包含氨基酸或其盐、和寡糖的植物活力剂、及其使用的制作方法

1.本发明涉及包含氨基酸或其盐、和寡糖的植物活力剂、和使用了该植物活力剂的植物的栽培/生产方法。


背景技术：

2.植物因为日照时间、气温和降雨量等非生物胁迫、以及病害虫等生物胁迫而收获量减少。特别是为了使农业作物的收获量增加，迄今为止，使用了各种肥料和农药。肥料虽然是植物的生长所需要的营养源，但不具有缓和胁迫的功能。农药虽然直接驱除寄生于植物的病害虫，排除生物胁迫，但在使用农药的情况下，虽说充分确认了安全性，但是也担心由过剩摄取引起的对人体、环境的影响，特别是通过化学合成法制造的农药等药剂一旦散布也有在土壤中等长期残存的担心，期望尽可能通过其它方法对生物胁迫赋予耐性。因此，近年来除了它们以外，作为对人体和环境都安全的物质，生物刺激素(biostimulant)的利用受到关注。
[0003]“生物刺激素”也被称为“生物刺激剂”、“植物活力剂”等，是指在含有任意物质群/微生物，并在施用于植物体、其根系的情况下，可以通过刺激在自然状态的作物体内也发生的一系列过程而使养分吸收提高，或提高施肥效率，或赋予胁迫耐性而使品质提高，并且对病害虫不显示直接作用，因此不分类到任何杀虫/杀菌剂的物质。即，是指在自然界存在的成分(包含微生物)，并且虽然不是植物激素、营养成分，但其极少量就刺激植物的活力，促进生长发育的物质。可以认为通过将生物刺激素施用于植物，从而提高植物的养分吸收和养分利用率，促进生长发育，农作物的收获量和品质变好。在农业用生物刺激素中，为了控制/增强作物的生理过程，包含施用于植物或土壤的化合物、物质和其它制品的多种多样的制剂。为了改善作物的活力、收获量、品质和收获后的保存性，生物刺激素通过与营养素不同的途径而作用于植物生理。
[0004]
这样，通过生物刺激素，不会产生以往的农药、肥料引起的问题，可以刺激植物固有的能力而促进其生长。
[0005]
作为与这样的生物刺激素相关的物质，迄今为止，报导了将几丁质寡糖与具有抗菌活性的壳聚糖等组合而成的植物活力剂(专利文献1)、在食用醋中混配了寡糖类和植物提取成分的植物活力剂(专利文献2)、包含纤维素的植物生长促进剂(专利文献3)、包含呋喃己糖衍生物的植物生长调节剂(专利文献4)、使用低分子化了的几丁质、壳聚糖而提高植物的耐病性的方法(专利文献5)、包含几丁质和/或壳聚糖等的肥料(专利文献6)、以及包含谷氨酸和脯氨酸作为构成氨基酸的植物生长促进剂(专利文献7)。
[0006]
现有技术文献
[0007]
专利文献
[0008]
专利文献1：日本特开平9-143013号公报
[0009]
专利文献2：日本特开2001-64112号公报
[0010]
专利文献3：日本特开2002-114610号公报
[0011]
专利文献4：日本特开2013-151438号公报
[0012]
专利文献5：日本特开2015-48436号公报
[0013]
专利文献6：日本特开2017-95352号公报
[0014]
专利文献7：日本特开2019-006774号公报
[0015]
专利文献8：国际公开第2017/104687号


技术实现要素：

[0016]
发明所要解决的课题
[0017]
本发明所要解决的课题是控制/增强植物的生理过程，改善农作物的活力、收获量、品质和收获后的保存性。
[0018]
用于解决课题的方法
[0019]
