一种六耳铃杀线虫剂、制备方法及其应用

1.本发明属于植物及其应用领域，具体涉及一种六耳铃杀线虫剂、制备方法及其应用。


背景技术：

2.南方根结线虫meloidogyne incognita(kofold&white)chitwood，为垫刃目，异皮科，根结线虫属，是一种重要的寄生线虫，寄主范围很广，可以危害几百种植物。根结线虫病发病较轻时，植株地上部分并无明显变化，所以不易察觉，发病严重时，植株叶片变黄、萎蔫，植株矮小，果实产量下降，品质降低，甚至植株死亡。因其适应力、繁殖力强，隐蔽性强，药剂的抗性问题等特点，根结线虫的防治十分困难。据数据统计显示，南方根结线虫每年引起的植物病害，会直接或间接造成全世界不同行业的经济损失约500亿，是现在危害农业、园艺等生产活动中十分严重的病虫害之一。
3.马铃薯茎线虫ditylenchus destructor thorne，为垫刃目，粒科，茎线虫属，是一种重要的寄生线虫，其寄主植物为马铃薯和甘薯，但在我国危害以甘薯为主，且南北薯区均有发生。马铃薯茎线虫只危害寄主的地下部分，被侵染的甘薯组织腐烂，变干，皱缩，表皮龟裂，内部组织逐渐变黑，通常会伴随真菌、细菌、螨虫的二次侵染。近年来，茎线虫病逐年加重，对甘薯的生产造成严重威胁，已经成为制约我国甘薯生产的三大严重病害之一，一般发病田块减产20％～50％，重病田块基本绝产无收。
4.六耳铃(blumea laciniata)为菊科，艾纳香属草本植物。六耳铃(b.laciniata)分布于云南、贵州、广西、广东、福建及台湾等省区。印度、不丹、锡金、巴基斯坦、斯里兰卡、缅甸、中南半岛、马来西亚、菲律宾、印度尼西亚、巴布亚新几内亚和所罗门群岛及夏威夷也有分布。生于田畦、草地、山坡及河边、林缘，海拔400～800米。全草辛、苦，温，祛风除湿，通经活络，用于风湿痹痛，头痛，跌打肿痛，湿疹，毒蛇咬伤。
5.关于六耳铃(b.laciniata)及其代谢产物对农业生产上病、虫、草害的作用目前报道很少。上世纪90年代有报道六耳铃(b.laciniata)对丁香假单胞细菌具有抑菌作用(srivastava,ujjwal&jaiswal,anil.(1993).morphogenetic effect of a juvenoid active component from blumea laciniata roxb.on the ovary of dysdercus cingulatus fab.journal of entomological research.17.309-312.)，以上只是在实验室内测定结果，且至今未见对其展开系统的农用活性作用研究，没有形成产品，不能应用于农业生产。


技术实现要素：

6.在发现了六耳铃提取物对线虫具有良好的毒杀活性后，发明人推断其可以制成有效的杀线虫剂，因此，本发明的目的在于以六耳铃(b.laciniata)为原料，研究出杀线虫效果高、无公害、价格低廉的植物源杀线虫剂及其制备方法，具体为一种六耳铃杀线虫剂、制备方法及其应用。
7.为达到上述目的，本发明采取的技术方案为：
8.六耳铃提取物用于制备杀线虫剂的应用。
9.可选的，所述的杀线虫剂中含有质量百分含量为10％～30％的六耳铃提取物。
10.可选的，所述的六耳铃提取物的制备方法包括：
11.六耳铃提取物为六耳铃粉碎后经有机溶剂浸提得到相当于1kg干粉/kg的浓缩液；
12.有机溶剂浸提的方式为超声提取法，浸提温度为30℃，浸提的时间为0.5～1小时，六耳铃与有机溶剂的质量比为1:(5～10)。
13.一种六耳铃杀线虫剂，该杀线虫剂以六耳铃提取物为主成分，六耳铃提取物的质量百分含量为10％～30％。
14.可选的，所述的六耳铃提取物为六耳铃粉碎后经有机溶剂浸提得到相当于1kg干粉/kg的浓缩液。
