一种肺纤维化诊断生物标志物及其应用

1.本发明属于临床医学技术领域，尤其涉及一种肺纤维化诊断生物标志物及其应用。


背景技术：

2.长链非编码rna是一种长度大于200个核苷酸且蛋白质编码能力较低的非编码。研究表明lncrna的数量和类型远远超过蛋白编码mrna，然而目前明确生物学功能的lncrna的数量十分有限。目前，越来越多的证据表明，lncrna在多种生物学过程中发挥着重要的作用。血清标志物是一种容易获得，价格低廉并且可重复的标志物。现有技术表明，使用lncrna作为分子生物标志物相较于传统的特异蛋白分子标志物更加有效。
3.肺纤维化是一种常见的呼吸系统并发症，近年来，肺纤维化的发病率和病死率不断呈现出上升趋势。因此，实现该病的早发现和早治疗对于提高患者的生存率具有重要的意义。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种能够辅助诊断肺纤维化的诊断生物标志物，并提供一种可以有效降低肺纤维化的药物。
5.本发明由下列技术方案实现：第一方面，本发明提供了检测lncrna enst00000564534.1表达的试剂在制备肺纤维化诊断试剂盒中的应用。
6.优选地，所述lncrna enst00000564534.1的cdna序列如seq id no.1所示。
7.优选地，所述试剂为检测lncrna enst00000564534.1表达的pcr引物。
8.优选地，所述pcr引物的序列如seq id no.2和seq id no.3所示。
9.第二方面，本发明提供了敲减lncrna enst00000564534.1表达量的敲减剂在制备肺纤维化治疗药物中的应用，所述lncrna enst00000564534.1的cdna序列如seq id no.1所示。
10.优选地，所述敲减剂为lncrna enst00000564534.1-sirna，所述lncrna enst00000564534.1-sirna由正义链和反义链组成，所述正义链的序列如seq id no.4所示，所述反义链的序列如seq id no.5所示；所述敲减剂抑制人肺成纤维细胞的生长并促进人肺成纤维细胞的凋亡。
11.第三方面，本发明提供了敲减lncrna enst00000564534.1表达量的敲减剂在制备人肺成纤维细胞生长抑制剂中的应用，其特征在于，所述lncrna enst00000564534.1的cdna序列如seq id no.1所示。
12.优选地，所述敲减剂为lncrna enst00000564534.1-sirna，所述lncrna enst00000564534.1-sirna由正义链和反义链组成，所述正义链的序列如seq id no.4所示，所述反义链的序列如seq id no.5所示。
13.第四方面，本发明提供了敲减lncrna enst00000564534.1表达量的敲减剂在制备人肺成纤维细胞凋亡促进剂中的应用，所述lncrna enst00000564534.1的cdna序列如seq id no.1所示。
14.优选地，所述敲减剂为lncrna enst00000564534.1-sirna，所述lncrna enst00000564534.1-sirna由正义链和反义链组成，所述正义链的序列如seq id no.4所示，所述反义链的序列如seq id no.5所示。
15.本发明的有益效果是：本发明所提供的肺纤维化生物标志物可以有效的辅助诊断肺纤维化患者，并且本发明发现在人肺成纤维细胞中通过lncrna enst00000564534.1-sirna抑制lncrna enst00000564534.1可以有效的抑制人肺成纤维细胞的生长并且可以有效的促进人肺成纤维细胞的凋亡。
附图说明
16.图1 lncrna enst00000564534.1在正常组，肺纤维化组中的表达差异；图2 lncrna enst00000564534.1作为标志物来区分正常组和肺纤维化组时的roc曲线；图3 lncrna enst00000564534.1-sirna的敲减效果检测；图4 cck-8检测敲减lncrna enst00000564534.1对于人肺成纤维细胞生长的调控效果；图5 western blot检测敲减lncrna enst00000564534.1对于人肺成纤维细胞凋亡的调控效果。
具体实施方式
17.为能清楚说明本方案的技术特点，下面通过具体实施方式，对本方案进行阐述。
18.实施例1（1）收集正常人外周血32例，肺纤维化患者外周血25例。
19.（2）将采集的血液置于离心机中，3000rpm离心15min，将上层的血浆转移至新的离心管中；（3）吸取250ul的血浆至离心管中，加入750ulrna提取液，混匀之后，静置5min；（4）静置结束之后，加入200ul氯仿，混匀后静置5min，将离心管置于离心机中12000rpm离心15min；（5）离心结束后，将上层的水相转移至新的无rna酶的离心管中，加入等体积的异丙醇混合均匀，之后放置10min；（6）将离心管置于离心机中进行离心，离心结束后，保留沉淀；（7）加入预冷的depc水配置的70%乙醇，离心后，弃去上清，室温干燥5-10min，加入depc水得到rna。
20.实施例2检测基因的差异表达（1）参照逆转录试剂盒配置gdna去除反应体系
组成成分使用量5
×
gdnabuffer2μltotalrna2μgrnase-freeddh2o添加到10μl反应的条件如下：42℃ 3min，冰上放置；（2）参照逆转录试剂盒配置逆转录反应体系组成成分使用量10
×
