碳青霉烯酶联合检测试剂盒的制作方法

1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种碳青霉烯酶联合检测试剂盒。


背景技术：

2.碳青霉烯类抗菌药物是一种抗菌谱广、抗菌作用强、不良反应发生率低的抗菌药物。随着抗菌药物的大量使用，革兰阴性杆菌对碳青霉烯类抗菌药物耐药率不断增高，碳青霉烯类抗生素耐药的肠杆菌科细菌(carbapenem resistant enterobacteriaceae，cre)的检出日益增加。碳青霉烯酶作为细菌主要耐药机制，其编码基因位于染色体或质粒上，通过克隆传播或基因水平转移使细菌对美罗培南、亚胺培南等β-内酰胺类抗菌药物抵抗。根据氨基酸序列同源性以及分子结构特点，可将碳青霉烯酶分为a、b、d三类(ambler分类法)，其中a类为丝氨酸蛋白酶，主要为kpc酶(klebsiella pneumoniae carbapenemase)；b类为金属酶，主要为ndm(new delhi metallo-βlactamase)、vim(verona integron-encoded metallo-β-lactamase)及imp酶(imipenemase)；d类为oxa酶(oxacillinase)，主要为oxa-48酶。其中kpc、ndm、oxa-48碳青霉烯酶是肠杆菌科细菌对碳青霉烯类耐药最主要的耐药机制。
3.目前，常用的检测碳青霉烯酶的方法主要分表型检测法和基因检测法。表型检测方法主要有改良霍奇试验(mht)、基于比色的carba np实验、基于质谱的美罗培南溶解试验(mha)、改良碳青酶烯失活法(mcim)等，这些检测方法所需时间长。此外，生化方法耗时短且敏感性及特异性均较高，但不能区分亚型。激光解吸电离时间飞行质谱(maldi-tof)可用于菌种鉴定、亚型分类及耐药基因检测，主要缺点是仪器成本较高许多实验室难以接受。基因检测法是碳青霉烯酶检测的“金标准”，但人力及成本很高。例如，专利cn202110733877.1公开了一种检测碳青霉烯酶基因的引物和探针，其可以用于快速灵敏地检测样品中kpc、vim、ctx、ges、ndm和imp共6种碳青霉烯酶基因。
4.快速检测产碳青霉烯酶多重耐药和泛耐药菌株可以针对性进行及时有效治疗。目前，已有基于胶体金免疫层析法的试剂应用，例如，专利201680030887.6公开了一种检测生物样品中可能存在的来自产碳青霉烯酶的肠杆菌科(cpe)的选自oxa特别是oxa-48、kpc、vim和/或ndm碳青霉烯酶的一种或多种碳青霉烯酶的方法。专利cn202110166073.8公开了一种抗oxa-23型碳青霉烯酶杂交瘤细胞株、单克隆抗体及应用，获得的抗oxa-23型碳青霉烯酶抗体能够用于检测oxa-23型碳青霉烯酶，可制备成体外诊断试剂盒。
5.因此，亟需提供一种基于胶体金免疫层析法检测kpc、oxa-48、ndm、imp及vim的快速碳青霉烯酶的检测方法。


技术实现要素：

6.针对以上问题，本发明提供了一种碳青霉烯酶联合检测试剂盒。本发明所述的碳青霉烯酶联合检测试剂盒可一次性检测kpc、oxa-48、ndm、imp及vim型五种碳青霉烯酶，可用于碳青霉烯酶耐药菌株的早期分型，指导用药，辅助临床感染控制和治疗。
7.为了实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：
8.一方面，本发明提供了一种碳青霉烯酶联合检测试剂盒，所述的试剂盒包括抗kpc、oxa-48、ndm、imp及vim型碳青霉烯酶抗原结合蛋白。
9.具体地，所述的抗ndm型碳青霉烯酶抗原结合蛋白包含以下互补决定区：
10.(1)包含seq id no:1或seq id no:7任一项所示的氨基酸序列或其变体序列的重链互补决定区1hcdr1；
11.(2)包含seq id no:2或seq id no:8任一项所示的氨基酸序列或其变体序列的重链互补决定区2hcdr2；
12.(3)包含seq id no:3或seq id no:9任一项所示的氨基酸序列或其变体序列的重链互补决定区3hcdr3；
13.(4)包含seq id no:4所示的氨基酸序列或其变体序列的轻链互补决定区1lcdr1；
14.(5)包含seq id no:5或seq id no:10任一项所示的氨基酸序列或其变体序列的轻链互补决定区2lcdr2；
15.(6)包含seq id no:6或seq id no:11任一项所示的氨基酸序列或其变体序列的轻链互补决定区3lcdr3；
