罗丹明硫螺内酯在上转换荧光分析法检测汞离子中的应用

1.本发明属于单光子吸收上转换（one-photon absorption upconversion，opa-uc）领域。具体涉及一种具有聚集态opa-uc上转换增强响应的罗丹明硫螺环内酯（rhs）探针以及该探针在高浓度汞离子检测应用。


背景技术：

2.汞离子污染有很多危害，特别是高浓度汞离子对人体和环境影响更甚。目前，测定汞离子的方法很多，如分光光度法、荧光法、电化学法和原子吸收光谱法等。其中，荧光分析法因其具有灵敏度高、检测时间短和操作相对简单等优点，备受青睐。然而，荧光检测法仅适合于低浓度汞离子的检测，这是由于常规的荧光法借助的是stokes荧光技术。众所周知，stokes荧光检测由于其浓度淬灭现象（ciq），只能探测很低浓度(通常＜10μ m)的离子，这限制了stokes荧光识别在高浓度范围检测中的应用。考虑到大浓度、宽范围的离子检测在污染环境中（如电镀废水和印染废水等）发挥着重要作用，高浓度汞离子检测技术开发与应用具有重要现实意义。


技术实现要素：

3.本发明公开了一种用单光子吸收上转换（opa-uc）检测技术，可检测高浓度的汞离子（毫摩尔浓度量级，mm）；克服了使用常规的荧光（即stokes荧光）检测技术仅能检测低浓度的汞离子（微摩尔浓度量级，μm）的局限性。相比于常规的荧光检测法，使用opa-uc方法对汞离子的浓度检测可提高2个数量级。此外，本发明使用是反斯托克斯发射，即“长波长激发，短波长发射”的上转换检测方法。使用长波长的激发光源，可加深激发光源在介质中的穿透力，检测深度广；同时，因其所需激发波长较长（即能量较低），可避免生物体背景荧光的影响从而提高检测分辨率。因而相较于常规的斯托克斯荧光（即下转换荧光）检测技术，opa-uc上转换检测技术则具有更绿色环保的应用前景。
4.为达上述发明目的，本发明采用的技术方案是：本发明公开了罗丹明硫螺环内酯在上转换荧光分析法检测汞离子中的应用，尤其是在高浓度汞离子检测中的应用。本发明公开的可以检测微摩尔浓度至毫摩尔浓度的汞离子，比如1
×
10-6 m～1
×
10-2 m，尤其是5
×
10-5 m～1
×
10-3 m，特别是1
×
10-4 m～1
×
10-3 m，汞离子浓度是指汞离子在上转换样本中的浓度。
5.本发明公开了一种上转换荧光分析检测样本中汞离子的方法，包括以下步骤，将含有汞离子的样本与罗丹明硫螺环内酯溶液混合，得到混合液，再用655 nm激发光源辐照混合液，根据发生光波长完成样本中汞离子的检测；具体的，当发射光的波长范围为565～630 nm，说明样本中含有汞离子。进一步的，除了定性检测之外，本发明方法还可以定量测样本中汞离子。混合液中，罗丹明硫螺环内酯的浓度为1 μm～10 mm，优选10 μm～1 mm，进一步优选10 μm～0.5 mm，可以检测高达毫摩尔浓度的汞离子。而且本发明通过肉眼观察即可判断样本中是否有汞离子，用655 nm的小型半导体激光器（＜1 w）照射rhs样本混合液，
如果出现明亮的橙色上转换荧光（峰位在~595 nm），表明样本含有汞离子；如果未出现明亮的橙色上转换荧光，则表明样本不含有汞离子。
6.本发明公开了上述罗丹明硫螺环内酯的制备方法，包括以下步骤：在氮气气氛和有机溶剂中，将罗丹明b和三氯氧磷进行反应，得到罗丹明b酰氯；再将罗丹明b酰氯与硫脲反应，得到罗丹明硫螺环内酯(rhs），作为单光子吸收上转换荧光探针。
