夜蛾、草螟和螟蛾有害生物的防治的制作方法

1.本发明涉及使用杀有害生物蛋白和编码它们的核酸分子来防治或对抗夜蛾科(noctuidae)、草螟科(crambidae)和螟蛾科(pyralidae)有害生物的组合物和方法。


背景技术：

2.苏云金芽孢杆菌(bacillus thuringiensis，bt)是一种革兰氏阳性的形成芽孢的土壤细菌，其特征在于其产生特异性地对于某些目和种的植物有害生物(包括昆虫)有毒性但对于植物和其他非靶标生物无害的晶状内含体的能力。因此，包含苏云金芽孢杆菌菌株或其杀昆虫蛋白的组合物可以用作环境可接受的杀昆虫剂以防治农业昆虫有害生物或者各种各样的人或动物疾病的昆虫媒介。
3.来自苏云金芽孢杆菌的晶体(cry)蛋白主要针对鳞翅类、双翅类和鞘翅类有害生物昆虫具有强效的杀昆虫活性。这些蛋白质还显示出针对在膜翅目(hymenoptera)、同翅目(homoptera)、虱目(phthiraptera)、食毛目(mallophaga)和蜱螨目(acari)有害生物目以及其他无脊椎动物目(例如线形动物门(nemathelminthes)、扁形动物门(platyhelminthes)和肉鞭虫门(sarcomastigorphora))中的有害生物的活性(feitelson,j.1993.the bacillus thuringiensis family tree.在advanced engineered pesticides中.marcel dekker,inc.,new york,n.y.)。这些蛋白质最初被分类为cryi至cryvi，主要基于它们的杀昆虫活性分类。主要类别为鳞翅目特异性的(i)、鳞翅目和双翅目特异性的(ii)、鞘翅目特异性的(iii)、双翅目特异性的(iv)和线虫特异性的(v)和(vi)。所述蛋白质被进一步分类成亚家族；在每个家族内更高度相关的蛋白质被分配了分组字母，例如cryia、cryib、cryic等。在每个分组内更加紧密相关的蛋白质被给予了诸如cryic(a)、cryic(b)等的名称。术语“cry毒素”和“δ-内毒素”已经与术语“cry蛋白”可互换使用。关于cry蛋白和基因的当前命名是基于氨基酸序列同源性，而非昆虫靶标特异性(crickmore等人,(1998)microbiol.mol.biol.rev.62:807-813)。在这个更被接受的分类法中，每种毒素被分配了独特的名称，其合并了第一等级(阿拉伯数字)、第二等级(大写字母)、第三等级(小写字母)和第四等级(另一阿拉伯数字)。在当前的分类法中，罗马数字已被调换为第一等级中的阿拉伯数字。例如，在旧命名法下的“cryia(a)”现在是在当前命名法下的“cry1aa”。根据ibrahim等人(2010,bioeng.bugs,1:31-50)，cry毒素仍然可以根据其昆虫宿主特异性分为六个主要类别，并且包括：第1组——鳞翅类(例如，cry1、cry9和cry15)；第2组——鳞翅类和双翅类(例如，cry2)；第3组——鞘翅类(cry3、cry7和cry8)；第4组——双翅类(cry4、cry10、cry11、cry16、cry17、cry19和cry20)；第5组——鳞翅类和鞘翅类(cry1i)；和第6组——线虫(cry6)。所述cry1i、cry2、cry3、cry10和cry11毒素(73-82kda)是独特的，因为它们看起来是更大的cry1和cry4蛋白(130-140kda)的天然截短物。
4.cry蛋白是球状蛋白质分子，其在bt的芽孢形成阶段期间积聚为晶体形式的原毒素。在被有害生物摄取后，所述晶体典型地被溶解从而释放出原毒素，原毒素的大小范围，例如对于许多鳞翅类活性cry蛋白(例如，cry1和cry9)来说可以为130-140kda，以及对于鞘
翅类活性cry3蛋白和鳞翅类/双翅类活性cry2蛋白来说可以为60-80kda。在所述晶体被易感昆虫溶解后，释放出的原毒素在昆虫肠道中通过蛋白酶(例如，胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶)进行加工，从而产生抗蛋白酶的核心cry蛋白毒素。这种蛋白水解加工涉及从各种cry原毒素的不同区域中去除氨基酸。例如，130-140kda的cry原毒素典型地通过下述方式来激活：蛋白水解去除25-30个氨基酸的n-末端肽和从c-末端开始的大约一半的剩余蛋白质，从而导致大约60-70kda的成熟的cry毒素。60-80kda的原毒素(例如，cry2和cry3)也进行加工，但程度与较大的原毒素不同。相比于较大的原毒素而言，较小的原毒素典型地从n-末端去除相同或更多的氨基酸，但是从c-末端去除更少的氨基酸。例如，cry2家族成员的蛋白水解激活典型地涉及去除大约40-50个n-末端氨基酸。cry蛋白中的许多对于特定的靶标昆虫是相当具有毒性的，但是许多具有窄的活性谱。
5.cry蛋白通常具有五个保守的序列结构域和三个保守的结构结构域(参见，例如，de maagd等人,(2001)trends genetics 17:193-199)。第一个保守的结构结构域(称为结构域i)典型地由七个α螺旋组成，并且参与膜插入和孔形成。结构域ii典型地由三个以希腊回纹(greek key)构型进行排列的β-片层组成，和结构域iii典型地由两个以“薄卷饼型”构造的反平行β-片层组成(de maagd等人,2001,同上)。结构域ii和iii参与受体识别和结合，并因此被认为是毒素特异性的决定子。
6.众多有商业价值的植物(包括普通的农作物)都容易受到植物有害生物(包括昆虫和线虫有害生物)的攻击，导致作物产量和品质的重大下降。例如，植物有害生物是世界重要农作物的损失的主要因素。在中国每年因昆虫有害生物和病害而损失大约15-20％的可收获谷物。另外，仅在美国，由于无脊椎有害生物(包括昆虫)的侵袭，每年损失大约80亿美元。昆虫有害生物对于蔬菜和水果栽培者、观赏花卉生产者和家庭园丁来说也是一种负担。
7.昆虫有害生物主要通过密集施用化学杀有害生物剂来进行防治，这些化学杀有害生物剂通过抑制昆虫生长、阻止昆虫摄食或繁殖或者引起死亡而发挥活性。生物学有害生物防治剂，例如表达杀有害生物毒素(例如，cry蛋白)的苏云金芽孢杆菌菌株，也已应用于作物植物，取得了令人满意的结果，从而为化学杀有害生物剂提供了备选或补充。编码这些cry蛋白中的一些的基因已被分离，并且它们在异源宿主(例如转基因植物)中的表达已显示出为防治在经济上重要的昆虫有害生物提供了另一种工具。大多数cry蛋白针对非常有限的昆虫有害生物谱具有活性。并且典型地，针对一种昆虫物种的活性无法预测针对不同的昆虫物种的活性。
8.鳞翅类有害生物，包括本公开内容的夜蛾(noctuid)、草螟(crambid)和螟蛾(pyralid)有害生物，在中国和存在此类有害生物的其他国家中仍然是一个问题。另外，对现有杀昆虫蛋白产生抗性的威胁意味着引入新的杀昆虫蛋白是重要的。因此，仍然需要鉴定能够防治鳞翅目有害生物(例如本公开内容的夜蛾、草螟和螟蛾有害生物)的杀昆虫蛋白。


技术实现要素：

9.本公开内容提供了用于防治鳞翅类(lepidopteran)有害生物(例如夜蛾、草螟和螟蛾有害生物)并保护作物(特别是玉米和水稻)免受由此类有害生物引起的经济损害的组合物和方法。本公开内容进一步涉及用编码本公开内容的cry蛋白(单独地或与其他杀昆虫
蛋白相组合地)的核酸分子稳定转化的植物，尤其是单子叶植物，特别是玉米(corn，maize，zea mays)和水稻(rice，oryza sativa)，用于防治或对抗鳞翅目(例如夜蛾、草螟和螟蛾)的用途。本公开内容还进一步涉及包含本公开内容的cry蛋白的杀昆虫制剂用于保护植物免受鳞翅目(例如夜蛾、草螟和螟蛾)侵害的用途。本公开内容还涉及植物，尤其是单子叶植物，特别是玉米植物或水稻植物，其可被鳞翅目(例如夜蛾、草螟和螟蛾)侵袭，并且用编码本公开内容的cry蛋白的可表达型核酸分子进行转化以对抗或防治鳞翅目(例如夜蛾、草螟和螟蛾)有害生物群体。
10.根据本公开内容，提供了一种方法来对抗和/或防治鳞翅目(例如夜蛾、草螟和螟蛾)和棉铃虫(helicoverpa armigera，cotton bollworm/old world bollworm)、东方粘虫(mythimna separata，oriental armyworm)、二点委夜蛾(athetis lepigone，two-spotted armyworm)、斜纹贪夜蛾(spodoptera litura，common cutworm/oriental leafworm)、小地老虎(agrotis ipsilon，black cutworm)、桃蛀螟(conogethes punctiferalis，yellow peach moth)、二化螟(chilo suppressalis，striped stem borer)、稻蛀茎夜蛾(sesamia inferens，pink stem borer)或亚洲玉米螟(ostrinia furnacalis，asian corn borer)物种的昆虫，其通过使这些昆虫与包含seq id no:1-5中任一个的氨基酸序列的cry蛋白或其杀昆虫片段相接触的步骤来进行。在一些实施方案中，所述小地老虎来自中国的小地老虎群体。