16.优选地，所述变体序列为与其来源的cdr相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加的cdr序列；所述的置换为保守置换。
17.进一步具体地，所述的抗ndm型碳青霉烯酶抗原结合蛋白包含：
18.(1)、包含seq id no:12或seq id no:14任一项所示的氨基酸序列的重链可变区vh；和/或包含seq id no:13或seq id no:15任一项所示的氨基酸序列的轻链可变区vl；
19.或者(2)、与(1)中的任一vh相比具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性的vh；和/或，与(1)任一中的vl相比具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性的vl；
20.或者(3)、与(1)中的任一vh相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加或其任意组合的vh；和/或，与(1)中的任一vl相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加或其任意组合的vl；所述的置换是保守置换。
21.进一步具体地，所述的抗ndm型碳青霉烯酶抗原结合蛋白包含：
22.(1)、包含seq id no:12所示的氨基酸序列的重链可变区vh；和/或包含seq id no:13所示的氨基酸序列的轻链可变区vl；和/或
23.(2)、包含seq id no:14所示的氨基酸序列的重链可变区vh；和/或包含seq id no:15所示的氨基酸序列的轻链可变区vl。
24.进一步具体地，上述抗ndm型碳青霉烯酶抗原结合蛋白包括全长抗体、fab、fab’、f(ab’)2、fv、scfv、di-scfv、双特异性抗体、多特异性抗体、重链抗体和/或单域抗体，或由上述抗体制得的单克隆抗体和/或多克隆抗体。
25.具体地，所述的试剂盒还包括金标垫、硝酸纤维素膜、吸水纸、底板和塑料卡。
26.进一步具体的，所述的金标垫包被金标碳青霉烯酶kpc、oxa-48、ndm、imp及vim型五种抗原结合蛋白，硝酸纤维素膜t线(检测线)处包被碳青霉烯酶kpc、oxa-48、ndm、imp及
vim型五种抗原结合蛋白，c线(质控对照线)包被羊抗鼠igg抗体。
27.另一方面，本发明提供了一种碳青霉烯酶检测方法，利用上述试剂盒检测kpc、oxa-48、ndm、imp及vim型五种碳青霉烯酶，所述的检测方法用于非疾病诊断或治疗目的。
28.又一方面，本发明提供了上述试剂盒在检测碳青霉烯酶中的应用。
29.具体地，所述的碳青霉烯酶包括kpc、oxa-48、ndm、imp及vim型五种碳青霉烯酶。
30.与现有技术相比，本发明的积极和有益效果在于：
31.(1)本发明所述的试剂盒(胶体金免疫层析法)中的检测试纸在硝酸纤维素膜的检测区固定了抗kpc、oxa-48、ndm、imp及vim型碳青霉烯酶单克隆抗体(包被抗体)，在对照区固定了羊抗鼠igg多抗，在免疫金垫上预包被抗kpc、oxa-48、ndm、imp及vim型碳青霉烯酶单克隆抗体(标记抗体)-胶体金。测试时，滴加100μl样本混合的缓冲液，水平放置。免疫金垫上的抗kpc、oxa-48、ndm、imp及vim型碳青霉烯酶单克隆抗体(标记抗体)-胶体金会溶解，如样本中含有kpc、oxa-48、ndm、imp及vim型碳青霉烯酶，抗kpc、oxa-48、ndm、imp及vim型碳青霉烯酶单克隆抗体(标记抗体)-胶体金与样本中的kpc、oxa-48、ndm、imp及vim型碳青霉烯酶结合在一起，形成“抗原-抗体-金”复合物，复合物沿着试纸条向后方移动，首先到达包被了抗kpc、oxa-48、ndm、imp及vim型碳青酶烯酶单克隆抗体(包被抗体)的检测区，“抗原-抗体-金”复合物将同抗kpc、oxa-48、ndm、imp及vim型碳青霉烯酶单克隆抗体(包被抗体)结合，并在检测线上滞留下来，形成一条红色的线，这表示阳性结果。线条颜色的深浅同样本中的碳青霉烯酶的浓度成正比关系。该区里如果没有带颜色的线条表示样本中不含kpc、oxa-48、ndm、imp及vim型碳青酶烯酶或kpc、oxa-48、ndm、imp及vim型碳青酶烯酶低于本试纸最低检出限。复合物继续移动，到达包被了羊抗鼠igg多抗的对照区，游离的“抗体-金”复合物将同羊抗鼠igg多抗结合在一起而富集在对照区，形成一条红色的线。对照线的出现证明试纸条检测功能正常。无论样本中是否含有kpc、oxa-48、ndm、imp及vim型碳青酶烯酶，在有效试验中，试纸条的对照区都应当出现淡红至紫红色的对照线。样本继续移动，通过对照区进入吸收区。吸收区的作用是吸附剩余的复合物，使其在试纸条内移动，并消除本底的颜色。自试纸条加入稀释后的样本混合液起计时，10-15分钟内方可读取结果。
