一种改善肉品质量的生物制剂及其制备方法和应用

1.本发明属于植物提取物，具体涉及一种改善肉品质量的生物制剂及其制备方法和应用。


背景技术：

2.鸡肉具有营养价值高、脂肪含量低和易于烹饪等特质，是中国肉类消费市场的主要商品之一。随着生活水平的不断提高，提升优质禽肉产能亦是应对消费者刚需的重要措施。然而集约化养殖模式下的肉鸡生长速度快，生长周期短，鸡肉品质难以达到优质禽肉水平且高密度笼养的肉鸡长期处于应激状态，这不仅降低肉鸡的生长性能，还可能会对肉鸡的健康产生一定影响。过去养殖户通常在饲料中添加抗生素来缓解集约化养殖带来的负面影响，但随着抗生素的长期使用造成的畜禽产品中药物含量超标、细菌耐药性增强、动物免疫力下降等问题日益突出，中国自2020年起开始全面禁止将含有促生长类药物添加到动物饲粮中。因此，寻找合适的抗生素替代品已经成为当前科研工作者和养殖从业人员关注的热点。
3.植物提取物是一类利用物理、化学或生物学的方法把植物中的活性成分提取出来，但不改变其有效成分的物质，其主要活性物质包括黄酮类、多酚类、皂苷和有机酸等。研究表明植物提取物具有绿色、无污染等特点，还具有增强机体抗氧化能力、缓解炎症反应、改善肌肉品质以及调节肠道菌群等功能。橙皮苷(hesperidin，hes)是橙皮素与芸香糖形成的糖苷，为二氢黄酮衍生物，主要存在于柑橘属水果的果皮中，其水溶性较差，在生物体内直接利用率低，需要经过一系列的修饰后才能在体内转运、吸收和利用。近年来橙皮苷因其具有抗氧化、调节糖脂质代谢、抗炎等多种生物活性作用而在畜禽养殖中受到广泛关注。迷迭香酸(rosmarinic acid，ros-a)是一种广泛分布于唇形科、紫草科等植物中的多酚类化合物。迷迭香酸具有较强的抗氧化功能，这与其自身具有的邻二酚羟基结构有关。研究表明，迷迭香酸主要通过减少活性氧(ros)的产生，调节机体脂质过氧化物以及提高机体抗氧化酶活性来发挥抗氧化作用。迷迭香酸在生产中多被应用于抗氧化产品，而其作为添加剂用于改善肉鸡生长性能的报道较少。


技术实现要素：

4.发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明提供一种制备简单，使用方便，促生长作用的生物制剂，该生物制剂包括橙皮苷和迷迭香酸。
5.本发明还提供所述促生长作用的生物制剂的制备方法和应用。
6.技术方案：为了实现是上述目的，本发明所述一种改善肉品质量的生物制剂包括橙皮苷和迷迭香酸。
7.作为优选，所述橙皮苷和迷迭香酸的质量比为1-4:1-2。
8.本发明提供一种改善肉品质量的生物制剂的制备方法，包括如下步骤：
9.(1)橙皮苷的提取：陈皮粉碎后过筛；过筛后的陈皮粉末加入乙醇中，进行热溶剂
提取，提取样品真空冷冻保存；
10.(2)迷迭香酸的提取：迷迭香叶片粉碎后过筛分离；过筛后的迷迭香粉末密封于聚乙烯袋中，加入乙醇溶液浸提，收集提取液进行提纯；先使用微滤膜对提取液进行过滤，将滤液调整ph用正丁醇进行萃取，回收萃取液加水溶解，调整ph用乙酸乙酯萃取，洗脱萃取液，过大孔树脂，收集滤液，低温结晶、过滤、干燥；
11.(3)提取物应用液的制备：将两种植物提取物用二甲基亚砜溶解后，加水过滤制成储存液，稀释后按比例混合制成植物提取物应用液，即为改善肉品质量的生物制剂。
12.其中，步骤(1)所述热溶剂提取反应条件为：在115～140℃条件下进行，提取时间为40～45min。
13.其中，步骤(1)所述陈皮粉末和乙醇溶液料液比为1:55～75g/ml，所述乙醇为浓度50-60％的乙醇溶液。
14.作为优选，步骤(1)所述陈皮粉末和乙醇溶液料液比为1:70g/ml，所述乙醇为浓度60％的乙醇溶液。
15.其中，步骤(2)所述乙醇溶液浓度为40％～50％，所述乙醇溶液为迷迭香粉体积的10-20倍。
16.作为优选，步骤(2)所述乙醇溶液浓度为50％，所述乙醇溶液为迷迭香粉体积的15倍。
17.其中，步骤(2)所述浸提时间为室温浸提4h～6h。
18.本发明所述的改善肉品质量的生物制剂制备在动物饲料中的应用。
19.作为优选，所述改善肉品质量的生物制剂制备在肉鸡饲料中的应用。
20.进一步地，所述肉鸡饲料包括基础饲粮、15-35mg/kg的橙皮苷和8-18mg/kg的迷迭香酸。
21.复合制剂机理阐述：由于橙皮苷属于自身水溶性较差的黄酮类化合物，而黄酮类化合物发挥抗氧化活性功能与其化学结构中的酚羟基有关，其主要通过2种方式来减轻动物机体的氧化反应，一是清除过多的自由基，二是通过激活细胞外信号调节激酶(erk)/核因子2相关因子2(nrf2)信号通路来增强细胞的防御功能。研究表明橙皮苷可以提高消化道紧密连接蛋白表达，降低消化道通透性，并且通过抑制核因子-κb(nf-κb)和激活蛋白-1(ap-1)的激活，降低炎症因子水平，缓解消化道炎症，从而保障机体消化道机能的正常运行以及更好的消化吸收功能。