醋酸棉酚在制备预防或治疗环形泰勒虫病药物中的应用

1.本发明属于环形泰勒虫病治疗技术领域，具体涉及一种醋酸棉酚在制备预防或治疗环形泰勒虫病药物中的应用。


背景技术：

2.环形泰勒虫病又称热带泰勒虫病(tropical theileriosis)，是由顶复门泰勒属的环形泰勒虫寄生于牛体内所引起的一种蜱传性的血源性原虫病。临床上病程从良性到致命性，表现出不同的症状，急性期临床和病理主要表现包括发热、淋巴结肿大、食欲不振和严重的病情丧失、结膜炎和粘膜苍白，此外，还可见黄疸、肝酶升高和白细胞增多等变化，严重者导致死亡。环形泰勒虫病发病率高，致病性强，给畜牧业带来巨大的损失。
3.目前环形泰勒虫病防治主要在三个方面，首先疫苗预防，包括抗蜱疫苗和环形泰勒虫细胞疫苗。关于抗蜱疫苗，针对盾糙璃眼蜱(hyalomma scupense)现有两种候选疫苗，并且在澳大利亚和拉丁美洲国家批准上市。这两种候选疫苗对成虫没有抗性，而是降低了若虫的含量，因此受到了一定的限制，据报道这种变化跟若虫和成虫表达的相关蛋白差异造成的。相对于抗蜱疫苗而言，应用较为广泛的是环形泰勒虫细胞苗，对同源株具有较强的免疫力，但是对异源株保护力较低。其次，除脾是防治环形泰勒虫病的重要环节，主要使用杀螨剂，包括有机磷(敌百虫、辛硫磷、库玛福等)、拟除虫菊酯(溴氰菊酯、氯氰菊酯、氟甲氰菊酯等)和甲脒(甲酰胺)。杀螨剂在一定程度上遏制了蜱，但也产生了负面影响，大面积使用对人畜健康和环境造成污染，此外，它对未寄生阶段的蜱的有效性是有限的，无法保证能够全部杀灭。最后，治疗环形泰勒虫最为有效的是精准药物治疗，目前最有效的药物是羟基萘醌家族包括parvaquone和buparvaquone，并且文献报道单次注射时buparvaquone的治疗效率明显高于parvaquone，但其治疗费用相对较高。moez mhadhbi等人发现，在突尼斯使用buparvaquone治疗环形泰勒虫感染的动物时出现治疗无效的情况，据此怀疑当地环形泰勒虫可能产生了针对buparvaquone的抗药性。近几年在非洲和亚洲也报道了环形泰勒虫地方株对buparvaquone具有抗药性。bashir salim等人从苏丹筛选了67株环形泰勒虫分离株，发现环形泰勒虫脯氨酰异构酶i基因(tapin1)的突变，是导致buparvaquone治疗失败的直接原因。j.marsolier等人也证明了tapin1是buparvaquone的作用靶点，该基因的突变是导致buparvaquone治疗失败的主要原因。环形泰勒虫抗药性的产生对治疗该病带来了巨大的挑战。
4.本发明意外发现，相较于其他寄生虫疾病，醋酸棉酚能够特异性的抑制环形泰勒虫tasp基因的转录水平，阻止环形泰勒虫继续感染及增殖，可用于预防或治疗环形泰勒虫病。