7.本发明中，所述的有机溶剂为二氯乙烷、四氢呋喃或二氧六环中的一种。罗丹明b和三氯氧磷的反应温度为50～120℃，优先选择70～80℃，反应时间为8～15小时，优选10～13小时；罗丹明b酰氯与硫脲的反应温度为15～60℃，优先选择室温，反应时间为8～15小时，优选10～13小时。罗丹明b、三氯氧磷、硫脲的摩尔比为1: 1.5～2.0:3～6。
8.本发明中，罗丹明硫螺环内酯采用单光子上转换荧光分析法检测汞离子，优选的，采用上转换荧光分析法检测汞离子时，激发光的波长为655 nm，发射光的波长范围为565～630 nm。用655 nm激发光源辐照探针rhs检测液，其不发光。只有当加入汞离子后即才可促使rhs探针发生开环生成开环的罗丹明衍生物，后者在655 nm激发光源辐照下，可发出明亮的橙色荧光。
9.上述技术方案中，本发明的技术方案具有如下技术效果和优点：本发明的探针制备方法简单，毒性小。探针检测液ph=7（tris-hcl/dmso, 1/1, v/v），实用性广。常规的荧光（stokes荧光）检测法由于受限于浓度猝灭效应（ciq），其探针的使用浓度一般不能高于10 μm，因此，也导致了常规荧光检测法可检测的外来物种（如汞离子）不超过10 μm。如罗丹明b在1
×ꢀ
10-6 ~1
×
10-5 m浓度范围内，其stokes荧光的强度是增强的；但当浓度高于1
×
10-5 m时，罗丹明b的荧光急剧下降。因此，用于stokes荧光检测的探针的使用浓度不能高于10 μm，也即能检测到的汞离子浓度亦不能高于10 μm。
10.有意义的是，本发明单光子吸收上转换（opa-uc）检测的探针的使用浓度可达到毫摩尔浓度，所以能检测到的汞离子浓度亦可高达毫摩尔浓度，这在检测环境污染废水中具有重要意义。作为示例，在655 nm连续二极管激光(1.7 w
∙ꢀ
cm-2
)的激发下，opa-uc强度在1
×
10-6 m~1
×
10-3 m浓度范围内增强了约14倍，其中opa-uc光谱呈现两种不同的变化特征：在1
×
10-6 m~1
×
10-4 m浓度范围内，opa-uc强度且保持了光谱形态和峰位不变；在1
×
10-4 m~1
×
10-3 m浓度范围内，opa-uc的强度继续增强，且峰位明显红移和光谱形状由双荧光峰变为单峰。因此，本发明上转换探针的使用浓度可以高达1.0 mm，即可检测到的汞离子浓度高达1.0 mm。
11.此外，opa-uc检测所用仪器为小型半导体激光器和光纤光谱仪，无需常规的大型荧光光谱仪器，因此，opa-uc检测显示出更加经济和便携。最后需要强调的是，目前已报道的有机上转换技术还包括双光子吸收上转换（tpa-uc）和三线态-三线态湮灭上转换（tta-uc）。前者需要的激发光的强度非常高（即激发光强度要达到兆瓦/平方厘米以上才能获得），而后者则需要在隔绝氧气的环境中才能获得。相比于前两种上转换（即tpa-uc和tta-uc），opa-uc既无需高的激发光的强度（激发光强度不高于瓦/平方厘米即可），又无需隔绝氧气，从而使得上转换检测技术更具实际应用价值。
附图说明
12.图1为罗丹明硫螺环内酯（rhs）的质谱图。
13.图 2 为罗丹明硫螺环内酯（rhs）的核磁氢谱（氘代dmso）。
14.图3为分别加入16种金属阳离子后，探针rhs的上转换荧光光谱图（其中，探针浓度和金属离子浓度均为100 μm，激发波长655 nm）。
15.图4为探针rhs（螺环结构）和罗丹明b（rhb, 开环结构）的吸收光谱。