15.可选的，所述的有机溶剂浸提的方式为超声提取法，浸提温度为30℃，浸提的时间为0.5～1小时，六耳铃茎碎物与有机溶剂的质量比为1:(5～10)。
16.可选的，六耳铃粉碎后的粒径为1～5mm；所述的有机溶剂为甲醇。
17.可选的，该杀线虫剂的制剂形态是可溶性液剂，可溶性液剂的助剂包括：
18.有机溶剂：0～30％，表面活性剂：5％～30％，防冻剂：4％～10％，余量为水，主成分与助剂的重量百分比之和为100％；
19.所述的有机溶剂为乙酸乙酯、环己酮、油酸甲酯、乙醇、甲醇、异丙醇和二甲基甲酰胺中的一种或几种的混合物；
20.所述的表面活性剂为烷基苯磺酸盐类、烷基酚聚氧乙烯醚类、苯乙基酚聚氧乙烯醚类、苯乙基酚聚氧乙烯醚聚氧丙烯醚类及其类似物质、蓖麻油与环氧乙烷的加成物和芳烷基酚聚氧乙烯醚甲醛缩合物中一种或几种的混合物；
21.所述的防冻剂为乙二醇或丙三醇。
22.可选的，该杀线虫剂的制剂形态是微乳剂，所述的微乳剂的助剂包括：
23.有机溶剂：0～30％，表面活性剂：5％～20％，防冻剂：5％～10％，余量为水，主成分与助剂的重量百分比之和为100％；
24.所述的有机溶剂为乙酸乙酯、环己酮、油酸甲酯、乙醇、甲醇、异丙醇和二甲基甲酰胺中的一种或几种的混合物；
25.所述的表面活性剂为烷基苯磺酸盐类、烷基酚聚氧乙烯醚类、苯乙基酚聚氧乙烯醚类、苯乙基酚聚氧乙烯醚聚氧丙烯醚类及其类似物质、蓖麻油与环氧乙烷的加成物和芳烷基酚聚氧乙烯醚甲醛缩合物中一种或几种的混合物；
26.所述的防冻剂为乙二醇或丙三醇。
27.本发明任一所述的六耳铃杀线虫剂的制备方法，包括：
28.a.将六耳铃粉碎至1～5mm的粗粉碎物；
29.b.将步骤a所得的粗粉碎物用甲醇浸提，粗粉碎物与甲醇的质量比为1:(5～10)，提取方式为超声提取法，提取温度为30℃，提取时间为0.5～1小时，反复提取三次，浸提物经真空浓缩至相当于1kg干粉/kg浓缩液；
30.c.将步骤b所得的浓缩液按配方量与助剂混配即得各剂型的杀线虫剂。
31.本发明所制成的六耳铃提取物杀线虫剂具有以下优点：
32.杀线虫活性显著，不仅可用于番茄、南瓜和黄瓜等作物上南方根结线虫m.incognita的防治，还可用于马铃薯、甘薯等作物上马铃薯茎线虫d.destructor的防治。对人、畜、害虫天敌及其它有益生物安全，环境兼容性好。生物源农药，使用后无残留毒害。制备方法简单、成本低廉、适宜推广使用。
具体实施方式
33.下面结合具体实施方案对本发明的技术方案作进一步详细地说明。
34.本发明的植物源杀线虫剂，以六耳铃提取物为活性物质，加入一定比例助剂进行剂型加工，可以制得环保型制剂微乳剂和可溶性液剂。经发明人的试验证明，20％六耳铃提取物微乳剂和20％六耳铃提取物可溶性液剂对南方根结线虫和马铃薯茎线虫具有良好的防治效果。本发明中的六耳铃提取物采用超声溶剂浸提，超声频率为植物提取领域常用的超声频率，超声频率的改变不会对提取物的成分产生影响，且本发明中使用的原料或助剂均为市场上购买的品种。本发明中使用的六耳铃为草本植物，提取时使用其全草。
35.六耳铃提取物用于制备杀线虫剂的应用。杀线虫剂中含有质量百分含量为10％～30％的六耳铃提取物。六耳铃提取物的制备方法包括：六耳铃提取物为六耳铃粉碎后经有机溶剂浸提得到相当于1kg干粉/kg的浓缩液；有机溶剂浸提的方式为超声提取法，浸提温度为30℃，浸提的时间为0.5～1小时，六耳铃与有机溶剂的质量比为1:(5～10)。六耳铃粉碎后的粒径为1～5mm；所述的有机溶剂为甲醇。
36.一种六耳铃杀线虫剂，该杀线虫剂以六耳铃提取物为主成分，六耳铃提取物的质量百分含量为10％～30％。
37.该杀线虫剂的制剂形态是可溶性液剂，可溶性液剂的助剂包括：
