一种冠状金-钯纳米异质材料及其制备方法和应用

1.本发明属于光敏纳米材料技术领域，具体涉及一种冠状金-钯纳米异质材料及其制备方法和应用。


背景技术：

2.光疗已经广泛应用于恶性肿瘤的治疗，与手术、放疗、化疗等常规治疗手段相比，光疗具有非侵入性、低毒性、靶向性高、副作用小等优势。
3.光疗，主要包括光热疗法和光动力疗法，通常使用光疗剂在光照下选择性地杀死肿瘤细胞。ptt通常利用光热剂在光照下产生高温来“烧伤”肿瘤细胞。pdt则是依靠特定波长的激光照射使光敏剂受到激发，进而将周围的氧分子转变为活性氧（ros），从而杀死肿瘤细胞。利用二者的协同作用将光热治疗与光动力治疗结合到一个诊疗系统中可以很好地用来治疗癌症。但是目前纳米材料光疗还有一些缺点：（1）、光疗中目前最常用的方法是将有机光敏剂载入到光热材料中以实现ptt/pdt协同治疗，这样就使得设计变的繁琐而不智能；（2）、同时具有ptt和pdt功能的纳米粒子的光疗效果很低；（3）、光疗后死亡的肿瘤细胞可以释放肿瘤相关抗原，诱导特异性的细胞毒性t淋巴细胞（cytotoxictlymphocyte，ctl）生成。ctl浸润到远处的肿瘤中，消灭癌细胞。光疗激活的免疫细胞可分泌大量的抗肿瘤细胞因子，如白细胞介素（il-6），肿瘤坏死因子α（tnf-α）和干扰素γ（ifn-γ）、白细胞介素12（il-12）等，也参与了肿瘤细胞的杀伤。但是，由于光疗对免疫系统的刺激不足，目前光疗只能消除原位肿瘤，不能完全清除转移的癌细胞。
4.受到生物体免疫系统的启发，具有病毒状（尖峰颗粒）的纳米颗粒在体外和体内可以激活和增强免疫应答。纳米钉向细胞施加机械应力，导致吞噬作用期间巨噬细胞和dc的钾外流和炎性小体激活。炎性小体能够调节凋亡蛋白（caspase-1）的活化，进而促进细胞因子前体pro-il-1β成熟为il-1β，增强抗原特异性的细胞免疫反应，并引发针对肿瘤生长的保护性免疫。然而，该过程很少报道，找到具有光疗特性且能有效激活免疫系统进行原位肿瘤消除并有效抑制肿瘤复发和转移的最佳病毒状纳米材料仍然是一个很大的挑战。


技术实现要素：

5.为了克服现有技术的不足，解决光热/光动力协同治疗癌症时光动力效率低且只能消除原位肿瘤，不能完全清除转移癌细胞的技术问题，本发明提供一种冠状金-钯纳米异质材料及其制备方法和应用。
6.为实现上述目的，本发明是根据以下技术方案实现的：一种冠状金-钯纳米异质材料，所述冠状金-钯纳米异质材料中金元素的存在形态为纳米金棒，钯元素的存在形态为凸起，并且钯凸起无规则地生长在纳米金棒的外表面上，金元素和钯元素的质量比为1:(0.1-0.5)。
7.进一步地，所述纳米金棒的直径为10.9nm、长径比为3.6，钯凸起的长度为11nm。
8.进一步地，所述金元素和钯元素的质量比为1:0.3。
9.一种冠状金-钯纳米异质材料的制备方法，包括以下步骤：s1、将十六烷基氯化吡啶一水合物加入水中充分搅拌溶解，直至溶液呈透明状态，配制成浓度为1-100mmol/l的十六烷基氯化吡啶一水合物溶液，用于控制金-钯纳米异质材料表面的冠状结构，然后将溶液加热至65℃留待后步使用；s2、向步骤s1加热后的溶液中加入2ml四氯钯酸钠溶液和4ml纳米金棒，四氯钯酸钠溶液的浓度为10-100mmol/l，通过控制napdcl4的含量，将混合溶液的等离子共振吸收峰调节至靠近800纳米处，纳米金棒的吸光值为1、直径为10.9nm、长径比为3.6；s3、向步骤s2制备的混合液中加入新鲜的、浓度为100mmol/l的抗坏血酸溶液，快速搅拌2分钟后保持65℃恒温静置2小时；s4、将步骤s3制得的混合溶液通过离心得到纳米粒子，然后纳米材料用水清洗至少3遍，制得冠状金-钯纳米异质结构材料。