32.(2)本发明提供了一种碳青霉烯酶ndm抗体，所述的碳青霉烯酶ndm抗体与碳青霉烯酶ndm具有较好的亲和力，可制备成检测试剂盒用于碳青霉烯酶耐药菌株的早期分型，指导用药，从而辅助临床感染控制和治疗。
33.(3)本发明所述的试剂盒操作简单，具有较好的检测灵敏度和准确性。
具体实施方式
34.下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
35.实施例1.ndm单克隆抗体的制备
36.1.小鼠免疫
37.采用ndm蛋白(氨基酸序列如美国国立生物技术信息中心ncbi baj10873所示)免疫6周龄左右的雌性balb/c小鼠，进行抗体制备。ndm蛋白浓度为1mg/ml，免疫剂量为50μg/
只。首次免疫，将ndm蛋白与弗氏完全佐剂按体积比1：1混合乳化均匀后，腹腔注射。第14d和第28d，将ndm蛋白与弗氏不完全佐剂按体积比1：1混合乳化均匀后，腹腔注射，进行第二次、第三次免疫。第42d，取ndm蛋白溶于pbs进行第四次免疫。分别于第21d和第35d进行滴度测试，检测免疫效果。
38.2.细胞融合及培养
39.免疫第45d提取小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞按计数比1:5混合。混合后加入rpmi 1640培养基至50ml，1500rpm离心5min，去上清。将细胞沉淀置于37℃条件下融合，加入1ml预热的融合剂，静置2min后，缓慢加入2ml预热的rpmi1640培养基。混匀后，1500rpm离心5min，去上清。将融合后的细胞液铺入已加有饲养细胞的细胞板中，5％co2培养箱中37℃培养。
40.3.杂交瘤阳性克隆细胞筛选
41.培养7天后，用新鲜的hat培养基置换细胞培养液，继续培养，14天后采用有限稀释法进行二次筛选阳性细胞，将细胞进行3-4次稀释，选择阳性值最高的细胞扩大培养，得到杂交瘤阳性克隆细胞株。
42.4.单克隆抗体的制备
43.取10周龄左右的雌性balb/c小鼠，按照1ml/只的剂量腹腔注射不完全弗氏佐剂，3d后按照5
×
105个细胞/只的剂量腹腔注射培养至对数期的杂交瘤细胞，约7-14d，观察小鼠腹部，待小鼠腹部隆起后抽取腹水，每隔3d抽取一次腹水，直至无腹水产生或小鼠状态不良。纯化小鼠腹水制备得到单克隆抗体。
44.本发明制备得到2个单克隆抗体，抗体序列信息如下表1所示。
45.表1
46.单克隆抗体ndm抗体andm抗体b重链cdr1seq id no:1seq id no:7重链cdr2seq id no:2seq id no:8重链cdr3seq id no:3seq id no:9轻链cdr1seq id no:4seq id no:4轻链cdr2seq id no:5seq id no:10轻链cdr3seq id no:6seq id no:11重链可变区seq id no:12seq id no:14轻链可变区seq id no:13seq id no:15
47.实施例2.ndm抗体亲和力检测
48.采用elisa法检测本发明实施例1制备得到的ndm抗体与ndm蛋白的结合能力。具体实验过程如下：取ndm蛋白稀释成1μg/ml浓度，按100μl/孔加入96孔板中，4℃过夜。96孔板用pbst洗三遍，加入含有2％bsa的pbs溶液，放置于37℃1h。取ndm抗体进行浓度梯度稀释后分别加入96孔板中，37℃孵育1h。pbst洗三遍，加入羊抗鼠二抗，置于37℃孵育30-60min。pbst洗三遍后，加入tmb显色液10min，终止显色，测定各个孔od值，计算出解离常数kd。
49.经检测，本发明制备的ndm抗体与ndm蛋白具有很好的结合能力，其中，抗体a的中值kd为5.2pm，抗体b的中值kd为3.9pm。
50.实施例3.碳青霉烯酶联合检测试剂盒
