加载均一浓度活性粒子的神经导管的制备方法及神经导管

1.本发明涉及生物材料技术领域，进一步地说，是涉及一种加载均一浓度活性粒子的神经导管的制备方法及神经导管。


背景技术：

2.以往使用的桥接周围神经损伤的神经导管主要有硅胶管、聚乙烯、聚氯乙烯以及聚四氟乙烯等不可降解的惰性材料制成神经导管植入人体内，引起慢性的异物反应，容易引发并发症，如炎症反应、神经纤维化等，需要二次手术才能将神经导管取出，手术成本较高，且不利于病人的身体健康。因此选择可降解的组织工程神经导管修复周围神经损伤日渐迫切。目前临床上可用的神经导管材料多为天然以及人工合成的可降解的高分子聚合物材料两类；与天然高分子聚合物相比较，人工合成的可降解高分子聚合物成本低、材料易得、及其无潜在的病毒传染等。目前，常用的人工合成的可降解高分子聚合物，如聚乳酸、聚己内酯、聚羟基乙酸等已得到美国食品药品管理局许可。
3.目前，仅十余种可降解的合成高分子聚合物材料可作为神经导管应用于周围神经的临床治疗，且大多为中空导管，主要起引导损伤的周围神经的断端桥接，并在修复完成后无毒降解的作用，由于其生物活性低且鲜有活性粒子的加载，导致周围神经损伤的修复速率较慢。
4.神经轴突的伸展和细胞的迁移是周围神经修复的必要过程，所以，引导轴突从近端向远端伸展以建立新的轴突可以有效的帮助周围神经功能的恢复。因此，增加周围神经轴突的伸展、促进神经细胞的迁移是神经组织工程支架设计中需要考虑的必要问题。神经生长因子对周围神经的再生具有深远的影响，在周围神经损伤时大量表达，以支持神经细胞存活和轴突再生以修复周围神经损伤；但是神经营养因子化学性质不稳定、体内半衰期短、活性易丧失、及其生物学功能性的有效释放量低，过度使用易产生毒副作用，不利于周围神经修复；因此，为使得神经营养因子在周围神经修复过程中有效发挥作用，需要将神经营养因子载于有效的载体之中，使之保护神经生长因子，又使得神经生长因子作用于特定的靶细胞，促进周围神经的修复与再生。综上所述，开发出生物活性较高且含有生长因子的加载的神经导管，对于拓宽神经导管的应用和提高修复周围神经损伤的速率极为重要。


技术实现要素：

5.为解决现有技术中出现的问题，本发明提供了一种加载均一浓度活性粒子的神经导管的制备方法及神经导管。本发明构筑具有取向结构的电纺纤维为外层，结合均一浓度的活性粒子为内层(内层是加载均一浓度活性粒子核壳结构的静电喷雾层，核层含有生长因子，壳层为天然高分子聚合物)等手段，从神经导管中持续释放所需的活性粒子；外层为取向结构的电纺纤维，起招募雪旺细胞作用；含有生长因子的活性粒子，起促进雪旺细胞迁移的作用，加载均一浓度活性粒子的神经导管起促进轴突伸展的作用以促进周围神经再生，神经导管可被降解并被新生神经取代，或在愈合后从周围神经表面降解分离。
6.本发明的中空导管为非单一的合成高分子聚合物，而是合成高分子聚合物或者天然高分子聚合物与合成高分子聚合物以提高神经导管的生物活性，加载活性粒子以促进周围神经损伤的修复速率。
7.本发明的目的之一是提供一种加载均一浓度活性粒子的神经导管的制备方法。
8.所述方法包括：
9.步骤(1)、将可降解的合成高分子聚合物或者天然高分子聚合物和可降解的合成高分子聚合物加入到溶剂a中，充分溶解，得到溶液a；
10.步骤(2)、将溶液a使用高速转动的辊筒作为接收器进行静电纺丝，得到取向结构的纤维膜；
11.步骤(3)、将天然高分子聚合物加入到溶剂b中，得到溶液b；将生长因子加入到溶剂c，得到溶液c；
12.步骤(4)、将步骤(2)中得到的取向纤维膜作为接收器，将溶液b和溶液c分别作为壳层和核层进行同轴静电喷雾，或将溶液b和溶液c混合进行单轴静电喷雾，得到单面加载均一浓度活性粒子的取向结构纤维膜；