10.进一步地，在所述步骤s2中，纳米金棒通过种子介导生长的方法制得，包括以下步骤：s2-1、制备金元素种子溶液：取0.25ml浓度为10mmol/l的四氯金酸加入5ml浓度为200mmol/l的十六烷基三甲基溴化铵溶液中，制得种子溶液留待后步使用；s2-2、制备生长溶液
①
、称取3.08g十六烷基三甲基氯化铵和0.77g油酸钠加入250ml水中，加热溶解直至溶液透明；
②
、保持步骤
①
中混合液的加热温度，并向其中加入6ml浓度为4mmol/l的硝酸银和250ml浓度为5mmol/l的四氯金酸，在30℃下搅拌150分钟至溶液无色透明；
③
、向步骤
②
制得的无色透明溶液中加入2ml浓度为37wt%的盐酸溶液，搅拌15分钟；
④
、首先，将步骤s2-1制得的种子溶液在剧烈搅拌下加入0.6ml浓度为10mmol/l的硼氢化钠溶液，所获得的棕黄色溶液在30℃下老化30分钟；与此同时，向步骤
③
制得的溶液中加入0.62ml浓度为64mmol/l的抗坏血酸溶液，剧烈搅拌30秒；最后，将0.4~0.6ml老化完成的种子溶快速注入混合溶液中；
⑤
、将步骤
④
制得的溶液搅拌1分钟，并在30℃条件下静置过夜生长，制得纳米金棒。
11.进一步地，在所述步骤
④
中，通过调整种子溶液加入的含量从而调节au纳米棒的长径比。
12.进一步地，在所述步骤s4中，离心转速为7000rpm，离心时间为10分钟。
13.本发明还提出了一种采用上述方法制得的冠状金-钯纳米异质材料的应用，所述冠状金-钯纳米异质材料用于近红外光激发条件下杀伤原位肿瘤细胞并抑制肿瘤复发和转移的药物中。
14.与现有技术相比本发明的有益效果为：本发明提供一种简单、高效、方便合成冠状金-钯纳米异质材料的方法。合成的冠状金钯纳米异质材料有很强的近红外光吸收能力，在近红外光照射下能够有效地促进电子
和空穴的分离，从而非常有效地提高材料的光热和光动力效率，可以有效的杀伤原位肿瘤细胞。而冠状金钯纳米异质结本身带有的毛刺性质及光疗后产生的大量肿瘤相关抗原可以促进树突细胞的成熟和活化，进一步诱导特异性的细胞毒性t淋巴细胞生成，有效抑制肿瘤的复发和转移。
附图说明
15.下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。
16.图1为冠状金-钯纳米异质材料的透射电子显微镜照片；图2为冠状金-钯纳米异质材料的吸收光谱图，图中由左向右依次为紫外光-可见光-近红外光；图3为冠状金-钯纳米异质材料在808nm近红外光照射下的光热升温曲线图；图4为冠状金-钯纳米异质材料在808nm近红外光照射下产生活性氧自由基（即光动力学性能）的曲线图；图5为冠状金-钯纳米异质材料本身带有的毛刺性质促进树突细胞的成熟和活化的流式数据图，共刺激分子（cd80、cd86）的表达是dc成熟的标志；图6为冠状金-钯纳米异质材料在光疗后产生的大量肿瘤相关抗原促进树突细胞的成熟和活化的流式数据图；图7为冠状金-钯纳米异质材料的生物安全性测试图；图8为冠状金-钯纳米异质材料对肿瘤细胞杀伤能力测试图；图9为实施例2制备的冠状金-钯纳米异质材料的透射电子显微镜照片。
