一种用于预防与治疗奶牛乳房炎的中药饲料添加剂

1.本发明属于饲料添加剂应用技术领域，具体涉及一种用于预防与治疗奶牛乳房炎的中药饲料添加剂。


背景技术：

2.作为奶牛场发病率高、治愈率低的重要疾病，奶牛乳房炎严重影响奶牛业健康发展。世界各国研究人员对乳房炎的诊断与预防做了大量研究，但由于诱发因素多样性，还没有非常有效的预防和治疗手段。目前，奶牛乳腺炎的治疗主要依靠大剂量使用抗生素，但抗生素不合理使用，不仅会导致病原菌产生耐药性，且牛奶中兽药残留也会间接影响人类健康。在此背景下，应开发新型天然替抗药品，并寻找新治疗靶点，可为奶牛乳房炎的防治开辟新途径。
3.h2s一直以来被认为是一种具有刺激性气味的有毒气体，多年研究结果表明，h2s也是是继第三种气体信号分子，其参与血管张力调节、神经调节、细胞保护、炎症、凋亡等生物过程。内源性h2s在机体内处于相对平衡状态，且发挥着重要生理调节功能，研究结果显示，添加外源h2s供体nahs可显著抑制小鼠主动脉根部动脉粥样硬化斑块，并抑制血管炎症反应。也有研究表明，h2s具有显著抑制肺组织内中性粒细胞聚集、减轻lps引起的肺水肿和肺毛细血管通透性增高等作用。以上结果都提示h2s在炎症发生早期具有抗炎抗损伤的作用，针对h2s开发具有-sh基团的天然外源供体，可为奶牛乳房炎防治提供新思路与方法。
4.作为中药单体的萝卜硫素(sulforaphane，sfn)是最有前途的抗癌活性物质之一，是迄今为止蔬菜中发现抗癌活性最强的物质，同时其-sh基团水解可促使h2s合成。萝卜硫素具有抗氧化，抗紫外线功能。主要存在于西兰花、芥蓝等十字花科植物中。十字花科植物在生长过程中产生次级代谢产物硫代葡萄糖苷。完整的硫代葡萄糖苷几乎没有抗癌活性，当植物水解而使细胞破碎时，内源性芥子酶被释放出来，将硫代葡萄糖苷水解为异硫氰酸盐，后经芥子酶水解形成萝卜硫素，目前已有许多研究表明其具有抗炎作用，但暂无针对其对奶牛乳房炎的防治效果并没有相关报道。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种针对奶牛具有良好的防治效果的用于预防与治疗奶牛乳房炎的中药饲料添加剂。
6.为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：
7.一种用于预防与治疗奶牛乳房炎的中药饲料添加剂，由如下重量份的原料组成：杜仲叶25～35份、川桂皮20～30份、冬青叶10～ 15份、萝卜硫素5～8份、松针粉4～9份、王不留行10～13份、黄芪6～10份、苍术6～10份、木香3～5份、甘草1～3份。
8.所述的用于预防与治疗奶牛乳房炎的中药饲料添加剂的制备方法，包括如下步骤：
9.1)用蒸馏水洗净杜仲叶、川桂皮并除去杂物，粉碎成10目～20 目筛，晾干，得粉碎
物q，备用；
10.2)将冬青叶揉碎后与松针粉进行混合，得混合物w，然后加入乙醇浸泡，加热提取2～3次，得浸膏物s，备用；
11.3)将王不留行和黄芪置于粉碎机中进行粉碎，得粉碎物r，然后将粉碎物r与乙醇混合以生产提取混合物，得提取物t和提取液y, 将提取液y进行过滤，经截流分子量30000～50000的超滤柱超滤，然后经加热至浓缩状，得浓缩物x，备用；
12.4)将苍术、木香和甘草混合后加入混合物重量的1.8～2.0重量份的去离子水进行回流提取，得残渣和提取液m，将残渣继续加入乙醇进行回流提取，得提取液n，将提取液m、提取液n、萝卜硫素与步骤1)、2)、3)中的粉碎物q、浸膏物s和浓缩物x混匀干燥，置于50～60℃条件下烘干，并置于避光干燥低温处保存。
13.进一步地，所述的用于预防与治疗奶牛乳房炎的中药饲料添加剂，由如下重量份的原料组成：杜仲叶30份、川桂皮25份、冬青叶 12份、萝卜硫素7份、松针粉6份、王不留行11份、黄芪8份、苍术8份、木香4份、甘草2份。
14.根据以上特征，所述步骤3)中的超滤膜孔径为0.002～0.003。
15.根据以上特征，所述步骤3)中的乙醇体积为70％～80％。
16.根据以上特征，所述步骤4)中烘干后在80℃～100℃下灭菌15～ 20min。
17.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
18.1)本发明中采用的萝卜硫素(sfn)是一种天然有机硫化学物质，其具有抗癌症、抗氧化、抗炎症、神经保护等功效，可用于多种炎症类疾病的预防。
19.2)本发明中的sfn作为中药单体成分，广泛存在于西兰花、卷心菜、芥蓝等十字花科植物中，与常用广谱抗生素相比，具有安全、绿色、高效的优点。