11.在一些实施方案中，所述接触步骤可以用杀昆虫组合物来进行，所述杀昆虫组合物包含：本公开内容的cry蛋白或其杀昆虫片段，以及可接受的农业用承载体。在一些实施方案中，昆虫的接触可以是与用编码本公开内容的cry蛋白的可表达型核酸分子稳定地转化的植物(尤其是单子叶植物，特别是玉米植物或水稻植物)接触，所述转化使得经转化的植物以有效的防治昆虫的量表达本公开内容的cry蛋白或其杀昆虫片段。
12.此外，被鳞翅目(例如夜蛾、草螟和螟蛾)侵袭的植物，尤其是单子叶植物，特别是玉米植物或水稻植物，通过用编码本公开内容的cry蛋白的基因稳定地转化而被保护免受来自该昆虫的持续的经济损害。
13.序列表中的序列的简要说明
14.seq id no:1为bt-0053蛋白的氨基酸序列。
15.seq id no:2为bt-0025蛋白的氨基酸序列。
16.seq id no:3为cryet4蛋白的氨基酸序列。
17.seq id no:4为cryet67蛋白的氨基酸序列。
18.seq id no:5为第二bt-0053蛋白的氨基酸序列。
具体实施方式
19.本描述并不旨在成为可以实施本发明所采取的所有不同方式或者可以添加至本发明的所有特征的详细目录。例如，关于一个实施方案所举例说明的特征可以合并到其他实施方案中，并且关于特定实施方案所举例说明的特征可以从该实施方案中删除。因此，本发明考虑了，在本发明的一些实施方案中，可以排除或省略在本文中所阐述的任何特征或特征组合。另外，依据本公开内容，对于在本文中所提出的各种实施方案的众多变化和添加对于本领域技术人员来说将会是清晰可见的，其不背离本发明。因此，下面的描述旨在举例
说明本发明的一些特定实施方案，而非穷尽地明确说明其所有排列、组合和变化。
20.除非另有定义，在本文中所使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员所通常理解的相同的含义。在本发明的描述中所使用的术语在本文中仅用于描述特定实施方案的目的，而并不旨在限制本发明。
21.如在本文中和在所附的权利要求书中所使用的，单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数提及，除非上下文另有明确规定。因此，例如，提及“一种植物”是提及一种或多种植物，并且包括本领域技术人员已知的其等价物，等等。
22.如在本文中所使用的，词语“和/或”是指并涵盖相关联的所列出项目中的一个或多个的任何和所有可能的组合，以及当以备选(“或”)来解释时缺乏组合。
23.术语“大约”在本文中用于意指近似、大致、大概或在...左右。当术语“大约”与数值范围相联合地进行使用时，它通过将边界延伸至高于和低于所阐述的数值来更改该范围。通常，术语“大约”在本文中用于将数值更改至高于和低于所陈述的值上下20％、优选地10％(更高或更低)的变化。关于温度，术语“大约”意指
±
1℃，优选地
±
0.5℃。当在本发明的情景下使用术语“大约”(例如，与温度或分子量值相组合地)时，精确的值(即，没有“大约”)是优选的。
[0024]“防治”昆虫意指通过毒性效应来抑制昆虫有害生物生存、生长、摄食或繁殖的能力，或者限制在作物植物中的与昆虫相关的损害或损失，或者当作物在昆虫有害生物存在下生长时保护作物的产量潜力。“防治”昆虫可能或可能不意指杀死昆虫，尽管它优选地意指杀死昆虫。
[0025]
当在本说明书中使用时，术语“包括”或“包含”明确说明所陈述的特征、整数、步骤、操作、要素或组分的存在，但是并不排除一个或多个其他特征、整数、步骤、操作、要素、组分或其组的存在或添加。
[0026]
如在本文中所使用的，过渡性短语“基本上由...组成”(和语法变体)意指，权利要求的范围待被解释为涵盖在该权利要求中所记述的明确说明的材料或步骤，以及那些不实质性地改变所要求保护的发明的基本和新的特征的材料或步骤。因此，当在本发明的权利要求中使用时，术语“基本上由
…
组成”并不旨在被解释为等价于“包括(包含)”。
[0027]
如在本文中所使用的，术语“cry蛋白”意指可以在苏云金芽孢杆菌或相关细菌中以晶体形式出现的杀昆虫蛋白。术语“cry蛋白”可以是指原毒素形式或者其任何杀昆虫片段或毒素。
[0028]“递送”组合物或毒性蛋白质意指，所述组合物或毒性蛋白质与昆虫发生接触，这促进所述组合物或毒性蛋白质的经口摄取，从而导致对昆虫的毒性效应和防治。所述组合物或毒性蛋白质可以以许多公认的方式来进行递送，包括但不限于转基因植物表达、经配制的蛋白质组合物、可喷雾的蛋白质组合物、诱饵基质或任何其他本领域公认的蛋白质递送系统。
[0029]“有效的防治昆虫的量”意指这样的毒性蛋白质的浓度，其通过毒性效应来抑制昆虫生存、生长、摄食或繁殖的能力，或者限制在作物植物中的与昆虫相关的损害或损失，或者当作物在昆虫有害生物存在下生长时保护作物的产量潜力。“有效的防治昆虫的量”可能或可能不意指杀死昆虫，尽管它优选地意指杀死昆虫。
[0030]
在本文中将“基因”定义为包含一个或多个多核苷酸的遗传单位，其占据染色体或
质粒上的特定位置，并且包含关于在生物中的特定特征或性状的遗传指令。
[0031]
如在本文中所使用的，“杀有害生物(的)”、“杀昆虫(的)”等是指本公开内容的cry蛋白防治有害生物类生物的能力，或者是指可以防治在本文中所定义的有害生物类生物的cry蛋白的量。因此，杀有害生物的cry蛋白可以杀死有害生物类生物(例如，昆虫有害生物)或抑制有害生物类生物(例如，昆虫有害生物)生存、生长、摄食或繁殖的能力。
[0032]
核苷酸在本文中通过下列标准缩写来指明：腺嘌呤(a)、胞嘧啶(c)、胸腺嘧啶(t)和鸟嘌呤(g)。同样地，氨基酸通过下列标准缩写来指明：丙氨酸(ala；a)、精氨酸(arg；r)、天冬酰胺(asn；n)、天冬氨酸(asp；d)、半胱氨酸(cys；c)、谷氨酰胺(gln；q)、谷氨酸(glu；e)、甘氨酸(gly；g)、组氨酸(his；h)、异亮氨酸(ile；i)、亮氨酸(leu；l)、赖氨酸(lys；k)、甲硫氨酸(met；m)、苯丙氨酸(phe；f)、脯氨酸(pro；p)、丝氨酸(ser；s)、苏氨酸(thr；t)、色氨酸(trp；w)、酪氨酸(tyr；y)和缬氨酸(val；v)。
[0033]
本发明基于毒性测定法的结果，所述毒性测定法是通过给某些夜蛾、草螟和螟蛾昆虫饲喂包含经纯化的cry毒素的人工膳食来进行的，并且令人惊讶地显示某些cry蛋白对于所测试的昆虫中的一种或多种具有毒性(参见实施例1)。因此，这些活性cry蛋白可以用于提供针对此类有害生物的最大保护作用，并且可以在田间防止或减少对于cry杀昆虫制剂的昆虫抗性的发展。
[0034]
本公开内容的“cry蛋白”可以是天然存在的或经改造的，并且涵盖具有在序列表的seq id no:1-5中任一个之中所显示的氨基酸序列的全长蛋白质(原毒素)以及任何其杀昆虫活性片段。
[0035]
本公开内容还包括作为编码cry蛋白原毒素的多核苷酸的片段的多核苷酸。“片段”意指编码cry蛋白的核苷酸序列的一部分。核苷酸序列的片段可以编码cry蛋白在生物学上有活性的部分，即所谓的“毒素片段”，或者它可以是可以通过使用下文所公开的方法而用作杂交探针或pcr引物的片段。作为编码cry蛋白的核苷酸序列的片段的核酸分子包含至少大约15、20、50、75、100、200、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450个连续核苷酸，或者直至在本文中所公开的编码全长cry蛋白的核苷酸序列中存在的核苷酸的数目，取决于所意欲的用途。“连续”核苷酸意指彼此紧邻的核苷酸残基。本公开内容的核苷酸序列的一些片段将会编码毒素片段，其保留所述cry蛋白的生物学活性，并因此保留杀昆虫活性。“保留杀昆虫活性”意指，所述片段将会具有所述cry蛋白的杀昆虫活性的至少大约30％，优选地至少大约50％，更优选地至少大约70％，更加优选地至少大约80％。用于测量杀昆虫活性的方法是本领域中众所周知的。参见，例如，czapla和lang(1990)j.econ.entomol.83:2480-2485；andrews等人,(1988)biochem.j.252:199-206；marrone等人,(1985)j.of economic entomology 78:290-293；和美国专利号5,743,477，所有这些均通过提及而以其整体合并入本文。
[0036]
本公开内容的cry蛋白的毒素片段将会编码至少大约15、25、30、50、75、100、125、150、175、200、250、300、350、400和450个连续氨基酸，或者直至在本公开内容的全长cry蛋白中存在的氨基酸的总数目。
[0037]
如在本文中所使用的，对于昆虫有害生物“有毒性”的cry蛋白意指，所述cry蛋白作为以经口方式有活性的昆虫防治剂而起作用以杀死所述昆虫有害生物，或者所述cry蛋