17.图10为实施例3制备的冠状金-钯纳米异质材料的透射电子显微镜照片。
具体实施方式
18.以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件。另外，对于本领域技术人员而言，在不偏离本发明的实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
19.实施例1本发明提供一种具有光热和光动力协同治疗能力来杀伤原位肿瘤，并利用材料本身带有的毛刺性质及光疗后产生的大量肿瘤相关抗原诱导特异性的细胞毒性t淋巴细胞生成，有效抑制肿瘤的复发和转移的冠状金-钯纳米异质材料。其中，所述纳米金棒的直径为10.9nm、长径比为3.6，钯凸起的长度为11nm，一种冠状金-钯纳米异质材料的制备方法，包括以下步骤：s1、将十六烷基氯化吡啶一水合物加入水中充分搅拌溶解，直至溶液呈透明状态，配制成浓度为1mmol/l的十六烷基氯化吡啶一水合物溶液，然后将溶液加热至65℃留待后步使用；s2、向步骤s1加热后的溶液中加入2ml四氯钯酸钠溶液和4ml纳米金棒，四氯钯酸钠溶液的浓度为50mmol/l，纳米金棒的吸光值为1、直径为10.9nm、长径比为3.6；其中，纳米金棒通过种子介导生长的方法制得，包括以下步骤：
s2-1、制备金元素种子溶液：取0.25ml浓度为10mmol/l的四氯金酸加入5ml浓度为200mmol/l的十六烷基三甲基溴化铵溶液中，制得种子溶液留待后步使用；s2-2、制备生长溶液
①
、称取3.08g十六烷基三甲基氯化铵和0.77g油酸钠加入250ml水中，加热溶解直至溶液透明；
②
、保持步骤
①
中混合液的加热温度，并向其中加入6ml浓度为4mmol/l的硝酸银和250ml浓度为5mmol/l的四氯金酸，在30℃下搅拌150分钟至溶液无色透明；
③
、向步骤
②
制得的无色透明溶液中加入2ml浓度为37wt%的盐酸溶液，搅拌15分钟；
④
、首先，将步骤s2-1制得的种子溶液在剧烈搅拌下加入0.6ml浓度为10mmol/l的硼氢化钠溶液，所获得的棕黄色溶液在30℃下老化30分钟；与此同时，向步骤
③
制得的溶液中加入0.62ml浓度为64mmol/l的抗坏血酸溶液，剧烈搅拌30秒；最后，将0.4ml老化完成的种子溶快速注入混合溶液中，通过调整种子溶液加入的含量从而调节au纳米棒的长径比；
⑤
、将步骤
④
制得的溶液搅拌1分钟，并在30℃条件下静置过夜生长，制得纳米金棒。
20.s3、向步骤s2制备的混合液中加入新鲜的、浓度为100mmol/l的抗坏血酸溶液，快速搅拌2分钟后保持65℃恒温静置2小时；s4、将步骤s3制得的混合溶液通过离心得到纳米粒子，离心转速为7000rpm，离心时间为10分钟；然后纳米材料用水清洗至少3遍，制得冠状金-钯纳米异质结构材料。
21.在本实施例1制得冠状金-钯纳米异质结构材料中，金元素和钯元素的质量比为1:0.3，钯凸起的长度为11nm。
22.本实施例1制备的冠状金-钯纳米异质材料的性能测试实验：一、冠状金-钯纳米异质材料的光热能力测试：1）取 1 ml 的冠状金-钯纳米异质材料（100 μg ml-1
）于石英比色皿中，固定好；2）用 808 nm 激光以 0.75 w cm-2
的功率照射上述溶液10分钟；3）照射过程中，每30秒记录一次温度数值，用于绘制光热曲线；二、冠状金-钯纳米异质材料的光动力性能测试：1）将20 μl冠状金钯纳米异质结材料（100μg/ml）与80 μl 2’，7