38.有机溶剂：0～30％，表面活性剂：5％～30％，防冻剂：4％～10％，余量为水，主成分与助剂的重量百分比之和为100％；有机溶剂为乙酸乙酯、环己酮、油酸甲酯、乙醇、甲醇、异丙醇和二甲基甲酰胺中的一种或几种的混合物；表面活性剂为烷基苯磺酸盐类、烷基酚聚氧乙烯醚类、苯乙基酚聚氧乙烯醚类、苯乙基酚聚氧乙烯醚聚氧丙烯醚类及其类似物质、蓖麻油与环氧乙烷的加成物和芳烷基酚聚氧乙烯醚甲醛缩合物中一种或几种的混合物；防冻剂为乙二醇或丙三醇。
39.该杀线虫剂的制剂形态是微乳剂，所述的微乳剂的助剂包括：有机溶剂：0～30％，表面活性剂：5％～20％，防冻剂：5％～10％，余量为水，主成分与助剂的重量百分比之和为100％；
40.本发明的六耳铃杀线虫剂的制备方法，包括：a.将六耳铃粉碎至1～5mm的粗粉碎物；b.将步骤a所得的粗粉碎物用甲醇浸提，粗粉碎物与甲醇的质量比为1:(5～10)，提取方式为超声提取法，提取温度为30℃，提取时间为0.5～1小时，反复提取三次，浸提物经真空浓缩至相当于1kg干粉/kg浓缩液；c.将步骤b所得的浓缩液按配方量与助剂混配即得各剂型的杀线虫剂。
41.为了更好的理解发明的实质，下面用实施例来详细说明发明的技术内容，但发明并不局限于这些实施例。
42.六耳铃甲醇提取物的提取方法包括：
43.a.将六耳铃用植物粉碎机粉碎至1～5mm的粗粉碎物。
44.b.将步骤a所得的粗粉碎物用甲醇浸提(粗粉碎物与甲醇的质量比为1:5～1:10)，提取方式为超声提取，提取温度为30℃，提取时间为0.5～1小时，浸提物经真空浓缩至相当于1kg干粉/kg浓缩液。
45.以下实施例中所用的六耳铃浓缩物即为六耳铃甲醇提取物，相当于1kg干粉/kg浓缩液。
46.六耳铃甲醇提取物对线虫的室内生物测定的方法和结果
47.采用药液浸泡法测定，选取生长健康、大小均匀的线虫为供试线虫，测定六耳铃提取物药液的毒杀活性。试验在24孔细胞培养板内进行，先将同样体积(v1)定容好的线虫悬浮液注入样品孔内，再根据试验浓度[按式(3)计算]需要补充添加的无菌水(v2),最后加入相应量的药剂母液(v3)，混合均匀，置于25℃培养箱中，每处理3个重复，每重复50～100条线虫，以甲醇处理为对照。处理后24h，48h，分别检查各处理的线虫死亡与存活情况，按式(1)和式(2)分别计算线虫死亡率和线虫的校正死亡率。
[0048]
线虫死活的判断方法:在显微镜下观察，虫体正在游动和虫体呈“s”型的记为存活，呈“直线”型和呈“半月”型的线虫，用睫毛不停的触动虫体，触动后明显改变形态的线虫记为存活，否则记为死亡。
[0049][0050][0051][0052]
(注：v＝线虫悬浮液的体积v1 补充无菌水体积v2 药剂母液体积v3,试验中n是事先设定的；为保证处理线虫数量的一致性，v1也是固定的，如v1＝100μl，n0是己知的，那么将v固定，一般v＝400μl据此可以得出不同处理的v2，v3)。
[0053]
采用药液浸泡法测定六耳铃提取物对线虫的毒杀活性，并绘制毒力曲线，其结果见表1和表2。
[0054]
表1六耳铃甲醇提取物对2种线虫的毒杀作用
[0055][0056]
表2六耳铃甲醇提取物对线虫毒杀活性的毒力曲线
[0057][0058]
由上述表格可知，六耳铃甲醇提取物对马铃薯茎线虫和南方根结线虫具有较强的毒杀活性，200mgdw/ml处理马铃薯茎线虫，48h的校正死亡率约为80％；200mgdw/ml处理南方根结线虫，48h的校正死亡率达到90％以上。马铃薯茎线虫24h和48h的lc
50
分别为73.885、74.337mgdw/ml；南方根结线虫24h和48h的lc
50
分别为75.761、45.498mgdw/ml。
[0059]
实施例1 20％六耳铃提取物微乳剂的配制
[0060]
