一种肝素类药物口服制剂及其制备方法

1.本发明属于药物制剂领域，特别涉及一种肝素类药物口服制剂及其制备方法。


背景技术：

2.静脉血栓栓塞是临床常见疾病，高发于术后、患癌和老年人群。静脉血栓栓塞是继心脏病和脑卒中之后的全球第三大心血管疾病，发病率和致死率呈逐年上升趋势。使用肝素类抗凝剂是临床治疗静脉血栓栓塞的主要手段。近年来，抗凝血药物的市场规模处于稳步增长的态势，其中，间接抗凝血酶抑制剂的市场份额占主导地位。间接抗凝血酶抑制剂的代表药物有普通肝素、低分子量肝素和华法令等。相关数据表明，在中国公立医疗机构使用的间接抗凝血酶抑制剂中，肝素类药物抗凝剂占主要地位。
3.但由于亲水性强、分子量大且带有大量负电荷，肝素类药物口服吸收困难，临床上只能通过皮下注射途径给药。为方便用药，患者通常以口服抗凝剂华法林代替。临床数据表明，华法林进入体内后存在不良反应多及药物相互作用发生率高等问题。如何提高肝素类药物的口服生物利用度是开发其口服制剂的关键。根据文献报道，目前能够提高肝素类药物口服生物利用度的方法主要分为三类：一是提高药物在胃肠道中的稳定性，二是增强药物的肠道渗透性，三是促进药物的淋巴吸收。其中，如何增强肝素类药物的肠道渗透性是提高其口服生物利用度的关键。按照促渗机制，常用的促渗手段主要分为以下三种：(1)将肝素类药物与脂质成分(如角鲨烯、聚甲基丙烯酸酯等)结合制成纳米粒或微粒，提高药物的亲脂性。纳米颗粒中的脂质成分有助于增强肠上皮细胞膜与纳米颗粒间的相互作用，促进肠上皮细胞吸附并内吞纳米颗粒，从而提高肝素类药物的口服吸收。(2)将肝素类药物或药物载体与特定的靶向分子(如胆酸盐、叶酸、维生素b12、转铁蛋白等)偶联，增强药物的靶向性。肠上皮细胞膜上存在多种结合转运体，偶联特定的靶向分子能够加强肝素类药物或药物载体与结合转运体的亲和力，从而提高肝素类药物的肠道转运率。(3)使用吸收促进剂(如表面活性剂、乙二胺四乙酸和壳聚糖及其衍生物等)，提高药物的肠道通透性。吸收促进剂能够打开肠上皮细胞间的紧密连接或者增加细胞膜通透性，从而提高肝素类药物的口服吸收。以上三种方法都能有效提高肝素类药物的肠道渗透性，同时，也存在一定的不足。前两种促渗方法在制备过程中涉及有机溶剂，不符合“绿色化学”的理念；制备过程相对复杂，制备成本较高；且合成或者偶联的过程很可能破坏肝素类药物的活性位点，使药物丧失药理活性。常用的吸收促进剂为阳离子表面活性剂，该类吸收促进剂通过扰乱肠道细胞的细胞膜，降低细胞膜的稳定性，从而提高药物的肠道通透性，但这种“扰乱”是不可逆的，对肠道组织的损害较大，安全性低。因此，目前还未有含有吸收促进剂的口服肝素类药物制剂上市。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于基于深共熔溶剂技术构建一种稳定且易于制备的肝素类药物口服制剂。本发明使用生物相容性好、安全性高的胆碱与香叶酸合成深共熔溶剂，将其与肝
素类药物结合形成递药系统。该递送系统能够增强肝素类药物的肠道渗透性，提高肝素类药物的口服生物利用度。
5.一种用于递送肝素类药物的口服制剂，其特征在于：包括一种肝素类药物和一种深共熔溶剂。
6.所述的肝素类药物和深共熔溶剂，其特征在于：所述的肝素类药物包括普通肝素、低分子量肝素和化学合成类肝素等常见肝素类药物；所述的深共熔溶剂是指由阴、阳离子组成的有机熔融盐，熔点通常低于100℃。
7.所述的阴、阳离子，其特征在于：所述的阴离子是指可作为氢键供体的有机酸(如香叶酸)、多元醇和糖；所述的阳离子是指可作为氢键受体的季铵盐类(如胆碱)、两性离子(如甜菜碱)等。
8.所述的肝素类药物口服制剂的制备方法为：
9.1)将胆碱溶液置于水浴中，搅拌下将香叶酸逐滴加入胆碱溶液中，反应至无二氧化碳溢出；
10.2)通过减压蒸发除去溶液中的溶剂；