本技术发明者们为了解决上述课题而进行深入研究，反复进行了实验，结果发现，氨基酸或其盐与寡糖的组合使植物的生长促进并且使植物的激发子活性增大这样的令人惊讶的认识，从而完成了本发明。
[0020]
本发明如以下所述。
[0021]
[1]一种植物活力剂，其特征在于，包含氨基酸或其盐、和寡糖。
[0022]
[2]根据1所述的植物活力剂，上述寡糖为选自几丁质寡糖、纤维寡糖和木寡糖中的至少1种。
[0023]
[3]根据1或2所述的植物活力剂，包含几丁质寡糖、纤维寡糖和木寡糖的全部3种作为上述寡糖。
[0024]
[4]根据1～3中任一项所述的植物活力剂，上述氨基酸为选自甘氨酸、谷氨酸、和组氨酸中的至少1种。
[0025]
[5]根据1～4中任一项所述的植物活力剂，上述氨基酸为甘氨酸。
[0026]
[6]根据1～5中任一项所述的植物活力剂，上述植物活力剂中的上述寡糖的合计含量为0.05～10质量％。
[0027]
[7]根据1～6中任一项所述的植物活力剂，上述植物活力剂中的上述氨基酸或其盐的合计含量为2.5～30质量％。
[0028]
[8]根据1～7中任一项所述的植物活力剂，进一步包含展布剂。
[0029]
[9]一种植物栽培方法，包括将1～8中任一项所述的植物活力剂应用于植物的步骤。
[0030]
[10]根据9所述的方法，包括将上述植物活力剂以上述寡糖的合计含量成为0.1～500质量ppm的浓度应用于植物的步骤。
[0031]
[11]根据9或10所述的方法，上述植物活力剂向植物的应用通过叶面散布进行。
[0032]
[12]一种方法，是与不应用1～8中任一项所述的植物活力剂的情况相比，具有增大了的激发子活性的植物或其一部分的生产方法，包括通过9～11中任一项所述的方法来栽培植物的步骤。
[0033]
[13]根据12所述的方法，上述激发子活性通过测定植物中的葡聚糖水解酶产生量来确定。
[0034]
[14]一种肥料组合物，含有1～8中任一项所述的植物活力剂。
[0035]
发明的效果
[0036]
根据本发明，能够在不发生以往的农药、肥料引起的对人体、环境的影响这样的问题的前提下，控制/增强植物的生理过程，改善农作物的活力、收获量、品质和收获后的保存性。
具体实施方式
[0037]
在本发明的第一方案中，提供一种植物活力剂，其特征在于，包含氨基酸或其盐、和寡糖。
[0038]
本发明涉及的“植物活力剂”不仅包含具有与植物的生长发育有关的温度、光、水、和盐等非生物胁迫的缓和作用的物质，而且包含具有病害虫等生物胁迫的缓和作用的物质。
[0039]
在本发明中使用的寡糖适合为选自几丁质寡糖、纤维寡糖和木寡糖中的至少1种。本发明涉及的植物活力剂更适合包含选自几丁质寡糖、纤维寡糖和木寡糖中的2种以上作为寡糖，进一步适合包含几丁质寡糖、纤维寡糖和木寡糖的全部3种作为寡糖。
[0040]
在本发明中，几丁质寡糖作为来源于除植物以外的生物的物质，例如来源于真菌、昆虫、甲壳类的成分的激发子(即“外源性激发子”)而使用，而且，纤维寡糖和木寡糖作为来源于植物的物质的激发子(即“内源性激发子”)而使用。
[0041]
激发子是对高等植物的组织或培养细胞诱导生物体防御反应的物质的总称，在植物的免疫机制中诱导病害抗逆性。植物通过存在于叶面等的受体而感知激发子，启动病原抵抗反应。由此，引发针对各种病原菌分泌各种化合物的生物体防御作用(免疫)。可以认为如果激发子作用于植物，则诱导植保素、感染特异性蛋白质的合成/蓄积、活性氧生成、活性氮生成、过敏感反应性细胞死亡、基因表达变化等防御反应，通过这些反应而植物守护自身不受病原菌影响而提高耐病性。
