通过蛋白质开关检测分析物的制作方法

通过蛋白质开关检测分析物
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技术领域
5.本公开内容涉及用于检测和/或监测分析物的物质组合物、方法、装置、系统和设备，诸如例如蛋白质开关以及其在体内传感器中的用途。所述蛋白质开关可以用于确定对于受试者的健康和/或良好状态具有诊断性和/或预后性的一种或多种分析物的水平。


背景技术：

6.目标分析物的检测或监测对于某些个体的健康和/或良好状态是有益的。许多疾病病症涉及可以被测量以诊断和/或监测个体的疾病状态的分析物。例如，可以通过此类分析物来监测生命器官，诸如脑、心脏、肾脏和肝脏以及神经系统和内分泌系统。
7.分析物检测和监测的关键要求是测定的特异性和灵敏度。当目标分析物在流体或生物样品中以较小或限制的量或浓度存在时，这些要求尤其重要。一般而言，测定的特异性和/或灵敏度由用于检测一种或多种目的分析物的捕获和/或检测抗体提供。利用该方法的诊断性测定是熟知的并且通常广泛用于酶联免疫吸附夹心测定(elisa)或免疫测定中。产生提供针对某些分析物的足够特异性和/或灵敏度的抗体可能具有挑战性(且是昂贵的)。
8.目前用于检测目标分析物以用于预后、诊断和/或监测目的的测定具有限制其在临床、非临床(例如，可穿戴)和定点照护型环境中的广泛应用的若干种局限性。另外，这些测定中有许多需要大量的技术专业知识和一组昂贵且特异性的试剂(诸如抗体)以及精密的生物医学基础设施，所述生物医学基础设施通常位于专业实验室环境中。
9.因此，需要可以在受试者中检测目标分析物以用于预后、诊断和/或监测目的的组合物、装置、系统和方法，所述组合物、装置、系统和方法相对便宜地产生，能够测量流体或生物样品中较小或有限量或浓度的分析物，并且适于在临床、非临床和定点照护型环境中广泛应用。


技术实现要素：

10.在一个实施方案中，本公开内容涉及一种蛋白质开关。本公开内容的蛋白质开关包括至少一种非天然存在的多肽，所述至少一种非天然存在的多肽具有：(a)能够与至少一种分析物结合的至少一个分析物结合结构域；和(b)具有氧化酶或脱氢酶活性并且能够与至少一种反应物结合或反应的至少一个氧化酶或脱氢酶结构域，其中(i)结合所述分析物
结合结构域的所述分析物不同于与所述氧化酶或脱氢酶结构域结合或反应的所述反应物；并且(ii)当所述分析物结合所述分析物结合结构域时，所述氧化酶或脱氢酶活性改变。在另外的方面，所述氧化酶是葡萄糖氧化酶或乳酸氧化酶。在另一方面，所述脱氢酶是葡萄糖脱氢酶或乳酸脱氢酶。
11.在另外的方面，在以上蛋白质开关中，当所述分析物结合结构域结合所述分析物时，所述氧化酶或脱氢酶的活性降低。在又另外的方面，在以上蛋白质开关中，当所述分析物结合结构域结合所述分析物时，所述氧化酶或脱氢酶的活性增加。在还又另外的方面，当所述分析物结合结构域结合所述分析物时，所述氧化酶或脱氢酶的活性由于竞争性抑制、无竞争性抑制或非竞争性抑制而增加或降低。在还又另一方面，当所述分析物结合结构域结合所述分析物时，所述氧化酶或脱氢酶的活性由于竞争性抑制而降低。
12.在又另一方面，在任一种上述蛋白质开关中，所述分析物是华法林(warfarin)、皮质醇、甲氨蝶呤或三碘甲状腺氨酸。
13.在还又另外的方面，在任一种上述蛋白质开关中，所述反应物是葡萄糖或乳酸。
14.在另一个实施方案中，本公开内容涉及一种蛋白质开关，其包含在seq id no:20的氨基酸位置96、155、156、159、170、198和252处的至少7个突变。
15.在一些方面，所述蛋白质开关包含至少以下突变：(a)在seq id no:20的氨基酸位置96处的半胱氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸或酪氨酸；(b)在seq id no:20的氨基酸位置155处的丙氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸或缬氨酸；(c)在seq id no:20的氨基酸位置156处的苏氨酸或丝氨酸；(d)在seq id no:20的氨基酸位置159处的苏氨酸或丝氨酸；(e)在seq id no:20的氨基酸位置170处的赖氨酸、精氨酸或组氨酸；(f)在seq id no:20的氨基酸位置198处的谷氨酸或天冬氨酸；以及(g)在seq id no:20的氨基酸位置252处的丙氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸或缬氨酸。