11.3)将产物置于真空干燥箱中干燥，得深共熔溶剂；
12.4)将肝素类药物溶解于蒸馏水中，滴加入深共熔溶剂中，混合均匀后得深共熔溶剂-肝素类药物递送系统。
13.所述的肝素类药物口服制剂的制备方法，其特征在于：
14.1)步骤1)中的胆碱与香叶酸的摩尔比为1:4到2:3；
15.2)步骤1)中的水浴温度为40℃，反应时间为12小时；
16.3)步骤2)中的加热温度为60℃，时间为2小时；
17.4)步骤3)中的干燥温度为60℃，时间为24小时；
18.5)步骤4)中，肝素类药物水溶液的浓度为0～100mg/ml，肝素类药物水溶液与深共熔溶剂的混合比例为1:1。
19.注射给药和口服给药是临床常用的给药方式。注射给药的剂量准确，药物在体内的吸收完全且迅速，起效快；但长期注射给药会引起注射部位组织损伤、疼痛和感染，患者的用药依从性差。相比于注射给药，口服给药具有无创、无疼痛、无需医护人员辅助和低成本等优点；同时，口服给药也存在药物吸收慢，易受胃肠内容物、胃肠蠕动状态及首过效应的影响，不适用于昏迷、呕吐或抽搐的病患等缺点。对于意识清醒且行动方便的患者来说，口服无疑是最经济、方便的服药方式。临床上能够口服给药的药物应避免注射给药。
20.深共熔溶剂(deep eutectic solvents，des)是由阳离子(氢键受体)和阴离子(氢键供体)以一定的化学计量比，在一定条件下形成的液态混合物，常温下的熔点通常低于100℃。组分间氢键的形成使组成分子的晶格能降低，导致混合物熔点降低而呈现液态。des的制备工艺简单，具有挥发性低、稳定性高和不易燃等特点。这些特点高度符合“绿色化学”的制药理念。同时，des还具有“可调节性”，即可以通过选择不同的阴、阳离子或者不同比例的阴、阳离子来改变des的物理、化学性质与生物活性。在药物递送中，des具有增加药物溶解度、提高药物稳定性和促进药物渗透性等作用，除此之外，des还可以作为药物活性成分，构成新型给药体系，应用于解决传统药物低溶解度、低生物利用度和多晶型的问题。目前，des在药物递送领域的应用还处于萌芽阶段。高黏性是限制des发展的主要因素。des在室温
下呈高黏性，在溶解药物时需要借助一定的机械外力。高黏性也限制了纯des的流动性，若想将其作为辅料加入制剂中，可能需要预先调节des的流动性，防止出现含量不均匀的问题。
21.本专利中选用胆碱(氢键受体)和香叶酸(氢键供体)作为des的主要组成成分，这两种物质均被美国食品药品监督管理局列为“安全成分”。胆碱是卵磷脂的重要组成成分，普遍存在于植物和动物中，其口服半数致死剂量为3400mg/kg。胆碱对于神经系统具有重要调节作用，世界卫生组织推荐的胆碱摄取量为：男性550mg/天，女性425mg/天。香叶酸来源于豆蔻和柠檬草等植物，其口服半数致死剂量为3700mg/kg。同时，香叶酸也是我国卫生部门批准使用的一种食品调味剂。根据文献报道，以胆碱作为氢键受体的des拥有良好的生物相容性。在胆碱与不同的氢键供体组合形成的des中，胆碱与香叶酸生成的des具有最高的药物溶解能力和最强的药物促渗作用。因此，本专利选择由胆碱和香叶酸组成des进行肝素类药物口服制剂的研究。
[0022][0023]
有益效果
[0024]
1、体外实验表明，本专利研制的口服制剂在模拟肠道消化液环境以及常温储存条件下稳定性高，易于生产和储存。体内实验表明，本专利研制的口服制剂能够显著提高肝素类药物的绝对生物利用度和相对生物利用度；且当本专利研制的口服制剂给药剂量为注射给药有效治疗剂量的4倍时，可达注射给药的有效血药浓度。
[0025]
2、本专利发明的基于深共熔溶剂技术开发的肝素类药物口服制剂是通过增强肝素类药物的肠道渗透性，从而改善肝素类药物的口服生物利用度。与传统的促渗方法相比，本专利发明的制剂制备过程简单，制备成本较低，且不涉及有机溶剂，符合“绿色化学”的理念。且本专利发明的制剂中使用的原料来源天然，被美国食品药品监督管理局列为“安全成分”，生物安全性较高。