称取六耳铃浓缩物20kg，溶解于30kg甲醇中，再加入15kg十二烷基苯磺酸钙，5kg苯乙烯酸聚氧乙烯醚，5kg乙二醇，在高速搅拌下混和，加热至40℃左右；高速搅拌下滴加去离子水25kg，控制水的滴加速度，使温度保持在40℃左右；水滴加完毕，升温至50℃，搅拌1小时，制得20％六耳铃提取物微乳剂100kg。制剂的稳定性、外观等符合商品制剂的要求。
[0061]
实施例2 20％六耳铃提取物可溶性液剂的配制
[0062]
称取六耳铃浓缩物20kg，溶解于30kg甲醇中，搅拌下加入15kg十二烷基苯磺酸钠、4kg乙二醇、0.3kg聚乙烯醇，去离子水补齐至100kg，混合均匀后，以搅拌速度800～1000转/分钟搅拌10～30分钟，即可制得六耳铃提取物可溶性液剂100kg。制剂的稳定性、外观等符合商品制剂的要求。
[0063]
实施例3实施例1-2六耳铃提取物制剂对南方根结线虫的田间防效实验结果
[0064]
1、供试药剂
[0065]
六耳铃提取物微乳剂，实施例1中的六耳铃提取物微乳剂
[0066]
六耳铃提取物可溶性液剂，实施例2六耳铃提取物可溶性液剂
[0067]
41.7％氟吡菌酰胺悬浮剂(拜耳作物科学(中国)有限公司北京分公司)
[0068]
2、供试作物
[0069]
番茄，品种为“精品毛粉802”[0070]
3、防治对象
[0071]
南方根结线虫(meloidogyne incognita)
[0072]
4、试验地块的选择与试验处理
[0073]
4.1试验地块的选择
[0074]
此试验设在陕西杨凌区杨村乡大寨村大棚蔬菜基地进行，选择发病有代表性的番茄地块作试验地，前茬种植番茄，南方根结线虫发生均匀单一且严重，其他病虫害轻微，沙壤土质，土壤质地较轻，养分含量较高，正常肥水管理。
[0075]
4.2试验处理与小区设计
[0076]
供试药剂为六耳铃提取物微乳剂100
×
、300
×
、500
×
；六耳铃提取物可溶液剂100
×
、300
×
、500
×
；41.7％氟吡菌酰胺悬浮剂1500
×
和空白对照(清水)共八种处理。试验小区采用随机区组排列，每小区面积为25m2，重复3次。
[0077]
4.3施药方法
[0078]
处理前灌溉各个小区，保证土壤含水量达饱和持水量的60％～70％，施药前旋耕土壤，旋耕土层深度20～30cm，将药剂按照设计用量均匀撒施在土壤表面后再次旋耕，使药剂与土壤充分混匀后移栽番茄。分别以41.7％氟吡菌酰胺悬浮剂1500
×
和清水处理作为药剂对照和空白对照，相同并正常水肥管理。试验期间大棚内气温偏低，最高温度30℃，最低温度20℃。两个月后取样调查。
[0079]
4.4调查方法
[0080]
采用随机取样，每小区取5点，每点5株，以下述标准查看每株番茄的根结数，并记录分级。分级方法如表3：
[0081]
表3根结分级标准
[0082][0083]
按照下述公式计算防治效果：
[0084]
根结指数(％)＝{∑[(病级株数
×
相应级数值)]/总株数
×
9}
×
100；
[0085]
防治效果(％)＝[(对照区的根结指数-药剂处理区的根结指数)/对照区的根结指数]
×
100。
[0086]
5、试验结果与统计
[0087]
测定了20％六耳铃提取物微乳剂和20％六耳铃提取物可溶性液剂对南方根结线虫的防治效果，结果见表4。
[0088]
表4 2种六耳铃提取物杀线虫制剂对南方根结线虫的防治效果
[0089][0090]
注：表中数据为3次重复的平均值；“防效”栏中，同列数值后相同字母是指在α＝
0.05水平上差异不显著(dmrt法)。(下表同)
[0091]
从表4可知，2种六耳铃提取物制剂对南方根结线虫的防治效果与对照药剂无明显差异，20％六耳铃提取物可溶性液剂100倍稀释液、300倍稀释液和20％六耳铃提取物微乳剂100倍稀释液防治效果超过80％。从经济、环保上讲，推荐使用以上2种六耳铃提取物制剂防治南方根结线虫。
[0092]