[0042]
植保素是通过激发子的作用而在植物体内被合成、蓄积的抗菌性化合物，每种植物缠上的抗菌性化合物都不同。作为代表性的植保素，可举出黄酮类、萜类、脂肪酸衍生物等。活性氧具有杀病原微生物的作用，今儿活性氧和活性氮单独或协调而作为启动各种防御反应的信号发挥功能。由这样的激发子效果产生的病害抗逆性对广泛的病害使抗逆性增强等，因此期待农业利用。
[0043]
几丁质寡糖是包含进行了部分脱乙酰化的壳寡糖，且由n-乙酰葡糖胺数个相连而成的寡糖类，一般而言，通过将来源于甲壳类等的几丁质水解等而获得。也被称为寡聚-n-乙酰葡糖胺。
[0044]
即，几丁质寡糖通过将从蟹、虾等甲壳类的壳等通过常规方法而制备的几丁质进行化学或酶部分水解来获得。作为几丁质寡糖，优选使用选自n-乙酰壳二糖、n-乙酰壳三糖、n-乙酰壳四糖、n-乙酰壳五糖、n-乙酰壳六糖、n-乙酰壳七糖、n-乙酰壳八糖等中的一种或多种的混合物。它们之中n-乙酰壳五糖、n-乙酰壳六糖、n-乙酰壳七糖的激发子效果特别高。
[0045]
在本发明中使用的几丁质寡糖特别优选为具有下述化学结构的物质。
[0046][0047]
另外也包含式中的乙酰基(coch3)部分脱落，变为nh2的物质。这样的脱乙酰化的比例优选为几丁质寡糖整体的30％以下，更优选为20％以下，进一步优选为15％以下。
[0048]
纤维寡糖是多个葡萄糖通过β-糖苷键聚合而成的寡糖类，近年来发现保湿性、发粘抑制、清爽味赋予、淀粉老化减少、蛋白变性抑制等功能性，期待向医药、化妆品、食品、饲料领域的利用。特别是，葡萄糖的聚合度为3以上的纤维寡糖在上述功能性的增大、新的功能性赋予这方面被寄于更大的期待。现在工业上利用的纤维寡糖通过酶反应而制造，但主成分为葡萄糖和作为二聚体的纤维二糖，三聚体的纤维三糖以上的低聚物几乎不含有。然而，近年来，由申请人报导了在使用了碳催化剂的植物性生物质的水解反应中，通过控制升温速度、冷却速度、反应温度、反应时间而使水热反应进行来制造含有葡萄糖的聚合度为3～6的低聚物的纤维寡糖的方法(专利文献8)。
[0049]
在通过纤维素的水解反应而获得纤维寡糖的情况下，作为纤维素原料，优选使用
アビセル
(merck社制)等结晶性微粉纤维素、棉绒浆。
[0050]
在本发明中使用的纤维寡糖特别优选为具有下述化学结构的物质。
[0051][0052]
木寡糖是数个木糖通过β-糖苷键聚合而成的寡糖类，一般而言，通过作为半纤维素的主成分的木聚糖的水解而获得，主要作为食品用途而被销售。
[0053]
在本发明中使用的木寡糖特别优选为具有下述化学结构的物质。
[0054][0055]
在植物活力剂仅包含几丁质寡糖和木寡糖这2种作为寡糖的情况下，几丁质寡糖与木寡糖的含量的质量比优选为几丁质寡糖:木寡糖＝1:1～1:5，更优选为几丁质寡糖:木寡糖＝1:1.5～1:4。
[0056]
在植物活力剂仅包含几丁质寡糖和纤维寡糖这2种作为寡糖的情况下，几丁质寡糖与纤维寡糖的含量的质量比优选为几丁质寡糖:纤维寡糖＝1:1～1:5，更优选为几丁质寡糖:纤维寡糖＝1:1.5～1:4。
[0057]
在植物活力剂包含几丁质寡糖、纤维寡糖、和木寡糖这3种作为寡糖的情况下，各
寡糖相对于几丁质寡糖与纤维寡糖与木寡糖的合计含量的比例优选为几丁质寡糖10～50质量％并且纤维寡糖10～50质量％并且木寡糖10～60质量％。各寡糖的比例更优选为几丁质寡糖20～40质量％并且纤维寡糖20～40质量％并且木寡糖20～55质量％。