附图说明
[0026]
图1为本发明中肝素类药物口服制剂的制备示意流程图
[0027]
图2为本发明中肝素类药物口服制剂中深共熔溶剂的核磁共振氢谱图
[0028]
图3为本发明中肝素类药物口服制剂的傅里叶变换红外光谱图
[0029]
图4为本发明中肝素类药物口服制剂的肠道消化液稳定性实验结果图
[0030]
图5为本发明中肝素类药物口服制剂的储存稳定性实验结果图
[0031]
图6为本发明中肝素类药物口服制剂的体外释放实验结果图
[0032]
图7为本发明中不同低分子量肝素制剂在大鼠体内的血药浓度-时间曲线图
[0033]
图8为本发明中肝素类药物口服制剂有效治疗给药剂量研究实验结果图
具体实施方式
[0034]
本发明所用的原料或者试剂，均市售可得。
[0035]
采用核磁共振波谱法、傅里叶变换红外光谱法、紫外分光光度法等技术对肝素类药物口服制剂进行表征。
[0036]
利用蠕动泵和微量生色底物法等仪器和方法评价肝素类药物口服制剂中肝素类药物的肠道渗透性和口服生物利用度。
[0037]
以下结合具体实施例对本发明做进一步的阐述。
[0038]
des：深共熔溶剂；lmwh：低分子量肝素；fitc-dextran：异硫氰酸荧光素葡聚糖。
[0039]
实施例1：des的合成与表征
[0040]
具体步骤为：取6.0ml胆碱碳酸氢盐(80％solution，0.045mol)置于100ml圆底烧瓶中，40℃水浴加热，搅拌下将3.3ml香叶酸(98％solution，0.030mol)逐滴加入胆碱溶液中，反应至无二氧化碳溢出；将反应瓶转移至旋转蒸发仪上，在60℃下旋蒸2小时，除去溶剂；将产物置于真空干燥箱中，在60℃下干燥24小时，得des。采用核磁共振波谱法，分别测定胆碱、香叶酸和des的氢谱图，通过分析氢原子的化学位移，验证des系统是否成立。
[0041]
结果如图2所示，des的核磁共振氢谱图中显示出胆碱和香叶酸的特征峰。此外，由于胆碱和香叶酸之间形成了氢键，des的核磁共振氢谱图中胆碱的羟基特征峰消失，表明了des的成功合成。
[0042]
实施例2：des-lmwh的合成与表征
[0043]
具体步骤为：取10mg lmwh溶解于0.5ml蒸馏水中，混匀，将上述溶液逐滴加入0.5ml des中，涡旋得des-lmwh，药物浓度为10mg/ml。将样品烘干后，采用傅里叶变换红外光谱法，分别测定des、lmwh和des-lmwh的红外光谱图。
[0044]
结果如图3所示，lmwh溶解于des后，两者之间并未生成新的共价键。des-lmwh中并未显示lmwh的特征峰，表明lmwh完全溶解于des中，des-lmwh是一个有机整体。
[0045]
实施例3：des-lmwh的肠道渗透性实验
[0046]
具体步骤为：取15只雄性sd大鼠(重约250～300g)按体重随机分成5组：free-lmwh组、des(4:1)-lmwh组、des(2:1)-lmwh组、des(1:1)-lmwh组和des(2:3)-lmwh组。采用在体单向肠灌流法，用fitc-dextran代替lmwh进行大鼠小肠灌流。实验前所有组别的大鼠禁食24h。free-lmwh组给予fitc-dextran水溶液，des-lmwh组给予含有不同比例des的des-fitc-dextran溶液。各组制剂中初始药物的浓度均为0.05mg/ml。先用生理盐水冲洗肠段内容物，再用ph 7.4的缓冲液平衡肠段，灌流速度为0.5ml/min，平衡时间为0.5小时。平衡结束后，将灌流液换为各组制剂，灌流速度为0.2ml/min，灌流时间为2小时。实验结束后，剥离并测量小肠的长度和内半径。采用重量法矫正灌流液的体积，通过微量生物底色法测定灌流前、后的药物浓度，从而计算各组制剂的肠道有效渗透系数peff和吸收速率常数ka，评估其肠道渗透性，优化制剂处方。
