2.3精液气味检查
72.正常大熊猫精液略带腥味，带有异常气味均为不正常精液。
73.2.4精液密度检查
74.精液密度采用血细胞计数板，在光学显微镜下直接观察。
75.2.5精液ph值检查
76.取少量精液，使用ph试纸或ph计检测，正常精液为弱碱性。
77.2.6精液精子活力检查
78.取少量精液于37℃保温的载玻片上，凡是能够向前运动的精子即为有活力的精子，以百分数表示。
79.2.7精液精子活率检查
80.滴1滴精液于37℃保温的载玻片上,在旁边滴上同体积的pap染液,用载玻片将其混合后平涂，待片干后在显微镜下观察计数，白色精子为活精子，粉红色是死精子，用百分数表示精子活率。
81.2.8精液精子运动状态检查
82.在显微镜下观察并评价精子的运动状态,用0-5表示：0为不活动；1为颤动；2为转圈；3为曲线向前运动；4为直线运动；5为很快的直线运动。用百分数表示各等级精子的比例。
83.2.9精液精子顶体完整性检查
84.吸取1μl精液 9μlpope染液，染色90s后涂片。待涂片干后用100
×
油镜观察并评级：a.正常顶体为深紫色；b.受损的顶体也为深紫色,但顶部表面凹凸不平,成锯齿状；c.顶体丢失,顶部为白色；d.顶体蓬松，顶部为白色，顶部表面凹凸不平，顶体损伤最严重。用百分数表示各等级精子的比例。
85.2.10精液精子形态检查
86.将2μl精液加入200μl 0.3％甘油醛中固体,取少量于载玻片上用油镜观察。
87.2.11精液精子质膜完整性检查
88.采用低渗肿胀实验，将少量精液加入适量低渗溶液中,若精子质膜完整，水会进入精子内部使精子体积增大、顶体肿胀、尾部弯曲，计算弯尾率，用百分数表示。
89.真实完整准确记录上述检查结果并保存，舍弃不合格精液，保留合格精液以执行后续操作。
90.步骤3：将步骤2检查后的雄性秦岭大熊猫精液颗粒冷冻或细管冷冻储存。
91.颗粒冷冻具体操作为：
92.步骤3.1.1：将步骤2检查合格的雄性秦岭大熊猫精液用冷冻稀释液稀释，其中精液和稀释液比为1:3；
93.步骤3.1.2：将步骤3.1.1稀释后的大熊猫精液在4℃冰箱中平衡4h。
94.步骤3.1.3：将冻精板放入装有液氮的金属槽中浸泡3次，将冻精板提升到距液氮面5cm处，用温度计测量冻精板的温度，当温度下降到-80℃时，用微量吸管快速地把平衡好的精液以40-80μl/粒滴在冻精板上。
95.步骤3.1.4：步骤3.1.3完成2min后，把冻精板快速侵入-196℃液氮中，用平衡好的
镊子把冷冻精粒装入玻璃小瓶中，放进液氮罐长期保存。
96.细管冷冻具体操作为：
97.步骤3.2.1：将步骤2检查合格的雄性秦岭大熊猫精液用test或sfs作1:3稀释；
98.步骤3.2.2：将步骤3.1稀释后的大熊猫精液在4℃冰箱中平衡4h。
99.步骤3.2.3：步骤3.2.2平衡后的大熊猫精液吸入细塑料管中，每管0.25ml，一端塞有棉花，另一端在注入精液后封闭，用在酒精灯上烧热的钳子融化塑料封闭。
100.步骤3.2.4：将步骤3.2.3封闭后的细塑料管放置于平衡好的试管架上层，温度为-20℃，离液氮7.5cm，时间为1min；然后将细塑料管移至试管架下层，此时离液氮2.5cm，-80℃，时间为1min；最后将细塑料管放入液氮中2min，之后装入纸筒中，放进液氮罐长期保存。
101.所述步骤3的试管冷冻具体操作为：
102.步骤3.3.1：取200μl采集的大熊猫精液加入400μl稀释液中；
103.步骤3.3.2：将稀释后的大熊猫精液装入1.5ml的塑料试管中，在4℃的冰箱中平衡4h；
104.步骤3.3.3：将步骤3.3.2平衡后的塑料试管置于离液氮7.5cm高的平板上冷冻10min，然后放入液氮中进行长期保存。