在其他方面，除了以上突变(a)-(g)之外，所述蛋白质开关进一步包含以下突变中的一种或多种：(1)在seq id no:20的氨基酸位置11处的甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸或缬氨酸；(2)在seq id no:20的氨基酸位置22处的甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸或缬氨酸；(3)在seq id no:20的氨基酸位置45处的天冬酰胺或谷氨酰胺；(4)在seq id no:20的氨基酸位置48处的丙氨酸、甘氨酸、异亮氨酸或亮氨酸；(5)在seq id no:20的氨基酸位置55处的天冬氨酸或谷氨酸；(6)在seq id no:20的氨基酸位置98处的丙氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸或缬氨酸；(7)在seq id no:20的氨基酸位置137处的苯丙氨酸、色氨酸或酪氨酸；(8)在seq id no:20的氨基酸位置141处的丙氨酸、甘氨酸、亮氨酸或缬氨酸；(9)在seq id no:20的氨基酸位置149处的丙氨酸、甘氨酸、异亮氨酸或亮氨酸；(10)在seq id no:20的氨基酸位置154处的丙氨酸、甘氨酸、异亮氨酸或缬氨酸；(11)在seq id no:20的氨基酸位置166处的苏氨酸或丝氨酸；(12)在seq id no:20的氨基酸位置173处的甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸或缬氨酸；(13)在seq id no:20的氨基酸位置184处的苏氨酸或丝氨酸；(14)在seq id no:20的氨基酸位置195处的组氨酸、亮氨酸或精氨酸；(15)在seq id no:20的氨基酸位置219处的苏氨酸或丝氨酸；(16)在seq id no:20的氨基酸位置240处的天冬酰胺或谷氨酰胺；和/或(17)在seq id no:20的氨基酸位置251处的丙氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸或缬氨酸。
16.在又另一方面，所述蛋白质开关包含在seq id no:20的氨基酸位置96、155、156、159、170、198和252处的7个突变。在这些方面，所述蛋白质开关包含在seq id no:20的氨基
酸位置96处的半胱氨酸或苯丙氨酸、氨基酸位置155处的丙氨酸、氨基酸位置156处的丝氨酸、氨基酸位置159处的酪氨酸、氨基酸位置170处的赖氨酸、氨基酸位置198处的谷氨酸和氨基酸位置252处的赖氨酸或缬氨酸。
17.在另一方面，所述蛋白质开关包含在seq id no:20的氨基酸位置96、98、155、156、159、170、198和252处的8个突变。在这些方面，所述蛋白质开关包含在seq id no:20的氨基酸位置96处的半胱氨酸或苯丙氨酸、氨基酸位置98处的亮氨酸、氨基酸位置155处的丙氨酸、氨基酸位置156处的丝氨酸、氨基酸位置159处的酪氨酸、氨基酸位置170处的赖氨酸、氨基酸位置198处的谷氨酸和氨基酸位置252处的赖氨酸或缬氨酸。
18.在另一方面，所述蛋白质开关包含在seq id no:20的氨基酸位置96、155、156、159、170、198、219和252处的8个突变。在这些方面，所述蛋白质开关包含在seq id no:20的氨基酸位置96处的半胱氨酸或苯丙氨酸、氨基酸位置155处的丙氨酸、氨基酸位置156处的丝氨酸、氨基酸位置159处的酪氨酸、氨基酸位置170处的赖氨酸、氨基酸位置198处的谷氨酸、氨基酸位置219处的苏氨酸和氨基酸位置252处的赖氨酸或缬氨酸。
19.在另一方面，所述蛋白质开关包含在seq id no:20的氨基酸位置96、155、156、159、170、195、198和252处的8个突变。在这些方面，所述蛋白质开关包含在seq id no:20的氨基酸位置96处的半胱氨酸或苯丙氨酸、氨基酸位置155处的丙氨酸、氨基酸位置156处的丝氨酸、氨基酸位置159处的酪氨酸、氨基酸位置170处的赖氨酸、氨基酸位置195处的精氨酸、氨基酸位置198处的谷氨酸和氨基酸位置252处的赖氨酸或缬氨酸。