13.步骤(5)、将步骤(4)得到的单面加载均一浓度活性粒子的取向结构纤维膜卷曲，加载活性粒子的一面为内层，用溶液a粘连，使之成管状结构，制得所述加载均一浓度活性粒子的神经导管。
14.本发明的一种优选的实施方式中，
15.步骤(1)，
16.所述溶剂a选自六氟异丙醇、三氟乙醇、三氯甲烷、甲醇、二氯甲烷、n，n'-二甲基甲酰胺中的至少一种；
17.所述可降解的合成高分子聚合物选自聚乳酸、聚己内酯、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚乳酸-羟基乙酸-己内酯共聚物中的至少一种；
18.所述的天然高分子聚合物选自胶原、明胶、壳聚糖、淀粉、纤维素、弹性蛋白中的至少一种。
19.本发明的一种优选的实施方式中，
20.步骤(1)，以可降解的合成高分子聚合物为1重量份来计，天然高分子材料的用量为0～100重量份；
21.所述的溶液a的质量浓度为6～20％，优选为6～12％；
22.本发明的一种优选实施的方式中，
23.步骤(2)，
24.溶液a推进速率为0.1～10ml/h，电压8～30kv，接收距离为10～25cm，辊筒转速为100～3000rpm；纺丝时间10～720min。
25.本发明的一种优选实施的方式中，
26.步骤(3)
27.溶剂b选自盐酸、醋酸、乙酸乙酯、丙三醇、三氟乙醇、六氟异丙醇中的至少一种；和/或，
28.溶剂c选自生理盐水、超纯水、缓冲溶液、甲醇、乙醇中的至少一种；和/或，
29.所述生长因子选自神经生长因子、血管内皮生长因子、脑源性神经生长因子、重组
人酸性成纤维细胞生长因子、神经营养因子中的至少一种；和/或，
30.所述的天然高分子聚合物选自胶原、明胶、壳聚糖、淀粉、纤维素、弹性蛋白中的至少一种。
31.本发明的一种优选实施的方式中，
32.溶液b的浓度范围是1mg/ml～200mg/ml；优选为10mg/ml～50mg/ml；
33.溶液c的浓度为10ng/ml～10mg/ml；优选为100ng/ml～1mg/ml。
34.本发明的一种优选实施的方式中，
35.步骤(4)，
36.壳层溶液和核层溶液的体积比为1：(0.2-0.6)；
37.取向结构的纤维膜与壳层溶液用量比为:1g:1g：(1-60)ml。
38.本发明的一种优选实施的方式中，
39.步骤(4)，
40.同轴喷雾时，溶液b和溶液c的体积比为1：(0.1-1)；
41.单轴喷雾时，溶液b和溶液c的体积比为1：(0.1-10)；
42.取向结构的纤维膜与溶液b和溶液c的体积之和的比例为：1g：(1～60ml)。
43.同轴喷雾时，溶液b电喷溶液推进速率为0.1～10ml/h，溶液c电喷溶液推进速率为0.1～5ml/h，电压8～30kv，接收距离为8～30cm，喷雾时间1～360min；
44.单轴喷雾时，溶液b和溶液c混合后的电喷溶液推进速率为2-10ml/h，电压8～30kv，接收距离为8～30cm，喷雾时间1～360min。
45.本发明的目的之二是提供一种神经导管。
46.所述神经导管为两层结构，外层为取向结构的电纺纤维；内层是加载活性粒子均一浓度核壳结构。
47.本发明的一种优选的实施方式中，
48.神经导管的外径为0.5-3.0mm。
49.本发明具体可采用以下技术方案：
50.本发明所述的制备方法具体包括以下步骤：
51.步骤(1)、将可降解的合成高分子聚合物或者天然高分子聚合物和可降解的合成高分子聚合物加入到溶剂a中，充分溶解，得到溶液a；