橙皮苷还具有较强的抗菌活性，可以在一定程度上抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等有害菌的生长，其作用机制可能是通过改变细菌细胞膜通透性来影响细菌生长；同时迷迭香酸对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制作用较强，它主要通过增加细菌细胞膜通透性、影响细菌蛋白质代谢以及dna复制等发挥抑菌作用。植物提取物中酚羟基数目越多，抗氧化能力越强，迷迭香酸化学结构中有4个酚羟基，橙皮苷化学结构中有2个酚羟基，表明迷迭香酸抗氧化能力强于橙皮苷。迷迭香酸发挥抗氧化作用主要通过减少活性氧的产生，调节谷胱甘肽过氧化物酶(gsh-px)、超氧化物歧化酶(sod)等抗氧化酶的活性来实现。但是橙皮苷的应用有一定的局限性，其分子结构以糖苷形式存在，导致水溶性较差，生物利用度低，不易被肠道上皮细胞吸收利用，通过酸水解对橙皮苷进行脱糖基处理，制备的橙皮素单葡萄糖苷和橙皮素的溶解度显著增加。本发明认为橙皮苷和迷迭香酸配合使用时，酚酸类化合物迷迭香酸不仅能发挥抗氧化、抑菌、抗炎等功能，还可能为橙皮苷提
供酸水解的条件，进而提高橙皮苷的利用效率，从而有助于调节肠道菌群结构，缓解肠道炎症反应。
22.有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下优点：
23.(1)本发明橙皮苷和迷迭香酸组合制剂添加剂量小活性强，在高效降低成本的同时，对肉鸡肉品质量起到了更为理想的改善效果。
24.(2)增强了肉鸡机体自身抗氧化能力，改善机体免疫能力的作用，有效活性成分对促进动物生长发育，改善动物生长性能具有积极作用。
25.(3)促进了肉鸡胸肌沉积、改善肌肉营养成分含量及比例，在增强机体对葡萄糖利用效率的同时对机体脂质合成与分解的过程也具有促进效应，能够改善肌肉内营养物质，尤其是脂肪酸的含量与比例。
26.(4)本发明的生物制剂制备简单，使用方便，生物利用率高，可以大规模生产应用，并有效降低成本。
附图说明
27.图1为本发明橙皮苷制剂、迷迭香酸制剂和橙皮苷-迷迭香酸制剂改善肉品质量制剂对肉鸡胸肌抗氧化功能的影响；
28.图2为本发明中橙皮苷或迷迭香酸添加剂低剂量添加模式下(橙皮苷30mg/kg、迷迭香酸15mg/kg)对肉鸡胸肌抗氧化功能的影响；
29.图3为本发明橙皮苷制剂、迷迭香酸制剂和橙皮苷-迷迭香酸制剂改善肉品质量制剂对肉鸡胸肌抗氧化相关基因mrna表达量的影响；
30.图4为本发明橙皮苷制剂、迷迭香酸制剂和橙皮苷-迷迭香酸制剂改善肉品质量制剂对肉鸡胸肌肌纤维的影响。
具体实施方式
31.以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
32.实施例1
33.植物提取物的获得与鉴定
34.1、橙皮苷的提取与鉴定
35.橙皮苷采用溶剂浸提法进行提取。陈皮粉碎后过250目分离筛后用于提取有效成分，样本储存在-20℃待用。具体步骤为：(1)称量0.20g过筛后的陈皮粉末于25ml聚四氟乙烯内衬的不锈钢反应釜中，按照70:1(g：ml)的料液比加入浓度为60％的(体积分数)乙醇溶液，在120℃条件下进行热溶剂提取，提取时间为45min。(2)提取结束后4000r/min离心5min，立即旋转蒸发除去乙醇，剩余样品真空冷冻保存，用于后续鉴定。
36.橙皮苷的鉴定采用高效液相色谱法(hplc)对提取物产品进行定量分析。(1)标准工作曲线的绘制：精确称量橙皮苷标准品10.00mg，使用50％的甲醇溶液定容到200ml容量瓶中。采用逐级稀释的方法将标准溶液稀释成2.50、5.00、10.00、15.00、20.00μg/ml的溶液。(2)使用液相色谱仪测定标准溶液和样品：色谱条件为kromasil c18柱(250mm
×
4.6mm,5μm)，流动相为：乙睛-水-磷酸(20:80：0.024，v/v)；流速：1.0ml/min；检测波长：283nm；进样量：20μl；柱温：室温。(3)先测定不同浓度标准品，绘制标准品曲线，再计算样品中橙皮苷
的含量。采用了高效液相色谱法(hplc)对提取物产品进行定量分析以进行鉴定，鉴定结果显示橙皮苷其纯度在98％以上。
37.2、迷迭香酸的提取与鉴定
38.迷迭香叶片粉碎后通过20目分离筛后用于提取有效成分，样本储存在-20℃待用。迷迭香酸采用溶剂浸提法提取。具体步骤为：(1)称量100.0g过筛后的迷迭香粉密封于聚乙烯袋中，加入1.5l浓度为50％的乙醇溶液，加入比例为15倍体积、浓度为50％(体积分数)的乙醇溶液，浸提两次，浸取时间为6h，收集浸提液用于后续分离提纯。(2)迷迭香酸的分离与纯化：先使用1.4μm微滤膜对提取液进行预处理，过滤三次，除去提取液中的悬浮颗粒(果胶、蛋白等)；再将上一步滤液用盐酸调整ph至2.9～3.2，以1.3～2倍体积正丁醇进行萃取，萃取条件为：萃取两次，每次时间22min，回收正丁醇用于下一步操作；将正丁醇加3～5倍体积水至溶解，用盐酸调整ph至2.1～2.6，用体积比为5:3的乙酸乙酯萃取3次，每次萃取22min；使用75％的乙醇溶液洗脱萃取液，然后通过x-5大孔树脂，收集滤液，低温结晶、过滤、干燥。