20.在另一方面，所述蛋白质开关包含在seq id no:20的氨基酸位置96、141、155、156、159、170、198和252处的8个突变。在这些方面，所述蛋白质开关包含在seq id no:20的氨基酸位置96处的半胱氨酸或苯丙氨酸、氨基酸位置141处的缬氨酸、氨基酸位置155处的丙氨酸、氨基酸位置156处的丝氨酸、氨基酸位置159处的酪氨酸、氨基酸位置170处的赖氨酸、氨基酸位置198处的谷氨酸和氨基酸位置252处的赖氨酸或缬氨酸。
21.在另一方面，所述蛋白质开关包含在seq id no:20的氨基酸位置96、155、156、159、170、173、198和252处的8个突变。在这些方面，所述蛋白质开关包含在seq id no:20的氨基酸位置96处的半胱氨酸或苯丙氨酸、氨基酸位置155处的丙氨酸、氨基酸位置156处的丝氨酸、氨基酸位置159处的酪氨酸、氨基酸位置170处的赖氨酸、氨基酸位置173处的甘氨酸、氨基酸位置198处的谷氨酸和氨基酸位置252处的赖氨酸或缬氨酸。
22.在另一方面，所述蛋白质开关包含在seq id no:20的氨基酸位置55、96、155、156、159、170、198和252处的8个突变。在这些方面，所述蛋白质开关包含在seq id no:20的氨基酸位置55处的谷氨酸、氨基酸位置96处的半胱氨酸或苯丙氨酸、氨基酸位置155处的丙氨酸、氨基酸位置156处的丝氨酸、氨基酸位置159处的酪氨酸、氨基酸位置170处的赖氨酸、氨基酸位置198处的谷氨酸和氨基酸位置252处的赖氨酸或缬氨酸。
23.在另一方面，所述蛋白质开关包含在seq id no:20的氨基酸位置96、137、155、156、159、170、198和252处的8个突变。在这些方面，所述蛋白质开关包含在seq id no:20的氨基酸位置96处的半胱氨酸或苯丙氨酸、氨基酸位置137处的酪氨酸、氨基酸位置155处的丙氨酸、氨基酸位置156处的丝氨酸、氨基酸位置159处的酪氨酸、氨基酸位置170处的赖氨酸、氨基酸位置198处的谷氨酸和氨基酸位置252处的赖氨酸或缬氨酸。
24.在另一方面，所述蛋白质开关包含在seq id no:20的氨基酸位置48、96、155、156、
159、170、198和252处的8个突变。在这些方面，所述蛋白质开关包含在seq id no:20的氨基酸位置48处的丙氨酸、氨基酸位置96处的半胱氨酸或苯丙氨酸、氨基酸位置155处的丙氨酸、氨基酸位置156处的丝氨酸、氨基酸位置159处的酪氨酸、氨基酸位置170处的赖氨酸、氨基酸位置198处的谷氨酸和氨基酸位置252处的赖氨酸或缬氨酸。
25.在另一方面，所述蛋白质开关包含在seq id no:20的氨基酸位置96、155、156、159、170、184、198和252处的8个突变。在这些方面，所述蛋白质开关包含在seq id no:20的氨基酸位置96处的半胱氨酸或苯丙氨酸、氨基酸位置155处的丙氨酸、氨基酸位置156处的丝氨酸、氨基酸位置159处的酪氨酸、氨基酸位置170处的赖氨酸、氨基酸位置184处的丝氨酸、氨基酸位置198处的谷氨酸和氨基酸位置252处的赖氨酸或缬氨酸。
26.在另一方面，所述蛋白质开关包含在seq id no:20的氨基酸位置96、155、156、159、166、170、198和252处的8个突变。在这些方面，所述蛋白质开关包含在seq id no:20的氨基酸位置96处的半胱氨酸或苯丙氨酸、氨基酸位置155处的丙氨酸、氨基酸位置156处的丝氨酸、氨基酸位置159处的酪氨酸、氨基酸位置166处的丝氨酸、氨基酸位置170处的赖氨酸、氨基酸位置198处的谷氨酸和氨基酸位置252处的赖氨酸或缬氨酸。
27.在另一方面，所述蛋白质开关包含在seq id no:20的氨基酸位置96、155、156、159、170、198、240和252处的8个突变。在这些方面，所述蛋白质开关包含在seq id no:20的氨基酸位置96处的半胱氨酸或苯丙氨酸、氨基酸位置155处的丙氨酸、氨基酸位置156处的丝氨酸、氨基酸位置159处的酪氨酸、氨基酸位置170处的赖氨酸、氨基酸位置198处的谷氨酸、氨基酸位置240处的谷氨酰胺和氨基酸位置252处的赖氨酸或缬氨酸。
28.在还又另一方面，所述蛋白质开关包含在seq id no:20的氨基酸位置45、96、149、155、156、159、170、198和252处的9个突变。在这些方面，所述蛋白质开关包含在seq id no:20的氨基酸位置45处的天冬酰胺、氨基酸位置96处的半胱氨酸或苯丙氨酸、氨基酸位置149处的丙氨酸、氨基酸位置155处的丙氨酸、氨基酸位置156处的丝氨酸、氨基酸位置159处的酪氨酸、氨基酸位置170处的赖氨酸、氨基酸位置198处的谷氨酸和氨基酸位置252处的赖氨酸或缬氨酸。