105.冻存大熊猫精液的标签须详细记录精液的来源、基本信息、遗传背景、日期、含量、精子品质和冻存方法等，并留档案。
106.装有大熊猫冻精的液氮罐须放置于平整、避光、安全的场所。应有负责检查液氮罐中液氮剩余量并及时补充。做好记录。冻精的运输应置于液氮充足的液氮罐内，运输过程中避免强烈震动。
107.步骤4：使用步骤3储存的雄性秦岭大熊猫精液，进行雌性秦岭大熊猫的人工授精，具体操作为：
108.准备工作：
109.年龄达到性成熟(野生7.5岁，圈养4.5岁)、处于发情季节(一般为春季2-5月)的健康未孕雌性大熊猫。圈养雌性大熊猫应在本场内30d以上，具有依照ly/t 2896-2017建立的种群遗传档案，并具有详细完整的基本资料、免疫、驱虫、检查检疫的记录。
110.对雌性秦岭大熊猫的临床检查，定期观察运动、精神、呼吸、饮食状况，检查粪便情况。大熊猫正常时，会出现定期或有规律性地排出白色或黄色的粘稠状液体的生理现象。
111.对雌性秦岭大熊猫的发情鉴定，一般于每年春季2-5月份，可以观察到雌性大熊猫短暂的发情特征，如叫声变化，出现嗅觉标记，外阴发生变化，活动量增加等。雌性大熊猫发情期高潮为2-6天，最佳配种时间为12小时。
112.对雌性秦岭大熊猫的人工授精麻醉前准备和人工授精场地的准备，准备的要求和过程与雄性秦岭大熊猫相同。
113.所有接触精液和雌性大熊猫生殖道的输精用器具都应严格清洗和消毒。
114.将采集的大熊猫精液品系信息与依据ly/t 2896-2017建立的待配雌性大熊猫种群遗传档案进行对比调查，排除近亲和遗传疾病，选取合适品系的进行人工授精。
115.和雄性秦岭大熊猫相同的操作，雌性秦岭大熊猫的麻醉保定，然后雌性秦岭大熊猫保持仰卧姿势，轻微前低后高。
116.对雌性秦岭大熊猫的生殖器官检查，检查待配雌性大熊猫外阴是否正常，是否有
多量异常分泌物。
117.冷冻雄性秦岭大熊猫精液的解冻，冷冻后的雄性秦岭大熊猫精液应可在任意时间进行解冻。若使用冷冻精液进行授精，则将冻精置于37℃水浴中摇晃解冻45-60s，然后将精液稀释于解冻液中，取少量精液检查品质，检查的操作同步骤2。
118.步骤4.1：操作人员寻找雌性大熊猫阴部，使用37℃0.1％新洁尔灭清洗雌性秦岭大熊猫的外阴和肛门部，然后使用37℃灭菌生理盐水冲洗至无消毒剂残留；
119.步骤4.2：将球式玻璃输精器用于颗粒冷冻精液的输精，输精前，在输精器后端装上橡胶头，手捏橡胶头吸取精液。
120.金属输精器用于细管冷冻精液的输精，剪去细管精液封口，剪口应正，断面应齐。将剪去封口的细管精液迅速装入输精器管内。步骤为：剪去封口端的为前端，将输精器推杆后推，细管装至管内，输精器管进入塑料外套管，管口紧顶外套管中固定圈，输精器管前推到头，外套管后部与输精器后部螺纹外拧紧，全部结合要紧密。
121.步骤4.3：找到雌性秦岭大熊猫阴部，透明玻璃制成的量筒状开腔器插入雌性秦岭大熊猫阴道端的端口平滑部；
122.步骤4.4：将输精器插入雌性大熊猫阴道，位置不易过深或过浅，注入精液前略后退约0.5cm，缓慢注入精液。输精管抽出前防治精液倒吸。
123.人工授精的时间及次数需要根据雌性个体的具体情况，雌性秦岭大熊猫的发情高潮约为2-3d。
124.步骤4.5：做好人工授精记录，详细准确记录雌性雄性信息、使用精液信息、精液来源大熊猫信息、日期、授精次数。
125.人工授精后，保持场所安静温暖，持续观察，待雌性秦岭大熊猫自然苏醒。若60min内未苏醒，则通知相关兽医人员及时检查。
126.以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。