一种葱韭类蔬菜种子超低温保存方法

1.本发明属于种子保存技术领域，尤其涉及一种葱韭类蔬菜种子超低温保存方法。


背景技术：

2.葱韭蔬菜主要包括韭菜、洋葱、韭葱、大葱等。富含糖分、维生素c以及硫、磷、铁等矿物质，并含有杀菌物质，有促进食欲、调味、去腥和医疗等作用，是重要的药菜兼用型特色蔬菜。
3.葱韭蔬菜类型多样，种质资源遗传多样性非常丰富，这些资源主要以种子的形式进行保存，服务于育种和产业发展。葱韭蔬菜种子属于短命种子，一般常温下，1-2年其活力会明显下降。因此，保存这些资源主要在低温种质库中进行保存。然而研究发现，在低温保存中保存这些种质资源并不理想，3-5年后均有明显下降，严重影响种子的发芽率。在实际实施中，种质资源保存库不得不耗费大量的人力物力不断监测这些资源的活力，并每隔2-5年就要对这些资源进行更新复壮。如何长久安全保存这些国家战略资源，面临巨大挑战。因此，研究一种可以长久安全保存这些种质资源的方法具有重大意义。
4.超低温保存作为离体保存技术的重要组成部分，具有环保，节约成本，方便等众多优点，是植物种质资源长期保存的理想方法。超低温保存技术是目前长期有效保存种质资源的方法，是指在-80℃以下的超低温中保存种植资源的生物学技术，其中液氮最为常用，是-196℃(液氮)的超低温环境下，植物种子几乎所有活细胞的物质代谢和生长活动处于相对稳定的生物学状态。这种方法能够保持生物材料的遗传稳定性，而且也不会丧失其形态发生的潜能。超低温保存技术可以保存和抢救物种，能避免物种突变的发生，是长期稳定保存植物种资源以及珍贵实验材料的重要方法。液氮超低温保存技术从开始成功储存植物材料发展至今，已被公认为种质长期保存的最佳方法之一。植物种子在液氮超低温环境中会停止细胞新陈代谢，因而细胞活力和形态理论上可获得稳定保存。超低温保存早期大多使用冻结化保存技术，主要有直接冷冻法、分步冷冻法、玻璃化法、干燥冷冻法、包埋脱水法等。到目前为止，1922年h.e.knowlton 将金鱼草花粉冷冻到-180℃后，仍获得一定程度的萌发率。这是超低温冷冻保存植物种质的最早报告。1956年日本科学家a.sakai首次报道耐寒桑树枝经冷冻脱水后超低温保存能存活。1968年r.s.quatrano报道亚麻培养细胞经(dmso) 预处理后能够抗-50℃低温。1971年r.latta报道胡萝卜悬浮细胞在液氮(-196℃) 中保存成功，且再生出胚状体。1976年m.seibert首次报道麝香石竹茎尖超低温保存成功，指出具有2～3对叶原基的效果最好，之后超低温保存技术在植物种质资源保存方面的研究逐渐深入，应用不断扩大。已有近千种植物成功进行了超低温保存，并且一些植物种质资源实现了规模化超低温保存；如苹果、桑树休眠芽和马铃薯茎尖。郑光植等人1983年成功地对药用植物的愈伤组织及其悬浮培养细胞进行了超低温保存，成为我国植物种质资源超低温保存研究的开创者。1989年，uragami等及langis等首次用玻璃化法成功地冻存了石刁柏体细胞胚和薄荷悬浮培养物。1992年，niino等采用包埋干燥法保存5个苹果品种的离体茎尖得到了较高的存活率。在国内此项研究起步较晚，赵艳华等人在1998年用包埋干燥超低温
技术保存苹果离体茎尖，获得了成功。研究还发现，2015年曾琳等人已对益智种子进行了液氮超低温保存实验探究，并已证明液氮超低温保存益智种子是可行的。2016宋红等人超低温冷冻后的玉蝉花种子可溶性蛋白含量、过氧化物酶(pod)活性和菊花茎尖超氧化物歧化酶(sod)活性降低了。尽管目前存在多种超低温保存植物材料的方法，但到目前为止仍没有一种可对所有植物材料进行保存的方法。因此，要对植物材料进行恰当的保存，必须根据材料的特点来选择合适的方法。
5.总上述，超低温保存技术可以实现种子长久安全保存，但需要针对不同作物的特点开展关键技术研究，从而建立相应的超低温保存方法。目前，应用在葱韭类蔬菜种子超低温保存方法尚未见报道。
6.通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：葱韭蔬菜属于短命性种质，对其长久安全保存面临巨大挑战；如何能简易高效的保存蔬菜类蔬菜种质资源缺乏技术参考；尚无针对葱韭类蔬菜种质资源的超低温保存技术；对葱韭类种子超低温保存后生理指标是否发生变化以及变化规律均不明了。