39.迷迭香酸含量的测定采用高效液相色谱法(hplc)，对提取物产品进行定量分析。(1)标准样品溶液的制备。使用分析天平准确称量出4.950mg的迷迭香酸标准品，使用无水乙醇定容至10ml，浓度为0.495mg/ml。(2)使用液相色谱仪测定。色谱条件：waters c18(150mm
×
4.6mm,5μm)；流动相为乙腈-0.5％磷酸水(35∶65)；流速为1.0m l/min；检测器为紫外检测器,检测波长为332nm；灵敏度为0.1afus；柱温为25℃；溶解介质为无水乙醇。(3)以标准品为参比，计算提取物中迷迭香酸的含量。采用了高效液相色谱法(hplc)对提取物产品进行定量分析以进行鉴定，鉴定结果显示迷迭香酸其纯度在98％以上。
40.3、两种植物提取物储备液制备
41.(1)橙皮苷提取物制备：称取4.00g橙皮苷于离心管中，加入10ml二甲基亚砜溶解混匀，置于摇床2h(37℃，150rpm)，每隔30min取出混匀30s。取出后用无菌水定容至10ml，后通过0.22μm滤膜过滤，制成400mg/ml的储存液，于4℃冰箱保存备用。
42.(2)迷迭香酸提取物：称取4.00g迷迭香酸于离心管中，加入10ml二甲基亚砜溶解混匀，置于摇床2h(37℃，150rpm)，每隔30min取出混匀30s。取出后用无菌水定容至10ml，后通过0.22μm滤膜过滤，制成400mg/ml的储存液，于4℃冰箱保存备用。
43.(3)将两种植物提取物储备液分别稀释，橙皮苷稀释成30mg/ml、40mg/ml、80mg/ml；迷迭香酸稀释成15mg/ml、20mg/ml、40mg/ml将两种组合制剂按浓度2：1混合后涡旋35s，置于摇床3h(37℃，150rpm)，每隔20min取出混匀25s，制成植物提取物应用液。
44.实施例2
45.试验设计
46.采用完全随机试验设计，选取1日龄、平均体重为(44.65
±
1.45)g的健康白羽肉鸡(aa)肉仔鸡公鸡雏200只，随机分成4个组，分别为对照组(con group)、橙皮苷组(hes group)、迷迭香酸组(ros-a group)和橙皮苷-迷迭香酸组(hes x ros-a group)，每组5个重复，每个重复10只鸡，各组体重无显著差异(p》0.05)。每个重复置于同一笼(0.9m x 0.6m)中。基础饲粮采用玉米-豆粕型饲粮，参照《鸡饲养标准》(ny/t 33-2004)配制成粉状配合饲粮。对照组饲喂基础饲粮，橙皮苷组饲喂基础饲粮 60mg/kg比例的橙皮苷制剂，迷迭香酸组饲喂基础饲粮 30mg/kg比例的迷迭香酸制剂，橙皮苷-迷迭香酸组饲喂基础饲粮
30mg/kg比例的橙皮苷制剂 15mg/kg比例的迷迭香酸制剂(橙皮苷制剂与迷迭香酸制剂预先制成橙皮苷-迷迭香酸改善肉品质量制剂)。试验于南京农业大学动物实验中心进行，时间为2021年5月～2021年7月，试验期间肉鸡自由采食和饮水，按正常免疫程序进行免疫接种。肉鸡采用三层笼养方式进行饲养，鸡舍内采用23h人工光照，1h黑暗处理，温度由1日龄时的34℃逐步降低至21日龄时的24℃，然后保持大致稳定。试验期42d，分为育雏期(1-21日龄)和育成期(22-42日龄)2个阶段。试验第42天，以每个重复为单位，空腹12h后称重，随后从每组中选取10只肉鸡(即每个重复依据平均体重选取2只)进行屠宰及后续样本采集工作。
47.实施例3
48.生长性能指标测定
49.试验开始时对1日龄肉仔鸡以每个重复为单位称取其初始体重，并记录。试验期间分别于21和42日龄，空腹3h后以每个重复为单位测定肉仔鸡的体重，同时统计各组给料量和剩余料量，计算平均日采食量、平均日增重和料重比，用以评价橙皮苷-迷迭香酸改善肉品质量制剂对肉鸡各项生长性能指标的影响效果，结果如表1所示。
50.表1饲粮添加橙皮苷制剂、迷迭香酸制剂和橙皮苷-迷迭香酸改善肉品质量制剂对肉鸡生长性能的影响
[0051][0052]
对照组、橙皮苷组、迷迭香酸组，以及橙皮苷-迷迭香酸组肉鸡生长性能结果如表1所示：与对照组相比，在饲粮中添加迷迭香酸制剂或橙皮苷-迷迭香酸改善肉品质量制剂均能极显著提高肉鸡1-21日龄平均日增重(p《0.01)，但单独添加橙皮苷制剂对肉鸡1-21日龄平均日增重无显著性影响(p》0.05)。与对照组相比，在饲粮中添加橙皮苷-迷迭香酸改善肉品质量制剂能显著提高肉鸡22-42日龄平均日增重(p《0.05)，但单独添加橙皮苷制剂或添
加迷迭香酸制剂对肉鸡22-42日龄平均日增重无显著性影响(p》0.05)。与对照组相比，在饲粮中添加橙皮苷-迷迭香酸改善肉品质量制剂能够显著提高肉鸡1-42日龄平均日增重(p《0.05)，但单独添加橙皮苷制剂或添加迷迭香酸制剂对肉鸡1-42日龄平均日增重无显著性影响(p》0.05)。与对照组相比，在饲粮中添加迷迭香酸制剂或橙皮苷-迷迭香酸改善肉品质量制剂均能极显著提高肉鸡1-21日龄平均日采食量(p《0.01)，但单独添加橙皮苷制剂对肉鸡1-21日龄平均日采食量无显著性影响(p》0.05)。与对照组相比，在饲粮中单独添加橙皮苷制剂或添加迷迭香酸制剂均对肉鸡22-42日龄平均日采食量无显著性影响(p》0.05)，但单独添加橙皮苷-迷迭香酸改善肉品质量制剂能够显著提高肉鸡22-42日龄平均日采食量(p《0.05)。与对照组相比，在饲粮中添加橙皮苷-迷迭香酸改善肉品质量制剂能够显著提高肉鸡1-42日龄平均日采食量(p《0.05)，但单独添加橙皮苷制剂或添加迷迭香酸制剂对肉鸡1-42日龄平均日采食量无显著性影响(p》0.05)。与对照组相比，在饲粮中单独添加橙皮苷制剂，单独添加迷迭香酸制剂，或添加橙皮苷-迷迭香酸改善肉品质量制剂对肉鸡1-21日龄料重比、22-42日龄料重比和1-42日龄料重比均无显著性影响(p》0.05)。
