一种治疗用重组卡介苗的冻干制剂及其制备方法和用途与流程

1.本发明生物制品领域，具体涉及一种治疗用重组卡介苗的冻干制剂及其制备方法和用途。


背景技术：

2.卡介菌是法国科学家calmette和guerin将一株来自于患结核病的牛的牛型分枝杆菌在含甘油、马铃薯和牛胆汁的培养基上进行培养分离，历经13年共231次传代，而得到的牛型分枝杆菌减毒株。以该卡介菌培养得到的卡介菌菌体制得的疫苗：卡介苗(bcg)，能够预防结核病。
3.除预防结核病的作用外，研究人员还发现了卡介苗对肿瘤的治疗作用。卡介苗可作为一种免疫调节剂，能够刺激机体增强免疫功能,促进释放免疫因子以达到抗肿瘤的效果，特别是对浅表性膀胱癌手术后防止复发(复发率高达60％～90％),甚至直接用于浅表性膀胱壁上生长的小乳头状肿瘤,有着良好的疗效和杀伤作用。自美国的morales等于1976年首次应用卡介苗(bcg)治疗膀胱癌以来，国内外研究者均进行了广泛的实验研究与临床观察。目前，已将bcg和丝裂霉素c作为治疗膀胱癌的首选药物，至今已有多个国家正式生产了用于治疗膀胱癌的治疗用卡介苗。
4.然而，一方面，为了获得更好的治疗效果，卡介菌的免疫原性，及其刺激机体细胞免疫反应的能力还有待进一步提升，因此，重组卡介菌的研究得到了越来越多的关注。例如申请号为cn201780089047.1的中国专利申请，公开了一种在卡bcg日本株中高量表达phopr的重组卡介菌，显著增强了免疫原性，与亲本菌株相比，重组卡介菌显著提高了细胞免疫反应，γ干扰素总量和cd4 t细胞γ干扰素的释放量提高3倍以上，且与亲本菌株有相同的安全性，表现出更佳的制备治疗用卡介苗的潜力。
5.不过，由于卡介苗的稳定性对其临床使用的有效性有重要影响，一方面，相比于用于预防结核病的卡介苗制剂而言，治疗用卡介苗中卡介菌的浓度增加，为治疗用卡介苗的稳定性带来了更高的挑战；另一方面，尽管治疗用卡介苗冻干制剂已有报道，例如公告号为cn111588859b的专利，虽然公开了一种用含有右旋糖苷、蔗糖、谷氨酸钠、氯化钾和海藻糖的冻干保护剂和卡介菌为bcg d2pb302菌株制备而成的卡介苗冻干制剂。然而，由于影响卡介苗稳定性的因素涉及菌种本身、冻干保护剂、培养基等多方面，由于重组卡介苗与卡介苗的菌种存在差异，其生理活性、理化性质存在区别，因此，制备卡介苗冻干制剂的冻干保护剂或冻干工艺难以直接应用于重组卡介苗。
6.为了保障治疗用重组卡介苗的稳定性和有效性，研发一种稳定性佳、效力高的治疗用重组卡介苗冻干制剂具有重要意义。