52.步骤(2)、将溶液a使用高速转动的辊筒作为接收器进行静电纺丝，得到取向结构的纤维膜；
53.步骤(3)、将天然高分子聚合物加入到溶剂b中，得到溶液b；将生长因子加入到溶剂c，得到溶液c；
54.步骤(4)、将步骤(2)中得到的取向纤维膜作为接收器，将溶液b和溶液c分别作为壳层和核层进行同轴静电喷雾，或将溶液b和溶液c混合进行单轴静电喷雾，得到单面加载均一浓度活性粒子的取向结构纤维膜；
55.步骤(5)、将步骤(4)得到的单面加载均一浓度活性粒子的取向结构纤维膜卷曲，加载活性粒子的一面为内层，用溶液a粘连，使之成管状结构，制得所述加载均一浓度活性粒子的神经导管。
56.所述的静电喷雾得到的纳米纤维膜还需要静置于通风橱中，晾2-3天，以脱除溶
剂。
57.在构筑神经导管类型的选择上，由于其类细胞外基质结构的特性，静电纺丝纤维备受关注。多种材料均可通过静电纺丝技术制备形成神经导管以用于周围神经损伤的修复，例如天然高分子聚合物如胶原、明胶、壳聚糖等及合成高分子聚合物如聚己内酯、聚乳酸、聚氨酯等。单一聚合物的纺丝纤维形成的中空导管往往生物活性较低且鲜少生物活性粒子，无法较好的修复周围神经的损伤，因此通过调控纺丝纤维的表面拓扑结构和功能性，加入促进修复生长因子或载药药物并实现可控释放是提高周围神经损伤的修复效果的关键及目前的研究热点。本发明在调控纤维拓扑结构方面，有序取向纤维可以通过表面接触诱导效应招募细胞，核壳结构中的壳层为天然高分子聚合物利于保护生长因子或者载药物质，能够促进细胞的迁移和轴突的伸展，神经导管表面构筑特定的粗糙结构或图案化结构也可提高周围神经损伤的修复效果。
附图说明
58.图1为实施例1步骤(2)得到的聚己内酯1ml/h取向纤维的sem图；
59.图2是实施例2步骤(2)得到的聚己内酯5ml/h取向纤维的sem图。
具体实施方式
60.下面结合具体附图及实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是以下实施例只用于对本发明的进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域技术人员根据本发明内容对本发明做出的一些非本质的改进和调整仍属本发明的保护范围。
61.实施例中所用原料均为市售。
62.实施例1
63.步骤(1).取聚己内酯溶于二氯甲烷中，室温磁力搅拌8h，得到质量浓度为12％的溶液a；
64.步骤(2).用溶液a进行静电纺丝，静电纺丝的接收器为转速为1200rpm的辊筒时，静电纺丝沉积，溶液a流动速率为1ml/h，电压18kv，接收距离为20cm，纺丝360min，静电纺丝的接收器为转速为200rpm的辊筒时，其他条件同上，共纺丝时间为720min，得到单轴取向结构的聚己内酯纤维膜；
65.步骤(3).取胶原蛋白溶解于乙酸水溶液中，室温磁力搅拌12h后充分混合，得到20mg/ml壳层溶液b，加载血管内皮生长因子溶于生理盐水的1mg/ml核层溶液c，采用同轴静电喷雾到步骤(2)得到的外层取向结构的聚己内酯纤维上，壳层电喷溶液推进速率为3ml/h，核层电喷溶液推进速率为1ml/h，电压22kv，接收距离为18cm，喷雾40min，得到加载均一浓度活性粒子的神经导管以修复周围神经损伤；壳层溶液和核层溶液的体积比为1：0.2，取向结构的纤维膜与溶液b和溶液c之和的用量比为：1g：30ml。
66.步骤(4).静电纺丝结束后，将膜在通风橱中室温放置3天，使残余溶剂充分挥发。
67.步骤(5)将膜卷曲，加载活性粒子的一面为内层，用溶液a粘连，使之成管状结构，制得所述加载均一浓度活性粒子的神经导管，神经导管外径为0.6mm。