技术实现要素：

5.针对上述技术问题，本发明的目的在于提供一种醋酸棉酚在制备预防或治疗环形泰勒虫病药物中的应用，具体包括以下内容：
6.第一方面，本发明提供了一种醋酸棉酚在制备治疗环形泰勒虫病药物中的应用，所述醋酸棉酚的结构式如下式(ⅰ)所示：
[0007][0008]
优选地，所述醋酸棉酚加入药学上可接受的载体和/或辅料制成药学上可接受的任一剂型。
[0009]
优选地，所述剂型包括片剂、喷雾剂、颗粒剂、胶囊剂、口服液、针剂、混悬剂。
[0010]
第二方面，本发明提供了一种醋酸棉酚在制备预防环形泰勒虫病药物中的应用，所述醋酸棉酚的结构式如下式(ⅰ)所示：
[0011][0012]
优选地，所述醋酸棉酚加入药学上可接受的载体和/或辅料制成药学上可接受的任一剂型。
[0013]
优选地，所述剂型包括片剂、喷雾剂、颗粒剂、胶囊剂、口服液、针剂、混悬剂。
[0014]
第三方面，本发明提供了一种醋酸棉酚在制备环形泰勒虫基因转录表达抑制剂药物中的应用，所述醋酸棉酚的结构式如下式(ⅰ)所示：
[0015][0016]
优选地，所述基因为tasp基因。
[0017]
优选地，所述醋酸棉酚或其药学上可接受的盐加入药学上可接受的载体和/或辅料制成药学上可接受的任一剂型。
[0018]
优选地，所述剂型包括片剂、喷雾剂、颗粒剂、胶囊剂、口服液、针剂、混悬剂。
[0019]
本发明的有益效果是：本发明意外发现，相较于其他寄生虫疾病，醋酸棉酚能够特异性地显著抑制环形泰勒虫tasp基因的rna转录水平，阻止环形泰勒虫继续感染及增殖，可用于预防或治疗环形泰勒虫病，对于环形泰勒虫病别的预防和治疗具有重要意义。
附图说明
[0020]
图1醋酸棉酚抑制环形泰勒虫感染细胞增殖效果；
[0021]
图2tasp基因转录水平结果图；
[0022]
图3醋酸棉酚处理后环形泰勒虫裂殖体不同时间段的镜检结果图(单位：10μm)；
[0023]
图4醋酸棉酚对正常pbmc细胞的毒性结果图。
具体实施方式
[0024]
为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。但本发明的保护范围并不局限于以下实施例所述。
[0025]
以下实施例中所述的实验获得生物安全许可和环形泰勒虫病实验室活动许可：
[0026]
中国农业科学院兰州兽医研究所根据生物安全2级实验室(bsl-2)和环形泰勒虫病相关生物安全的相关要求，经兰州兽医研究所生物安全委员会、实验动物伦理委员会、中国农业科学院生物安全委员会、兰州兽医研究所实验动物伦理委员会、兰州兽医研究所生物安全委员会逐级上报，并已在农业农村部备案，符合国家生物安全等级的要求。
[0027]
以下实施例中所述的实验细胞来源：
[0028]
环形泰勒虫感染tadc细胞，由中国农业科学院兰州兽医研究所外寄生虫和虫媒疫病团队提供。细胞在含有10％fbs(购自pan公司)的rpmi 1640完全培养基(购自gibco公司)中，37℃、5％co2培养箱中培养。
[0029]
醋酸棉酚，购至medchemexpress，品牌：mce，货号：hy-17510。
[0030]
实验中其他试剂如果没有特别说明均为常见的市售试剂；实验中的操作如果没有特别说明均是本领域知晓的操作方法。
[0031]
实施例1醋酸棉酚抑制环形泰勒虫感染细胞增殖
[0032]
1.环形泰勒虫感染细胞增殖的变化
[0033]
在24孔板中用含10％fbs的rpmi 1640培养基培养环形泰勒虫喀什株感染的细胞tadc细胞(5
×
105/孔)，实验组用5μm醋酸棉酚药物浓度处理细胞，对照组用dmso(1％)处理细胞；将细胞板置于37℃，5％co2条件培养24h、48h和72h。每个时间记录细胞的数量。
[0034]