[0053]
虽然从实际结果中可以发现在单一模式添加时仍有部分指标产生了积极的变化，但对添加剂的用量要求为已报道文献中的最低标准(橙皮苷60mg/kg，迷迭香酸30mg/kg)，且为本试验组合制剂使用量的数倍，为此通过模拟组合制剂中的添加剂剂量，对单一模式(低剂量橙皮苷30mg/kg、低剂量迷迭香酸15mg/kg)添加的使用效果进行了分析，其对比结果如表2所示，从表2中可以看出，与对照组相比，迷迭香酸制剂或橙皮苷制剂单一模式同比于组合制剂添加剂量时，对肉鸡1-21日龄平均日增重、平均日采食量、料重比，22-42日龄平均日增重、平均日采食量、料重比和1-42日龄平均日增重、平均日采食量、料重比均无显著性影响(p》0.05)。
[0054]
以上结果表明，饲粮添加橙皮苷-迷迭香酸(均低剂量组合)改善肉品质量制剂对提高肉鸡的平均日采食量和平均日增重具有重要作用，虽然结果中部分指标在单独使用迷迭香酸制剂时已经显示出积极的效果，但由于本试验设计中，单独使用迷迭香酸制剂组别的添加量为改善肉品质量制剂组别的数倍，而迷迭香酸的成本相对较高，且相同剂量的橙皮苷制剂成本价格仅为迷迭香酸制剂成本价格的千分之一，故饲粮添加橙皮苷-迷迭香酸改善肉品质量制剂对肉鸡生长性能的提升作用优于单一提取物添加模式。
[0055]
表2饲粮添加低剂量橙皮苷制剂、迷迭香酸制剂和橙皮苷-迷迭香酸改善肉品质量制剂对42日龄肉鸡生长性能的影响
[0056][0057]
实施例4
[0058]
屠宰性能指标测定
[0059]
屠宰前对每只试验鸡分别进行称重，记录为活重；肉鸡屠宰脱毛后称取屠宰体重记为w1，用于测定屠宰率；去除气管、食管、嗦囊、肠、脾脏、胆囊、胰腺、生殖器官、心脏、肝脏、腺胃、肌胃、腹脂，以及头和脚后称重记为w2，用于测定全净膛率，其中屠宰率＝(屠体重/屠宰前活重)
×
100％，全净膛率＝(w1
–
w2)/屠宰前活重
×
100％；同时称取腹脂、两侧胸肌、带骨腿肌和去骨腿肌重量，用以进行腹脂率、胸肌率和腿肌率的分析，其中腹脂率＝[腹脂重量(g)/屠宰前活重(g)]
×
100％，胸肌率＝两侧胸肌质量/全净膛质量
×
100％，腿肌(含骨重或去骨重)率＝腿肌(含骨重或去骨重)质量/全净膛质量
×
100％。
[0060]
表3饲粮添加橙皮苷制剂、迷迭香酸制剂和橙皮苷-迷迭香酸改善肉品质量制剂对42日龄肉鸡屠宰性能的影响
[0061]
[0062]
(1)对照组、橙皮苷组、迷迭香酸组，以及橙皮苷-迷迭香酸组肉鸡42日龄屠宰性能结果如表3所示：与对照组相比，在饲粮中添加橙皮苷-迷迭香酸改善肉品质量制剂可以显著提高肉鸡42日龄屠宰率(p《0.05)，但单独添加橙皮苷制剂或迷迭香酸制剂对肉鸡42日龄屠宰率无显著性影响(p》0.05)。与对照组相比，在饲粮中单独添加橙皮苷制剂，单独添加迷迭香酸制剂，或添加橙皮苷-迷迭香酸改善肉品质量制剂对肉鸡42日龄全净膛率均无显著性影响(p》0.05)。与对照组相比，在饲粮中添加橙皮苷-迷迭香酸改善肉品质量制剂可以显著提高肉鸡42日龄胸肌率(p《0.05)，但单独添加橙皮苷制剂或迷迭香酸制剂对肉鸡42日龄胸肌率无显著性影响(p》0.05)。与对照组相比，在饲粮中单独添加橙皮苷制剂，单独添加迷迭香酸制剂，或添加橙皮苷-迷迭香酸改善肉品质量制剂对肉鸡42日龄腿肌率均无显著性影响(p》0.05)。与对照组相比，在饲粮中单独添加橙皮苷制剂，单独添加迷迭香酸制剂，或添加橙皮苷-迷迭香酸改善肉品质量制剂对肉鸡42日龄腹脂率均无显著性影响(p》0.05)。以上结果表明，饲粮添加橙皮苷-迷迭香酸改善肉品质量制剂对提高肉鸡42日龄的屠宰率和胸肌率具有重要作用，并且对肉鸡屠宰性能的提升作用明显优于单一提取物添加模式。
[0063]
(2)虽然从实际结果中可以发现在单一模式添加时仍有部分指标产生了积极的变化，但对添加剂的用量要求为已报道文献中的最低标准(橙皮苷60mg/kg，迷迭香酸30mg/kg)，且为本试验组合制剂使用量的数倍，为此通过模拟组合制剂中的添加剂剂量，对单一模式(低剂量橙皮苷30mg/kg、低剂量迷迭香酸15mg/kg)添加的使用效果进行了分析，其对比结果如表4所示，从表4中可以看出，与对照组相比，迷迭香酸制剂或橙皮苷制剂单一模式同比于组合制剂添加剂量时，对肉鸡的屠宰率、全净膛率、胸肌率、腿肌率和腹脂率均无显著性影响(p》0.05)。以上结果表明，饲粮添加橙皮苷-迷迭香酸改善肉品质量制剂对提高肉鸡的屠宰率和胸肌率具有重要意义，并且对肉鸡屠宰性能的提升作用优于单一提取物添加模式。