白能够扰乱或阻止昆虫摄食或引起对于所述昆虫有害生物的生长抑制，这两者可能或可能不引起所述昆虫的死亡。当将本公开内容的cry蛋白递送至昆虫或者昆虫与所述cry蛋白发生口部接触时，结果典型地为所述昆虫的死亡，或者所述昆虫的生长减慢，或者所述昆虫停止摄食使得所述昆虫可得到所述毒性cry蛋白的来源。
[0038]
在一些实施方案中，本公开内容提供了抑制有害生物生长或杀死有害生物的方法，所述方法包括使所述有害生物与包含seq id no:1-5中任一个的氨基酸序列的cry蛋白或其杀昆虫片段相接触，其中所述有害生物选自棉铃虫、东方粘虫、二点委夜蛾、斜纹贪夜蛾、小地老虎、桃蛀螟、二化螟、稻蛀茎夜蛾和亚洲玉米螟。在一些实施方案中，所述小地老虎来自中国的小地老虎群体。
[0039]
在一些实施方案中，本公开内容提供了用于防治有害生物群体的方法，所述方法包括使所述有害生物群体与杀昆虫有效量的包含seq id no:1-5中任一个的氨基酸序列的cry蛋白或其杀昆虫片段相接触，其中所述有害生物选自棉铃虫、东方粘虫、二点委夜蛾、斜纹贪夜蛾、小地老虎、桃蛀螟、二化螟、稻蛀茎夜蛾和亚洲玉米螟。在一些实施方案中，所述小地老虎来自中国的小地老虎群体。
[0040]
在本公开内容的进一步的实施方案中，使所述有害生物或有害生物群体进一步地与不同于包含seq id no:1-5中任一个的氨基酸序列的cry蛋白的第二杀昆虫蛋白相接触。在另外其他实施方案中，所述第二杀昆虫蛋白选自苏云金芽孢杆菌(bt)杀昆虫蛋白、致病杆菌(xenorhabdus)杀昆虫蛋白、光杆状菌(photorhabdus)杀昆虫蛋白、侧孢短芽孢杆菌(brevibacillus laterosporus)杀昆虫蛋白、球形芽孢杆菌(bacillus sphaericus)杀昆虫蛋白、穿孔素、蛋白酶抑制剂(丝氨酸和半胱氨酸型两者)、凝集素、α-淀粉酶、过氧化物酶、胆固醇氧化酶和双链rna(dsrna)分子。
[0041]
在本公开内容的其他实施方案中，所述接触步骤(其中本公开内容的cry蛋白与有害生物发生接触)用表达所述蛋白或其杀昆虫片段的微生物或植物来进行。在其他实施方案中，用编码本公开内容的cry蛋白或其杀昆虫片段的核酸分子稳定地转化所述植物。在另外其他实施方案中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物。在其他实施方案中，所述单子叶植物为玉米植物或水稻植物，或者所述双子叶植物为大豆植物。
[0042]
在一些实施方案中，本公开内容提供了用于保护植物免受有害生物侵害的方法，所述方法包括在所述植物或其细胞中表达杀昆虫有效量的包含seq id no:1-5中任一个的氨基酸序列的cry蛋白或其杀昆虫片段，其中所述有害生物选自棉铃虫、东方粘虫、二点委夜蛾、斜纹贪夜蛾、小地老虎、桃蛀螟、二化螟、稻蛀茎夜蛾和亚洲玉米螟。在一些实施方案中，所述小地老虎来自中国的小地老虎群体。
[0043]
为了针对本公开内容的昆虫有害生物是有效的，所述cry蛋白首先被所述昆虫经口摄取。但是，所述cry蛋白可以以许多公认的方式被递送至所述昆虫。将蛋白质经口递送至昆虫的方式包括但不限于，(1)在转基因植物中提供所述蛋白质，其中所述昆虫吃(摄取)所述转基因植物的一个或多个部分，从而摄取在所述转基因植物中表达的多肽；(2)在可以施加至或掺入到例如昆虫生长介质中的经配制的蛋白质组合物中提供所述蛋白质；(3)在可以施加至表面的蛋白质组合物中提供所述蛋白质，例如喷雾到植物部分的表面上，然后当所述昆虫吃经喷雾的植物部分中的一个或多个时，所述昆虫将其摄取；(4)诱饵基质；或(5)任何其他本领域公认的蛋白质递送系统。因此，在本公开内容的方法中可以使用任何经
口递送至昆虫的方法来递送本公开内容的毒性cry蛋白。在一些特别的实施方案中，将本公开内容的cry蛋白经口递送至昆虫，其中所述昆虫摄取转基因植物的一个或多个部分。
[0044]
在其他实施方案中，将本公开内容的cry蛋白经口递送至昆虫，其中所述昆虫摄取用包含本公开内容的cry蛋白的组合物进行喷雾的植物的一个或多个部分。将本公开内容的组合物递送至植物表面可以通过使用本领域技术人员已知用于将化合物、组合物、制剂等施加至植物表面的任何方法来进行。递送至或接触植物或其部分的一些非限制性的实例包括喷雾、撒粉、喷洒、散播、施弥雾、雾化、撒播、浸泡、土壤灌注、土壤掺入、湿透(例如，根、土壤处理)、浸渍、灌溉、包覆、叶或茎渗透、侧施或种子处理等以及其组合。用于使植物或其部分与化合物、组合物或制剂相接触的这些和其他程序是本领域技术人员所众所周知的。
[0045]
在本公开内容的一些实施方案中，本公开内容的杀昆虫cry蛋白在高等生物(例如植物)中表达。在这种情况下，表达有效量的杀昆虫蛋白的转基因植物保护它们自己免受植物有害生物例如昆虫有害生物侵害。当昆虫有害生物幼虫开始摄食这样的转基因植物时，它会摄取表达出的杀昆虫cry蛋白。这可以阻止所述昆虫进一步啃咬入植物组织，或者甚至可以伤害或杀死所述昆虫。将编码本公开内容的cry蛋白的多核苷酸插入到表达盒中，其然后被稳定地整合到植物的基因组中。在其他实施方案中，所述多核苷酸被包括在非致病性自我复制型病毒中。根据本公开内容进行转化的植物可以为单子叶植物或双子叶植物，并且包括但不限于玉米(玉蜀黍)、大豆、水稻、小麦、大麦、黑麦、燕麦、高粱、粟、向日葵、红花、糖甜菜、棉花、甘蔗、油籽油菜、苜蓿、烟草、花生、蔬菜(包括甘薯、菜豆、豌豆、菊苣、莴苣、甘蓝、花椰菜、球花甘蓝、芜菁、胡萝卜、茄子、黄瓜、萝卜、菠菜、马铃薯、番茄、芦笋、洋葱、大蒜、甜瓜、辣椒、芹菜、倭瓜、南瓜，密生西葫芦)、水果(包括苹果、梨、榅桲、李子、樱桃、桃、油桃、杏、草莓、葡萄、覆盆子、黑莓、菠萝、鳄梨、番木瓜、芒果、香蕉)和特种植物(例如，拟南芥(arabidopsis))以及木本植物(例如，针叶树和落叶树)。优选地，本公开内容的植物为作物植物，例如玉蜀黍、大豆、高粱、小麦、向日葵、番茄、十字花科植物、辣椒、马铃薯、棉花、水稻、糖甜菜、甘蔗、烟草、大麦、油籽油菜等。一旦所希望的多核苷酸已经转化到特定的植物物种中，它就可以在该物种中进行增殖，或者通过使用传统育种技术而移动到相同物种的其他品种(特别地包括商业品种)中。
[0046]
编码本公开内容的cry蛋白的多核苷酸在转基因植物中进行表达，从而引起在所述转基因植物中所编码的cry蛋白(以原毒素或毒素形式)的生物合成。以这种方式，产生了在昆虫有害生物群体压力存在下具有增强的产量保护作用的转基因植物。为了在转基因植物中表达它们，编码所述cry蛋白的核苷酸序列可能需要修饰和优化。尽管在许多情况下来自微生物生物的基因可以在植物中以高水平进行表达而无需修饰，但是在转基因植物中的低表达可能是由于具有在植物中并不偏好的密码子的微生物核苷酸序列而引起的。本领域中已知活体生物对于密码子使用具有特定的偏好，并且在本公开内容中所描述的核苷酸序列的密码子可以变化成符合植物偏好的，同时保持由此所编码的氨基酸。此外，在植物(例如，玉米植物)中的高表达最佳地是从具有至少大约35％gc含量、或至少大约45％gc含量、或至少大约50％gc含量、或至少大约60％gc含量的编码序列来实现的。具有低gc含量的微生物核苷酸序列可能在植物中表达欠佳，这是由于存在可能使信息不稳定的attta基序和可能引起不适当的聚腺苷酸化的aataaa基序。尽管某些基因序列可以在单子叶植物和双子叶植物物种中均充分地进行表达，但是可以对序列进行修饰以解决单子叶植物或双子叶植
mol.biol.23:1129-1138,1993；和matsuoka等人,proc.natl.acad.sci.usa 90:9586-9590,1993所描述的]，种子优选启动子[例如，来自种子特异性基因(simon等人,plant mol.biol.5.191,1985；scofield等人,j.biol.chem.262:12202,1987；baszczynski等人,plant mol.biol.14:633,1990)，巴西坚果白蛋白(pearson'等人,plant mol.biol.18:235-245,1992)，豆球蛋白(ellis等人,plant mol.biol.10:203-214,1988)，谷蛋白(水稻)(takaiwa等人,mol.gen.genet.208:15-22,1986；takaiwa等人,febs letts.221:43-47,1987)，玉米醇溶蛋白(matzke等人,plant mol biol,14(3),323-32,1990)，napa(stalberg等人,planta 199:515-519,1996)，小麦spa(albanietal,plant cell,9:171-184,1997)，向日葵油质蛋白(cummins等人,plant mol.biol.19:873-876,1992)]、胚乳特异性启动子[例如，小麦lmw和hmw，麦谷蛋白-1(mol gen genet 216:81-90,1989；nar 