[0058]
在本发明中使用的氨基酸适合为选自甘氨酸、谷氨酸、和组氨酸中的至少1种，更适合为甘氨酸。
[0059]
在本发明中使用的氨基酸的盐没有特别限定，可以举出例如氨基酸的钠盐、钾盐等。作为氨基酸的盐的具体例，可以举出谷氨酸钠等。
[0060]
本发明涉及的植物活力剂可以以粉状、颗粒状、液状等的任一形态制品化，但一般而言优选为易于散布的液状。本发明涉及的植物活力剂可以作为使氨基酸或其盐、和寡糖以高浓度溶解于水等溶剂的原液而供给。在一实施方案中，植物活力剂原液中的上述寡糖的合计含量适合为0.05～10质量％，更适合为0.1～8质量％，进一步适合为0.5～6质量％。在其它实施方案中，植物活力剂原液中的上述寡糖的合计含量适合为1～15质量％，更适合为3～12质量％，进一步适合为5～10质量％。
[0061]
在一实施方案中，本发明涉及的植物活力剂原液中的上述氨基酸或其盐的合计含量适合为2.5～30质量％，更适合为5～20质量％，进一步适合为9～16质量％。在其它实施方案中，上述氨基酸或其盐的合计含量适合为10～70质量％，更适合为15～60质量％，进一步适合为20～50质量％。
[0062]
本发明涉及的植物活力剂可以进一步包含除作为活性成分的氨基酸或其盐、和寡糖以外的其它成分，例如防腐剂、展布剂、沉淀防止剂、增稠剂、赋形剂。作为防腐剂，可举出山梨酸钾、对羟基苯甲酸酯、安息香、脱氢乙酸钠、桧木醇(hinokitiol)、苯氧基乙醇、聚氨丙基双胍、聚赖氨酸等。展布剂为以表面活性剂作为主成分的粘稠的液体，只要可以作为植物活力剂的展布剂而使用，就没有特别限制，可举出例如，聚氧乙烯壬基苯基醚、失水山梨糖醇脂肪酸酯、聚氧乙烯己糖醇酐脂肪酸酯等。作为沉淀防止剂，可举出多磷酸或多磷酸的盐类、或多元羧酸型高分子表面活性剂等。作为增稠剂，可举出羧甲基纤维素(cmc)、聚丙烯酰胺、淀粉等水溶性高分子、或废糖蜜、醇发酵浓缩废液、氨基酸发酵浓缩废液等。作为赋形剂，可举出乳糖、淀粉等。
[0063]
在本发明的第二方案中，提供一种植物栽培方法，包括将本发明涉及的植物活力剂应用于植物的步骤。
[0064]
应用本发明涉及的植物活力剂的对象植物没有特别限制，典型地为农作物，可举出菊科、茄科、十字花科、禾本科、豆科、蔷薇科、葫芦科、旋花科、藜科、百合科、伞形科、锦葵科、姜科、莲科等的植物。
[0065]
具体而言，可举出白菜、甘蓝、绿花菜、花椰菜类、小松菜、日本芜菁、萝卜、芜菁等十字花科植物、马铃薯、番茄、茄、柿子椒、辣椒、小绿辣椒、烟草等茄科植物、茼蒿、莴苣、散叶莴苣、牛蒡、蜂斗菜等菊科植物、西瓜、甜瓜、南瓜、黄瓜、苦瓜、丝瓜、葫芦等葫芦科植物、菠菜、厚皮菜、莙荙菜、无翅猪毛菜、甜菜等等藜科植物、胡萝卜、芹菜、荷兰芹、鸭儿芹等伞形科植物、大豆(
エダマメ
)、赤豆、菜豆、蚕豆、豌豆、四棱豆、花生等豆科植物、番薯、蕹菜等旋花科植物、韭、葱类、洋葱、大蒜、石刁柏等百合科植物、草莓、苹果、梨、枇杷等蔷薇科植物、秋葵、棉等锦葵科植物、生姜等姜科植物、莲等莲科植物、玉米、水稻、大麦、小麦、甘蔗等禾本科植物等。
[0066]
其中，优选为甘蓝、小松菜等十字花科植物、番茄、茄等茄科植物、莴苣、散叶莴苣等菊科植物、草莓、苹果等蔷薇科植物，其中更优选为小松菜、番茄。
[0067]