[0047]
计算公式：peff＝[-q*in(c
out
·vout
/c
in
·vin
)]/2*π*l*r
[0048]
ka＝q*(1-c
out
·vout
/c
in
·vin
)/(π*r*r*l)
[0049]cin
和c
out
分别为肠道进、出口灌流液的质量浓度(mg/ml)；v
in
和v
out
分别为校正后肠道进、出口灌流液的体积(ml)；l和r和为被灌流肠段的长度(cm)和横截面半径(cm)；q为灌流速度(ml/min)。
[0050]
表1为本发明中肝素类药物口服制剂的肠道渗透性实验结果图
[0051][0052]
*
p《0.05，
**
p《0.01,
***
p《0.001 vs control
[0053]
结果如表1所示，不同比例组成的des均能提高fd4的肠道渗透性，其效果受组成成分比例的影响。对peff进行单因素方差分析，发现仅有香叶酸与胆碱的摩尔比为2:1的组别与其他组有显著性差异；对ka进行单因素方差分析，发现各组之间差异均有统计学意义。其中，香叶酸与胆碱的摩尔比为2:1的组别与其他组别的差异最为显著。因此，选取香叶酸和胆碱摩尔比为2:1为最优处方。
[0054]
实施例4：des-lmwh的复合率和载药量测定
[0055]
具体步骤为：精密量取1.0ml des-lmwh(lmwh的浓度为10mg/ml)，加入9ml纯化水破坏des结构。样品溶液于4℃、10000r/min冷冻离心10min。取上清液，采用紫外分光光度法测定制剂中药物的含量，即w
real
；按照以下公式计算制剂的复合率和载药量。
[0056]
计算公式：复合率(％)＝(w
real
/w
drug
)*100％
[0057]
载药量(iu/g)＝w
real
/w
total
[0058]wreal
、w
drug
和w
total
分别为实际测得药量(iu)，投药量(iu)和制剂总重量(g)。
[0059]
结果表明，dem-lmwh具有较高的复合率和载药量，其中复合率为87.81％，载药量为957.47iu/g。
[0060]
实施例5：des-lmwh在肠道消化液中的稳定性研究
[0061]
为探究des-lmwh在模拟肠道环境中的稳定性，采用体外模拟法测定des-lmwh中的lmwh在肠液消化环境下的活性变化。具体步骤为：实验设置游离药物组(free lmwh)和制剂组(des-lmwh)，每组溶液中lmwh的浓度均为10mg/ml，且每组平行3份。精密量取各组制剂0.5ml，分别加入9.5ml人工模拟肠道消化液(ph 6.8磷酸盐缓冲液，含1％的胰蛋白酶和0.3％的胆酸盐)，在恒温、恒速(37℃、100rpm)的水浴摇床中进行体外模拟消化实验。在实验开始后第0、1、2、4h取样0.5ml。样品溶液于70℃水浴锅中灭酶，迅速冷却样品，将反应溶液置于4℃、6000r/min冷冻离心10min。取上清液，采用紫外分光光度法测定各个时间点的lmwh的活性。
[0062]
结果如图4所示，游离的lmwh在模拟肠液中的剩余活性随着消化时间的延长呈下降趋势，消化4h后，活性降低至92.97％；而在整个模拟消化过程中，des-lmwh组中lmwh的剩余活性一直保持在100％左右。由此可见，des-lmwh对肠液的耐受性良好，des对于lmwh在肠道中的活性具有保护作用，这可能归因于两者之间形成的氢键作用。
[0063]
实施例6：des-lmwh的储存稳定性研究
[0064]
为了考察制剂的稳定性，采用紫外分光光度法定期测定制剂中的药物含量。具体步骤为：精密称定10mg lmwh，加入0.5ml蒸馏水中，混匀。将lmwh水溶液加入0.5ml des中，