kingrtbuffer2μlfastkingrtenzymemix1μlfq-rtprimermix2μl步骤（1）反应液10μlrnase-freeddh2o5μl反应的条件如下：42℃ 15min，95℃ 3min，冰上放置。
21.（3）设计lncrna enst00000564534.1的引物并合成，lncrna enst00000564534.1的cdna序列（seq id no.1）如下：atatcgctgctgtcccctacaagttatgtgactctcttgcctgtgctctgccaacatgggccattgtgacatgttgctgggtccaaaacctaggttctgcctgcagaagagattgtaacatgttgctgggcaccttgggcctgccctcagaaggcattatgacatattcctgggtccaacaccaaggtgatgtgcgtctcctggctggaccctgcccacagtgggcactgtgacatatctcttggcccatcagattgttcatgttatccccttccctttttttcctggtgtttgcccatgagagacattgtgatgcatttctggacctagcacctaggtgatatcttcctgggacctgtctatatgggttattgtgatacatcatgtacgtggcccagtacttacttgatgtgactctcctctcatgcctagaccctgctcacaggtgatgctactctctacttatggctgggccttgacaaaaagagggattgggacatatccctggacgctgaacctaagaggtggaggttgccgtggtgacagagtgagacttcgccaaaacaaaacaaaaaaaacaacaacaaaaaaggcagggtttcaccgtgttagtcaggatggtctcaatctcctgacctcgtgatctgcccgccttggcctcccaaagtgctgcaattacaggcgtaagccatcgcacctggccagggggtactttctgcccacaaatgagattgtggcatctaaccctaaggtgatgttacttctttgctctggctgtgcccttagaaaacactgaaacatactgctgggtccagcaccaagattatgtgagttttctgcctgaaccctgaccacaggaagcattgtaacatatctcttgacccattgcaatttctcctatgggcaaagcccagggggccttgtgacatatttctgtatccatcacccaggagatgaaactgtctacttctgcattctgcccactcggaagattgtgacaatcattaggcccagcaaccagagcccactggtgaggtcctgaatcacacgtgaatgccgttcacagttggaattttcactgtcataagtgaacatctggccacagttgggatggtgactcatttctaaacccagcttgtaggaaggtgaggactctcctatctggactcaaccaattggagagatgttgactgtcatatctggacgtagaaccacagggaagactctggatctccttcctgtatgaaggtcacagaggatcaccattcttgcatattgtataaagccttcaggtgacacagagagtgtcataagagaacacagcacacaggtgggctagtgactctcagaccaagattcagcacacatgtgaggctgtaactgcactgaaaggacaagtctgcagaataaactgtggctgtcttgcaaaaattctgtcaaccattgagactgtgactcacacacttagatccaacatccaaggctgggcgcagtggctcacgcctgtaatcccagcactttgaaaggccaacgcaggcggatcaccggaggtcaggagttcaagaccatcctggccaacatggtgaaacccccatctctactaaaaatacaaaaattagccgcgcgtggtggcaggcacctgtaatcccagctactcgggaggc
tgacacaggagaatcgcttgaacctgggaggcagaggttgcagtgagccgagatcacaccattgcatcccagcctgggggacaagagtgagacttcatctcaaaaaaacaaaagcaaaaacaaaatagataaatagatccaacatccaggaggtgttgactctcatacctagaa；lncrna enst00000564534.1的引物序列如下：上游引物为:cattaggcccagcaaccaga,seq id no.2；下游引物为:atcccaactgtggccagatg,seq id no.3；（2）配置荧光定量pcr反应液成分体积sybr
⑩
premixextaqii10μlpcr上游引物0.8μlpcr下游引物0.8μlroxreferencedye0.4μldna模板2μldh2o6μltotal20μlpcr反应条件如下：95℃ 30s预变性，95℃ 5s，60℃ 30s， 40个循环；（3）使用β-actin为内参，采用2
‑∆∆
ct
的方法计算基因的相对表达量。
22.实验结果如图1所示，肺纤维化组中lncrna enst00000564534.1的相对表达量为1.958
±