技术实现要素：

7.本发明的目的在于提供一种治疗用重组卡介苗的冻干保护剂及其用途。
8.本发明提供了一种治疗用重组卡介苗冻干制剂，它含有如下各重量份数的组分：
9.重组卡介菌12份、右旋糖苷-40 1～3份、蔗糖3.5～4.5份、谷氨酸钠1～3份、氯化钾0.8～1.3份、海藻糖3.5～4.5份、吐温-80 0.005～0.015份。
10.进一步地，它含有如下各重量份数的组分：重组卡介菌12份、右旋糖苷-40 3份、蔗糖4份、谷氨酸钠1～3份、氯化钾1份、海藻糖4份、吐温-80 0.01份；
11.优选地，它含有如下各重量份数的组分：重组卡介菌12份、右旋糖苷-403份、蔗糖4份、谷氨酸钠2份、氯化钾1份、海藻糖4份、吐温-80 0.01份。
12.进一步地，它是重组卡介菌与稳定剂混合冻干而成；
13.所述稳定剂是含有所述右旋糖苷-40、蔗糖、谷氨酸钠、氯化钾、海藻糖和吐温-80的水溶液，所述水溶液的ph值为7.3～7.5,。
14.更进一步地，所述冻干的工艺如下：
15.(a)预冻：温度-40～-45℃，维持2～3小时；
16.(b)升华干燥：温度-20～-10℃，真空压力8～10pa，干燥12～18小时；
17.(c)解吸干燥：温度30～35℃，真空压力0.5～10pa，干燥6～12小时。
18.更进一步地，上述重组卡介菌是过表达phop和phor蛋白的卡介菌；优选地，所述过表达phop和phor蛋白的卡介菌是如专利申请号为cn201780089047.1的专利申请中所述的重组卡介菌。
19.本发明还提供了上述的治疗用重组卡介苗冻干制剂的制备方法，包括如下步骤：
20.(1)右旋糖苷、蔗糖、谷氨酸钠、氯化钾、海藻糖和吐温加注射用水配制成溶液，其中右旋糖苷的质量浓度为1～3％；
21.(2)将重组卡介菌加入步骤(1)的溶液中形成均一溶液，
22.(3)步骤(2)得到的均一溶液进行冻干，冻干工艺为：在温度-40～-45℃，预冻2～3小时；然后在温度-20～-10℃，真空压力8～10pa，干燥12～18小时；最后在温度30～35℃，真空压力0.5～10pa，干燥6～12小时。
23.进一步地，步骤(1)还包括加碱调节溶液ph至7.3～7.5的步骤；优选地，所述碱是氢氧化钠；
24.和/或步骤(1)还包括将溶液灭菌的步骤；优选地，所述灭菌是在115～120℃，0.15～0.20mpa条件下灭菌30～60分钟。
25.进一步地，步骤(2)所述将重组卡介菌加入步骤(1)的溶液中包括先用步骤(1)的溶液稀释重组卡介菌制备原液，再加入步骤(1)的溶液稀释至重组卡介菌质量浓度为12％。
26.进一步地，步骤(3)所述均一溶液灌装在西林瓶中进行冻干。
27.本发明还提供了上述的治疗用重组卡介苗冻干制剂在抗肿瘤药物中的应用，优选地，所述药物是治疗膀胱癌和/或预防膀胱癌复发的药物。
28.本发明的有益效果：本发明提供了一种过表达phop和phor蛋白的重组卡介菌制备的治疗用重组卡介苗冻干制剂，所用的稳定剂能够有效减轻或防止冷冻干燥过程对重组卡介菌造成损害，从而有效保证重组卡介菌活力和生物活性，重组卡介苗活菌数量高、分散性、稳定性好，具有很好的临床应用价值。
29.本发明的术语：“卡介菌”指减毒牛型分枝杆菌，包括其经培养基培养、传代得到的菌体。
[0030]“卡介苗”是由减毒牛型分枝杆菌制成的活菌苗，具有增强巨噬细胞活性，加强巨
噬细胞杀灭肿瘤细胞的能力，活化t淋巴细胞，增强机体细胞免疫的功能。
[0031]
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
[0032]
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
具体实施方式
[0033]
本发明所用原料与设备均为已知产品，通过购买市售产品所得。
[0034]
本发明重组卡介菌的来源：重组卡介菌为专利申请201780089047.1公开的重组卡介菌(bcg-japan/phopr)，其原始种子(bcg-3株)从加拿大多伦多大学引进。主种子批和工作种子批由成都安永鼎业生物技术有限公司制备。
[0035]
实施例1、本发明治疗用重组卡介苗冻干制剂的制备
[0036]