[0064]
以上结果表明，饲粮添加橙皮苷-百里香酚(均低剂量组合)促生长制剂对提高肉鸡42日龄的活重、屠体重、全净膛重、胸肌重、腿肌重和腹脂重具有重要作用，同时能够显著增加肉鸡屠宰率和胸肌率，并且对肉鸡屠宰性能的提升作用明显优于单一提取物添加模式；而当单独运用低剂量的橙皮苷制剂(30mg/kg)或迷迭香酸制剂(15mg/kg)时，对肉鸡屠宰性能基本不会产生显著改变表观指标的作用。
[0065]
表4饲粮添加低剂量橙皮苷制剂、迷迭香酸制剂和橙皮苷-迷迭香酸改善肉品质量制剂对42日龄肉鸡屠宰性能的影响
[0066][0067]
实施例5
[0068]
免疫及抗氧化指标测定
[0069]
完整取出肉鸡胸腺、法氏囊和脾脏，剪去周边组织，用滤纸擦干后称重，同时计算免疫器官指数，其中免疫器官指数＝免疫器官重量(g)/屠宰前活重(kg)。采集右侧胸肌样品用液氮速冻后置于液氮罐中保存，用于常规成分和抗氧化功能检测；其中采用考马斯亮蓝法测定胸肌中总蛋白(tp)含量、比色法测定胸肌中总抗氧化能力(t-aoc)、羟胺法测定总超氧化物歧化酶(t-sod)、钼酸铵法测定过氧化氢酶(cat)、比色法测定谷胱甘肽过氧化物酶(gsh-px)和tba法测定丙二醛(mda)含量；用酶标仪(spark a-5082型，tecan公司)测定各吸光度值并计算最终结果；胸肌的抗氧化酶活性及丙二醛(mda)含量按照检测试剂盒中的说明书进行测定，试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。同时分析胸肌抗氧化相关基因mrna表达量，用trizol试剂(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)提取胸肌样品总rna，并使用微量分光光度计(thermo,nd-2000)检测rna浓度。用ⅲall-in-one rt super mix perfect for qpcr试剂盒将rna反转录成cdna,反转录后的cdna分装后置于-80℃保存。根据chamq sybr qpcr试剂盒(vazyme，南京)说明书进行操作:2
×
chamq sybr qpcr master mix 10μl，上游引物0.4μl，下游引物0.4μl，50
×
rox reference dye1 0.4μl，cdna 2μl，加ddh2o至20μl，反应条件:95℃30s；95℃10s，60℃30s，共40个循环。熔解曲线测定程序:95℃15s，60℃1min，95℃15s。以β-actin为内参基因，采用2-δδct
法计算nqo1、nrf2、cat、sod、gpx和ho-1的mrna相对表达量。引物由上海生工生物工程股份有限公司设计合成。
[0070]
表5饲粮添加橙皮苷制剂、迷迭香酸制剂和橙皮苷-迷迭香酸改善肉品质量制剂对42日龄肉鸡免疫器官指标的影响
[0071][0072]
(1)对照组、橙皮苷组、迷迭香酸组，以及橙皮苷-迷迭香酸组肉鸡42日龄免疫器官指标结果如表5所示：与对照组相比，在饲粮中添加橙皮苷-迷迭香酸改善肉品质量制剂可以显著提高肉鸡42日龄胸腺指数(p《0.05)，但单独添加橙皮苷制剂或迷迭香酸制剂对肉鸡42日龄胸腺指数无显著性影响(p》0.05)。与对照组相比，在饲粮中单独添加橙皮苷制剂，单独添加迷迭香酸制剂，或添加橙皮苷-迷迭香酸改善肉品质量制剂对肉鸡42日龄法氏囊指数均无显著性影响(p》0.05)。与对照组相比，在饲粮中单独添加橙皮苷制剂，单独添加迷迭香酸制剂，或添加橙皮苷-迷迭香酸改善肉品质量制剂对肉鸡42日龄脾脏指数均无显著性影响(p》0.05)。以上结果表明，饲粮添加橙皮苷-迷迭香酸改善肉品质量制剂对提高肉鸡42日龄的胸腺指数具有重要作用，并且对肉鸡器官指数的提升作用明显优于单一提取物添加模式。
[0073]
(2)对照组、橙皮苷组、迷迭香酸组，以及橙皮苷-迷迭香酸组肉鸡胸肌抗氧化功能结果分析如图1所示，从图1中可以看出，与对照组相比，在饲粮中添加橙皮苷制剂、迷迭香酸制剂，以及橙皮苷-迷迭香酸改善肉品质量制剂对肉鸡胸肌中总抗氧化能力(t-aoc)、过氧化氢酶(cat)和谷胱甘肽过氧化物酶(gsh-px)的含量均无显著性影响(p》0.05)。与对照
组相比，在饲粮中单独添加橙皮苷制剂，或添加橙皮苷-迷迭香酸改善肉品质量制剂均能够显著提高肉鸡胸肌中总超氧化物歧化酶(t-sod)的含量(p《0.05)，且橙皮苷-迷迭香酸改善肉品质量制剂的效果优于单一添加组，但单独添加迷迭香酸制剂对肉鸡胸肌中总超氧化物歧化酶(t-sod)的含量无显著性影响(p》0.05)。与对照组相比，在饲粮中单独添加橙皮苷制剂，或添加橙皮苷-迷迭香酸改善肉品质量制剂均能够显著降低肉鸡胸肌中丙二醛(mda)的含量(p《0.05)，且橙皮苷-迷迭香酸改善肉品质量制剂的效果优于单一添加组，但单独添加迷迭香酸制剂对肉鸡胸肌中丙二醛(mda)的含量无显著性影响(p》0.05)。
[0074]