17:461-2)，小麦a、b和g麦醇溶蛋白(emb03:1409-15,1984)，大麦ltrl启动子，大麦b1、c、d大麦醇溶蛋白(theor appl gen 98:1253-62,1999；plant j 4:343-55,1993；mol gen genet 250:750-60,1996)，大麦dof(mena等人,the plant journal,116(1):53-62,1998)，biz2(ep99106056.7)，合成启动子(vicente-carbajosa等人,plant j.13:629-640,1998)，水稻谷醇溶蛋白nrp33，水稻-球蛋白glb-1(wu等人,plant cell physiology 39(8)885-889,1998)，水稻α-球蛋白reb/ohp-1(nakase等人,plant mol.biol.33:513-s22,1997)，水稻adp-葡萄糖pp(trans res 6:157-68,1997)，玉蜀黍esr基因家族(plant j 12:235-46,1997)，高粱γ-高粱醇溶蛋白(plant mol.biol 32:1029-35,1996)]、胚特异性启动子[例如，水稻osh1(sato等人,proc.natl.acad.sci.usa,93:8117-8122)，knox(postma-haarsma等人,plant mol.biol.39:257-71,1999)，水稻油质蛋白(wu等人,j.biochem.,123:386,1998)]、花特异性启动子[例如，atprp4，查尔酮合酶(chsa)(van der meer等人,plant mol.biol.15,95-109,1990)，lat52(twell等人,mol.gen genet.217:240-245,1989)，apetala-3]、植物繁殖组织[例如，osmads启动子(美国专利申请2007/0006344)]。
[0051]
所述核苷酸序列也可以在以化学方式进行调控的启动子的调控下进行表达。这使得只有在用诱导化学品处理作物植物时作物植物才能合成本公开内容的cry蛋白。这样的用于基因表达的化学诱导的技术的实例详细描述在公开的申请ep 0 332 104和美国专利号5,614,395中。在一个实施方案中，所述化学调控型启动子为烟草pr-1a启动子。
[0052]
在本公开内容中有用的另一类别的启动子为创伤可诱导的启动子。已经描述了众多在创伤部位处和还在植物病原体感染部位处进行表达的启动子。理想地，这样的启动子应当只在昆虫侵入部位处局部地具有活性，并且以这种方式，杀昆虫蛋白仅在需要合成所述杀昆虫蛋白以杀死正在侵入的昆虫有害生物的细胞中积聚。这一种类的启动子的实例包括由下列文献所描述的那些：stanford等人,mol.gen.genet.215:200-208(1989)；xu等人,plant molec.biol.22:573-588(1993)；logemann等人,plant cell 1:151-158(1989)；rohrmeier&lehle,plant molec.biol.22:783-792(1993)；firek等人,plant molec.biol.22:129-142(1993)；和warner等人,plant j.3:191-201(1993)。
[0053]
在本公开内容中有用的引起组织特异性表达模式的启动子的非限制性实例包括绿色组织特异性启动子、根特异性启动子、茎特异性启动子或花特异性启动子。适合于在绿色组织中进行表达的启动子包括许多调控参与光合作用的基因的启动子，并且其中许多已经从单子叶植物和双子叶植物中克隆出来。一种这样的启动子为来自磷酸烯醇羧化酶基因
的玉蜀黍pepc启动子(hudspeth&grula,plant molec.biol.12:579-589(1989))。另一种用于根特异性表达的启动子为由de framond(febs 290:103-106(1991)或美国专利号5,466,785)所描述的那种。另一种在本公开内容中有用的启动子为在美国专利号5,625,136中所描述的茎特异性启动子，其天然地驱动玉蜀黍trpa基因的表达。
[0054]
除了选择合适的启动子之外，用于在植物中表达杀昆虫毒素的构建体还需要合适的转录终止子以可操作地连接在本公开内容的cry蛋白编码序列的下游。几种这样的终止子是可得的，并且是本领域中已知的(例如，来自camv的tml，来自rbcs的e9)。任何可得的已知在植物中起作用的终止子均可以在本公开内容的情景下进行使用。
[0055]
众多其他序列可以掺入到在本公开内容中所描述的表达盒中。这些包括已显示出增强表达的序列，例如内含子序列(例如，来自adhl和bronzel)和病毒前导序列(例如，来自tmv、mcmv和amv)。
[0056]
可能优选的是，将本公开内容的核苷酸序列的表达靶向至植物中的不同的细胞定位。在一些情况下，定位在胞质溶胶中可能是所希望的，而在其他情况下，定位在一些亚细胞器中可能是优选的。任何用于靶向基因产物(例如在植物中)的机制均可以用于实施本发明，并且这样的机制已知存在于植物中并且控制这些机制起作用的序列已经进行了较为详细的表征。已经表征了引起将基因产物靶向至其他细胞区室的序列。氨基末端序列可以负责将目标蛋白质靶向至任何细胞区室，例如液泡、线粒体、过氧化物酶体、蛋白质体、内质网、叶绿体、淀粉粒、造粉体、质外体或植物的细胞壁(例如，unger等人,plant molec.biol.13:411-418(1989)；rogers等人,(1985)proc.natl.acad.sci.usa 82:6512-651；美国专利号7,102,057；wo 2005/096704，它们所有均通过提及而合并入本文)。任选地，信号序列可以为来自waxy的n-末端信号序列、来自γ-玉米醇溶蛋白的n-末端信号序列、淀粉结合结构域、c-末端淀粉结合结构域、叶绿体靶向序列(其将成熟蛋白质输入至叶绿体)(comai等人,(1988)j.biol.chem.263:15104-15109；van den broeck等人,(1985)nature 313:358-363；美国专利号5,639,949)或来自糊粉细胞的分泌信号序列(koehler&ho,plant cell 2:769-783(1990))。另外，氨基末端序列与羧基末端序列一起共同负责基因产物的液泡靶向(shinshi等人,(1990)plant molec.biol.14:357-368)。在一个实施方案中，所选择的信号序列包括已知的切割位点，并且所构建的融合物考虑了在所述切割位点之后的任何氨基酸(其是切割所需要的)。在一些情况下，这个要求可以通过在切割位点和转基因atg之间添加少量氨基酸或者备选地替换在转基因序列内的一些氨基酸而得到满足。这些构建技术是本领域中众所周知的，并且同样地适用于任何细胞区室。
[0057]
将会认识到，上面所描述的用于细胞靶向的机制不仅可以与其同源启动子相联合地进行使用，而且还可以与异源启动子相联合地进行使用，以便在具有与靶向信号所源自的启动子的表达模式不同的表达模式的启动子的转录调控下实现特定的细胞靶向目标。
[0058]
用于转化植物的程序是本领域中众所周知的，并且在文献中自始至终都有描述。用于植物转化的方法的非限制性实例包括通过下列方式的转化：细菌介导的核酸递送(例如，经由土壤杆菌(agrobacterium))、病毒介导的核酸递送、碳化硅或核酸须晶介导的核酸递送、脂质体介导的核酸递送、显微注射、微粒轰击、磷酸钙介导的转化、环糊精介导的转化、电穿孔、纳米颗粒介导的转化、超声处理、渗入、peg-介导的核酸摄取以及任何其他导致将核酸引入到植物细胞中的电、化学、物理(机械)或生物学机制，包括其任何组合。本领域
中已知的关于各种植物转化方法的通用指南包括miki等人(“procedures for introducing foreign dna into plants”,在methods in plant molecular biology and biotechnology中,glick,b.r.和thompson,j.e.,编辑(crc press,inc.,boca raton,1993),第67-88页)和rakowoczy-trojanowska(cell.mol.biol.lett.7:849-858(2002))。
[0059]
对于土壤杆菌介导的转化，携带至少一个t-dna边界序列的一种或多种双元载体是合适的，而对于直接基因转移(例如，粒子轰击等)，任何载体都是合适的并且可以使用仅包含目标构建物的线性dna。在直接基因转移的情况下，可以使用用单一dna种类来进行的转化或共转化(schocher等人,biotechnology 4:1093-1096(1986))。对于直接基因转移和土壤杆菌介导的转移两者，转化通常(但不是必需地)用选择性标记来进行，所述选择性标记可以为正选择(磷酸甘露糖异构酶)，提供对于抗生素(卡那霉素、潮霉素或氨甲蝶呤)或除草剂(草甘膦或草铵膦)的抗性。但是，选择性标记的选择对于本发明来说不是关键性的。
[0060]