’‑
二氯荧光黄二乙酸酯（dcfh-da，29 μm）混合；2）用808 nm激光以0.75 w cm-2
的功率照射上述溶液10分钟；3）共同孵育24小时后，以激发波长为490 nm，收集500-600nm内dcf的荧光发射光谱；三、冠状金钯纳米异质结材料本身对树突细胞的体外免疫刺激：1）从大约8周龄的balb/c小鼠的骨髓中分离树突细胞，并在含有10%胎牛血清、青霉素（100μg /ml）、链霉素（100μg/ml）、gm-csf（10 ng/ml）和il-4（10 ng/ml）的rpmi-1640培养基中培养；2）将培养好的树突细胞以1.6
×
105/孔的细胞密度接种于6孔板中，在37
ꢀ°
c 和5% co2气氛下过夜生长；
3）除掉上层培养基，加入100 μg ml-1
冠状金钯纳米异质结材料，共同孵育24小时；4）用pbs轻轻洗涤细胞三次，用cd80、cd86标记的抗体对dc进行染色，流式细胞仪检测dc的成熟程度；四、光疗对树突细胞的体外免疫刺激：1）将从balb/c小鼠中分离出的骨髓来源的树突细胞接种于transwell下腔，冠状金钯纳米异质结材料与4t1细胞共孵育后被接种于上腔；2）用808 nm激光以0.75 w cm-2
的功率照射10分钟；3）共培养6小时后，用pbs轻轻洗涤细胞三次，用cd80、cd86标记的抗体对dc进行染色，流式细胞仪检测dc的成熟程度；五、冠状金-钯纳米异质材料的生物相容性测试：1）将小鼠乳腺癌细胞4t1细胞以1
×
104/孔的细胞密度接种至96孔板中，在37 o
c和5% co2气氛下过夜生长；2）除去上层培养基，加入100 μl新鲜的培养基，培养基中含有6.25、12.5、25、50和100 μg ml-1 冠状金钯纳米异质结材料，共同孵育24小时；3）向每个孔中加入20 μl的5 mg ml-1
的mtt溶液，孵育3.5 小时；4）除去细胞培养基，向各孔中加入150 μl dmso。然后在将板摇动10分钟后，检测490 nm处的吸收值计算细胞活性；六、冠状金-钯纳米异质材料在808nm激光照射下对肿瘤细胞的杀伤实验：1）将小鼠乳腺癌细胞4t1细胞以1
×
104/孔的细胞密度接种至96孔板中，在37 o
c和5% co2气氛下过夜生长；2）除去上层培养基，加入100 μl新鲜的培养基，培养基中含有6.25、12.5、25、50和100 μg ml-1 冠状金钯纳米异质结材料，共同孵育6小时；3）持续孵育6小时后，用808 nm激光（0.75w cm-2
）照射细胞10分钟，并再培养18小时；4）向每个孔中加入20 μl的5 mg ml-1
的mtt溶液，孵育3.5 小时；5）除去细胞培养基，向各孔中加入150 μl dmso。然后在将板摇动10分钟后，检测490 nm处的吸收值计算细胞活性。
23.图1为实施例1制备的冠状金-钯纳米异质材料的透射电子显微镜照片，由图1可知纳米金棒的直径为10.9nm、长径比为3.6，钯凸起的长度为11nm。表面成功合成了冠状金-钯纳米异质材料，并且尺寸均一。
24.图2为实施例1制备的冠状金-钯纳米异质材料的吸收光谱图，由图1可知冠状金-钯纳米异质材料的吸收峰位于808nm附近。