29.在还又另一方面，所述蛋白质开关包含在seq id no:20的氨基酸位置22、96、154、155、156、159、170、198和252处的9个突变。在这些方面，所述蛋白质开关包含在seq id no:20的氨基酸位置22处的甘氨酸、氨基酸位置96处的半胱氨酸或苯丙氨酸、氨基酸位置154处的甘氨酸、氨基酸位置155处的丙氨酸、氨基酸位置156处的丝氨酸、氨基酸位置159处的酪氨酸、氨基酸位置170处的赖氨酸、氨基酸位置198处的谷氨酸和氨基酸位置252处的赖氨酸或缬氨酸。
30.在又另一方面，所述蛋白质开关包含在seq id no:20的氨基酸位置96、141、154、155、156、159、170、198和252处的9个突变。在这些方面，所述蛋白质开关包含在seq id no:20的氨基酸位置96处的半胱氨酸或苯丙氨酸、氨基酸位置141处的缬氨酸、氨基酸位置154处的甘氨酸、氨基酸位置155处的丙氨酸、氨基酸位置156处的丝氨酸、氨基酸位置159处的酪氨酸、氨基酸位置170处的赖氨酸、氨基酸位置198处的谷氨酸和氨基酸位置252处的赖氨酸或缬氨酸。
31.在还又另外的方面，所述蛋白质开关包含在seq id no:20的氨基酸位置12、96、155、156、159、170、195、198、251和252处的10个突变。在这些方面，所述蛋白质开关包含在
seq id no:20的氨基酸位置12处的赖氨酸、氨基酸位置96处的半胱氨酸或苯丙氨酸、氨基酸位置155处的丙氨酸、氨基酸位置156处的丝氨酸、氨基酸位置159处的酪氨酸、氨基酸位置170处的赖氨酸、氨基酸位置195处的精氨酸、氨基酸位置198处的谷氨酸、氨基酸位置251处的赖氨酸和氨基酸位置252处的赖氨酸或缬氨酸。
32.在另一个实施方案中，本公开内容涉及一种蛋白质开关，其包含与seq id no:11具有至少80％同一性的氨基酸序列。
33.在一方面，所述蛋白质开关包含与seq id no:11具有至少85％同一性的氨基酸序列。
34.在又另一方面，所述蛋白质开关包含与seq id no:11具有至少90％同一性的氨基酸序列。
35.在还又另一方面，所述蛋白质开关包含与seq id no:11具有至少95％同一性的氨基酸序列。
36.在还又另一方面，所述蛋白质开关包含与seq id no:11具有至少96％同一性的氨基酸序列。
37.在还又另一方面，所述蛋白质开关包含与seq id no:11具有至少97％同一性的氨基酸序列。
38.在还又另一方面，所述蛋白质开关包含与seq id no:11具有至少98％同一性的氨基酸序列。
39.在还又另一方面，所述蛋白质开关包含与seq id no:11具有至少99％同一性的氨基酸序列。
40.在还又另一方面，所述蛋白质开关包含与seq id no:11具有至少100％同一性的氨基酸序列。
41.在还又另一方面，所述蛋白质开关包含seq id no.1-10或12-19中的任一个的氨基酸序列。
42.在又另一个实施方案中，本公开内容涉及一种组合物或试剂盒，所述组合物或试剂盒包含至少一种上述蛋白质开关和至少一种反应物。在一方面，所述组合物或试剂盒中的所述反应物是葡萄糖或乳酸。
43.在又另一个实施方案中，本公开内容涉及一种检测分析物的方法。所述方法包括以下步骤：
44.a.提供蛋白质开关，其包括至少一种多肽，所述至少一种多肽具有：(a)能够与至少一种分析物结合的至少一个分析物结合结构域；和(b)具有氧化酶或脱氢酶活性并且能够与至少一种反应物结合或反应的至少一个氧化酶或脱氢酶结构域，其中(i)结合所述分析物结合结构域的所述分析物不同于与所述氧化酶或脱氢酶结构域结合或反应的所述反应物；并且(ii)当所述分析物结合所述分析物结合结构域时，所述氧化酶或脱氢酶活性改变；
45.b.使所述蛋白质开关与包含对所述蛋白质开关具有特异性的反应物的流体接触，其中所述分析物结合结构域结合所述流体中的所述分析物，由此所述氧化酶或脱氢酶活性改变；以及
46.c.检测所述蛋白质开关的所述氧化酶或脱氢酶结构域对所述反应物的分解速率
的改变。
47.在以上方法的一方面，所述氧化酶是葡萄糖氧化酶或乳酸氧化酶。
48.在以上方法的另一方面，所述脱氢酶是葡萄糖脱氢酶或乳酸脱氢酶。
49.在以上方法的还又另一方面，所述反应物是葡萄糖或乳酸。
50.在以上方法的仍又另一方面，所述分析物是华法林、皮质醇、甲氨蝶呤或三碘甲状腺氨酸。