本发明涉及的植物活力剂一般而言在其原液中加入水等而稀释成所希望的浓度(例如稀释成1000倍)而使用，植物活力剂中的上述寡糖的合计含量适合在成为0.1～500质量ppm的浓度下应用于植物。植物活力剂中的上述寡糖的合计含量更适合在成为0.5～200质量ppm，进一步适合在成为1～100质量ppm的浓度下应用于植物。
[0068]
植物活力剂向植物应用可以通过本行业习惯的方法进行，散布方法也没有特别限定，可以为例如，直接散布于植物的叶、茎等的方法、散布在栽培植物的培养基、土壤中的方法、混配于肥料等而散布在培养基、土壤中的方法等的任一者。另外，在混配在肥料中的情况下，作为肥料，为含有氮、磷酸、钾的化学肥料、油渣、鱼渣、骨粉、海藻粉末、糖类、维生素类等有机质肥料等，其种类没有限定。作为散布方法，特别是通过叶面散布进行在使激发子活性有效地表现方面是优选的。叶面散布可以通过本行业习惯的方法例如动力喷雾器、肩挂式喷雾器、撒播机、喷雾机、有人或无人直升机、烟雾器、手动喷雾器等进行。
[0069]
在将植物活力剂混配于肥料而散布的情况下，相对于肥料组合物中的固体成分100质量％，上述寡糖的含量优选为10～50质量％，更优选为15～40质量％。相对于肥料组合物中的固体成分100质量％，上述氨基酸或其盐的含量优选为10～50质量％，更优选为15～40质量％。肥料组合物优选除了上述寡糖和上述氨基酸或其盐以外，还含有选自氮、磷酸、钾中的至少1种营养素，更优选含有氮、磷酸、和钾的全部3种营养素。在为液状肥料的情况下，肥料组合物优选含有水70～99质量％，更优选含有75～99质量％，优选在散布前将该原液进行100倍～1000倍稀释而使用。
[0070]
通过这样的方法来栽培植物，从而与不应用植物活力剂的情况相比，能够生产具有激发子活性的植物或其一部分(例如，根、茎、叶、花、果实、种子、组织、细胞等)，进而，可以改善农作物的活力、收获量、品质和收获后的保存性。
[0071]
如上所述，激发子效果作为病害抗逆性的一个指标是重要的，但本发明者们这次发现，根据作为激发子效果的一个信号的葡聚糖水解酶产生量，通过测定其酶活性，从而能够评价激发子活性。采取栽培中植物的叶的一部分，分析其葡聚糖水解酶活性，从而能够进行同一个体的经时的评价。
[0072]
以下显示激发子活性的评价方法中的步骤的概要：
[0073]
(i)进行植物的取样和前处理；(ii)将bsa作为蛋白质标准而制作标准曲线(利用由色素结合法获得的波长(600nm)的吸光度)；(iii)测定在(i)中制备的样本的蛋白质浓度；(iv)测定在(i)中制备的样本的葡聚糖水解酶活性。具体而言，利用通过葡聚糖水解酶而可溶性的低分子分解物游离而发色的b-hs试剂，将其活性作为波长590nm的吸光度值进行评价；(v)计算出每单位蛋白质的葡聚糖水解酶活性。
[0074]
关于这样的激发子活性的评价方法的具体步骤，在下述实施例中详细地说明。
[0075]
通过以下实施例进一步具体地说明本发明，但本发明不限定于此。
[0076]
实施例
[0077]
[1.寡糖的准备]
[0078]
(1)几丁质寡糖
[0079]
将几丁质(富士
フイルム
和光純薬株式会社制，精制几丁质)10g分散于包含磷酸
1.2g的水30ml后，进行了减压干燥，将所得的粉末与直径5mm的氧化铝球100g一起加入到容量250ml的氧化铝罐中，放置于行星球磨机(
フリッチュ
社制，pulverisette6)以500rpm连续处理6小时而获得了反应物。另外，关于温度，在室温下开始，由剪切发热引起的温度上升顺其自然。
[0080]