25.图3为实施例1制备的冠状金-钯纳米异质材料在808nm近红外光照射下的光热升温曲线图。由图3可见，在808nm激光照射下，温度稳定升高，说明冠状金-钯纳米异质材料具有很好的光热转化性能。
26.图4为实施例1制备的冠状金-钯纳米异质材料在808nm近红外光照射下产生活性氧自由基的曲线图。由图4可知冠状金-钯纳米异质材料在808nm近红外光照射下可以引起荧光强度的显著升高，表明活性氧自由基的高效生成，展示其优异的光动力性能。
27.图5为实施例1制备的冠状金-钯纳米异质材料本身带有的毛刺性质促进树突细胞
的成熟和活化的流式数据图，共刺激分子（cd80、cd86）的表达是dc成熟的标志。结果说明，冠状金-钯纳米异质材料本身能够诱导树突细胞成熟，意味着其有潜力诱导免疫反应。
28.图6为实施例1制备的冠状金-钯纳米异质材料在光疗后产生的大量肿瘤相关抗原促进树突细胞的成熟和活化的示意图（图6a）和流式数据图（图6b）。结果证明光疗后4t1细胞碎片可显著提高树突细胞的成熟。
29.图7为实施例1制备的冠状金-钯纳米异质材料的生物安全性测试图。结果说明，冠状金-钯纳米异质材料于4t1细胞共同孵育24小时后，细胞存活率都在80%以上，表面具有良好的生物相容性，可以用于细胞及生物体内实验。
30.图8为实施例1制备的冠状金-钯纳米异质材料在近红外光激发下对肿瘤细胞杀伤能力的测试图。mtt结果表面，冠状金-钯纳米异质材料在近红外光激发下呈现出浓度依赖的肿瘤细胞杀伤能力，说明采用上述方法制得的冠状金-钯纳米异质材料，可以用于近红外光激发条件下杀伤肿瘤细胞。
31.实施例2一种冠状金-钯纳米异质材料的制备方法，包括以下步骤：s1、将十六烷基氯化吡啶一水合物加入水中充分搅拌溶解，直至溶液呈透明状态，配制成浓度为1mmol/l的十六烷基氯化吡啶一水合物溶液，然后将溶液加热至65℃留待后步使用；s2、向步骤s1加热后的溶液中加入2ml四氯钯酸钠溶液和4ml纳米金棒，四氯钯酸钠溶液的浓度为10mmol/l，纳米金棒的吸光值为1、直径为10.9nm、长径比为3.6；其中，纳米金棒通过种子介导生长的方法制得，包括以下步骤：s2-1、制备金元素种子溶液：取0.25ml浓度为10mmol/l的四氯金酸加入5ml浓度为200mmol/l的十六烷基三甲基溴化铵溶液中，制得种子溶液留待后步使用；s2-2、制备生长溶液
①
、称取3.08g十六烷基三甲基氯化铵和0.77g油酸钠加入250ml水中，加热溶解直至溶液透明；
②
、保持步骤
①
中混合液的加热温度，并向其中加入6ml浓度为4mmol/l的硝酸银和250ml浓度为5mmol/l的四氯金酸，在30℃下搅拌150分钟至溶液无色透明；
③
、向步骤
②
制得的无色透明溶液中加入2ml浓度为37wt%的盐酸溶液，搅拌15分钟；
④
、首先，将步骤s2-1制得的种子溶液在剧烈搅拌下加入0.6ml浓度为10mmol/l的硼氢化钠溶液，所获得的棕黄色溶液在30℃下老化30分钟；与此同时，向步骤
③
制得的溶液中加入0.62ml浓度为64mmol/l的抗坏血酸溶液，剧烈搅拌30秒；最后，将0.4ml老化完成的种子溶快速注入混合溶液中，通过调整种子溶液加入的含量从而调节au纳米棒的长径比；
⑤
、将步骤
④
制得的溶液搅拌1分钟，并在30℃条件下静置过夜生长，制得纳米金棒。
32.s3、向步骤s2制备的混合液中加入新鲜的、浓度为100mmol/l的抗坏血酸溶液，快速搅拌2分钟后保持65℃恒温静置2小时；s4、将步骤s3制得的混合溶液通过离心得到纳米粒子，离心转速为7000rpm，离心