51.在又另一个实施方案中，本公开内容涉及一种检测分析物的方法。所述方法包括以下步骤：
52.a.提供一种上述蛋白质开关；
53.b.使所述蛋白质开关与包含对所述蛋白质开关具有特异性的反应物的流体接触，其中所述分析物结合结构域结合所述流体中的所述分析物，由此所述氧化酶或脱氢酶活性改变；以及
54.c.检测所述蛋白质开关的所述氧化酶或脱氢酶结构域对所述反应物的分解速率的改变。
55.在以上方法的一方面，所述蛋白质开关包含与seq id no:11具有至少80％同一性的氨基酸序列。
56.在以上方法的一方面，所述蛋白质开关包含与seq id no:11具有至少85％同一性的氨基酸序列。
57.在以上方法的另一方面，所述蛋白质开关包含与seq id no:11具有至少90％同一性的氨基酸序列。
58.在以上方法的又另一方面，所述蛋白质开关包含与seq id no:11具有至少95％同一性的氨基酸序列。
59.在以上方法的还又另一方面，所述蛋白质开关包含与seq id no:11具有至少96％同一性的氨基酸序列。
60.在以上方法的还又另一方面，所述蛋白质开关包含与seq id no:11具有至少97％同一性的氨基酸序列。
61.在以上方法的还又另一方面，所述蛋白质开关包含与seq id no:11具有至少98％同一性的氨基酸序列。
62.在以上方法的还又另一方面，所述蛋白质开关包含与seq id no:11具有至少99％同一性的氨基酸序列。
63.在以上方法的还又另一方面，所述蛋白质开关包含与seq id no:11具有至少100％同一性的氨基酸序列。
64.在以上方法的还又另一方面，所述蛋白质开关包含seq id no.1-10或12-19中的任一个的氨基酸序列。
65.在以上方法的还又另一方面，所述氧化酶是葡萄糖氧化酶或乳酸氧化酶。
66.在以上方法的还又另一方面，所述脱氢酶是葡萄糖脱氢酶或乳酸脱氢酶。
67.在以上方法的还又另一方面，所述反应物是葡萄糖或乳酸。
68.在以上方法的仍又另一方面，所述分析物是华法林、皮质醇、甲氨蝶呤或三碘甲状腺氨酸。
69.在又另一个实施方案中，本公开内容涉及一种用于检测或监测分析物浓度的系统。所述系统包括传感器控制装置和信号检测装置，其中所述传感器控制装置包括至少一个传感器，所述至少一个传感器包括一种上述蛋白质开关。
70.在一方面，所述传感器中使用的所述蛋白质开关中的氧化酶是葡萄糖氧化酶或乳酸氧化酶。
71.在另一方面，所述传感器中使用的所述蛋白质开关中的脱氢酶是葡萄糖脱氢酶或乳酸脱氢酶。
72.在又另一个实施方案中，本公开内容涉及一种分析物监测系统。所述分析物监测系统包括：传感器，所述传感器包括基板、一个或多个工作电极和一种上述蛋白质开关，所述传感器的至少一部分适于植入和与体液紧密接触，所述传感器被配置和布置为产生代表所述体液中分析物水平的信号；和用于接收所述信号的信号检测装置，其中所述信号由所述分析物与所述蛋白质开关的接触生成。
73.在一方面，所述分析物监测系统中使用的所述蛋白质开关中的氧化酶是葡萄糖氧化酶或乳酸氧化酶。
74.在另一方面，所述分析物监测系统中使用的所述蛋白质开关中的脱氢酶是葡萄糖脱氢酶或乳酸脱氢酶。
75.在又另外的方面，所述分析物监测系统中检测的所述分析物是华法林、皮质醇、甲氨蝶呤或三碘甲状腺氨酸。
附图说明
76.图1示出了并入包括本公开内容的至少一种蛋白质开关的传感器的说明性感测系统的图。
77.图2a示出了具有单一工作电极的说明性两电极传感器配置的图。图2b和2c示出了具有单一工作电极的说明性三电极传感器配置的图。
78.图3示出了具有两个工作电极、一个参比电极和一个对电极的说明性传感器配置的图。
79.图4示出了说明性传感器配置，其中在单一工作电极的表面上设置有两个不同的活性区域。
80.图5a和5b示出了说明性工作电极的图，其中第一活性区域直接设置在工作电极的表面上并且第二活性区域通过膜与工作电极分离。
81.图6示出了传感器的一部分的说明性示意图，所述传感器具有两个工作电极并且特征在于外包覆两个工作电极之一的双层膜。
82.图7示出了包含以下蛋白质开关的传感器对增加的葡萄糖浓度的线性灵敏度响应：gdh-2004、gdh-2007、gdh-2008、gdh-2009、gdh-2010、gdh-2011、gdh-2015、gdh-2018、gdh-2019、gdh-2005、gdh-2013、gdh-2016和gdh-2024。包含gdh-105的传感器是对照。