(一)、稳定剂的制备：注射用水中加入如下质量分数的组分：右旋糖苷3.0％、蔗糖4.0％、谷氨酸钠1.0％、氯化钾1.0％、海藻糖4.0％、吐温0.01％，然后用10％氢氧化钠溶液调节ph值为7.3～7.5，于116℃、0.16mpa条件下，灭菌50分钟。
[0037]
(二)、生产菌种传代
[0038]
1.工作种子复苏：重组卡介菌工作种子，接种罗氏培养基，于38℃培养2-3周。
[0039]
2.传代苏通培养基：罗氏菌种接种于苏通培养基，于适宜温度(38℃)，适宜时间(2-3周)培养。
[0040]
(三)、原液制备
[0041]
1.生产菌膜培养：用生产菌种以适宜接种量2次传代苏通培养基，在适宜温度下(38℃)培养适宜时间(7-12天)后，得到苏通培养基菌膜用于原液制备。
[0042]
2.原液制备：收集培养的菌膜，在低温振荡器上进行研磨；再用稳定剂稀释至一定浓度，即为治疗用重组卡介苗原液。
[0043]
(四)、半成品配制
[0044]
用稳定剂将原液稀释成浓度为120mg/ml，即为治疗用重组卡介苗半成品。
[0045]
(五)、灌装、冻干
[0046]
1.采用西林瓶包装，灌装量：0.5ml/瓶。
[0047]
2.冻干
[0048]
重组卡介苗冻干工艺：
[0049]
a预冻：最低温度-40-45℃，达到最低温度后维持2～3小时；
[0050]
b升华干燥：最终温度-20～-10℃，运行时间为12～18小时，真空压力控制在8～10pa；
[0051]
c解吸干燥：最终温度30～35℃，真空压力控制在0.5～10pa，运行6～12小时。
[0052]
实施例2、重组卡介苗冻干制剂的制备
[0053]
稳定剂的制备：注射用水中加入如下质量分数的组分：右旋糖苷3.0％、蔗糖4.0％、谷氨酸钠2.0％、氯化钾1.0％、海藻糖4.0％、吐温0.01％，然后用10％氢氧化钠溶液调节ph值为7.3～7.5，于116℃、0.16mpa条件下，灭菌50分钟。
[0054]
其余方法步骤同实施例1。
[0055]
对比例1、
[0056]
不含吐温的稳定剂的制备：注射用水中加入如下质量分数的组分：右旋糖苷3.0％、蔗糖4.0％、谷氨酸钠1.0％、氯化钾1.0％、海藻糖4.0％；然后用10％氢氧化钠溶液调节ph值为7.3～7.5，于116℃、0.16mpa条件下，灭菌50分钟。
[0057]
其余方法步骤同实施例1。
[0058]
对比例2、
[0059]
组分用量比例与实施例不同的稳定剂的制备：注射用水中加入如下质量分数的组分：右旋糖苷3％、蔗糖6％、谷氨酸钠1％、氯化钾1％、海藻糖2％、吐温0.01％；然后用10％氢氧化钠溶液调节ph值为7.3～7.5，于116℃、0.16mpa条件下，灭菌50分钟。
[0060]
其余方法步骤同实施例1。
[0061]
对比例3、
[0062]
注射用水中加入如下质量分数的组分：右旋糖苷1％、蔗糖8％、谷氨酸钠1％、氯化钾1％、海藻糖2％、吐温0.01％；然后用10％氢氧化钠溶液调节ph值为7.3～7.5，于116℃、0.16mpa条件下，灭菌50分钟。
[0063]
以下通过实验例证明本发明的有益效果。
[0064]
实验例1、本发明制剂的质量评价
[0065]
1、实验方法
[0066]
对实施例和对比例制剂冻干前后的活菌数、物理外观和水分、热稳定性等性能进行了评价和比较，结果如表2所示。
[0067][0068]
从表中的结果可以看出，添加本发明特定组成的稳定剂的重组卡介苗冻干制剂(实施例1、2)冻干后活菌率较高达到12-23％，成品活菌数不低于30
×
106cfu/mg；产品热稳定性好，与4℃储存条件(即冻干后活菌数)相比活菌率达到50％以上；且有利于重组卡介菌分散，同批产品分装前、后段样品的活菌数一致性好，反映本发明制剂有效减少了细菌聚集，产品活菌数均一性优异；各项性能显著优于对比例。
[0069]
上述结果证明，只有在本发明特定的稳定剂组分和用量下，才能够制得分散效果好、活菌数量高、性质稳定、易于保存的治疗用重组卡介苗冻干制剂。
[0070]
综上，本发明提供了一种治疗用重组卡介苗的冻干制剂，该制剂活菌数量高、性质稳定，易于保存，作为治疗膀胱癌和/或预防膀胱癌复发的药物具有很好的应用价值。