接着将反应物悬浮于水，用氢氧化钙中和了，将所得的浆料液使用5b滤纸通过吸滤器进行过滤，将回收了的滤液进行冷冻干燥而获得了几丁质寡糖粉末。
[0081]
(2)纤维寡糖
[0082]
在以下实施例1、2和比较例1、4中使用了通过“制造方法1”而制造的纤维寡糖，在实施例6、8、10中使用了通过“制造方法2”而制造的纤维寡糖。
[0083]
(制造方法1：从结晶性微粉纤维素的获得)
[0084]
将
アビセル
(merck社制结晶性微粉纤维素)10g、和活性炭ba50(味
の
素
ファインテクノ
(株)制)1.5g与直径1.5cm的氧化铝球2000g一起加入到容量3600ml的陶瓷罐磨机中，设置于台式罐磨机旋转台(日陶科学(株)制，台式罐磨机型号anz-51s)，以60rpm处理48小时而获得了反应原料。另外，关于温度，在室温下开始，由剪切发热引起的温度上升顺其自然。
[0085]
接着，将反应原料0.374g和水40ml加入到高压反应器(内容积100ml，
オーエムラボテック
(株)制高压釜，哈斯特洛伊耐蚀镍基合金c22制)中后，一边以600rpm搅拌一边直到反应温度以10～30℃/分钟(平均升温速度11.3℃/分钟)加热直到230℃后，立即停止加热，将反应器以10～30℃/分钟(平均降温速度16.7℃/分钟)利用风冷进行冷却而制作出反应液。
[0086]
接着将反应液通过离心分离装置进行了回收，将所得的上清液进行冷冻干燥而获得了纤维寡糖粉末。
[0087]
(制造方法2：从棉绒浆的获得)
[0088]
将棉绒浆(東工
コーセン
株式会社，纤维素含有率97％)271g(含水率1.8％，干燥质量266g)使用食品搅拌器(型号：hbf500s，
ハミルトンビーチ
社制)与85质量％磷酸(富士
フイルム
和光純薬株式会社制特级试剂)38g混合，获得了反应原料309g(含水率3.4％，磷酸含有率10.4％)。
[0089]
接着，将反应原料309g与φ3/4英寸碳钢球13kg一起投入到振动磨机(装置名：mb-1型，中央化工机株式会社制，罐尺寸5l)中在总振幅8mm、频率16.2hz、夹套流通水温度75℃的条件下，进行了24小时采用干式粉碎的水解反应后，回收反应粉体。
[0090]
将该反应粉体10g和离子交换水90g加入到200l烧杯中，使用电磁搅拌器在25℃下进行1小时搅拌，获得了纤维素水解物的提取液。
[0091]
接着，在提取物中加入40质量％氢氧化钙水溶液1.3g，使用电磁搅拌器在25℃下进行1小时搅拌，从制备的中和液通过离心分离装置而回收了上清液后，冷冻干燥而获得了纤维寡糖粉末。
[0092]
(3)木寡糖
[0093]
在以下实施例1、2和比较例1、4中使用下述“市售品”的木寡糖，在实施例6～9、11中使用了通过“制造方法”而制造的木寡糖。
[0094]
(制造方法：从玉米穗轴粉末的获得)
[0095]
将解纤维素枝顶孢(acremonium cellulolyticus)tn株(ferm p-18508)在加入了液体培养基(
アビセル
50g/l、kh2o
4 24g/l、硫酸铵5g/l、酒石酸钾1/2h2o 4.7g/l、脲4g/l、tween80 1g/l、mgso4·
7h2o 1.2g/l、znso4·
7h2o 10mg/l、mnso4·
5h2o 10mg/l、cuso4·
5h2o 10mg/l)100ml的500ml烧瓶中在30℃振荡培养6天，在所得的培养液的离心分离上清液50ml中悬浮玉米穗轴粉末5g，以50℃、72hr进行搅拌反应，将所得的反应液的离心分离上清液冷冻干燥而获得了木寡糖原料粉末。