制成浓度为10mg/ml的des-lmwh，分别保存于(4
±
1)℃和(25
±
3)℃下。在实验的第0d,1d,4d,7d,14d，取20μl样品溶液，加水稀释10倍。取500μl稀释后的样品溶液至10ml容量瓶中，加入1.5ml天青ⅱ溶液(0.05mg/ml)，加水稀释到刻度，室温下反应5min后测定吸光度值，计算药物含量，从而评估制剂的储存稳定性。
[0065]
结果如图5所示，在两种温度条件存放下，制剂中的药物含量稳定，且组间均值显著性水平p＝0.643》0.05，说明制剂在4℃和25℃下的稳定性无显著性差异。
[0066]
实施例7：des-lmwh的体外释放研究
[0067]
为了考察des-lmwh在体内的释放情况，采用体外模拟法测定lmwh在不同ph条件下的累计释放量。具体步骤为：在恒温水浴摇床中进行体外释放实验(37℃、100rpm)，将4.5mldes-lmwh(10mg/ml)等分为9份置于透析袋内(mwco：8000-14000da)，分别放置于ph 1.2、ph 6.8和ph 7.4的磷酸缓冲液中，每种介质平行三份。在实验开始后第0.5、1、2、3、4、6、8、12、24、36和48h取样200μl，同时补充等体积新鲜的释放介质。采用紫外分光光度法测定各个时间点的lmwh的浓度，计算lmwh的累计释放量。
[0068]
结果如图6所示，当ph为1.2时，des-lmwh的释放度为零。很可能是由于lmwh在酸性环境下被破坏，导致样品中药物含量极低。这也提示了制剂在胃液环境中会被破坏，给药时需要绕过胃部环境或者进行肠溶包衣。释放持续36小时后，膜内外药物浓度趋于平衡。当ph为7.4时，des-lmwh的累计释放量最大，约为60％。
[0069]
实施例8：des-lmwh的口服生物利用度研究
[0070]
具体步骤为：取15只雄性sd大鼠(重约250
±
20g)按体重随机分成3组：静脉注射组、肠道注射组和对照组。各组的给药剂量均为40mg/kg。实验前所有组别的大鼠禁食24h。静脉注射组和肠道注射组给予制剂des-lmwh，对照组给予lmwh普通水溶液。在实验第0h、0.5h、1.0h、1.5h、2.0h、3.0h、4.0h、6.0h、8.0h和24h从大鼠眼球内眦静脉丛采集血样(0.5ml/次)。通过微量生色底物法测定样品血浆中lmwh的抗fxa活性，计算药物的血浆浓度，从而评估制剂的口服生物利用度。
[0071]
lwmh在大鼠体内的血药浓度-时间曲线和药动学参数如图7和表2所示。结果表明，des-lmwh口服制剂的相对生物利用度是lmwh水溶液的2.3倍，绝对生物利用度为21.2％，表明制剂显著提高了lmwh的口服生物利用度。
[0072]
表2 本发明中不同低分子量肝素制剂在大鼠体内的药动学参数结果图
[0073][0074]
实施例9：des-lmwh口服制剂有效治疗血药浓度的研究
[0075]
具体步骤为：取15只雄性sd大鼠(重约250
±
20g)按体重随机分成3组：皮下注射组(5mg/kg)、肠道注射低剂量组(20mg/kg)、肠道注射高剂量组(40mg/kg)。实验前所有组别的大鼠禁食24h。静脉注射组和肠道注射组给予制剂des-lmwh，皮下注射组和对照组给予lmwh普通水溶液。在实验第0h、0.5h、1.0h、1.5h、2.0h、3.0h、4.0h、6.0h、8.0h和24h从大鼠眼球内眦静脉丛采集血样(0.5ml/次)。通过微量生色底物法测定样品血浆中lmwh的抗fxa活性，
计算药物的血浆浓度，从而评估制剂的口服生物利用度。
[0076]
据相关文献报道，当lwmh的皮下注射剂量为5mg/kg时，大鼠体内的药物浓度即可达到有效治疗浓度。lwmh在大鼠体内的血药浓度-时间曲线如图8所示，当本专利研制的口服制剂给药剂量为注射给药有效治疗剂量的4倍时，可达注射给药的有效血药浓度。