0.492，可以看出lncrna enst00000564534.1在肺纤维化患者的外周血血浆中高表达；对照组和肺纤维化组的roc曲线的结果如图2所示，曲线下面积为0.937，置信区间为0.879-0.994，灵敏度为0.880，特异度为0.875，可以看出，当将lncrna enst00000564534.1用于区分正常人和肺纤维化患者时具有较高的灵敏度和特异度。
23.实施例3检测敲减lncrna enst00000564534.1是否能够抑制人肺成纤维细胞的生长1. lncrna enst00000564534.1-sirna敲减效果检测（1）将人胚肺成纤维细胞mrc-5消化后配置成细胞悬液，将细胞悬液均匀加入到6孔细胞培养板孔中；（2）待细胞密度达到80%左右的时候去除培养基，对照组转染nc-sirna的小干扰rna，实验组转染lncrna enst00000564534.1-sirna，lncrna enst00000564534.1-sirna的序列如下：正义链:5
’‑
ucacaauggcccauguuggca-3’,seq id no.4；反义链:5
’‑
ccaacaugggccauugugaca-3’,seq id no.5；转染结束后，将细胞置于细胞培养箱中，进行培养，每组设置5个重复；（3）转染48h后，每孔加入1ml rna提取液，使用移液器将细胞吹下，将rna提取液收集到离心管中，静置5min；（4）静置结束之后，加入200ul氯仿，混匀后静置5min，将离心管置于离心机中12000rpm离心15min；
（5）离心结束后，将上层的水相转移至新的无rna酶的离心管中，加入等体积的异丙醇混合均匀，之后放置10min；（6）将离心管置于离心机中进行离心，离心结束后，保留沉淀；（7）加入预冷的depc水配置的70%乙醇，离心后，弃去上清，室温干燥5-10min，加入depc水得到rna；（8）gdna去除反应和逆转录反应的步骤同实施例2；（9）荧光定量pcr反应的步骤同实施例2，检测实验组和对照组中lncrna enst00000564534.1的相对表达量。
24.lncrna enst00000564534.1-sirna的敲减效果如图3所示，实验组的相对表达量为0.178
±
0.235，相对表达量相较于对照组降低了0.822，因此敲减效果为:82.2%；2. 检测敲减lncrna enst00000564534.1抑制人肺成纤维细胞生长的效果（1）将人胚肺成纤维细胞mrc-5消化后，进行细胞计数，将细胞配置成浓度为5
×
104个/ml的细胞悬液；（2）将100ul细胞悬液加入到细胞培养板孔中，培养24h后，去除培养基，对照组转染nc-sirna的小干扰rna，实验组转染lncrna enst00000564534.1-sirna，转染结束后，将细胞置于细胞培养箱中，进行培养，每组设置5个重复；（3）培养48h后，进行cck-8检测，每孔加入10ul cck-8检测试剂，置于细胞培养箱中继续培养3h后，置于酶标仪中计算450nm的od值。
25.实验结果如图4所示，从图中可以看出，转染了lncrna enst00000564534.1-sirna的实验组的od值（0.395
±
0.033）显著低于对照组od值（0.762
±
0.041），差异具有统计学差异；该结果说明通过敲减lncrna enst00000564534.1能够有效的抑制人成纤维细胞的增殖。
26.实施例4检测敲减lncrna enst00000564534.1是否能够促进人肺成纤维细胞的凋亡（1）将mrc-5细胞接种于6孔细胞培养板中，对照组转染nc-sirna，实验组转染lncrna enst00000564534.1-sirna，每组设置3个重复，转染48h之后，加入蛋白裂解液对细胞进行裂解；（2）使用细胞刮刀将细胞刮下后，将细胞收集至1.5ml离心管中，置于冰上裂解30min，每隔10min使用涡旋振荡器对离心管振荡1min；（3）细胞裂解结束后，将蛋白样品置于离心机中进行离心，离心结束后，收集上清至新的1.5ml离心管中；（4）使用bca法检测蛋白样品浓度，使用sds loading buffer调整蛋白样品浓度；（5）按照配置表配置sds-page分离胶和浓缩胶，配置好后，组装电泳架，将电泳架置于电泳槽中，加入电泳液，进行蛋白样品和蛋白marker的加样；（6）打开电泳仪，浓缩胶采取恒压80v，分离胶采取恒压120v，当溴酚蓝到达分离胶底部时停止电泳；（7）按照海绵垫、滤纸、凝胶、pvdf膜、滤纸、海绵垫的顺序安装转膜夹，恒流250ma，电转1.5h；（8）电转结束后，将pvdf膜取出置于由tbst配置的5%的脱脂奶粉中，在水平摇床上
室温封闭1.5h；（9）按照抗体说明书稀释bcl-2，bax和β-actin，切膜后，孵育一抗，之后将膜置于4℃孵育过夜；（10）孵育结束后，回收一抗，使用tbst清洗pvdf膜，共清洗3次，每次10min；（11）按照说明书，孵育二抗，室温孵育1h；（12）去除二抗，使用tbst清洗pvdf膜，共3次，每次10min，添加发光液进行显影曝光。
27.实验结果如图5所示，从图中可以看出，敲减lncrna enst00000564534.1后，促凋亡蛋白bax的表达量升高，而抑凋亡蛋白bcl-2的表达量降低，说明通过敲减lncrna enst00000564534.1可以有效的促进人成纤维细胞的凋亡。
28.综合上述结果可以得到，通过敲减lncrna enst00000564534.1能够有效的抑制人成纤维细胞的生长，并且可以有效的促进人成纤维细胞的凋亡，因此可将lncrna enst00000564534.1的sirna做成药物来治疗肺纤维化疾病。