[0096]
(市售品)
[0097]
使用了物産
フードサイエンス
株式会社制，木寡糖95p。
[0098]
[2.氨基酸的准备]
[0099]
(1)甘氨酸：昭和电工株式会社制
[0100]
(2)赖氨酸：富士
フィルム
和光純薬株式会社制
[0101]
(3)谷氨酸钠(msg)：富士
フィルム
和光純薬株式会社制
[0102]
(4)组氨酸：富士
フィルム
和光純薬株式会社制
[0103]
(5)丙氨酸：富士
フィルム
和光純薬株式会社制
[0104]
(6)精氨酸：富士
フィルム
和光純薬株式会社制
[0105]
[3.皱叶生菜的根干燥重量的测定]
[0106]
(1)植物活力剂的制备
[0107]
将在[1.寡糖的准备]中准备的各寡糖、和在[2.氨基酸的准备]中准备的各氨基酸以成为下述表中的比较例1-2和实施例1、6-7中的植物活力剂浓度(质量ppm)的1000倍的方式以各自的组成比率进行搅拌器搅拌而溶解于水后，用0.45μm过滤器进行了除菌，将所得的溶液设为植物活力剂原液。
[0108]
(2)栽培试验
[0109]
在试验区中，在准备用于实施水耕栽培的营养液150l中添加各条件的植物活力剂原液150g使其分散(1000倍稀释)，在温度20～22℃下开始了各120株的栽培。栽培合计实施60天，在开始后每隔1周追加植物活力剂原液150g，合计进行5次的追加，测定了皱叶生菜的根干燥重量。
[0110]
根干燥重量的测定通过将根的部分切下，使切下的根通过恒温干燥机在50℃下干燥12小时后测定重量来进行。
[0111]
另外，表1中的根干燥重量表示将不添加植物活力剂的无添加区中的根干燥重量设为100％时的比例(％)。
[0112]
表1：
[0113]
[0114]
[4.小松菜的激发子活性的评价]
[0115]
(1)植物活力剂的制备
[0116]
将在[1.寡糖的准备]中准备的各寡糖、和在[2.氨基酸的准备]中准备的各氨基酸以成为下述表中的比较例4-10和实施例2、8-9中的植物活力剂浓度(质量ppm)的1000倍的方式以各自的组成比率进行搅拌器搅拌而溶解于水后，用0.45μm过滤器进行了除菌，将所得的溶液设为植物活力剂原液。将该原液用水稀释到1000倍，使用于以下栽培试验。
[0117]
(2)ms培养基的制备
[0118]
在小松菜的培育中使用了
ムラシゲスクーグ
(ms)琼脂培养基。将制备出的植物活力剂以成为各比较例和实施例所示的终浓度的方式添加于ms培养基，然后，以121℃20分钟进行了热压处理。
[0119]
(3)播种和生长发育方法
[0120]
在洁净台上，将进行了高压蒸气灭菌的ms培养基转移到苗木箱，充分冷却后，播种小松菜(
わかみ
，
サカタのタネ
)的种子各10粒。然后，在明处在22℃24小时、长日照条件下生长发育6天。
[0121]
(4)蛋白质提取
[0122]
制备出以下组成的蛋白质提取用缓冲液。
[0123]
表2
[0124]
蛋白质提取用缓冲液
[0125]
试剂名容量(mol)备注0.2m磷酸缓冲液(ph6.0)1.25ml 5.0m nacl0.3ml(150mm) 0.5m edta2na20μl(1mm) 60％甘油1.7ml可以为纯度99～100％品triton x-1000.1ml表面活性剂1m dtt10μl(1mm) 25
×