16.图5为探针rhs（螺环结构）和罗丹明b（rhb, 开环结构）的荧光光谱。
17.图6为加入不同浓度的汞离子（0~1 mm），探针rhs溶液的上转换荧光光谱（探针浓度0.5 mm，激发波长:655 nm）。
18.图7为相应的工作曲线，其中，纵坐标i/i0为加入hg
2
前、后探针在620 nm荧光强度（探针浓度0.5 mm，激发波长: 655 nm）。
19.图8为加入不同浓度的汞离子（0~10μm），探针rhs溶液的stokes荧光光谱（探针浓度10 μm，激发波长: 553 nm）。
20.图9为在不同浓度下，罗丹明b的stokes荧光光谱（在520 nm xe灯激发下，溶剂为水）。
具体实施方式
21.本发明公开了一种用单光子吸收上转换（opa-uc）检测技术，采用单光子吸收上转换荧光探针—罗丹明硫螺环内酯（rhs），可检测高浓度的汞离子（毫摩尔浓度量级，mm）；对废水汞离子检测具有应用价值。opa上转换测试，选用655 nm半导体激光器作为激发光源，光纤光谱仪作为信号接收和处理设备。下转换测试：用爱丁堡荧光光谱仪器测试，激发波长553 nm。
22.本发明在氮气气氛和有机溶剂中，以罗丹明b为原料，先与三氯氧磷进行回流反应，后与硫脲在室温进行反应，最终得探针rhs。进一步的，在罗丹明酰氯与硫脲反应结束后，旋转蒸发去除溶剂，通过柱层析和真空干燥得到荧光探针rhs，为淡黄色粉末。上述技术方案可表示如下：本发明公开的单光子吸收上转换荧光分析检测样本中汞离子的方法如下：（1）将探针rhs溶于二甲基亚砜（dmso）中，加入到等体积量的三羟甲基氨基甲烷/盐酸缓冲液（简称缓冲液tris-hcl，ph=7）中，配制得到rhs检测液；避光保存；（2）将样本溶液滴入上述rhs检测液，得到“rhs 样本”混合液；（3）用655 nm的小型半导体激光器（＜1 w）照射“rhs 样本”混合液，如果出现明亮的橙色上转换荧光（峰位在~595 nm），表明滴入的样本含有汞离子；如果未出现明亮的橙色上转换荧光，则表明滴入的样本不含有汞离子。本发明的创造性在于，“rhs 样本”混合液中，可检测的汞离子浓度可从微摩尔浓度至毫摩尔浓度（即1
×
10-6 m～1
×
10-3 m），克服了现有stokes荧光检测仅可检测汞离子浓度≤1
×
10-5 m的技术局限。
23.实施例一 罗丹明硫螺环内酯（rhs）的制备在50 ml的三口烧瓶中加入罗丹明b（1 g，2.6 mmol）、三氯氧磷（8 ml）和20 ml二
氯乙烷；90℃回流反应12h，反应过程点板跟踪，展开剂为二氯甲烷：石油醚（1/1，v/v），停止反应，冷却至室温；减压蒸馏除去二氯乙烷和三氯氧磷，得到土黄色固体中间产物（罗丹明酰氯）。在不提纯的情况下，直接将上述中间产物溶于无水四氢呋喃中，加入硫脲（10 mm , 760 mg）；在氮气气氛下，室温反应12h；反应过程点板跟踪，展开剂为二氯甲烷：石油醚（1/1，v/v）。停止反应，冷却至室温；加圧蒸留除去四氢呋喃得到固体混合物，通过柱层析方法提纯产物，展开剂为二氯甲烷：石油醚（1/1，v/v），得到0.21g浅黄色的产物rhs。1h nmr (400 mhz, 氘代dmso) δ 7.87 (1h), 7.6 (1h), 7.4 (1h), 7.25 (1h), 6.75 (2h), 6.25 (4h), 3.38~3.31 (q, 8h), 1.29~1.14 (t, 12h)。ms, 计算值：c
28h30
n2o2s[m