(3)虽然从实际结果中可以发现在单一模式添加时仍有部分指标产生了积极的变化，但对添加剂的用量要求为已报道文献中的最低标准(橙皮苷60mg/kg，迷迭香酸30mg/kg)，且为本试验组合制剂使用量的数倍，为此通过模拟组合制剂中的添加剂剂量，对单一模式(低剂量橙皮苷30mg/kg、低剂量迷迭香酸15mg/kg)添加的使用效果进行了分析，其对比结果如图2所示，从图2中可以看出，与对照组相比，迷迭香酸制剂或橙皮苷制剂单一模式同比于组合制剂添加剂量时，对肉鸡胸肌抗氧化功能指标中的总抗氧化能力(t-aoc)、过氧化氢酶(cat)、谷胱甘肽过氧化物酶(gsh-px)、总超氧化物歧化酶(t-sod)和丙二醛(mda)的含量均无显著性影响(p》0.05)。以上结果表明，饲粮添加橙皮苷-迷迭香酸(均低剂量组合)改善肉品质量制剂对提高肉鸡胸肌的总超氧化物歧化酶(t-sod)含量、降低肉鸡胸肌的丙二醛(mda)含量具有重要意义，并且对肉鸡屠宰性能的提升作用优于单一提取物添加模式。
[0075]
(4)对照组、橙皮苷组、迷迭香酸组，以及橙皮苷-迷迭香酸组肉鸡胸肌抗氧化相关基因的结果分析如图3所示，从图3中可以看出，与对照组相比，在饲粮中添加橙皮苷-迷迭香酸改善肉品质量制剂均可以显著(p《0.05)提高肉鸡胸肌中抗氧化基因nqo1、sod和nrf2的mrna表达量；在饲粮中单独添加迷迭香酸制剂可以显著(p《0.05)提高肉鸡胸肌中抗氧化基因nrf2的mrna表达量；在饲粮中单独添加橙皮苷制剂可以显著(p《0.05)提高肉鸡胸肌中抗氧化基因nrf2的mrna表达量，且橙皮苷-迷迭香酸改善肉品质量制剂的效果优于单一添加组，但单独添加迷迭香酸制剂或添加橙皮苷制剂对肉鸡胸肌中抗氧化基因nqo1和sod的mrna表达量无显著性影响(p》0.05)。与对照组相比，在饲粮中添加橙皮苷制剂、迷迭香酸制剂，以及橙皮苷-迷迭香酸改善肉品质量制剂对肉鸡胸肌中抗氧化基因ho-1、cat和gpx的mrna表达量均无显著性影响(p》0.05)。以上结果表明，饲粮添加橙皮苷-迷迭香酸改善肉品质量制剂对改善肉鸡42日龄的免疫器官指数、胸肌抗氧化指标和胸肌抗氧化相关基因的mrna表达量具有重要作用，并且对肉鸡免疫能力的提升作用明显优于单一提取物添加模式。同时，低剂量添加模式下(低剂量橙皮苷30mg/kg或者低剂量迷迭香酸15mg/kg)，单一植物提取物添加对鸡胸肌抗氧化相关基因各项指标均不会产生显著影响。
[0076]
实施例6
[0077]
肉品质量指标
[0078]
依据《畜禽肉质的测定》(ny/t 1333-2007)的方法对右侧胸肌样品进行肌肉ph45min、ph24h、滴水损失、蒸煮损失和肉色的测定，同时依据《肉嫩度的测定剪切力测定法》(ny/t 1180-2006)进行剪切力测定。胸肌营养成分(水分、粗蛋白、粗脂肪和粗灰分)测定依据食品安全国家标准中的方法进行。同时使用赛默飞trace1310气相色谱仪测定胸肌肌内脂肪酸含量，操作方法由南京农业大学共享仪器平台实验中心提供。同时准确称取0.10g左右的胸肌样品放入安瓿瓶中，于安瓿瓶中加入6mol/l的盐酸溶液10ml，将安瓿瓶
在-20℃环境下放置3min冷冻处理，冷冻处理完成后安瓿瓶用氮吹仪通入氮气3min后用防爆气体罐封口，安瓿瓶在110℃烘箱处理24h后将溶液全部转移至50ml容量瓶中加超纯水定容，取1ml容量瓶中液体至5ml离心管中放置氮吹仪上吹干，然后加入0.02mol/l的盐酸2ml使残渣充分溶解后于0.22um孔径的水相滤器中过滤到色谱瓶中，用氨基酸全自动分析仪对胸肌肌内氨基酸进行测定；同时剪取约1cm
×
2cm大小的胸肌组织置于4％甲醛中固定，固定后的组织经梯度乙醇脱水，二甲苯透明，浸蜡；包埋、切片；最后进行苏木精-伊红(he)染色封片，处理好的切片置于虚拟显微镜上拍照，使用image-pro plus软件测定肌纤维的面积及密度，用以评价橙皮苷-迷迭香酸改善肉品质量制剂对肉鸡各项肉品质量指标的影响效果。
[0079]
表6饲粮添加橙皮苷制剂、迷迭香酸制剂和橙皮苷-迷迭香酸改善肉品质量制剂对肉鸡胸肌肉品质量常规指标的影响
[0080][0081][0082]
对照组、橙皮苷组、迷迭香酸组，以及橙皮苷-迷迭香酸组肉鸡胸肌肉品质量常规指标的结果分析如表6所示：与对照组相比，在饲粮中添加橙皮苷-迷迭香酸改善肉品质量制剂可以显著降低肉鸡胸肌的亮度(l*)值，黄度(b*)值和剪切力(p《0.05)，并且极显著降低肉鸡胸肌的蒸煮损失(p《0.01)，但对肉鸡胸肌的ph45min、ph24h、红度(a*)值、滴水损失24h和滴水损失48h无显著性影响(p》0.05)。与对照组相比，在饲粮中单独添加橙皮苷制剂或添加迷迭香酸制剂均可以极显著降低肉鸡胸肌的蒸煮损失(p《0.01)，但对肉鸡胸肌的ph45min、ph24h、亮度(l*)值、红度(a*)值、黄度(b*)值、滴水损失24h、滴水损失48h和剪切力均无显著性影响(p》0.05)。此外，低剂量添加模式下(低剂量橙皮苷30mg/kg或者低剂量迷迭香酸15mg/kg)，单一植物提取物添加对肉鸡胸肌肉品质量常规指标不会产生显著影响。以上结果表明，饲粮添加橙皮苷-迷迭香酸改善肉品质量制剂对降低肉鸡胸肌的剪切力，进而增加其嫩度具有重要作用，并且对肉鸡常规肉品质量指标的改善作用明显优于单一提取物添加模式。