68.实施例2
69.步骤(1).取聚己内酯溶于六氟异丙醇中，室温磁力搅拌12h，得到质量浓度为10％
的溶液a；
70.步骤(2).用溶液a进行静电纺丝，静电纺丝的接收器为转速为800rpm的辊筒时，静电纺丝沉积，溶液a流动速率为5ml/h，电压15kv，接收距离为15cm，纺丝400min，静电纺丝的接收器为转速为100rpm的辊筒时，其他条件同上，共纺丝时间为800min，得到单轴取向结构的聚己内酯纤维膜；
71.步骤(3).取明胶溶解于乙酸水溶液中，室温磁力搅拌12h后充分混合，得到30mg/ml溶液b，加载神经生长因子溶于生理盐水的核层2mg/ml溶液c，采用同轴静电喷雾到步骤(2)得到的外层取向结构的聚己内酯纤维上，壳层电喷溶液推进速率为1.5ml/h，核层电喷溶液推进速率为0.5ml/h，电压20kv，接收距离为15cm，喷雾35min，得到加载均一浓度活性粒子的神经导管以修复周围神经损伤，壳层溶液和核层溶液的体积比为1：0.25；取向结构的纤维膜与溶液b和溶液c之和的用量比为：1g：40ml。
72.步骤(4).静电纺丝结束后，将纺丝膜在通风橱中室温放置3天，使残余溶剂充分挥发。
73.步骤(5)将膜卷曲，加载活性粒子的一面为内层，用溶液a粘连，使之成管状结构，制得所述加载均一浓度活性粒子的神经导管，神经导管的外径为0.8mm。
74.实施例3
75.步骤(1).取聚乳酸溶于二氯甲烷中，室温磁力搅拌24h，得到质量浓度为10％的溶液a；
76.步骤(2).用溶液a进行静电纺丝，静电纺丝的接收器为转速为1500rpm的辊筒时，静电纺丝沉积，溶液a流动速率为2ml/h，电压18kv，接收距离为20cm，纺丝480min，静电纺丝的接收器为转速为150rpm的辊筒时，其他条件同上，共纺丝时间为960min，得到单轴取向结构的聚乳酸纤维膜；
77.步骤(3).取胶原溶解于乙酸水溶液中，室温磁力搅拌24h后充分混合，得到40mg/ml壳层溶液b，加载神经生长因子溶于去离子水的3mg/ml核层溶液c，采用同轴静电喷雾到步骤(2)得到的外层取向结构的纤维上，壳层电喷溶液推进速率为2ml/h，核层电喷溶液推进速率为0.4ml/h，电压25kv，接收距离为30cm，喷雾10min，得到加载均一浓度活性粒子的神经导管以修复周围神经损伤，壳层溶液和核层溶液的体积比为1：0.3；取向结构的纤维膜与溶液b和溶液c之和的用量比为：1g：20ml；
78.步骤(4).静电纺丝结束后，将纺丝膜在通风橱中室温放置3天，使残余溶剂充分挥发；
79.步骤(5).将膜卷曲，加载活性粒子的一面为内层，用溶液a粘连，使之成管状结构，制得所述加载均一浓度活性粒子的神经导管，神经导管的外径为1.0mm。
80.实施例4
81.步骤(1).取聚乳酸溶于三氟乙醇中，室温磁力搅拌20h，得到质量浓度为12％的溶液a；
82.步骤(2).用溶液a进行静电纺丝，静电纺丝的接收器为转速为2800rpm的辊筒时，静电纺丝沉积，溶液a流动速率为3ml/h，电压24kv，接收距离为20cm，纺丝420min，静电纺丝的接收器为转速为180rpm的辊筒时，其他条件同上，共纺丝时间为840min，得到单轴取向结构的聚合物纤维膜；
83.步骤(3).取明胶溶解于乙酸水溶液中，室温磁力搅拌12h后充分混合，得到20mg/ml溶液b，加载脑源性神经生长因子、重组人酸性成纤维细胞生长因子溶于去离子水的4mg/ml核层溶液c，采用同轴静电喷雾到步骤(2)得到的外层取向结构的纤维上，壳层电喷溶液推进速率为4ml/h，核层电喷溶液推进速率为2ml/h，电压22kv，接收距离为15cm，喷雾50min，得到加载均一浓度活性粒子的神经导管以修复周围神经损伤，壳层溶液和核层溶液的体积比为1：0.4；取向结构的纤维膜与溶液b和溶液c之和的用量比为：1g：50ml；