51.本发明使用胶体金法制备碳青霉烯酶检测卡，制备双抗体夹心法免疫胶体金试剂盒。本发明所述的试剂盒中，抗体a可作为包被抗体，抗体b作为金标抗体；同时，也可将抗体b作为包被抗体，抗体a作为金标抗体。
52.以下试剂盒中采用抗体a作为包被抗体，抗体b作为金标抗体；其中，ndm抗体a和抗体b如上述表1所示；kpc抗体a购自广州博康生物技术有限公司，货号为c661，kpc抗体b购自广州博康生物技术有限公司，货号为c663；vim抗体a购自广州博康生物技术有限公司，货号为c691，vim抗体b购自广州博康生物技术有限公司，货号为c692；imp抗体a购自广州博康生物技术有限公司，货号为c681，imp抗体b购自广州博康生物技术有限公司，货号为c682；oxa-48抗体a购自广州博康生物技术有限公司，货号为c652，oxa-48抗体b购自广州博康生物技术有限公司，货号为c653。
53.1.检测试剂条的制备：
54.(1)检测线包被液制备：用0.01m ph7.0-7.6磷酸盐缓冲液和3％的蔗糖溶液，将上述抗体a分别配制成2mg/ml待用。
55.(2)对照线包被液配制：用0.01m ph7.0-7.6磷酸盐缓冲液和3％的蔗糖溶液，将羊抗鼠igg抗体配制成2mg/ml待用。
56.(3)划线：取上述制备的检测线包被液和对照线包被液分别装入喷膜机中，在硝酸纤维素膜(膜的规格为25mm
×
310mm)上按0.1μl/mm的量划上检测线和对照线。
57.(4)包被：将上述硝酸纤维素膜置于37℃温育2h。
58.(5)封闭：将温育后的硝酸纤维素膜放入0.5％bsa封闭液中浸泡30min，再用蒸馏水洗两次，在37℃真空干燥器内干燥16h，真空度0.1。
59.(6)封装：在干燥室内(湿度＜20％)，将干燥好的硝酸纤维素膜装入铝箔袋内，封口。外加干燥剂防潮。
60.2.结合物垫的制备
61.金标抗体浓度和ph的选择：采用交叉配比法，碳青霉烯酶抗体最适标记浓度均为2mg/ml，ph为7.0-7.6。
62.(1)胶体金的准备：取aucl4稀释为0.01％的水溶液，煮沸，搅动下准确加入1％柠檬酸三钠水溶液0.7ml，金黄色的氯金酸水溶液在2分钟内变为紫红色，继续煮沸15min，冷却后以蒸馏水恢复到原体积。
63.(2)偶联：将以上制备好的胶体金溶液先用0.2m k2co3调节ph值至最适范围7.0-7.6，再按最适标记浓度比例加抗体b标记，室温搅拌30min。
64.(3)封闭：加入10％peg20000使其终浓度为1％，搅拌20min。
65.(4)包被：取10mm
×
310mm硝酸纤维素膜在上述封闭后的溶液中浸泡5-10min。
66.(5)干燥：将上述硝酸纤维素膜放入真空干燥器内干燥20h，真空度0.1。
67.(6)封装：在干燥室内(湿度＜20％)，将已干燥好的硝酸纤维素膜装入事先装有干燥剂的铝箔袋内，机器封口。
68.3.样本缓冲液
69.所用样本缓冲液为磷酸缓冲液(pb)配制：称取2.84g磷酸氢二钠溶于高纯水，容量瓶定容至100ml，即为0.2m磷酸氢二钠溶液；称取2.40g磷酸二氢钠溶于高纯水，容量瓶定容至100ml，即为0.2m磷酸二氢钠溶液；用0.22μm滤头过滤，2-8℃保存备用。量取19ml 0.2m磷
酸二氢钠溶液，81ml 0.2m磷酸氢二钠溶液，加入1900ml高纯水，混匀，即为0.01m，ph＝7.4的磷酸缓冲液(pb)，2-8℃密闭保存备用。
70.4.检测
71.实验开始前，将试剂盒和含待测克隆菌株的平板恢复至室温(15-30℃)。打开包装袋取出检测卡。
72.检验步骤：
73.(1)准备一个无菌ep管滴加10滴样本处理液。
74.(2)使用一次性细菌环蘸取克隆菌株并将该环插入至含有样本处理液的无菌ep管中。
75.(3)充分搅拌使溶液均匀。
76.(4)取100μl稀释后的样本加至检测卡的加样孔处。
77.(5)等待15分钟后读取结果。
78.5.分别取阴性样本及阳性样本，采用上述试剂盒及检测方法进行检测。检测结果如下表2所示。
79.表2
[0080][0081]
注： 表示检测阳性；-表示检测阴性。
[0082]
由表2可知，阴性样品检测结果呈阴性，阳性样品结果为阳性，证明通过本技术制
备得到的试剂盒能够快速检测kpc、oxa-48、ndm、imp及vim型碳青霉烯酶及kpc、oxa-48、ndm、imp及vim型碳青霉烯酶阳性样本，其检测限低且操作方便。
[0083]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。