实施例4实施例1-2六耳铃提取物制剂对马铃薯茎线虫的田间防效实验结果
[0093]
1、供试药剂
[0094]
六耳铃提取物微乳剂，实施例1中的六耳铃提取物微乳剂
[0095]
六耳铃提取物可溶性液剂，实施例2六耳铃提取物可溶性液剂
[0096]
1.8％阿维菌素乳油(江苏苏灵农药化工有限公司)
[0097]
2、供试作物
[0098]
马铃薯，品种为“紫花白”[0099]
3、防治对象
[0100]
马铃薯茎线虫(ditylenchus destructor)
[0101]
4、试验地块的选择与试验处理
[0102]
4.1试验地块的选择
[0103]
此试验设在陕西省渭南市大荔现代农业园区内温室进行，选择发病有代表性的马铃薯地块作试验地，前茬种植马铃薯，马铃薯茎线虫发生均匀单一且严重，其他病虫害轻微，沙壤土质，土壤质地较轻，养分含量较高，正常肥水管理。
[0104]
4.2试验处理与小区设计
[0105]
供试药剂为六耳铃提取物微乳剂100
×
、300
×
、500
×
；六耳铃提取物可溶液剂100
×
、300
×
、500
×
；1.8％阿维菌素乳油1000
×
和空白对照(清水)共八种处理。试验小区采用随机区组排列，每小区面积为25m2，重复3次。
[0106]
4.3施药方法
[0107]
处理前灌溉各个小区，保证土壤含水量达饱和持水量的60％～70％，施药前旋耕土壤，旋耕土层深度20～30cm，将药剂按照设计用量均匀撒施在土壤表面后再次旋耕，使药剂与土壤充分混匀后定植。分别以1.8％阿维菌素乳油1000
×
和清水处理作为药剂对照和空白对照，相同并正常水肥管理。试验期间大棚内气温偏低，最高温度30℃，最低温度20℃。45天后取样调查。
[0108]
4.4调查方法
[0109]
采用“z”字型取样法取样，每区取5个样点，取样深为0～10cm、10～20cm、20～30cm，土钻直径2.5cm。每次取200ml土，采用浅盘法分离线虫，用60℃的温水杀死线虫，用甲醛固定线虫，计算虫口减退率。
[0110]
在薯块收获期，试验区各小区进行5点取样，每点取10个薯块，逐块横切，按照其横切面的发病程度进行分级:
[0111]
0级：无病症(无糠心及龟裂)；
[0112]
1级：发病面积占横切面的25％以下；
[0113]
2级：发病面积占横切面的25％～50％；
[0114]
3级：发病面积占横切面的50％～75％；
[0115]
4级：发病面积占横切面的75％以上。
[0116]
记录各级别薯块的块数，计算病情指数、发病率与防治效果。计算公式如下：
[0117]
虫口减退率＝(处理前虫口数－处理后虫口数)/处理前虫口数
×
100％；
[0118]
病情指数＝[∑(病级数值
×
相应级别的薯块数)]/(调查总薯块数
×
最高病级值)
×
100；
[0119]
防治效果＝(对照区病情指数－处理区病情数)/对照区病情指数
×
100％；
[0120]
5、试验结果与统计
[0121]
测定了20％六耳铃提取物微乳剂和20％六耳铃提取物可溶性液剂对马铃薯茎线虫的防治效果，结果见表5：
[0122]
表5 2种六耳铃提取物杀线虫制剂对马铃薯茎线虫的防治效果
[0123][0124]
从表5可知，2种六耳铃提取物制剂对马铃薯茎线虫的防治效果与对照药剂的防效无显著差异，20％六耳铃提取物可溶性液剂100倍稀释液和20％六耳铃提取物微乳剂100倍稀释液的防效为80％。2种六耳铃提取物的制剂均会降低土壤中马铃薯茎线虫的种群密度，20％六耳铃提取物可溶性液剂100倍稀释液和20％六耳铃提取物微乳剂100倍稀释液的虫口减退率超过70％。因此，推荐使用以上2种六耳铃提取物制剂防治马铃薯茎线虫。
[0125]
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。