一种高粱籽粒单宁基因Tannin2内的等位变异体tan2-d及其分子标记和应用

一种高粱籽粒单宁基因tannin2内的等位变异体tan2-d及其分子标记和应用
技术领域
1.本发明涉及作物分子标记辅助育种技术领域，具体涉及一种高粱籽粒单宁基因tannin2内的等位变异体tan2-d及其分子标记和应用。


背景技术：

2.高粱(sorghum bicolor l.moench)是世界第五大禾谷类作物，也是中国最早栽培的禾谷类作物之一。高粱在世界上分布很广，主要在非洲、亚洲和美洲的干旱和半干旱地区种植，对高温，干旱和盐碱等极端环境具有良好的耐受性。高粱主要作为食物、饲料、酿造和生物燃料等种植。在我国，高粱生产的经济意义和国家需求主要体现在杂粮食品、酿酒工业、饲料工业、色素工业和生物质能源等几个方面。高粱曾是中国北方地区的主要粮食作物，近年来种植面积锐减。一方面原因是随着工业经济飞速发展，国内饮食结构发生变化；另一方面则是高粱籽粒的营养品质低，适口性差。具体表现为单宁含量偏高，淀粉结构欠佳、氨基酸组成不平衡。
3.高粱谷物富含营养成分和有益健康的酚类化合物，单宁是高粱中含量最多的多酚物质之一。高粱单宁在功能的开发利用上具有双重性，一方面，单宁含有涩味，作为饲料时可以与蛋白质、碳水化合物、酶和金属离子等结合形成难以消化吸收的复合物，还会降低一些消化酶的活性，从而影响蛋白质的消化吸收，降低了饲料的营养价值。另一方面单宁作为一种天然抗氧化剂，具有降低氧化胁迫和防治心脑血管疾病等功能；另外酿酒的发酵过程中产生的多酚类物质和特殊芳香化合物，对酒的口感和品质具有直接影响。
4.基于以上特点，食用及饲用高粱要求单宁含量较低，而酿造高粱则需要较高的单宁含量，这就对不同用途高粱的育种选择提出了明确要求。因此鉴定并利用控制单宁形成基因培育具有不同单宁含量的品种是高粱籽粒单宁含量改良的最经济有效的途径。
5.原花青素(proanthocyanidin,pa)又叫缩合单宁(condensed tannin,ct),是高等植物特有并广泛存在的聚多酚类化合物，以pa单体、寡聚物或多聚物的形式存在。在高粱中，单宁主要存在于籽粒的外种皮的单宁层中，由于单宁层通常呈棕色或紫色，因此籽粒的果皮呈现棕色。经典遗传学和连锁研究通过种子颜色及外种皮层的有无鉴定了一些控制高粱籽粒颜色及多酚化合物的位点。禾谷类作物单宁形成、调控等分子基础的研究还处于初始阶段，除tannin1和tnnin2基因外，其他与单宁合成有关的基因还未被鉴定，更缺乏用于有无单宁育种选择的高通量分子标记。


技术实现要素：

6.通过qtl精细作图技术，已经图位克隆了位于高粱第2号染色体上的qtl，将其命名为tannin2，将含有单宁的高粱与不含单宁的高粱tannin2基因测序并进行序列比对，发现tannin2在 8018位点、 7777位点、 8031位点的三个功能性等位变异位点，造成tannin2编码的氨基酸序列发生了变化，是造成部分高粱品种单宁丧失的根本原因。但是，我们在对大
量来自中国及非洲的高粱品种单宁有无及含量鉴定及以上三个关键snp进行检测时发现，部分品种虽然籽粒不含单宁，但tannin1基因型与野生型(有单宁类型)相同。tannin2不含有上述三个功能性等位变异，说明这些品种资源中tannin2可能含有其他的变异类型。
7.在此基础上，本研究利用tannin2基因的序列特异引物，对这些品种的基因序列进行测序、比对，最终在品种“黑萼白”tannin2编码区 1366位点(456aa)处发现一个c/t的突变。该突变导致tannin2基因编码的蛋白在456aa处的密码子由cag变为tag，编码终止密码子，导致翻译提前终止，不编码hlh结构域，从而造成tannin2基因功能的丧失，将这个位点分别命名为tan2-d。
8.利用tan2-d功能性等位变异设计在育种中进行标记辅助选择的高通量kasp标记，对高粱品种中tannin2基因编码区内造成单宁有无变化的关键变异进行检测，可以辅助筛选出不含单宁的种质材料，并在育种群体中用该标记进行标记辅助选择，选育单宁含量不同的新品种，对于利用tannin2选育单宁含量不同高粱品种具有重要利用价值。
9.现有技术相比，本发明提供了一个调控高粱单宁有无基因tannin2的一种新型功能性等位变异类型，还提供了在育种中有重要利用价值的高通量检测高粱不含单宁的kasp分子标记，可以快速、高效、高通量检测tannin2基因编码区导致中国高粱单宁有无发生改变的关键snp变异，广泛应用于检测这个关键snp在中国高粱种质资源中的分布情况，及高效筛选不含单宁基因的高粱种质资源并应用于高粱分子标记辅助选择育种，对利用tannin2提高高粱单宁育种效率，具有重要利用价值。
10.本发明所采用的技术方案是：
11.本发明提供了高粱控制单宁有无基因tannin2的一种新型功能性等位变异，是位于tannin2基因编码区的 1366位点(456aa)处c突变为t。
12.见图3.