土壤杆菌介导的转化是普遍使用的用于转化植物的方法，这是因为其高的转化效率和因为其广泛的与许多不同物种的可用性。土壤杆菌介导的转化典型地涉及将携带目标外源dna的双元载体转移至合适的土壤杆菌菌株，其可以依赖于由宿主土壤杆菌菌株在共驻留ti质粒上或在染色体上所携带的vir基因的互补物(uknes等人,(1993)plant cell 5:159-169)。重组双元载体向土壤杆菌的转移可以通过三亲交配程序来完成，其中使用携带重组双元载体的大肠杆菌(escherichia coli)，携带能够使重组双元载体移动至靶标土壤杆菌菌株的质粒的辅助大肠杆菌菌株。备选地，可以通过核酸转化来将重组双元载体转移至土壤杆菌(&willmitzer(1988)nucleic acids res.16:9877)。
[0061]
双子叶植物以及单子叶植物均可以通过使用土壤杆菌来进行转化。用于水稻的土壤杆菌介导的转化的方法包括众所周知的用于水稻转化的方法，例如在下列文献中的任一项之中所描述的那些：欧洲专利申请ep 1198985a1；aldemita和hodges(planta 199:612-617,1996)；chan等人(plant mol biol 22(3):491-506,1993)；hiei等人(plant j 6(2):271-282,1994)，其公开内容通过提及而合并入本文。在玉米转化的情况下，优选的方法描述在ishida等人(nat.biotechnol 14(6):745-50,1996)或frame等人(plant physiol 129(1):13-22,2002)中，其公开内容通过提及而合并入本文。作为例子，所述方法进一步描述在下列文献中：b.jenes等人,techniques for gene transfer,在transgenic plants,vol.1,engineering and utilization中,s.d.kung和r.wu编辑,academic press(1993)128-143；和potrykus annu.rev.plant physiol.plant molec.biol.42(1991)205-225。优选地将待表达的核酸或构建体克隆到适合于转化根癌土壤杆菌(agrobacterium tumefaciens)的载体中，例如pbin19(bevan等人,nucl.acids res.12(1984)8711)。然后，经这样的载体转化的土壤杆菌可以以已知的方式用于植物(例如，用作模型的植物(例如拟南芥)或作物植物(例如烟草植物))的转化，例如通过将捣碎的叶或切碎的叶浸没在土壤杆菌溶液中，然后在合适的培养基中培养它们。借助于根癌土壤杆菌的植物转化例如由hagen和willmitzer在nucl.acid res.(1988)16,9877中进行了描述，或者尤其从f.f.white,vectors for gene transfer in higher plants,在transgenic plants,vol.1,engineering and utilization中,s.d.kung和r.wu编辑,academic press,1993,第15-38页中知晓。
[0062]
通过重组土壤杆菌的植物转化通常涉及土壤杆菌与来自植物的外植体的共培养，
并且遵循本领域中众所周知的方法。在选择培养基上再生出经转化的组织，其在双元质粒t-dna边界之间携带抗生素或除草剂抗性标记。
[0063]
如先前所讨论的，另一种用于转化植物、植物部分和植物细胞的方法涉及将惰性或在生物学上有活性的颗粒推进至植物组织和细胞。参见，例如美国专利号4,945,050、5,036,006和5,100,792。通常，这种方法涉及在对于穿透细胞的外表面并提供掺入到细胞内部之中来说有效的条件下，将惰性或在生物学上有活性的颗粒推进至植物细胞。当使用惰性颗粒时，所述载体可以通过用包含目标核酸的载体包覆所述颗粒来引入到细胞中。备选地，细胞可以被所述载体围绕，从而使得所述载体尾随所述颗粒而被携带到细胞中。也可以将在生物学上有活性的颗粒(例如，经干燥的酵母细胞、经干燥的细菌或噬菌体，各自包含一种或多种试图引入的核酸)推进到植物组织中。
[0064]
在其他实施方案中，可以将编码本公开内容的cry蛋白的多核苷酸直接转化到质体基因组中。质体转化的主要优点是，质体通常能够在无重大修饰的情况下表达细菌基因，并且质体能够在单个启动子的控制下表达多个开放阅读框。质体转化技术详尽地描述在美国专利号5,451,513、5,545,817和5,545,818中，在pct申请号wo 95/16783中，和在mcbride等人,(1994)proc.nati.acad.sci.usa 91,7301-7305中。用于叶绿体转化的基本技术涉及将侧连选择性标记连同目标基因一起的经克隆的质体dna的区域引入到合适的靶标组织中，例如通过使用生物射弹或原生质体转化(例如，氯化钙或peg介导的转化)。1至1.5kb的侧翼区域(称为靶向序列)促进与质体基因组的同源重组，并因此允许质体组(plastome)的特定区域的替换或修饰。最初，赋予对于壮观霉素或链霉素的抗性的在叶绿体16s rrna和rps12基因中的点突变可以用作用于转化的选择性标记(svab,z.,hajdukiewicz,p.,和maliga,p.(1990)proc.natl.acad.sci.usa87,8526-8530；staub,j.m.和maliga,p.(1992)plant cell 4,39-45)。在这些标记之间克隆位点的存在允许创建用于引入外源基因的质体靶向载体(staub,j.m.和maliga,p.(1993)embo j.12,601-606)。可以通过用显性选择性标记(细菌aada基因，其编码壮观霉素解毒酶即氨基糖苷-3'-腺苷酰基转移酶)替换隐性rrna或r-蛋白抗生素抗性基因来获得转化频率的重大提高(svab,z.和maliga,p.(1993)proc.natl.acad.sci.usa 90,913-917)。先前，该标记已经成功用于绿藻莱茵衣藻(chlamydomonas reinhardtii)的质体基因组的高频率转化(goldschmidt-clermont,m.(1991)nucl.acids res.19:4083-4089)。对于质体转化来说有用的其他选择性标记是本领域中已知的，并且被包括在本公开内容的范围之内。典型地，在转化后需要大约15-20个细胞分裂周期来达到同质体状态。质体表达(其中通过同源重组将基因插入到在每个植物细胞中存在的全部数千个拷贝的环状质体基因组中)利用了超过核表达的基因的巨大的拷贝数优点，从而允许可以容易地超过总可溶性植物蛋白质的10％的表达水平。在一个实施方案中，可以将本公开内容的多核苷酸插入到质体靶向载体中并转化到所希望的植物宿主的质体基因组中。因此，可以获得关于包含本公开内容的核苷酸序列的质体基因组来说同型的植物，其能够进行所述多核苷酸的高表达。
[0065]
选择经转化的转基因植物、植物细胞或植物组织培养物的方法在本领域中是常规的，并且可以在本文中所提供的本公开内容的方法之中使用。例如，本公开内容的重组载体还可以包括这样的表达盒，所述表达盒包含关于可以用于选择经转化的植物、植物部分或植物细胞的选择性标记的核苷酸序列。如在本文中所使用的，“选择性标记”意指这样的核
苷酸序列，其在被表达时赋予表达所述标记的植物、植物部分或植物细胞以不同的表型，并因此允许将这样的经转化的植物、植物部分或植物细胞与不具有所述标记的那些植物、植物部分或植物细胞区分开。这样的核苷酸序列可以编码选择性标记或筛选性标记，这取决于所述标记是否赋予可以通过化学手段例如通过使用选择试剂(例如，抗生素、除草剂等)来进行选择的性状，或者所述标记是否简单地是可以通过观察或测试例如通过筛选而鉴定出的性状(例如，r-基因座性状)。当然，合适的选择性标记的许多实例是本领域中已知的，并且可以在本文中所描述的表达盒之中使用。
[0066]
选择性标记的实例包括但不限于：编码neo或nptii的核苷酸序列，其赋予对于卡那霉素、g418等的抗性(potrykus等人,(1985)mol.gen.genet.199:183-188)；编码bar的核苷酸序列，其赋予对于膦丝菌素的抗性；编码经改变的5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸(epsp)合酶的核苷酸序列，其赋予对于草甘膦的抗性(hinchee等人,(1988)biotech.6:915-922)；编码腈水解酶的核苷酸序列(例如来自臭鼻克雷伯氏菌(klebsiella ozaenae)的bxn)，其赋予对于溴苯腈的抗性(stalker等人,(1988)science 242:419-423)；编码经改变的乙酰乳酸合酶(als)的核苷酸序列，其赋予对于咪唑啉酮、磺酰脲或其他抑制als的化学品的抗性(欧洲专利申请号154204)；编码氨甲蝶呤抗性的二氢叶酸还原酶(dhfr)的核苷酸序列(thillet等人,(1988)j.biol.chem.263:12500-12508)；编码茅草枯脱卤素酶的核苷酸序列，其赋予对于茅草枯的抗性；编码甘露糖-6-磷酸异构酶(也称为磷酸甘露糖异构酶(pmi))的核苷酸序列，其赋予代谢甘露糖的能力(美国专利号5,767,378和5,994,629)；编码经改变的邻氨基苯甲酸合酶的核苷酸序列，其赋予对于5-甲基色氨酸的抗性；或编码hph的核苷酸序列，其赋予对于潮霉素的抗性。本领域技术人员能够选择用于在本公开内容的表达盒中使用的合适的选择性标记。