83.图8示出了包含以下蛋白质开关的传感器的烧杯(长期)稳定性：gdh-2004、gdh-2007、gdh-2008、gdh-2009、gdh-2010、gdh-2011、gdh-2015、gdh-2018、gdh-2019、gdh-2005、gdh-2013、gdh-2016和gdh-2024。包含gdh-105的传感器是对照。
84.图9a和9b示出了包含蛋白质开关gdh-2016的传感器对增加的华法林浓度的抑制，
而包含gdh-105的传感器(对照)不受影响。
85.图10示出了包含gdh-105(对照)的传感器和包含蛋白质开关gdh-2025、gdh-2026、gdh-2027和gdh-2028的传感器的基于烧杯校准(beaker calibration)的线性灵敏度响应。
86.图11示出了包含蛋白质开关gdh-2025、gdh-2026、gdh-2027和gdh-2028的传感器的烧杯(长期)稳定性。包含gdh-105的传感器是对照。
87.图12a和12b示出了包含以下蛋白质开关的传感器对增加的华法林浓度的抑制：gdh-2016、gdh-2025、gdh-2026、gdh-2027和gdh-20288。包含gdh-105的传感器是对照。
88.图13示出了包含以下的传感器对增加的华法林浓度的抑制：gdh-2016、gdh-2025、gdh-2026、gdh-2027和gdh-20288。包含gdh-105的传感器是对照。
89.图14示出了seq id no.1-20的序列。
具体实施方式
90.本文提供了用于检测和/或监测体液或生物样品中的目标分析物的物质组合物、方法、装置(例如，传感器)、系统和设备的示例性方面。应当理解，本公开内容的教导并不限于所描述的具体方面，因此当然可以变化。还应当理解，本文所用的术语是仅仅出于描述具体方面的目的，并且不旨在是限制性的。
91.出于说明而非限制的目的，蛋白质开关可以被设计来识别、鉴定和/或定量体液或生物样品中的一种或多种目标分析物。蛋白质开关的确切性质和配置可以变化。蛋白质开关可以具有用于检测目标分析物的分析物结合部分和在结合分析物时生成产物(例如，信号)或生成的产物的变化(例如，信号的变化)的酶部分。蛋白质开关可以在多种条件和配置中，包括在用于测量受试者中分析物水平的传感器中利用。这种传感器的配置可以取决于所测量的分析物和装置测量其分析物的体液。传感器可以被配置用于检测和/或测量受试者中的体内分析物。体内传感器可以包括可定位于皮肤表面以下，例如穿透皮肤并且进入真皮或皮下区域中的插入尖端。传感器可以测试真皮流体、间质流体、皮下流体或血液(例如，毛细血管)中的分析物。
92.传感器可以包括一种或多种蛋白质开关，所述一种或多种蛋白质开关结合分析物(在分析物结合部分(part)或部分(portion)中)并且然后生成可以由传感器检测的产物(诸如来自酶部分(part)或部分(portion)的信号)。传感器中的蛋白质开关可以在分析物未被结合时具有一种活性水平(例如，更低或更高)并且在分析物被结合时具有不同的活性(例如，更高或更低)。例如，由蛋白质开关的分析物结合部分进行的分析物结合可以降低酶活性。可替代地，由蛋白质开关的分析物结合部分进行的分析物结合可以增加酶活性。酶活性的改变可以作为基于由酶制得的产物的量的信号的改变而由传感器检测(直接或间接)。可以将由传感器检测的信号与可以对患者的健康和/或良好状态具有预后性或诊断性的分析物的量相关联。可替代地，可以将传感器处检测的信号与用于监测患者的健康和/或良好状态的情况的分析物的量相关联。也可以将所测量的分析物的量与血液或其他体液中的量相关联和/或转换为血液或其他体液中的量。
93.a.定义
94.除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常所理解的相同的含义。当发生冲突时，以本文件(包括定义)为准。虽然在公开的实践或
测试中可以使用与本文所述的那些方法和材料类似或等效的方法和材料，但以下描述了优选的方法和材料。本文提及的所有出版物、专利申请、专利以及其他参考文献通过引用以其全文并入。本文公开的材料、方法和实施例仅是说明性的并且不旨在是限制性的。