时间为10分钟；然后纳米材料用水清洗至少3遍，制得冠状金-钯纳米异质结构材料。
33.一种冠状金-钯纳米异质材料，在本实施例2中金元素和钯元素的质量比为1:0.1。
34.本实施例2制得的冠状金-钯纳米异质结构材料中，金元素和钯元素的质量比为1:0.1，钯凸起的长度为5nm。
35.图9为实施例2制备的冠状金-钯纳米异质材料的透射电子显微镜照片，观察到成功制备了冠状金-钯纳米异质材料且结构均一。
36.本实施例2制备的冠状金-钯纳米异质材料具有实施例1制备的光热、光动力及刺激树突细胞成熟的能力，也可以有效杀伤肿瘤细胞。
37.实施例3一种冠状金-钯纳米异质材料的制备方法，包括以下步骤：s1、将十六烷基氯化吡啶一水合物加入水中充分搅拌溶解，直至溶液呈透明状态，配制成浓度为1mmol/l的十六烷基氯化吡啶一水合物溶液，然后将溶液加热至65℃留待后步使用；s2、向步骤s1加热后的溶液中加入2ml四氯钯酸钠溶液和4ml纳米金棒，四氯钯酸钠溶液的浓度为100mmol/l，纳米金棒的吸光值为1、直径为10.9nm、长径比为3.6；其中，纳米金棒通过种子介导生长的方法制得，包括以下步骤：s2-1、制备金元素种子溶液：取0.25ml浓度为10mmol/l的四氯金酸加入5ml浓度为200mmol/l的十六烷基三甲基溴化铵溶液中，制得种子溶液留待后步使用；s2-2、制备生长溶液
①
、称取3.08g十六烷基三甲基氯化铵和0.77g油酸钠加入250ml水中，加热溶解直至溶液透明；
②
、保持步骤
①
中混合液的加热温度，并向其中加入6ml浓度为4mmol/l的硝酸银和250ml浓度为5mmol/l的四氯金酸，在30℃下搅拌150分钟至溶液无色透明；
③
、向步骤
②
制得的无色透明溶液中加入2ml浓度为37wt%的盐酸溶液，搅拌15分钟；
④
、首先，将步骤s2-1制得的种子溶液在剧烈搅拌下加入0.6ml浓度为10mmol/l的硼氢化钠溶液，所获得的棕黄色溶液在30℃下老化30分钟；与此同时，向步骤
③
制得的溶液中加入0.62ml浓度为64mmol/l的抗坏血酸溶液，剧烈搅拌30秒；最后，将0.4ml老化完成的种子溶快速注入混合溶液中，通过调整种子溶液加入的含量从而调节au纳米棒的长径比；
⑤
、将步骤
④
制得的溶液搅拌1分钟，并在30℃条件下静置过夜生长，制得纳米金棒。
38.s3、向步骤s2制备的混合液中加入新鲜的、浓度为100mmol/l的抗坏血酸溶液，快速搅拌2分钟后保持65℃恒温静置2小时；s4、将步骤s3制得的混合溶液通过离心得到纳米粒子，离心转速为7000rpm，离心时间为10分钟；然后纳米材料用水清洗至少3遍，制得冠状金-钯纳米异质结构材料。
39.一种冠状金-钯纳米异质材料，在本实施例3中金元素和钯元素的质量比为1:0.5。
40.在本实施例3制得的冠状金-钯纳米异质结构材料中，金元素和钯元素的质量比为1: 0.5，钯凸起的长度为13nm。
41.图10为实施例3制备的冠状金-钯纳米异质材料的透射电子显微镜照片，观察到成功制备了冠状金-钯纳米异质材料且结构均一。
42.本实施例制备的冠状金-钯纳米异质材料具有实施例1制备的光热、光动力及刺激树突细胞成熟的能力，也可以有效杀伤肿瘤细胞。
43.以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。