[0067]
另外的选择性标记包括但不限于：编码β-葡糖醛酸糖苷酶的核苷酸序列，或uida(gus)(其编码一种对于其已知各种生色底物的酶)；编码在植物组织中调节花色素苷色素(红色)的产生的产物的r-基因座核苷酸序列(dellaporta等人,“molecular cloning of the maize r-nj allele by transposon-tagging with ac”263-282,在chromosome structure and function:impact of new concepts中,18th stadler genetics symposium(gustafson&appels编辑,plenum press 1988))；编码β-内酰胺酶(一种对于其已知各种生色底物(例如，padac，生色头孢菌素)的酶)的核苷酸序列(sutcliffe(1978)proc.natl.acad.sci.usa 75:3737-3741)；编码xyle(其编码儿茶酚双加氧酶)的核苷酸序列(zukowsky等人,(1983)proc.natl.acad.sci.usa 80:1101-1105)；编码酪氨酸酶的核苷酸序列，所述酪氨酸酶为一种能够将酪氨酸氧化为dopa和多巴醌(dopaquinone)(其则凝聚形成黑色素)的酶(katz等人,(1983)j.gen.microbiol.129:2703-2714)；编码β-半乳糖苷酶(一种对于其存在生色底物的酶)的核苷酸序列；编码萤光素酶(lux)的核苷酸序列，萤光素酶允许生物发光检测(ow等人,(1986)science 234:856-859)；编码水母发光蛋白的核苷酸序列，其可以用在钙敏感型生物发光检测中(prasher等人,(1985)biochem.biophys.res.comm.126:1259-1268)；或编码绿色荧光蛋白的核苷酸序列(niedz等人,(1995)plant cell reports 14:403-406)。本领域技术人员能够选择用于在本公开内容的表达盒中使用的合适的选择性标记。
[0068]
此外，如本领域中众所周知的，可以通过使用各种各样的已知技术中的任一种来
从经转化的植物细胞、植物组织培养物或经培养的原生质体再生出完整的转基因植物。从植物细胞、植物组织培养物或经培养的原生质体开始的植物再生描述在例如evans等人(handbook of plant cell cultures,vol.1,macmilan publishing co.new york(1983))；和vasil i.r.(编辑)(cell culture and somatic cell genetics of plants,acad.press,orlando,vol.i(1984)和vol.ii(1986))中。
[0069]
另外，上面所描述的被改造到本公开内容的转基因种子和植物、植物部分或植物细胞中的遗传特性可以通过有性繁殖或营养生长来进行传递，并因此可以在后代植物中进行维持和增殖。通常，维持和增殖利用已知的为了符合特定目的(例如，收获、播种或耕作)而开发的农业方法。
[0070]
因此，可以以任何数目的在本领域中众所周知的方式(如上面所描述的)将多核苷酸引入到植物、植物部分或植物细胞中。因此，不依赖于特定的用于将一种或多种多核苷酸引入到植物中的方法，而是可以使用任何允许所述一种或多种多核苷酸稳定地整合到植物基因组中的方法。当待引入多于一种多核苷酸时，可以将各自的多核苷酸装配成单个核酸分子的一部分，或者装配成分开的核酸分子，并且可以位于相同或不同的核酸分子上。因此，可以在单个转化事件中，在分开的转化事件中，或例如在植物中，作为育种方案的一部分，将所述多核苷酸引入到目标细胞中。
[0071]
在一些实施方案中，本公开内容提供了防治有害生物的方法，所述方法包括使所述有害生物与包含第一杀昆虫蛋白和不同于所述第一杀昆虫蛋白的第二有害生物防治剂的组合物相接触，其中所述第一杀昆虫蛋白为包含seq id no:1-5中任一个的氨基酸序列的cry蛋白，其中所述有害生物选自棉铃虫、东方粘虫、二点委夜蛾、斜纹贪夜蛾、小地老虎、桃蛀螟、二化螟、稻蛀茎夜蛾和亚洲玉米螟。在其他实施方案中，所述组合物为用于局部施加至植物的制剂。在另外其他实施方案中，所述组合物为转基因植物。在进一步的实施方案中，所述组合物为局部施加至转基因植物的制剂的组合。在一些实施方案中，当所述转基因植物包含第二有害生物防治剂时，所述制剂包含本公开内容的第一cry蛋白。在其他实施方案中，当所述转基因植物包含本公开内容的第一cry蛋白时，所述制剂包含第二有害生物防治剂。
[0072]
在一些实施方案中，所述第二有害生物防治剂可以为从由下列各项组成的组中选择的试剂：化学杀有害生物剂(例如杀昆虫剂)、苏云金芽孢杆菌(bt)杀昆虫蛋白、致病杆菌杀昆虫蛋白、光杆状菌杀昆虫蛋白、侧孢短芽孢杆菌杀昆虫蛋白、球形芽孢杆菌杀昆虫蛋白、穿孔素、蛋白酶抑制剂(丝氨酸和半胱氨酸型两者)、凝集素、α-淀粉酶、过氧化物酶、胆固醇氧化酶和双链rna(dsrna)分子。
[0073]
在其他实施方案中，所述第二有害生物防治剂为从由下列各项组成的组中选择的化学杀有害生物剂：拟除虫菊酯类、氨基甲酸酯类、新烟碱类、神经元钠通道阻断剂、杀昆虫大环内酯类、γ-氨基丁酸(gaba)拮抗剂、杀昆虫脲类和保幼激素模拟物。在其他实施方案中，所述化学杀有害生物剂选自由下列各项组成的组：阿巴美丁(abamectin)、乙酰甲胺磷(acephate)、啶虫脒(acetamiprid)、磺胺螨酯(amidoflumet)(s-1955)、阿维菌素(avermectin)、印楝素(azadirachtin)、保棉磷(azinphos-methyl)、联苯菊酯(bifenthrin)、联苯肼酯(bifenazate)、噻嗪酮(buprofezin)、克百威(carbofuran)、虫螨腈(chlorfenapyr)、氟啶脲(chlorfluazuron)、毒死蜱(chlorpyrifos)、甲基毒死蜱
(chlorpyrifos-methyl)、环虫酰肼(chromafenozide)、噻虫胺(clothianidin)、氟氯氰菊酯(cyfluthrin)、β氟氯氰菊酯(beta-cyfluthrin)、氯氟氰菊酯(cyhalothrin)、λ氯氟氰菊酯(lambda-cyhalothrin)、氯氰菊酯(cypermethrin)、灭蝇胺(cyromazine)、溴氰菊酯(deltamethrin)、杀螨隆(diafenthiuron)、二嗪磷(diazinon)、除虫脲(diflubenzuron)、乐果(dimethoate)、苯虫醚(diofenolan)、甲氨基阿维菌素(emamectin)、硫丹(endosulfan)、高氰戊菊酯(esfenvalerate)、乙虫腈(ethiprole)、苯硫威(fenothicarb)、苯氧威(fenoxycarb)、甲氰菊酯(fenpropathrin)、唑螨酯(fenproximate)、氰戊菊酯(fenvalerate)、氟虫腈(fipronil)、氟啶虫酰胺(flonicamid)、氟氰戊菊酯(flucythrinate)、氟胺氰菊酯(tau-fluvalinate)、嘧虫胺(flufenerim)(ur-50701)、氟虫脲(flufenoxuron)、地虫硫磷(fonophos)、氯虫酰肼(halofenozide)、氟铃脲(hexaflumuron)、吡虫啉(imidacloprid)、茚虫威(indoxacarb)、异柳磷(isofenphos)、虱螨脲(lufenuron)、马拉硫磷(malathion)、四聚乙醛(metaldehyde)、甲胺磷(methamidophos)、杀扑磷(methidathion)、灭多威(methomyl)、烯虫酯(methoprene)、甲氧氯(methoxychlor)、久效磷(monocrotophos)、甲氧虫酰肼(methoxyfenozide)、噻虫醛(nithiazin)、氟酰脲(novaluron)、多氟脲(noviflumuron)(xde-007)、杀线威(oxamyl)、对硫磷(parathion)、甲基对硫磷(parathion-methyl)、氯菊酯(permethrin)、甲拌磷(phorate)、伏杀磷(phosalone)、亚胺硫磷(phosmet)、磷胺(phosphamidon)、抗蚜威(pirimicarb)、丙溴磷(profenofos)、吡蚜酮(pymetrozine)、啶虫丙醚(pyridalyl)、蚊蝇醚(pyriproxyfen)、鱼藤酮(rotenone)、多杀菌素(spinosad)、螺甲螨酯(spiromesifin)(bsn 