20.3)本发明中sfn可诱导机体内源性硫化氢的产生，内源性硫化氢作为一种气体信号分子，较低浓度下可在机体中发挥抗炎作用，sfn 与传统硫化氢供体nahs都可促进硫化氢产生。本发明中的新型饲料产品，能有效防治奶牛乳房炎从而提升奶牛产奶量。
附图说明
21.图1为本发明从3739个deps中筛选与硫氨基酸代谢相关的候选 go terms及deps的示意图。
22.图2为本发明与硫氨基酸代谢相关的候选deps和kegg pathway 的示意图。
23.图3为本发明乳腺病理检查及cbs/cth mrna和蛋白的表达和分布的示意图。
24.图4为本发明细胞鉴定、炎症相关基因的mrna和蛋白质表达以及lps诱导的mac-t中的cbs/cth的示意图。
25.图5为本发明nahs和bca对mac-t细胞cth/cbs和il-1β/il-8 的mrna和蛋白表达的影响的示意图。
26.图6为本发明sfn对mac-t细胞活性的影响的示意图。
27.图7为本发明sfn对mac-t细胞cth/cbs的mrna和蛋白表达的影响的示意图。
28.图8为本发明sfn对mac-t细胞炎症因子mrna表达的影响的示意图。
具体实施方式
29.下面将参照附图更详细地描述本发明的实施例。虽然附图中显示了本发明的实施例，然而应该理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了使本发明更加透彻和完整，并且能够将本发明的范围完整地传达给本领域的技术人员。本领域的技术人员可以在不偏离本发明精神和保护范围的基础上从下述描述得到替代技术方案。
30.实施例1
31.一种用于预防与治疗奶牛乳房炎的中药饲料添加剂，由如下重量份的原料组成：杜仲叶25～35份、川桂皮20～30份、冬青叶10～ 15份、萝卜硫素5～8份、松针粉4～9份、王不留行10～13份、黄芪6～10份、苍术6～10份、木香3～5份、甘草1～3份。
32.所述的用于预防与治疗奶牛乳房炎的中药饲料添加剂的制备方法，包括如下步骤：
33.1)用蒸馏水洗净杜仲叶、川桂皮并除去杂物，粉碎成10目～20 目筛，晾干，得粉碎物q，备用；
34.2)将冬青叶揉碎后与松针粉进行混合，得混合物w，然后加入乙醇浸泡，加热提取2～3次，得浸膏物s，备用；
35.3)将王不留行和黄芪置于粉碎机中进行粉碎，得粉碎物r，然后将粉碎物r与乙醇混合以生产提取混合物，乙醇体积为70％～80％，得提取物t和提取液y,将提取液y进行过滤，经截流分子量30000～ 50000的超滤柱超滤，所述超滤膜孔径为0.002～0.003，然后经加热至浓缩状，得浓缩物x，备用；
36.4)将苍术、木香和甘草混合后加入混合物重量的1.8～2.0重量份的去离子水进行回流提取，得残渣和提取液m，将残渣继续加入乙醇进行回流提取，得提取液n，将提取液m、提取液n、萝卜硫素与步骤1)、2)、3)中的粉碎物q、浸膏物s和浓缩物x混匀干燥，置于50～60℃条件下烘干，并置于避光干燥低温处保存。
37.实施例2
38.一种用于预防与治疗奶牛乳房炎的中药饲料添加剂，由如下重量份的原料组成：杜仲叶30份、川桂皮25份、冬青叶12份、萝卜硫素7份、松针粉6份、王不留行11份、黄芪8份、苍术8份、木香 4份、甘草2份。
39.实施例3
40.一种用于预防与治疗奶牛乳房炎的中药饲料添加剂，由如下重量份的原料组成：杜仲叶35份、川桂皮30份、冬青叶15份、萝卜硫素8份、松针粉9份、王不留行13份、黄芪10份、苍术10份、木香5份、甘草3份。
41.实验例
42.1、从3739个deps中筛选与硫氨基酸代谢相关的候选go terms 及deps，如图1所示：
43.由图1可知，(a-c)根据对照组和临床乳腺炎组的deps(p《0.05)， go分析将蛋白质分为三个功能组：生物过程(bp)、分子功能(mf) 和细胞成分(cc)(p《0.05)，x轴代表deps的数量。(d)与bp、 mf和cc相关deps的维恩图。(e)蛋白质-蛋白质相互作用(ppi) 网络调控分析与含硫氨基酸代谢和生物合成过程相关的17个deps和 9个go项。(f)dia蛋白质组学使用
log2(fc)值量化17个dep 的相对表达水平。(g)17个dep的热图与硫氨基酸代谢和生物合成过程有关。
44.2、与硫氨基酸代谢相关的候选deps和kegg pathway，如图2 所示：
45.由图2可知，(a)kegg途径富集圈图：最外层的颜色代表与硫氨基酸代谢和生物合成过程有关的不同kegg分类；第二层包含差异基因数量和显著富集程度的信息；第三层显示基因的上下调节；第四层是每个通路的富集因子(b)与硫氨基酸代谢和生物合成过程相关的五种kegg分类的颠覆维恩图。(c)24个deps的火山图，包括8 个下调和16个上调蛋白质。(d)蛋白质-蛋白质相互作用(ppi)网络调控分析和关于24个deps的氨基酸生物合成以及12个dep的半胱氨酸和蛋氨酸代谢的热图分析。