[0083]
表7饲粮添加橙皮苷制剂、迷迭香酸制剂和橙皮苷-迷迭香酸改善肉品质量制剂对
肉鸡胸肌营养成分的影响
[0084][0085]
对照组、橙皮苷组、迷迭香酸组，以及橙皮苷-迷迭香酸组肉鸡胸肌营养成分的结果分析如表7所示：与对照组相比，在饲粮中添加橙皮苷制剂、迷迭香酸制剂，以及橙皮苷-迷迭香酸改善肉品质量制剂对肉鸡胸肌的水分、粗蛋白、粗脂肪和粗灰分含量均无显著性影响(p》0.05)，同时，低剂量添加模式下(低剂量橙皮苷30mg/kg或者低剂量迷迭香酸15mg/kg)，单一植物提取物添加对肉鸡胸肌营养成分指标不会产生显著影响。
[0086]
表8饲粮添加橙皮苷制剂、迷迭香酸制剂和橙皮苷-迷迭香酸改善肉品质量制剂对肉鸡胸肌脂肪酸含量的影响
[0087]
[0088][0089]
对照组、橙皮苷组、迷迭香酸组，以及橙皮苷-迷迭香酸组肉鸡胸肌脂肪酸含量的结果分析如表8所示：与对照组相比，在饲粮中添加橙皮苷-迷迭香酸改善肉品质量制剂可以显著降低肉鸡胸肌饱和脂肪酸(sfa)、棕榈酸c16：0、硬脂酸c18:0和二十四烷酸c24:0的含量(p《0.05)，且能够极显著降低肉鸡胸肌肉豆蔻酸c14：0的含量(p《0.01)，同时能够显著提高肉鸡胸肌肌肉反式油酸c18:1n9t、油酸c18:1n9c、α-亚油酸c18:3n3、顺-11,14,17-二十碳三烯酸c20:3n3含量和pufa/sfa值(p《0.05)，且能够极显著提高肉鸡胸肌肌肉单不饱和脂肪酸(mufa)、肉豆蔻油酸c14:1和n-3多不饱和脂肪酸含量(p《0.01)，但对肉鸡胸肌肌肉丁酸c4：0、己酸c6：0、辛酸c8：0、葵酸c10：0、十一烷酸c11：0、月桂酸c12：0、十三烷酸c13：0、十五烷酸c15：0、十七烷酸c17：0、花生酸c20:0、二十一碳酸c21:0、山嵛酸c22:0、二十三烷酸c23:0、银杏酸c15:1、棕榈油酸c16:1、十七碳-10-烯酸c17:1、二十碳-11-烯酸c20:1n9、芥酸c22:1n9、二十四碳-15-烯酸c24:1、多不饱和脂肪酸(pufa)、反亚油酸c18:2n6t、亚油酸c18:2n6c、γ-亚油酸c18:3n6、二十碳二烯酸c20:2、顺-8,11,14-二十碳三烯酸c20:3n6、花生四烯酸c20:4n6、二十碳五烯酸c20:5n3、二十二碳二烯酸c22:2、二十二碳六烯酸c22:6n3、n-6多不饱和脂肪酸含量和n-6/n-3值均无显著性影响(p》0.05)。
[0090]
与对照组相比，在饲粮中单独添加迷迭香酸制剂可以显著降低肉鸡胸肌棕榈酸c16：0、十七烷酸c17：0和十七碳-10-烯酸c17:1含量(p《0.05)，且能够极显著降低肉鸡胸肌肌肉的肉豆蔻酸c14：0含量(p《0.01)，同时能够显著提高肉鸡胸肌肌肉己酸c6：0、银杏酸c15:1和反式油酸c18:1n9t含量(p《0.05)，且能够极显著提高肉鸡胸肌肌肉的肉豆蔻油酸c14:1含量(p《0.01)，但对肉鸡胸肌肌肉饱和脂肪酸(sfa)、丁酸c4：0、辛酸c8：0、葵酸c10：0、十一烷酸c11：0、月桂酸c12：0、十三烷酸c13：0、十五烷酸c15：0、硬脂酸c18:0、花生酸c20:0、二十一碳酸c21:0、山嵛酸c22:0、二十三烷酸c23:0、二十四烷酸c24:0、单不饱和脂肪酸(mufa)、棕榈油酸c16:1、油酸c18:1n9c、二十碳-11-烯酸c20:1n9、芥酸c22:1n9、二十四碳-15-烯酸c24:1、多不饱和脂肪酸(pufa)、反亚油酸c18:2n6t、亚油酸c18:2n6c、γ-亚油酸c18:3n6、α-亚油酸c18:3n3、二十碳二烯酸c20:2、顺-8,11,14-二十碳三烯酸c20:3n6、花生四烯酸c20:4n6、顺-11,14,17-二十碳三烯酸c20:3n3、二十碳五烯酸c20:5n3、二十二碳二烯酸c22:2、二十二碳六烯酸c22:6n3、n-3多不饱和脂肪酸和n-6多不饱和脂肪酸含量，以及n-6/n-3值和pufa/sfa值均无显著性影响(p》0.05)。
[0091]
与对照组相比，在饲粮中单独添加橙皮苷制剂可以显著降低肉鸡胸肌棕榈油酸c16:1含量(p《0.05)，且能够极显著降低肉鸡胸肌肉的肉豆蔻酸c14：0含量(p《0.01)，同时能够显著提高肉鸡胸肌肌肉己酸c6：0和二十四碳-15-烯酸c24:1含量(p《0.05)，且能够极显著提高肉鸡胸肌肌肉n-6/n-3值(p《0.01)，但对肉鸡胸肌肌肉饱和脂肪酸(sfa)、丁酸c4：0、辛酸c8：0、葵酸c10：0、十一烷酸c11：0、月桂酸c12：0、十三烷酸c13：0、十五烷酸c15：0、棕榈酸c16：0、十七烷酸c17：0、硬脂酸c18:0、花生酸c20:0、二十一碳酸c21:0、山嵛酸c22:0、