蛋白酶抑制剂0.4ml1片/2ml h2oh2o6.22ml超纯水合计10ml [0126]
在
バイオマッシャー
(株式会社
ニッピ
)附属的1.5ml管中添加上述制作的蛋白质提取用缓冲液300μl，在其中加入用剪刀切为4
×
4mm左右而取样的叶(植物体)。将该操作对各样品进行5次。接着，用手使搅拌棒旋转，将植物体破碎直到大致眼睛可以看到的固体成分消失的程度为止。在15,000
×
g、10分钟、4℃的条件下离心分离，将水层回收到新的1.5ml管中，制备出提取液。
[0127]
(5)蛋白质浓度的调整
[0128]
将纯度已知的牛血清白蛋白(bsa)2mg/ml连续稀释(1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64稀释)而制作出标准品。使用制作出的标准品，取600nm下的吸光度(abs600)的平均值，制作出标准曲线(n＝3)。将考马斯亮蓝(cbb)液300μl分注于96孔板，添加上述制备的提取液6μl。测定了abs600。空白使用了milliq。将提取液的吸光度代入到通过连续稀释了的bsa2mg/ml而制作的标准曲线，求出蛋白质浓度。
[0129]
另外，在提取液的abs600测定值超出标准曲线的情况下，用超纯水(milliq)适当稀释进行再测定而求出蛋白质浓度。
[0130]
使用求出的值以提取液的浓度变为一定的方式进行稀释，用于以下葡聚糖水解酶活性测定。
[0131]
(6)葡聚糖水解酶活性的测定
[0132]
在1.5ml管中混合将b-hs试剂(megazyme社)1片悬浮于milliq 10ml的b-hs基质溶液100μl、0.2m磷酸缓冲液(ph6.0)50μl、和上述制备的稀释液或超纯水(空白)50μl，制备出各比较例和实施例的样品。每隔15分钟将样品充分振动，同时在30℃的水浴中进行了1小时30分钟酶反应。加入反应停止液0.2n naoh 100μl(合计300μl)而停止了反应。在15,000rpm、5分钟的条件下离心分离，将上清液200μl分注于96孔板，为了评价葡聚糖水解酶活性而测定590nm下的吸光度(abs590)，与不应用植物活力剂的情况(比较例3)进行了比较。
[0133]
表3-1
[0134][0135]
表3-2
[0136][0137]
[5.小松菜的生物体重量的测定]
[0138]
(1)植物活力剂的制备
[0139]
将在[1.寡糖的准备]中准备的各寡糖、和在[2.氨基酸的准备]中准备的各氨基酸以成为下述表中的比较例12-14和实施例3-5、10-11中的植物活力剂浓度(质量ppm)的1000倍的方式以各自的组成比率进行搅拌器搅拌而溶解于水后，用0.45μm过滤器进行了除菌，将所得的溶液设为植物活力剂原液。将该原液用水稀释为1000倍，使用于以下栽培试验。
[0140]
(2)生物体重量的测定
[0141]
作为作物，准备了小松菜(
わかみ
，
サカタのタネ
)，作为培土，准备了有机蔬菜的土(广田商店)，作为肥料，准备了新多木有機入
り
液肥3号(多木化学株式会社)。
[0142]
在滤纸上进行了作物的出芽后，向加入了培养土和肥料的25孔连接罐(整体280
×
280mm一孔50
×
50
×
50mm)进行了定植。定植后以一周的间隔一边对小松菜进行各植物活力剂的叶面散布一边在培养室中培育了34天后，测定生物体重量，与不应用植物活力剂的情况(比较例11)进行了比较。
[0143]
表4
[0144]