46.3、乳腺病理检查及cbs/cth mrna和蛋白的表达和分布，如图3 所示：
47.由图3可知，(a)通过h&e染色检查对照组(c)和临床乳腺炎组(cm)的代表性病理表现(400x)确认。(b-c)通过免疫组织化学(ihc)和免疫荧光(if)染色对乳腺组织中的ck-18、cbs和cth 蛋白进行细胞内定位分析(400x)。(ct：结缔组织；ma：乳腺腺泡；mec：乳腺上皮细胞；pn：吞噬性中性粒细胞)。(d)在血清样本中检测h2s水平。(e-f)以gapdh为内对照，检测乳腺组织中cbs 和cth mrna表达水平。(g)不同组织样本的cbs和cth蛋白及β
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肌动蛋白的western blot分析。(h-i)乳腺组织中cbs和cth蛋白的相对积分光密度。*表示差异显著(p＜0.05)；**表示差异极显著 (p＜0.01)。
48.4、细胞鉴定、炎症相关基因的mrna和蛋白质表达以及lps诱导的mac-t中的cbs/cth，具体如图4所示：
49.由图4可知，(a)通过细胞爬片和免疫细胞化学(icc)染色对 mac-t细胞中的ck-18、cbs和cth蛋白进行细胞内定位分析。(b) 用cck-8测定不同浓度lps对mac-t细胞24小时存活率的影响。(c-d) 通过qpcr检测il-1β(c)和il-8(d)mrna的相对水平，并通过 gapdh标准化。(e-g)不同浓度lps孵育的mac-t细胞中cbs(f) 和cth(g)的western blot分析和(e)相对积分光密度。(h-i) 通过qpcr测量cth(h)和cbs(i)mrna的相对水平，并通过gapdh 标准化。(j-l)不同浓度lps孵育的mac-t细胞中cbs(k)抗cth (l)的western blot分析和(j)相对积分光密度。*或#表示差异显著(p＜0.05)；**或##表示差异极显著(p＜0.01)。在f和i中表示差异显著，而在e和h中则表示差异极显著。
50.5、nahs和bca对mac-t细胞cth/cbs和il-1β/il-8的mrna 和蛋白表达的影响，具体如图5所示：
51.(a)用cck-8测定不同浓度的bca对mac-t细胞24小时存活率的影响。(b)在不同处理的mac-t上清液中检测h2s水平。(c-f) 通过qpcr测量cbs(c)和cth(d)、il-1β(e)和il-8(f)mrna 的相对水平，并通过gapdh标准化。(g/j)mac-t细胞样本中抗cth、抗cbs、抗il-1β和抗il-8蛋白及β-肌动蛋白的western blot分析。(h-i)不同处理的mac-t细胞中cth和cbs的相对积分光密度。 (k-l)不同处理的mac-t细胞中抗il-1β和抗il-8的相对积分光密度。*表示差异显著(p＜0.05)；**表示差异极显著(p＜0.01)。
52.6、sfn对mac-t细胞活性的影响，具体如图6所示：
53.由图6可知，(a)cck-8试剂盒检测不同浓度sfn对mac-t细胞24小时存活率的影响。(b)倒置显微镜观察不同浓度sfn对mac-t 细胞24小时存活率的影响。
54.7、sfn对mac-t细胞cth/cbs的mrna和蛋白表达的影响，具体如图7所示：
55.由图7可知，(a)在sfn处理的mac-t细胞上清液中检测h2s 水平。(b)sfn处理的mac-t细胞中cbs mrna相对表达水平；(c) sfn处理的mac-t细胞中cth mrna相对表达水平。(d)sfn处理的 mac-t细胞中cbs和cth蛋白及β-actin的western blot分析；(e-f) mac-t细胞中cth(e)和cbs(f)蛋白表达相对积分光密度。
56.8、sfn对mac-t细胞炎症因子mrna表达的影响，具体如图8所示：
57.(a)sfn处理的mac-t细胞中il-1βmrna相对表达水平；(b) sfn处理的mac-t细胞中il-6mrna相对表达水平。(d)sfn处理的 mac-t细胞中il-8mrna相对表达水平。
58.以上所述，仅为本公开的具体实施方式，但本公开实施例的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本公开实施例揭露的技术范围内或者在本公开实施例揭露的思想下，可轻易想到变化、替换或组合，都应涵盖在本公开实施例的保护范围之内。