95.如本文所用，术语“包含(comprise)”、“包括(include)”、“具有(having)”、“具有(has)”、“可(can)”、“含有(contain)”以及其变化形式意图是不排除另外行为或结构的可能性的开放式连接词、术语或词语。除非上下文另外清楚地说明，否则单数形式“一个/种(a)”、“一个/种(an)”和“所述(the)”包括复数参照物。本公开内容还涵盖“包括(comprising)”本文所呈现的方面或要素、“由其组成(consisting of)”以及“主要由其组成(consisting essentially of)”的其他方面，无论是否明确地提出。
96.对于本文数值范围的叙述来说，明确地涵盖具有相同精确度的介于其间的每个中间数字。例如，对于范围6-9，除6和9之外还涵盖数字7和8，并且对于范围6.0-7.0，明确涵盖数字6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9和7.0。
97.如本文所用，“affimer”通常是指特异性或选择性结合目标(例如，分析物、目标组织、目标分子、目标细胞等)的肽。一般而言，affimer可以是通常具有小于12kda的分子量的小肽或蛋白质。affimer可以具有识别特异性表位或抗原的能力，并且具有可以接近于抗体的结合亲和力的结合亲和力(例如，在低纳摩尔至皮摩尔范围内)；然而，如本文所用，术语“affirmer”不涵盖抗体、免疫球蛋白、抗体的fab区或抗体的fc区。affimer可以具有抗体的相同特异性优点，但是可以是更小的、可以是化学合成的或化学修饰的并且具有不含细胞培养污染物的优点。
98.如本文可互换使用的“传感器(sensor)”、“体内传感器”或“传感器(sensor)”是指被配置为经由传感器上的电化学氧化和还原反应来检测样品中一种或多种(例如，多种)分析物的存在和/或测量其水平的装置。这些反应可以变换为可以与样品中分析物的量、浓度或水平或者酶的活性相关联的电信号。
[0099]“酶”是指对一种或多种反应物(例如，酶底物)具有活性(例如，催化活性、酶活性或酶促活性)的蛋白质或其片段。一种或多种反应物(例如，酶底物)的实例是葡萄糖、乳酸、谷氨酸、抗坏血酸、胆固醇、胆碱乙酰胆碱、次黄嘌呤、去甲肾上腺素、5-羟色胺、苯基乙胺和e/e-甲基组胺、多酚、乙醇、醛或苹果酸。
[0100]
如本文可互换使用的“流体”、“体液”、“样品”或“生物样品”是指从受试者或患者获得的真皮流体、间质流体、皮下流体或血液(例如诸如毛细血管)。在一方面，流体或样品是真皮流体。在一方面，流体或样品是间质流体。在又另一方面，流体是皮下流体。在又另一方面，流体或样品是血液(诸如毛细血管)。
[0101]
如本文所用，“相同”、“同一性”或“序列同一性”在两种或更多种多肽或多核苷酸序列的背景下可以意指序列在使用标准算法确定的指定区域上具有指定百分比的相同残基，考虑了在比较窗口上序列相同的程度。同一性或序列同一性可以使用计算机算法诸如程序中的gap、bestfit、fasta和blast家族确定，如例如由altschul等人,1997,nucl.acids res.25 3389公开的。序列分析的详细论述可见于ausubel等人编辑的current protocols in molecular biology(john wiley&sons inc ny,1995-1999)的第19.3单元中。合适地，序列同一性在seq id no.1-20的整个长度上测量。
[0102]
如本文所用，“分离的多核苷酸”可以意指如下多核苷酸(例如，基因组、cdna或合
成来源或其组合的多核苷酸)：根据其来源，所述分离的多核苷酸不与通过其而使得“分离的多核苷酸”被发现于自然界中的多核苷酸的全部或一部分缔合。
[0103]
如本文所用，“感测层”是指传感器的组分，所述组分包括促进化合物直接在电极处的或者经由一种或多种电子转移剂、一种或多种辅因子或者一种或多种电子转移剂和一种或多种辅因子的组合的电氧化或电还原的成分。在传感器的一些方面，感测层设置在工作电极附近或在工作电极上。
[0104]
如本文所用，“感测区”是指传感器的活性化学区域。
[0105]
如本文可互换使用的“受试者”或“患者”是指任何脊椎动物，包括但不限于哺乳动物(例如，牛、猪、骆驼、美洲驼、马、山羊、兔、绵羊、仓鼠、豚鼠、猫、狗、大鼠和小鼠、非人灵长类动物(例如，猴，诸如食蟹猴或恒河猴、黑猩猩等)和人)。在一些方面，受试者可以是人或非人。在一些方面，受试者是人。受试者或患者可以经历一种或多种形式的治疗。
[0106]