2060)、硫丙磷(sulprofos)、虫酰肼(tebufenozide)、氟苯脲(teflubenzuron)、七氟菊酯(tefluthrin)、特丁硫磷(terbufos)、杀虫畏(tetrachlorvinphos)、噻虫啉(thiacloprid)、噻虫嗪(thiamethoxam)、硫双威(thiodicarb)、杀虫双(thiosultap-sodium)、四溴菊酯(tralomethrin)、敌百虫(trichlorfon)和杀铃脲(triflumuron)、涕灭威(aldicarb)、杀线威、苯线磷(fenamiphos)、双甲脒(amitraz)、灭螨猛(chinomethionat)、乙酯杀螨醇(chlorobenzilate)、三环锡(cyhexatin)、三氯杀螨醇(dicofol)、除螨灵(dienochlor)、乙螨唑(etoxazole)、喹螨醚(fenazaquin)、苯丁锡(fenbutatin oxide)、甲氰菊酯、唑螨酯、噻螨酮(hexythiazox)、克螨特(propargite)、哒螨灵(pyridaben)和吡螨胺(tebufenpyrad)。在另外其他实施方案中，所述化学杀有害生物剂选自由下列各项组成的组：氯氰菊酯、氯氟氰菊酯、氟氯氰菊酯和β氟氯氰菊酯、高氰戊菊酯、氰戊菊酯、四溴菊酯、苯硫威、灭多威、杀线威、硫双威、噻虫胺、吡虫啉、噻虫啉、茚虫威、多杀菌素、阿巴美丁、阿维菌素、甲氨基阿维菌素、硫丹、乙虫腈、氟虫腈、氟虫脲、杀铃脲、苯虫醚、蚊蝇醚、吡蚜酮和双甲脒。
[0074]
在另外的实施方案中，所述第二有害生物防治剂可以为任何数目的苏云金芽孢杆菌杀昆虫蛋白中的一种或多种，包括但不限于cry蛋白、营养期杀昆虫蛋白(vip)和任何前述杀昆虫蛋白的杀昆虫嵌合体。在其他实施方案中，所述第二有害生物防治剂为从由下列各项组成的组中选择的cry蛋白：cry1aa、cry1ab、cry1ac、cry1ad、cry1ae、cry1af、cry1ag、cry1ah、cry1ai、cry1aj、cry1ba、cry1bb、cry1bc、cry1bd、cry1be、cry1bf、cry1bg、cry1bh、cry1bi、cry1ca、cry1cb、cry1da、cry1db、cry1dc、cry1dd、cry1ea、cry1eb、cry1fa、cry1fb、cry1ga、cry1gb、cry1gc、cry1ha、cry1hb、cry1hc、cry1ia、cry1ib、cry1ic、cry1id、cry1ie、
cry1if、cry1ig、cry1ja、cry1jb、cry1jc、cry1jd、cry1ka、cry1la、cry1ma、cry1na、cry1nb、cry2aa、cry2ab、cry2ac、cry2ad、cry2ae、cry2af、cry2ag、cry2ah、cry2ai、cry2aj、cry2ak、cry2al、cry2ba、cry3aa、cry3ba、cry3bb、cry3ca、cry4aa、cry4ba、cry4ca、cry4cb、cry4cc、cry5aa、cry5ab、cry5ac、cry5ad、cry5ba、cry5ca、cry5da、cry5ea、cry6aa、cry6ba、cry7aa、cry7ab、cry7ac、cry7ba、cry7bb、cry7ca、cry7cb、cry7da、cry7ea、cry7fa、cry7fb、cry7ga、cry7gb、cry7gc、cry7gd、cry7ha、cry7ia、cry7ja、cry7ka、cry7kb、cry7la、cry8aa、cry8ab、cry8ac、cry8ad、cry8ba、cry8bb、cry8bc、cry8ca、cry8da、cry8db、cry8ea、cry8fa、cry8ga、cry8ha、cry8ia、cry8ib、cry8ja、cry8ka、cry8kb、cry8la、cry8ma、cry8na、cry8pa、cry8qa、cry8ra、cry8sa、cry8ta、cry9aa、cry9ba、cry9bb、cry9ca、cry9da、cry9db、cry9dc、cry9ea、cry9eb、cry9ec、cry9ed、cry9ee、cry9fa、cry9ga、cry10aa、cry11aa、cry11ba、cry11bb、cry12aa、cry13aa、cry14aa、cry14ab、cry15aa、cry16aa、cry17aa、cry18aa、cry18ba、cry18ca、cry19aa、cry19ba、cry19ca、cry20aa、cry20ba、cry21aa、cry21ba、cry21ca、cry21da、cry21ea、cry21fa、cry21ga、cry21ha、cry22aa、cry22ab、cry22ba、cry22bb、cry23aa、cry24aa、cry24ba、cry24ca、cry25aa、cry26aa、cry27aa、cry28aa、cry29aa、cry29ba、cry30aa、cry30ba、cry30ca、cry30da、cry30db、cry30ea、cry30fa、cry30ga、cry31aa、cry31ab、cry31ac、cry31ad、cry32aa、cry32ab、cry32ba、cry32ca、cry32cb、cry32da、cry32ea、cry32eb、cry32fa、cry32ga、cry32ha、cry32hb、cry32ia、cry32ja、cry32ka、cry32la、cry32ma、cry32mb、cry32na、cry32oa、cry32pa、cry32qa、cry32ra、cry32sa、cry32ta、cry32ua、cry33aa、cry34aa、cry34ab、cry34ac、cry34ba、cry35aa、cry35ab、cry35ac、cry35ba、cry36aa、cry37aa、cry38aa、cry39aa、cry40aa、cry40ba、cry40ca、cry40da、cry41aa、cry41ab、cry41ba、cry42aa、cry43aa、cry43ba、cry43ca、cry43cb、cry43cc、cry44aa、cry45aa、cry46aa、cry46ab、cry47aa、cry48aa、cry48ab、cry49aa、cry49ab、cry50aa、cry50ba、cry51aa、cry52aa、cry52ba、cry53aa、cry53ab、cry54aa、cry54ab、cry54ba、cry55aa、cry56aa、cry57aa、cry57ab、cry58aa、cry59aa、cry59ba、cry60aa、cry60ba、cry61aa、cry62aa、cry63aa、cry64aa、cry65aa、cry66aa、cry67aa、cry68aa、cry69aa、cry69ab、cry70aa、cry70ba、cry70bb、cry71aa、cry72aa和cry73aa。
[0075]
在进一步的实施方案中，所述第二有害生物防治剂为从由下列各项组成的组中选择的vip3营养期杀昆虫蛋白：vip3aa1、vip3aa2、vip3aa3、vip3aa4、vip3aa5、vip3aa6、vip3aa7、vip3aa8、vip3aa9、vip3aa10、vip3aa11、vip3aa12、vip3aa13、vip3aa14、vip3aa15、vip3aa16、vip3aa17、vip3aa18、vip3aa19、vip3aa20、vip3aa21、vip3aa22、vip3aa2、vip3aa24、vip3aa25、vip3aa26、vip3aa27、vip3aa28、vip3aa29、vip3aa30、vip3aa31、vip3aa32、vip3aa33、vip3aa34、vip3aa35、vip3aa36、vip3aa37、vip3aa38、vip3aa39、vip3aa40、vip3aa41、vip3aa42、vip3aa43、vip3aa44、vip3ab1、vip3ab2、vip3ac1、vip3ad1、vip3ad2、vip3ae1、vip3af1、vip3af2、vip3af3、vip3ag1、vip3ag2、vip3ag3 hm117633、vip3ag4、vip3ag5、vip3ah1、vip3ba1、vip3ba2、vip3bb1、vip3bb2和vip3bb3。
[0076]
在更加进一步的实施方案中，本公开内容的所述第一cry蛋白和所述第二有害生物防治剂在转基因植物中共表达。在同一转基因植物中多于一种杀有害生物有效成分的该