13.本发明提供了控制高粱单宁有无基因tannin2的一种新型变异的snp分子标记，用于诊断功能性等位变异，其特征在于，这个分子标记分别包含2个kasp正向引物和一个共同的反向引物。tan2-d-kasp正向引物为tan2-d-kasp-fam和tan2-d-kasp-hex；反向引物为tan2-d-kasp-r；分子标记检测位点处的基因型分别为t和c；引物序列分别如seq id no.3-5所示。
14.本发明提供了高粱单宁有无基因tannin2的一种新型变异检测方法，用于检测单宁有无基因tannin2编码区内单宁丧失变异，包括如下步骤：
15.(1)提取待测高粱样品的dna；
16.(2)取浓度为20-40ng/μl的模板dna 3μl，seq id no.3-5所示的混合引物/seq id no.6-8所示的混合引物0.0825μl，2
×
master mix 3μl，分别进行pcr扩增；
17.(3)采用荧光检测仪检测pcr扩增产物的荧光信号，进行基因分型。
18.优选的，步骤(2)中，pcr扩增的条件为：
19.1)94℃预变性5min；
20.2)94℃变性20s；
21.3)60℃退火30s，步骤2)-3)循环10次，每个循环退火温度降低0.5℃；
22.4)94℃变性20s；
23.5)55℃退火30s，步骤4)-5)循环40次；
24.6)4℃保存。
25.本发明还提供了所述的新型变异、分子标记或检测方法在高粱单宁育种中的应用。
26.本发明提供的高粱tannin2基因的新型变异是导致中国高粱单宁有无发生改变的关键snp变异，挖掘该变异位点的引物序列如下：
27.tan2_1f:
28.5'aagcagcctcatcaaacacc 3'，其核苷酸序列如seq id no.1所示；
29.tan2_1r:
30.5'atgatggacacctgcacctc 3'，其核苷酸序列如seq id no.2所示；
31.在获得引物之后，发明人进一步提供了具体的检测方法如下：
32.1.利用ctab法提取高粱基因组dna；
33.2.利用上述设计合成的引物和提取的基因组dna在pcr仪(t100
tm
thermal cycler)进行pcr扩增，并进行测序；
34.3.利用dnaman对序列进行比对以及clustalx2进行氨基酸多态性分析。
35.具体方法如下：
36.利用ctab法提取待检测的高粱基因组dna：
37.(a)取高粱幼嫩叶片置于2ml离心管中，利用液氮冷冻并于组织粉碎器上磨成粉末；(b)加800ul ctab提取液于2ml离心管中，置于65℃水浴60min，期间轻晃5-8次使得dna充分裂解；(c)加入800ul氯仿异戊醇(体积比24:1)轻晃10min；(d)3000g条件下离心10min中后取500ul上清液置于洁净的96孔深孔板中(注意对应序号)；(e)加500ul异丙醇(提前-20℃冷冻)及50ul 3m醋酸钠(ph＝5.2)轻晃摇匀，即可看到白色dna絮状物产生，置于-20℃20min增加dna产量。(f)3000g离心10min后倒掉上清液，将沉淀用70％乙醇(提前放入-20℃冰箱冷冻)清洗2-3次后风干至无酒精味；(g)加入300ul ddh2o溶解dna，置于-20℃冰箱保存备用；
38.pcr扩增体系和程序如下
39.20ulpcr体系配制
40.依下表配制体系，模板dna2ul，2
×
taq mix10ul，上游引物1ul，下游引物1ul，ddh2o6ul。
41.表1配制表
42.43.pcr程序如下：
44.1. 95℃预变性5min；
45.2. 95℃变性30s；
46.3. 58℃退火30s；
47.4. 72℃延伸1min，步骤2-4循环35次；
48.5. 72℃彻底延伸10min；
49.6. 4℃保存
50.tannin2成功扩增后，进行测序(北京睿博兴科生物公司)。
51.利用dnaman软件对测序结果进行序列比对，利用clustalx2软件进行氨基酸多态性分析。
52.本发明提供的2个高粱单宁kasp分子标记，可灵活、高效、高通量地检测tannin2基因编码区导致中国高粱单宁有无发生改变的关键snp变异，标记为kasp高通量snp标记，包括2条正向引物，1条反向引物；
53.标记tan2-d-kasp的引物序列如下：