84.步骤(4).静电纺丝结束后，将纺丝膜在通风橱中室温放置3天，使残余溶剂充分挥发；
85.步骤(5)将膜卷曲，加载活性粒子的一面为内层，用溶液a粘连，使之成管状结构，制得所述加载均一浓度活性粒子的神经导管，神经导管的外径为1.25mm。
86.实施例5
87.步骤(1).取聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶于n，n'-二甲基甲酰胺中，室温磁力搅拌16h，得到质量浓度为11％的溶液a；
88.步骤(2).用溶液a进行静电纺丝，静电纺丝的接收器为转速为2800rpm的辊筒时，静电纺丝沉积，溶液a流动速率为3ml/h，电压18kv，接收距离为20cm，纺丝300min，静电纺丝的接收器为转速为300rpm的辊筒时，其他条件同上，共纺丝时间为600min，得到单轴取向结构的聚合物纤维膜；
89.步骤(3).取层粘连蛋白、纤连蛋白溶解于乙酸水溶液中，室温磁力搅拌16h后充分混合，得到30mg/ml壳层溶液b，加载血管内皮生长因子溶于去离子水的5mg/ml核层溶液c，采用同轴静电喷雾到步骤(2)得到的外层取向结构的纤维上，壳层电喷溶液推进速率为5ml/h，核层电喷溶液推进速率为2.5ml/h，电压25kv，接收距离为30cm，喷雾35min，得到加载均一浓度活性粒子的神经导管以修复周围神经损伤，壳层溶液和核层溶液的体积比为1：0.5；取向结构的纤维膜与溶液b和溶液c之和的用量比为：1g：45ml；
90.步骤(4).静电纺丝结束后，将纺丝膜在通风橱中室温放置3天，使残余溶剂充分挥发。
91.步骤(5)将膜卷曲，加载活性粒子的一面为内层，用溶液a粘连，使之成管状结构，制得所述加载均一浓度活性粒子的神经导管,神经导管的外径为1.6mm。
92.实施例6
93.步骤(1).取聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶于n，n'-二甲基甲酰胺中，室温磁力搅拌24h，得到质量浓度为8％的溶液d；
94.步骤(2).用溶液a进行静电纺丝，静电纺丝的接收器为转速为2000rpm的辊筒时，静电纺丝沉积，溶液a流动速率为2ml/h，电压12kv，接收距离为20cm，纺丝250min，静电纺丝的接收器为转速为250rpm的辊筒时，其他条件同上，共纺丝时间为500min，得到单轴取向结构的聚合物纤维膜；
95.步骤(3).取层粘连蛋白、纤连蛋白溶解于乙酸水溶液中，室温磁力搅拌12h后充分混合，得到10mg/ml溶液b，加载脑源性神经生长因子、重组人酸性成纤维细胞生长因子溶于去离子水的6mg/ml核层溶液c，采用同轴静电喷雾到步骤(2)得到的外层取向结构的纤维上，壳层电喷溶液推进速率为1.5ml/h，核层电喷溶液推进速率为0.5ml/h，电压18kv，接收距离为20cm，喷雾30min，得到加载均一浓度活性粒子的神经导管以修复周围神经损伤，壳
层溶液和核层溶液的体积比为1：0.6；取向结构的纤维膜与溶液b和溶液c之和的用量比为：1g：35ml；
96.步骤(4).静电纺丝结束后，将纺丝膜在通风橱中室温放置3天，使残余溶剂充分挥发；
97.步骤(5)将膜卷曲，加载活性粒子的一面为内层，用溶液a粘连，使之成管状结构，制得所述加载均一浓度活性粒子的神经导管,神经导管的外半径1.5mm。