] 458.20。测试值：ms (maldi-tof)：459.21；见附图1和附图2。
[0024]
实施例二探针（rhs）母液的配制：将一定量的探针rhs溶于二甲基亚砜（dmso）中，与等体积量的三羟甲胺甲烷/盐酸缓冲水溶液（ph=7）混合，配制得到浓度为2.0 mm 的母液，避光保存。
[0025]
探针（rhs）检测液的配制：将取一定量的rhs母液，分别用不同体积量的dmso稀释，得到两种不同浓度的rhs检测液：用于常规的stokes荧光检测时，rhs检测液的浓度为10 μm；用于opa-uc检测时，rhs检测液的浓度为0.5 mm。
[0026]
待测的金属离子溶液配制：选择16种金属离子（分别为：hg
2
、pb
2
、cd
2
、zn
2
、cu
2
、fe
2
、fe
3
、co
2
、ni
2
、mn
2
、mg
2
、ca
2
、na

、k

、li

、nh
4
），分别配制了浓度为100 μm金属离子水溶液（用缓冲溶液控制ph=7），以常规金属盐作为原料。再以二氯化汞水溶液为待测液，配制浓度范围在0～1.0 mm的汞离子水溶液（用缓冲溶液控制ph=7）。
[0027]
实施例三 探针rhs对hg
2
选择性响应在盛有探针rhs检测液的比色皿中分别加入16种（分别为：hg
2
、pb
2
、cd
2
、zn
2
、cu
2
、fe
2
、fe
3
、co
2
、ni
2
、mn
2
、mg
2
、ca
2
、na

、k

、li

、nh
4
）金属离子水溶液（100 μm，终浓度），随即测定上转换荧光光谱（opa-uc检测，激发波长为655 nm）。由附图3可见，只有在加入hg
2
后出现宽而强的上转换荧光，峰位在~590 nm，肉眼可见到非常强烈的橙黄色荧光从rhs检测液里发出。相反地，加入了其它15中金属离子后，rhs检测液的opa-uc光谱几乎没有发生变化，肉眼也观测不到rhs检测液发出荧光。
[0028]
附图4和附图5可见，探针rhs分子由于具有螺环结构，其吸收带很弱，峰位于紫外光区的358 nm（见附图4，虚线），该探针rhs在可见光区内不发光（见附图5，虚线）。当探针rhs分子遇到汞离子后，hg
2
就和rhs分子内的硫原子（s）作用，最终形成开环结构的罗丹明b，其分子内三个苯环之间形成共轭关系，出现宽而强的吸收带，峰位在553 nm（见附图4，实线光谱）；同时，开环结构的罗丹明b（rhb）出现宽而强的荧光发射，峰位在585 nm（见附图5，实线光谱）。表明rhs探针对hg
2
的荧光检测行之有效，选择性很高。
[0029]
实施例四 探针rhs对hg
2
浓度的响应在0.5mm的探针溶液（ph=7）中加入不同浓度的hg
2
（0~1 mm，终浓度，0.001、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0，单位都是mm），观察探针溶液的上转换荧光光谱的变化（激发波长655 nm），见附图6。可以看到，在hg
2
浓度为0~1 mm范围内，探针溶液的上转换荧光强度与hg
2
浓度呈现很好的现线性关系（相关系数r2=0.993，检测限为1.74
×
10-6
m），见附图7。作为对比，用常规的stokes荧光法测试探针rhs对
hg
2
浓度响应（见附图8），此时探针rhs的使用浓度上限只可定为10 μm（即1
×
10-5 m），当rhs探针的浓度大于1
×
10-5 m时，其开环结构rhb的荧光将大幅度淬灭（参见附图9），因此现有技术认为rhs只可在浓度0~10 μm范围内检测hg
2
；实验证实，在0.05 mm（即5
×
10-5 m）的探针溶液中加入0.1 mm浓度或者0.05 mm浓度的hg
2
，用常规的stokes荧光法测试，均不能得到真实线性的“浓度-荧光”工作曲线，说明无法应用。作为对比，本课题组之前公开的四溴荧光素螺环内硫酯（cn113354662a）对汞离子的检测浓度上限为50μm，增加导致上转换荧光强度明显下降，至100μm时，无法应用。
[0030]
由此可见，相对于常规的（stokes）荧光检测方法来说，本发明用单光子吸收上转换（opa-uc）检测技术可检测的汞离子的浓度提高了2个数量级，用于高污染（印染和电镀等）废水检测，具有实用意义。
[0031]
本方面公开了一种用单光子吸收上转换（opa-uc）检测技术，可检测高浓度的汞离子（毫摩尔浓度量级，mm）；克服了使用常规的荧光（即stokes荧光）检测技术仅能检测低浓度的汞离子（微摩尔浓度量级，μm）的局限性。单光子吸收上转换荧光，其光谱特征为“短波（长） 激发，长波（长）发射”。其机理为通过激发单光子热带能级（s0υ
t
），跃迁至激发单线态（s1）而后通过辐射衰变回落至基态而发光。上转换荧光属于反-斯托克斯（an-stokes）荧光，而传统的斯托克斯（stokes）荧光即为下转换荧光。传统的下转换荧光发射检测方法大多是用短波长（如紫外光）来检测的，其能量高（还会激发废水中一些有机杂质）检测干扰大；上转换检测技术由于是用长波长（可见光）来检测的，其激发光强度小，能量低检测干扰小，激发光穿透深度大、对生物辐射伤害小安全可靠且在空气氛中即可检测。