54.tan2-d-kasp-fam c-tan2:
55.5'ggagagcgccgccggtcc 3'，其核苷酸序列如seq id no.3所示；
56.tan2-d-kasp-hex t-tan2-d:
57.5'ggagagcgccgccggtct 3'，其核苷酸序列如seq id no.4所示；
58.tan2-d-kasp-r:
59.5'gcatgacgaacctctcattgagc 3'，其核苷酸序列如seq id no.5所示；
60.在获得引物之后，发明人进一步提供了具体的检测方法如下：
61.1.利用上述设计合成的标记和上步提取的基因组dna在q-cycler 96pcr仪(hain lifescience uk 1td.uk)进行pcr扩增，并在lgc snpline荧光信号检测系统上进行snp检测；
62.判定的标准以点的颜色和聚集在横轴或纵轴的位置决定：信号为红色，聚集在纵轴附近且与tan2-d对照聚集在一起，判定为tan2-d基因型；信号为蓝色，与横轴和野生型tannin2对照聚集在一起，判定为tannin2基因型；
63.2.分析上述得到tannin2基因关键snp在高粱中的分布情况。
64.具体方法如下：
65.引物稀释与化验引物混合：
66.将每组中的三条引物用超纯水稀释到100μm后按照体积比
67.按照体积比正向引物fam：正向引物hex：反向引物：buffer＝6:6:15:23的比例进行混合，混匀后保存至-20℃备用；
68.所采用的pcr扩增体系和程序如下：
69.6ul pcr体系配制
70.依下表在冰上配制体系，模板dna 3μl(20ng/ul左右)，2
×
master mix3ul(lgc group uk)，kasp化验引物0.0825ul(北京睿博兴科生物公司合成)
71.表2配制表
[0072][0073]
pcr程序如下：
[0074]
1. 94℃预变性15min；
[0075]
2. 94℃变性20s；
[0076]
3. 65℃退火1min(每个循环降低0.8℃)，步骤2-3循环10次；
[0077]
4. 94℃变性20s；
[0078]
5. 57℃退火1min，步骤4-5循环40次；
[0079]
6. 10℃保存。
[0080]
本发明所提供的上述检测标记和检测方法均针对普通高粱种质和品种。
[0081]
综上所述，本发明的有益效果在于：本发明提供了一个高粱调控单宁有无基因tannin2的一种新型变异，还提供了在育种中有重要利用价值的高通量检测高粱不含单宁的分子标记，可以快速、灵活、高效、高通量检测tannin2基因编码区导致中国高粱单宁有无发生改变的关键snp变异，可用于检测关键功能性等位变异在中国高粱种质资源中的分布情况，可高效筛选不含单宁的高粱种质资源并应用于高粱单宁含量不同分子标记辅助选择育种，对利用tannin2提高高粱单宁育种效率，具有重要利用价值。
附图说明
[0082]
图1.是高粱籽粒单宁有无表型鉴定。
[0083]
图2a是tannin2基因的结构及编码区的变异位点tan2-d(c/t)；图2b为tan2-d氨基酸多态性分析。
[0084]
图3.是tan2-a-kasp的snp检测结果图,其中靠近纵轴的圆点是t(d)(不含单宁)基因型,靠近横轴的圆点是c(d)基因型；
·
是所设ddh2o空白对照。
[0085]
图4.是tan2-d-kasp的snp检测结果图。其中靠近纵轴的圆点是t(d)(不含单宁)基因型,靠近横轴的圆点代c(d)基因型；
·
是所设ddh2o空白对照。
[0086]
图5.为实施例中重组自交系f2群体中tan2-d-kasp,snp检测结果图,其中靠近纵轴的圆点代表t(d)(不含单宁)基因型,靠近横轴的圆点代表c(d)基因型；中间部分为杂合基因型，
·
是所设ddh2o空白对照。
具体实施方式
[0087]
为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0088]
实施例中所采用的高粱品种均可从市场或其他公开渠道获得。
[0089]
实施例1不同来源高粱品种籽粒单宁有无的鉴定
[0090]
no.1.1实验材料
[0091]
籽粒单宁有无鉴定采用的实验材料包括193份的高粱品种。
[0092]
no.1.2单宁有无鉴定
[0093]