二十三烷酸c23:0、二十四烷酸c24:0、单不饱和脂肪酸(mufa)、肉豆蔻油酸c14:1、银杏酸c15:1、十七碳-10-烯酸c17:1、反式油酸c18:1n9t、油酸c18:1n9c、二十碳-11-烯酸c20:1n9、芥酸c22:1n9、多不饱和脂肪酸(pufa)、反亚油酸c18:2n6t、亚油酸c18:2n6c、γ-亚油酸c18:3n6、α-亚油酸c18:3n3、二十碳二烯酸c20:2、顺-8,11,14-二十碳三烯酸c20:3n6、花生四烯酸c20:4n6、顺-11,14,17-二十碳三烯酸c20:3n3、二十碳五烯酸c20:5n3、二十二碳二烯酸c22:2、二十二碳六烯酸c22:6n3、n-3多不饱和脂肪酸和n-6多不饱和脂肪酸含量，以及pufa/sfa值均无显著性影响(p》0.05)，同时，低剂量添加模式下(低剂量橙皮苷30mg/kg或者低剂量迷迭香酸15mg/kg)，单一植物提取物添加对肉鸡胸肌脂肪酸含量各项指标均不会产生显著影响。以上结果表明，饲粮添加橙皮苷-迷迭香酸改善肉品质量制剂对改善肉鸡胸肌肌肉的脂肪酸组成及其比例具有重要作用，并且其改善作用明显优于单一提取物添加模式。
[0092]
表9饲粮添加橙皮苷制剂、迷迭香酸制剂和橙皮苷-迷迭香酸改善肉品质量制剂对肉鸡胸肌氨基酸含量的影响
[0093][0094]
[0095]
对照组、橙皮苷组、迷迭香酸组，以及橙皮苷-迷迭香酸组肉鸡胸肌氨基酸含量的结果分析如表9所示：与对照组相比，在饲粮中添加橙皮苷-迷迭香酸改善肉品质量制剂可以显著提高肉鸡胸肌谷氨酸glu、甘氨酸gly、缬氨酸val、酪氨酸tyr和脯氨酸pro的含量，且能够极显著提高肉鸡胸肌丙氨酸ala的含量，同时能够显著提高鲜味氨基酸、非必需氨基酸neaa和总氨基酸taa的含量，但对肉鸡胸肌天冬氨酸asp、苏氨酸thr、丝氨酸ser、半胱氨酸cys、蛋氨酸met、异亮氨酸ile、亮氨酸leu、苯丙氨酸phe、赖氨酸lys、组氨酸his、精氨酸arg和必需氨基酸eaa含量，以及eaa/taa和eaa/neaa值均无显著性影响(p》0.05)。与对照组相比，在饲粮中单独添加迷迭香酸制剂或添加橙皮苷制剂对肉鸡胸肌天冬氨酸asp、苏氨酸thr、丝氨酸ser、谷氨酸glu、甘氨酸gly、丙氨酸ala、半胱氨酸cys、缬氨酸val、蛋氨酸met、异亮氨酸ile、亮氨酸leu、酪氨酸tyr、苯丙氨酸phe、赖氨酸lys、组氨酸his、精氨酸arg、脯氨酸pro、鲜味氨基酸、总氨基酸taa、必需氨基酸eaa和非必需氨基酸neaa含量，以及eaa/taa值和eaa/neaa值均无显著性影响(p》0.05)，同时，低剂量添加模式下(低剂量橙皮苷30mg/kg或者低剂量迷迭香酸15mg/kg)，，单一植物提取物添加对肉鸡胸肌氨基酸含量各项指标均不会产生显著影响。以上结果表明，饲粮添加橙皮苷-迷迭香酸改善肉品质量制剂对改善肉鸡胸肌的氨基酸含量，尤其是对肉品质指标具有重要影响的鲜味氨基酸含量具有重要作用，而单一提取物添加模式并不能改变肉鸡胸肌的氨基酸含量。
[0096]
对照组、橙皮苷组、迷迭香酸组，以及橙皮苷-迷迭香酸组肉鸡胸肌肌纤维的结果分析如图4所示，从图中可以看出，与对照组相比，在饲粮中添加橙皮苷-迷迭香酸改善肉品质量制剂可以显著降低肉鸡胸肌肌纤维面积(p《0.05)，且同时显著低于单独添加橙皮苷制剂或添加迷迭香酸制剂的效果(p《0.05)。与对照组相比，在饲粮中添加橙皮苷-迷迭香酸改善肉品质量制剂可以显著增加肉鸡胸肌肌纤维密度(p《0.05)，且同时显著高于单独添加迷迭香酸制剂的效果(p《0.05)。以上结果表明，饲粮添加橙皮苷-迷迭香酸改善肉品质量制剂对降低肉鸡胸肌的肌纤维面积，增加肉鸡胸肌的肌纤维密度具有重要作用，并且对肉鸡胸肌肌纤维的改善效果明显优于单一提取物添加模式，同时，低剂量添加模式下(低剂量橙皮苷30mg/kg或者低剂量迷迭香酸15mg/kg)，单一植物提取物添加对肉鸡胸肌肌纤维各项指标均不会产生显著影响。
[0097]
对比例1
[0098]
采用等量的6-姜酚代替实施例2中的橙皮苷、等量的百里香酚代替实施例2中的迷迭香酸，并按本发明后续的实施例3进行各个测定实验，橙皮苷-迷迭香酸组与6-姜酚-百里香酚组肉鸡1-21日龄、22-42日龄和1-42日龄三个阶段的平均日增重、平均日采食量和料重比结果分析如表10所示。
[0099]
表10橙皮苷-迷迭香酸组与6-姜酚-百里香酚组肉鸡生长性能对比结果
[0100][0101][0102]
从表10可以看出，与在饲粮中添加6-姜酚-百里香酚相比，添加橙皮苷-迷迭香酸改善肉品质量制剂均能显著提高肉鸡在22-42日龄的平均日采食量，以及1-42日龄的平均日采食量和平均日增重(p《0.05)。
[0103]
对比发现，两种组合制剂的叠加与协同作用在本试验中产生了较为理想的实际效果，但并非任意两两组合均可产生叠加及协同效应，同时也不是任何可以通过微生态改善肠道微生物组成的物质如6-姜酚与百里香酚组合促进肉鸡的各项生理指标。而采用迷迭香酸和姜酚的组合在前期预试验中发现二者混合时会产生相互抑制的作用。