结果如图1所示，5μm醋酸棉酚即能够显著抑制环形泰勒虫感染的细胞增殖，且抑制效果明显。
[0035]
2.tasp基因rna转录水平
[0036]
在24孔板中用rpmi 1640 10％fbs培养基培养环形泰勒虫喀什株感染的细胞tadc细胞(5
×
105/孔)，实验组用5μm醋酸棉酚药物浓度处理细胞，对照组用dmso(1％)处理细胞；将细胞板置于37℃，5％co2条件培养24h、48h和72h。将实验组和对照组细胞继续培养24h、48h和72h后，收集细胞培养物，将细胞用pbs洗一遍，离心，弃上清。用trizol法提取总rna，使用iscripttm reverse transcription supermix for rt-qpcr(bio-rad)试剂盒合成cdna后，用q-pcr方法检测tasp基因的转录水平。
[0037]
q-pcr反应体系总体积20μl，包括10μm的上下游引物，90ng的cdna，10μl的sybr green supermix(2
×
)(bio-rad)，补充无菌去离子水到20μl。反应条件为：95℃，10min；95℃，30s，60℃，1min，40cycles；
[0038]
其中tasp引物序列为：上游引物5
’‑
agcagccccttgtcatggg-3’；下游引物5
’‑
taatagcttttgcacggagga-3’。
[0039]
tasp的rna表达水平实验结果如图2所示，醋酸棉酚能够抑制环形泰勒虫tasp基因转录水平，且随药物处理时间的增长，其转录水平逐渐下降。醋酸棉酚化合物剂量为5μm时，即可对tasp基因的转录水平产生显著的抑制效果。
[0040]
3.醋酸棉酚化合物处理环形泰勒虫后对细胞形态的影响
[0041]
在24孔板中用rpmi 1640 10％fbs培养基环形泰勒虫喀什株感染的细胞tadc细胞(5
×
105/孔)，实验组用5μm醋酸棉酚药物浓度处理细胞，对照组用dmso(1％)处理细胞；将细胞板置于37℃，5％co2条件培养24h、48h和72h。将实验组和对照组细胞继续培养24h、48h和72h后，收集细胞培养物。在此期间将载玻片放置于细胞涂片离心机中。静置后的细胞弃200μl上清，其余细胞用pbs缓冲液混匀后取200μl细胞悬液于离心孔中，500rpm离心5min，细胞被涂于载玻片上，将载玻片取下后，快速甩干。用甲醇固定细胞两次，再用姬姆萨染液染色20min，在光学显微镜下观察细胞内的虫体情况，结果如图3所示，其中从左至右依次为对照组、培养24h、48h和72h的镜检结果，结果表明细胞内环形泰勒虫裂殖体数量随着药物处理时间的延长而逐渐减少，在72h时细胞内裂殖体裂殖数量最少。
[0042]
实施例2醋酸棉酚化合物的细胞毒性
[0043]
用cck-8法对醋酸棉酚化合物细胞毒性进行检测。在96孔板中用rpmi 1640 10％fbs培养基培养正常分离的pbmc细胞(2
×
105/孔)，过夜培养，向孔中加入5μm的醋酸棉酚药物，同时设置空白孔(仅含有培养基)，对照孔(含有细胞和培养基)，将培养板在培养箱中孵育72h后，向板的每个孔中加入10μl的cck-8溶液，将培养板在培养箱中孵育4h，在读取平板之前，可以在摇床上温柔的混匀。然后读取酶标仪测量450nm处的吸光度，计算细胞存活率。
[0044]
结果如图4所示，表明醋酸棉酚对细胞的毒性较小，安全性较好。
[0045]
本发明在实验过程中意外发现，相较于其他寄生虫感染疾病，本发明所述醋酸棉酚化合物对环形泰勒虫病具有较好的抑制作用，能够增强免疫反应，并且细胞毒性小，安全性较好，可用于预防或治疗环形泰勒虫病。
[0046]
以上之实施例，只是本发明的较佳实施例而已，并非限制本发明的实施范围故凡依本发明专利范围的构造、特征及原理所做的等效变化或修饰，均应包括于本发明申请专利范围。