对以上材料的种子进行单宁有无鉴定。将15gkoh溶于20ml漂白剂及20ml水中，制成漂白溶液。将10粒高粱种子放入1.5ml离心管中，加入1ml的漂白溶液保持3min，期间轻微晃动三次，后将种子置于过滤网中，用流水去除种子表面的漂白溶液，于培养皿中静置晾干水分。观察种子颜色变化确定单宁有无，含有单宁的种子呈现黑红色，不含单宁的种子颜色不变。
[0094]
no.1.3结果分析
[0095]
通过bleach test对来自中国和非洲的193份高粱品种进行单宁有无鉴定，44个品种含有单宁，149份不含单宁(图1.)。
[0096]
实施例2不含已有变异类型品种tannin2基因测序与变异类型鉴定
[0097]
no.2.1实验材料
[0098]
所用的实验材料为121份籽粒不含单宁但tannin1基因型为野生型且不含有之前发现的三个等位变异的高粱品种。
[0099]
1)dna提取叶片的收集
[0100]
取高粱苗期幼嫩叶片，按编号放入对应的2ml离心管中，并放在冰盒上低温保存，防止dna降解。
[0101]
2)利用ctab法提取高粱基因组dna；置于-20℃保存备用：
[0102]
上述步骤具体如下：
[0103]
(a)取高粱幼嫩叶片置于2ml离心管中，利用液氮冷冻并于组织粉碎器上磨成粉末；(b)加800ul ctab提取液于2ml离心管中，置于65℃水浴60min，期间轻晃5-8次使得dna充分裂解；(c)加入800ul氯仿异戊醇(体积比24:1)轻晃10min；(d)3000g条件下离心10min中后取500ul上清液置于洁净的96孔深孔板中(注意对应序号)；(e)加500ul异丙醇(提前-20℃冷冻)及50ul 3m醋酸钠(ph＝5.2)轻晃摇匀，即可看到白色dna絮状物产生，置于-20℃20min增加dna产量。(f)3000g离心10min后倒掉上清液，将沉淀用70％乙醇(提前放入-20℃冰箱冷冻)清洗2-3次后风干至无酒精味；(g)加入300ul ddh2o溶解dna，置于-20℃冰箱保存备用；
[0104]
no.3.2 tannin2测序
[0105]
1)设计用于tan2扩增的引物(北京睿博兴科生物公司合成)：
[0106]
tan2_1f:aagcagcctcatcaaacacc其核苷酸序列如seq id no.1
[0107]
tan2_1r:atgatggacacctgcacctc其核苷酸序列如seq id no.2
[0108]
2)pcr扩增体系和程序如下
[0109]
20ul pcr体系配制
[0110]
依下表配制体系，模板dna2ul，2
×
taq mix10ul，上游引物1ul，下游引物1ul，ddh2o 6ul。
[0111]
表3配制表
[0112][0113]
pcr程序如下：
[0114]
1. 95℃预变性5min；
[0115]
2. 95℃变性30s；
[0116]
3. 58℃退火30s；
[0117]
4. 72℃延伸1min，步骤2-4循环34次；
[0118]
5. 72℃彻底延伸10min；
[0119]
6. 12℃保存
[0120]
3)tannin2成功扩增后，进行测序(北京睿博兴科生物公司)。
[0121]
4)利用dna man软件对测序结果进行序列比对。
[0122]
no.3.3 tannin2基因克隆与测序、变异挖掘
[0123]
利用克隆tannin2基因的特异引物对dna序列进行扩增、测序、拼接，获得基因的dna序列。通过不含单宁高粱品种与含有单宁高粱品种中tannin2基因序列比对，找到tannin2中可能引起单宁丧失的功能性等位变异位点。
[0124]
no.3.4 tannin2基因内的关键变异
[0125]
经克隆、测序，从不同品种中获得了tannin2基因的dna序列，通过序列比对发现，品种“黑萼白”tannin2编码区 1366位点(456aa)处发现一个c/t的突变。该突变导致tannin2基因编码的蛋白在456aa处的密码子由cag变为tag，编码终止密码子，导致翻译提前终止，不编码hlh结构域，从而造成tannin2基因功能的丧失，将这个位点命名为tan2-d(图2)。
[0126]
实施例3 tan2-d位点的kasp标记开发
[0127]
no.3.1实验材料
[0128]