技术实现要素：

7.针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种葱韭类种子超低温保存方法。
8.本发明是这样实现的，一种葱韭类种子超低温保存方法包括：
9.步骤一、取适量种子进行处理放入冻存管中；
10.取适量种子，将种子放置在培养皿中再用滴管吸取冷冻保护剂pvs2浸泡 (浸泡0min,20min，30min，40min)种子。(pvs2)：30％甘油 15％乙二醇 15％二甲亚砜 0.4mol
·
l蔗糖。取出种子并用滤纸擦干种子表面残留pvs2，种子放入冻存管中；
11.步骤二、将冻存管投入液氮罐；
12.步骤三、对超低温处理后种子进行复温(化冻)，按照正交表中(表1) 设计的试验方法在4℃，25℃，30℃，40℃四种不同水平的温度，放置4h， 10h，16h，24h。
13.步骤四、将复温(化冻)后的种子进行发芽试验；
14.步骤五、将发芽的种子转移至含有基质的穴盘中培养。
15.进一步，所述步骤四中的发芽试验步骤包括：
16.准备透明塑料培养皿，将灭菌后的滤纸用蒸馏水浸湿放入培养皿中；
17.再将经过不同时间及温度复温(化冻)后的种子放入，在22℃人工培养箱中进行种子发芽实验，每组50粒种子，三次重复。
18.结合上述的技术方案和解决的技术问题，本发明提供了一种简易可实现葱韭类蔬菜种子长久保存的发明方法；可实现大规模的葱韭类蔬菜种质资源的安全保存；大大减少定期繁种提高种源活力的物力消耗。
附图说明
19.图1是本发明实施例提供的葱韭类种子超低温保存方法流程图；
20.图2是本发明实施例提供的各因素曲线效应图；
21.图3是本发明实施例提供的实验过程效果图一。
22.图4是本发明实施例提供的实验过程效果图二。
具体实施方式
23.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
24.如图1所示，本发明实施例提供的葱韭类种子超低温保存方法包括：
25.s101，取适量种子放入冻存管中；
26.s102，将冻存管投入液氮罐；
27.s103，对超低温处理后种子进行复温(化冻)；
28.s104，将复温(化冻)后的种子进行发芽试验；
29.s105，将发芽的种子转移至含有基质的穴盘中培养。
30.所述步骤s101取适量种子进行处理放入冻存管中包括：
31.取适量种子，将种子放置在培养皿中再用滴管吸取冷冻保护剂pvs2浸泡(浸泡0min,min20min，30min，40min)种子。(pvs2)：30％甘油 15％乙二醇 15％二甲亚砜 0.4mol
·
l蔗糖。取出种子并用滤纸擦干种子表面残留pvs2，种子放入冻存管中；
32.所述步骤s103对超低温处理后种子进行复温(化冻)，按照正交表中 (表1)设计的试验方法在4℃，25℃，30℃，40℃四种不同水平的温度，放置4h，10h，16h，24h。
33.进一步，所述步骤s104中的发芽试验步骤包括：
34.准备透明塑料培养皿，将灭菌后的滤纸用蒸馏水浸湿放入培养皿中；
35.再将经过不同时间及温度复温(化冻)后的种子放入，在22℃人工培养箱中进行种子发芽实验，每组50粒种子，三次重复。
36.本发明实施例在研发或者使用过程中取得了一些明显效果，和现有技术相比的确具备很大的优势。
37.优势1：
38.经过本发明方法保存后的种子很好地保持了原有的生活力并可以成功生长发育成完整植株，达到了长久保存种子的效果；
39.优势2：经过较大规模的试验研究证明韭菜和大葱种子用液氮超低温保存这一方法是十分可靠的，并且对韭葱和洋葱韭种子的超低温保存也获得同样的效果；
40.优势3：通过对比不同种质最适超低温保存条件，可见本发明的液氮超低温保存对不同种源有很好的适用性；优势4关本发明方法成功探索研究出葱韭类蔬菜种子超低温保存的技术方法。
41.下面内容结合试验过程的数据、图表等进行描述。
42.1、材料与方法：
43.1.1材料：
44.供试材料韭菜，大葱，韭葱，洋葱4种葱韭类蔬菜种质资源。
45.1.2实验方法：
46.1.2.1选取实验材料：
47.随机选取韭菜种质10份，大葱种质10份，韭葱种质5份，洋葱韭种质5 份。
48.1.2.2设计正交试验：
49.正交试验设计，是指多因素多水平的一种试验设计方法。当试验涉及的因素在3个