共表达可以通过对植物进行遗传改造以包含和表达所有必需的基因来实现。备选地，可以对植物“亲本1”进行遗传改造以表达本公开内容的cry蛋白。可以对第二植物“亲本2”进行遗传改造以表达第二有害生物防治剂。通过将“亲本1”与“亲本2”杂交，获得表达引入到“亲本1”和“亲本2”中的所有基因的后代植物。
[0077]
在进一步的实施方案中，本公开内容提供了产生抗有害生物的(例如，抗昆虫的)转基因植物的方法，所述方法包括将包含编码本公开内容的cry蛋白的核苷酸序列的多核苷酸、嵌合基因、重组载体、表达盒或核酸分子引入到植物中，其中所述核苷酸序列在所述植物中进行表达，从而赋予所述植物以对于有害生物的抗性，并且产生抗昆虫的转基因植物，其中所述有害生物选自：棉铃虫、东方粘虫、二点委夜蛾、斜纹贪夜蛾、小地老虎、桃蛀螟、二化螟、稻蛀茎夜蛾和亚洲玉米螟。在一些实施方案中，所述小地老虎来自中国的小地老虎群体。在一些实施方案中，所述引入通过转化所述植物来实现。在其他实施方案中，所述引入通过使包含本公开内容的嵌合基因、重组载体、表达盒或核酸分子的第一植物与不同的第二植物杂交来实现。
[0078]
在一些实施方案中，本公开内容包括给农场主提供用于防治有害生物的手段的方法，所述方法包括向农场主供应或出售植物材料(例如种子)，所述植物材料包含能够在从所述种子生长出的植物中表达本发明的cry蛋白的多核苷酸、嵌合基因、表达盒或重组载体，如上面所描述的，其中所述有害生物选自：棉铃虫、东方粘虫、二点委夜蛾、斜纹贪夜蛾、小地老虎、桃蛀螟、二化螟、稻蛀茎夜蛾和亚洲玉米螟。在一些实施方案中，所述小地老虎来自中国的小地老虎群体。
[0079]
通过参考下列实施例可以更好地理解本发明的实施方案。对于本发明的实施方案的前文和下文的描述以及各种实施方案并不旨在限制权利要求，而只是对其举例说明。因此，应该理解，权利要求并不局限于这些实施例的具体细节。本领域技术人员将会意识到，可以实施本发明的其他实施方案，而不背离本公开内容的精神和范围，本公开内容的范围由所附的权利要求书来定义。
[0080]
实施例
[0081]
实施例1.cry蛋白针对夜蛾科、草螟科和螟蛾科有害生物的活性
[0082]
在人工膳食生物测定法中，针对棉铃虫、东方粘虫、二点委夜蛾、斜纹贪夜蛾、小地老虎、桃蛀螟、二化螟、稻蛀茎夜蛾和亚洲玉米螟中的每一个的中国群体，测试了表1的bt-0053、bt-0025、cryet4和cryet67蛋白。如在表1中所显示的，这些cry蛋白先前已有记载。
[0083]
表1.关于cry蛋白公开内容的参考文献
[0084]
cry蛋白seq id no:公开号bt-0053蛋白1wo2018128744bt-0025蛋白3wo2018128744cryet4蛋白2wo1995004146cryet67蛋白4wo2001019859突变的bt-0053蛋白5wo2018128744
[0085]
基本上，将相等量的处于溶液中的蛋白质施加至在多孔平板中的人工昆虫膳食的表面。在膳食表面干燥后，将24只幼虫添加至每个孔。将平板密封并且维持在环境实验室条件(相关于温度、光照和相对湿度)下。阳性对照组由暴露于已知的活性cry蛋白的幼虫组
成。阴性对照组由暴露于仅用缓冲溶液进行处理的昆虫膳食的幼虫组成。在大约3-4天后评估死亡率。对于每种蛋白，实验至少重复两次。
[0086]
生物测定法的结果显示在表2中，其中
“‑”
表示0％死亡率，“ /
‑”
表示1-9％死亡率(这一类别还包括具有强的幼虫生长抑制的0％死亡率)，“ ”表示10-24％死亡率，“ ”表示25-74％死亡率，和“ ”表示75-100％死亡率。在表2中还显示了所述cry蛋白针对夜蛾科中的四种北美有害生物昆虫物种[其包括小地老虎(black cutworm，agrotis ipsilon)、草地贪夜蛾(fall armyworm，spodoptera frugiperda)、谷实夜蛾(corn earworm，helicoverpa zea)和欧洲玉米螟(european corn borer，ostrinia nubilalis)]的活性的指示。对于这四种昆虫物种，活性简单地表示为“ ”或
“‑”
，没有基于公布的数据指出死亡率百分比。标示有“nt”的单元格表示所述蛋白没有针对该有害生物物种进行测试或没有公开的信息表明所述cry蛋白已针对该有害生物物种进行了测试。
[0087]
表2.用cry蛋白进行的生物测定法的结果
[0088]
[0089][0090]
实施例2.cry蛋白在玉蜀黍植物中的表达和活性
[0091]
使用本公开内容的cry蛋白制备转基因玉蜀黍植物。基本上如在negrotto等人,2000,plant cell reports 19:798-803中所描述的那样来进行未成熟玉蜀黍胚的转化。简而言之，土壤杆菌菌株lba4404(psb1)用包含两个表达盒的表达载体进行转化，其中第一个表达盒包含可操作地连接至cry蛋白编码序列(其可操作地连接至终止子)的植物可表达启动子，和第二个表达盒包含可操作地连接至选择性标记(其可操作地连接至终止子)的植物可表达启动子。所述选择性标记的表达允许在选择培养基上鉴定出转基因植物。将这两个表达盒都克隆到合适的用于土壤杆菌介导的玉蜀黍转化的载体中。使经转化的土壤杆菌菌株在28℃下在yep(酵母提取物(5g/l)、蛋白胨(10g/l)、nacl(5g/l)、15g/l琼脂，ph 6.8)固体培养基上生长2-4天。将大约0.8
×
109个土壤杆菌细胞悬浮在补充有100μm as的ls-inf培养基中。将细菌在该培养基中预诱导大约30-60分钟。
[0092]
将来自近交玉蜀黍品系的未成熟胚从8-12日龄的穗上切取到液体ls-inf 100μm as中。将胚用新鲜的感染培养基漂洗一次。然后，添加土壤杆菌溶液，并且将胚涡旋振荡30秒并允许其与细菌一起沉降5分钟。然后，将胚以盾片侧朝上转移至lsas培养基，并且在黑暗中培养2至3天。随后，将大约20至25个胚/培养皿转移至补充有头孢噻肟(250mg/l)和硝酸银(1.6mg/l)的lsdc培养基，并且在大约28℃下在黑暗中培养10天。
[0093]
将产生胚发生性愈伤组织的未成熟胚转移至lsd1m0.5s培养基。将所述培养物在该培养基上进行选择大约6周，其中在大约3周进行传代培养步骤。将存活的愈伤组织转移至补充有甘露糖的reg1培养基。在光照(16小时光照/8小时黑暗分案)下进行培养之后，然后将绿色组织转移至没有生长调节剂的reg2培养基并且温育大约1-2周。将小植株转移至包含reg3培养基的magenta ga-7箱(magenta corp,chicago ill.)并且让其在光照下生长。在大约2-3周后，通过pcr就选择性标记基因和bt cry基因的存在来对植物进行测试。将来自pcr测定法的阳性植物转移至温室以进行进一步评估。
[0094]
就拷贝数(通过taqman分析来测定)、蛋白质表达水平(通过elisa来测定)和针对昆虫物种的功效(在实施例1的生物测定法中)来对转基因植物进行评价。具体地，从单拷贝事件(v3-v4阶段)上切取植物组织(叶或穗丝)并且用实施例1中的有害生物的新生幼虫进行侵袭，然后在室温下温育5天。
[0095]
实施例3.cry蛋白在水稻植物中的表达和活性
[0096]
使用本公开内容的cry蛋白制备转基因水稻植物。水稻转化的方法是本领域已知的，例如hiei等人(plant journal 1994,6(2):271-282)和zaidi等人(mol biotechnol 2009,43:232-242)所阐述的实验方案。
[0097]
就拷贝数(通过taqman分析来测定)、蛋白质表达水平(通过elisa来测定)和针对
昆虫物种的功效(在实施例1的生物测定法中)来对转基因植物进行评价。具体地，从单拷贝事件上切取植物组织(叶或分蘖)并且用实施例1中的有害生物的新生幼虫进行侵袭，然后在室温下温育4天。
[0098]
来自实施例2和实施例3的转基因植物组织生物测定的结果将证实当在转基因植物中表达时本公开内容的cry蛋白对实施例1中的有害生物是有毒的。
[0099]
实施例4.cry蛋白在大豆植物中的表达和活性
[0100]
使用本公开内容的cry蛋白制备转基因大豆植物。大豆转化的方法是本领域已知的，例如美国专利公开号us2004034889中所阐述的实验方案。用大豆合适的启动子构建用于大豆转化的双元载体，所述合适的启动子驱动本公开内容的cry蛋白的表达。可以基于它们的编码区的预测氨基酸序列对编码本公开内容的cry蛋白的基因进行密码子优化以用于大豆表达。还通过添加转化选择性标记基因来构建含有表达盒的土壤杆菌双元转化载体，所述表达盒包含cry蛋白编码序列。也可以对选择性标记编码序列进行密码子优化以在大豆中表达。
[0101]
就拷贝数(通过taqman分析来测定)、蛋白质表达水平(通过elisa来测定)和针对昆虫物种的功效(在实施例1的生物测定法中)来对转基因植物进行评价。具体地，从单拷贝事件上切取植物组织(叶)并且用实施例1中的新生幼虫进行侵袭，然后在室温下温育4天。
[0102]
来自实施例4的转基因植物组织生物测定的结果将证实当在转基因植物中表达时本公开内容的cry蛋白对实施例1中的有害生物是有毒的。