所用的实验材料包括12份高粱品种，其中6份含有单宁；6份包含黑萼白等不含单宁的品种。
[0129]
高粱基因组提取参照实施例2。
[0130]
no.3.2 tan2-d-kasp分子标记的开发
[0131]
将tan2-d位点进一步转化为kasp标记，首先在鲁6141、九叶、m-60031b、mn-4323、黑萼白、m-67209、大支白等已知该位点基因型的品种中进行基因分型，验证该标记的准确性(图3.)。
[0132]
实施例4不含单宁品种tannin2基因内变异类型鉴定
[0133]
no.4.1实验材料
[0134]
所用材料为356份来自中国和非洲的高粱品种。
[0135]
1)dna提取叶片的收集
[0136]
取高粱苗期幼嫩叶片，按编号放入对应的2ml离心管中，并放在冰盒上低温保存，防止dna降解。
[0137]
2)利用ctab法提取高粱基因组dna；置于-20℃保存备用：
[0138]
上述步骤具体如下：
[0139]
(a)取高粱幼嫩叶片置于2ml离心管中，利用液氮冷冻并于组织粉碎器上磨成粉末；(b)加800ul ctab提取液于2ml离心管中，置于65℃水浴60min，期间轻晃5-8次使得dna充分裂解；(c)加入800ul氯仿异戊醇(体积比24:1)轻晃10min；(d)3000g条件下离心10min中后取500ul上清液置于洁净的96孔深孔板中(注意对应序号)；(e)加500ul异丙醇(提前-20℃冷冻)及50ul 3m醋酸钠(ph＝5.2)轻晃摇匀，即可看到白色dna絮状物产生，置于-20℃20min增加dna产量。(f)3000g离心10min后倒掉上清液，将沉淀用70％乙醇(提前放入-20℃冰箱冷冻)清洗2-3次后风干至无酒精味；(g)加入300ul ddh2o溶解dna，置于-20℃冰箱保存备用；
[0140]
no.4.2引物稀释与化验引物混合
[0141]
将每个kasp化验标记的三条引物按照体积比正向引物fam：正向引物hex：反向引物：buffer＝6:6:15:23的比例进行混合，混匀后保存至-20℃备用。
[0142]
no.4.3所采用的pcr扩增体系和程序如下
[0143]
6ul pcr体系配制
[0144]
依下表在冰上配制体系，模板dna(20ng/ul左右)，2
×
master mix 3ul(lgc group uk)，kasp化验引物0.0825ul(北京睿博兴科生物公司合成)。
[0145]
表4配制表
[0146][0147]
pcr程序如下：
[0148]
1. 94℃预变性15min；
[0149]
2. 94℃变性20s；
[0150]
3. 65℃退火1min(每个循环降低0.8℃)，步骤2-3循环10次；
[0151]
4. 94℃变性20s；
[0152]
5. 57℃退火1min，步骤4-5循环40次；
[0153]
6. 10℃保存。
[0154]
no.4.4结果分析
[0155]
利用abi quant studio
tm
12k flex实施荧光定量pcr系统对扩增好的pcr体系进行snp及indel分型结果的收集，如图4所示，纵轴为tan2-d基因型，横轴为tan2及其他基因型，在356份高粱品种中，17个品种含有tan2-d基因型，是所设ddh2o空白对照。
[0156]
实施例5重组自交系群体基因分型
[0157]
no.5.1实验材料
[0158]
所用材料为矮脚糯(tan2)/m-66933(tan2-d)构建的重组自交系群体的158个f2代植株。82个材料为tan2基因型，44个为tan2-d基因型，杂合基因型为15个。含有单宁与不含单宁的材料比例为144:44,符合3:1的基因分离比。
[0159]
高粱基因组提取参照实施例2。
[0160]
kasp流程参照实施例3。
[0161]
实验结果见图5，实施例中重组自交系f2群体中tan2-d-kasp,snp检测结果图,其中靠近纵轴的圆点代表t(d)(不含单宁)基因型,靠近横轴的圆点代表c(d)基因型；中间部分为杂合基因型，
·
是所设ddh2o空白对照。
[0162]
以上所述仅是本专利的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利技术原理的前提下，还可以做出若干改进和替换，这些改进和替换也应视为本专利的保护范围。