或3个以上时，试验工作量会变得很大，实施困难。对于这一难点正交试验则是一种很好的选择，可以实现以最少的试验次数达到与大量全面试验等效的结果，因此本发明应用正交表设计试验。超低温保存能否成功是由材料特性、预培养方法、冷冻保护剂、冷冻方法等因素共同决定的。因此设置影响种子超低温保存因素有pvs2处理时间(因素a)，化冻温度(因素b)以及化冻时间(因素c)。每个因素设置4种处理水平。因素a为pvs2浸泡(浸泡a1(0min)、a2(20min)、a3(30min)、a4(40min)；b1(4℃)、 b2(25℃)、b3(30℃)、b4(40℃)；c1(4h)、c2(10h)、c3(16h)、 c4(24h)。通正交设计l
16
(45)正交表(表1)，共需要进行16个试验，以不同组合处理后种子的发芽率比值(正常种子发芽率/超低温保存后种子发芽率) 作为正交试验结果。通过spss软件进行统计分析。
50.表1超低温保存方法正交试验
[0051][0052]
1.2.3种子超低温保存方法：
[0053]
种质资源超低温保存的一般步骤为材料的选择与制备，预处理，降温冷冻，解冻，材料存活鉴定，以及遗传稳定性分析。本实验采用直接冷冻法和玻璃化法对葱韭种子进行超低温保存。
[0054]
直接冷冻法：
[0055]
步骤一、取适量种子放入冻存管中；
[0056]
步骤二、将冻存管投入液氮罐；
[0057]
步骤三、对超低温处理后种子进行复温(化冻)；
[0058]
玻璃化法：
[0059]
步骤一、取适量种子放入将种子放置在培养皿中；
[0060]
步骤二、用滴管吸取冷冻保护剂pvs2浸泡种子。(pvs2)：30％甘油 15％乙二醇 15％二甲亚砜 0.4mol
·
l蔗糖；
[0061]
步骤三、取出种子并用滤纸吸取种子表面残留pvs2
[0062]
步骤四、取适量种子放入冻存管中
[0063]
步骤五、将冻存管投入液氮罐
[0064]
步骤六、对超低温处理后种子进行复温(化冻)；
[0065]
1.2.4种子发芽试验
[0066]
采用培养皿滤纸法进行种子萌发试验，准备透明塑料培养皿，将灭菌后的滤纸用蒸馏水浸湿放入培养皿中。再将经过不同时间及温度复温(化冻)后的种子放入，在22℃人工培养箱中进行传统种子发芽实验，每组50粒种子，三次重复。根据国家标准《农作物种子检验规程》在培养后第12天统计发芽率。
[0067]
2、结果与分析：
[0068]
2.1正交试验结果分析
[0069]
通过设计正交试验通过方差分析结果(表2)得出因素a和因素c的f值小于f临界值，在p《0.05水平上有显著性差异。由此可知，因素a(pvs2处理时间)和因素c(复温(化冻)时间)对试验结果有显著影响，因素b(复温(化冻)温度)、对试验结果影响不明显。可以确定影响试验结果的主因素为因素a(pvs2处理时间)和因素c(复温(化冻)时间)。
[0070]
表2正交试验设计方差分析表
[0071][0072][0073]
以各因素水平为横坐标，试验指标平均值为纵坐标绘制各因素曲线效应图 (图2)。此趋势图可以更加直观地看出试验指标随着因素水平变化的趋势。根据结果显示，发芽率比值随着pvs2处理时间增加逐渐下降，发芽率比值随着复温(化冻)时温度的增加而逐渐上升，发芽率比值随着复温(化冻)时间逐渐变长而逐渐下降。在本试验中，试验指标越大越
好。因此可确定对试验结果影响的主要因素为pvs2处理时间，最优水平经pvs2处理0h。但因素复温 (化冻)时间及因素复温(化冻)所需温度曲线较为平缓，这两个因素水平对试验结果影响不大明显。
[0074]
在供试材料中随机选取不同试验材料30份。按照正交表(表1)中的16 个不同试验组合进行试验，即先用pvs2溶液处理不同时间，投入液氮中保存24h后，取出并在不同温度下进行不同梯度时长的复温(化冻)。再复温(化冻)结束后立即对种子进行发芽试验并统计发芽率，与未经过液氮冷冻的种子原始发芽率对比，两者比值为正交试验的结果。其比值越大证明以该试验组合进行试验的保存效果越好。通过表1直观分析法比较不同因素水平的平均值k，得出本试验的最优水平组合为a1b4c1，即不经过pvs2(冷冻保护剂)处理在 40℃恒温下复温(化冻)4h。
[0075]
其中，图3、图4是本发明实施例提供的实验过程效果图。
[0076]
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。