如本文可互换使用的术语“变体蛋白质”、“蛋白质变体”或“变体”意指与亲本蛋白质因至少一个氨基酸修饰而不同的蛋白质。术语“蛋白质变体”可以是指蛋白质本身、包含蛋白质的组合物或编码其的氨基序列。在一些方面，蛋白质变体具有相比于亲本或参考蛋白质的至少一个氨基酸修饰，例如相比于亲本蛋白质的约一至约五十个氨基酸修饰。在一些方面，蛋白质变体具有相比于亲本蛋白质的约一至约四十个氨基酸修饰。在一些方面，蛋白质变体具有相比于亲本蛋白质的约一至约三十个氨基酸修饰。在一些方面，蛋白质变体具有相比于亲本蛋白质的约一至约二十个氨基酸修饰。在一些方面，蛋白质变体具有相比于亲本蛋白质的约一至约十个氨基酸修饰。在一些方面，蛋白质变体具有相比于亲本蛋白质的约一至约五个氨基酸修饰。在一些方面，本文的蛋白质变体序列将与亲本蛋白质序列具有至少约80％同一性。在其他方面，本文的蛋白质变体序列将具有至少约90％同一性。在还其他方面，蛋白质变体序列将具有至少约95％、96％、97％、98％或99％同一性。
[0107]
在本公开内容中，提及了氨基酸。除了氨基酸的名称外，本文还使用了三字母和单字母代码。出于清楚目的，本公开内容中提及的氨基酸参考如下：丙氨酸(ala，a)、精氨酸(arg，r)、天冬酰胺(asn，n)、天冬氨酸(asp，d)、半胱氨酸(cys，c)、谷氨酰胺(qln，q)、谷氨酸(glu，e)、甘氨酸(gly，g)、组氨酸(his，h)、异亮氨酸(ile，i)、亮氨酸(leu，l)、赖氨酸(lys，k)、甲硫氨酸(met，m)、苯丙氨酸(phe，f)、脯氨酸(pro，p)、丝氨酸(ser，s)、苏氨酸(thr，t)、色氨酸(trp，w)、酪氨酸(tyr，y)和缬氨酸(val，v)。
[0108]
除非本文另外定义，否则结合本公开内容使用的科学和技术术语将具有由本领域普通技术人员通常所理解的含义。例如，结合本文中描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学和蛋白质及核酸化学以及杂交使用的任何命名法以及其技术是本领域熟知并且常用的那些。术语的含义和范围应为清晰的；然而，如果存在任何隐含歧义，则本文中所提供的定义优先于任何字典或外来定义。此外，除非另外通过上下文要求，否则单数的术语应包括复数并且复数术语应包括单数。
[0109]
b.蛋白质开关
[0110]
在一些方面，本公开内容涉及物质组合物，其可以包含一种或多种蛋白质开关。具体地，蛋白质开关可以包括但不限于至少两部分：至少一个分析物结合部分(part)(或部分(portion))和至少一个酶部分(part)(或部分(portion))。分析物结合部分调节蛋白质开关的酶部分的活性。如将在本文中进一步详细论述的，当分析物结合分析物结合部分时，酶
部分的活性作为竞争性抑制、无竞争性抑制或非竞争性抑制的结果而改变(例如，增加或降低)。在一些方面，当分析物结合分析物结合部分时，酶部分的活性增加(当相比于没有分析物时)。在其他方面，当分析物结合分析物结合部分时，酶部分的活性降低(当相比于没有分析物时)。酶活性的这种调节可以提供分析物的检测。
[0111]
本公开内容的蛋白质开关包括至少一种非天然存在的多肽，所述多肽具有至少两个不同的结构域或部分。在一些方面，至少两个不同的结构域或部分在其序列上可以彼此重叠(例如，含有重叠的一种或多种核酸或氨基酸序列)或在其空间取向上彼此重叠。第一结构域或部分是包含至少一个分析物结合结构域的分析物结合部分(binding part)(或结合部分(binding portion))。至少一个分析物结合结构域与或能够与一种或多种目的分析物结合。第二结构域或部分是酶部分，其包含具有酶活性(例如，催化活性)的至少一个氧化酶或脱氢酶结构域。换言之，第二结构域或部分是催化活性的。另外，氧化酶或脱氢酶结构域与一种或多种反应物和任选的一种或多种辅因子结合、反应，能够与一种或多种反应物和任选的一种或多种辅因子结合和/或反应，以生成或产生可以被检测的产物(例如，信号)，这将在本文中更详细论述。
[0112]
在一方面，在分析物的存在下(例如，当至少一种分析物结合分析物结合结构域时)，氧化酶或脱氢酶结构域与至少一种反应物结合和/或反应，并且酶(例如，氧化酶或脱氢酶)的活性增加。具体地，所产生的产物(例如，信号)的量增加。酶的活性可以增加(当相比于野生型酶时)约0.1％、约0.5％、约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约11％、约12％、约13％、约14％、约15％、约16％、约17％、约18％、约19％、约20％、约21％、约22％、约23％、约24％、约25％、约26％、约27％、约28％、约29％、约30％、约40％、约41％、约42％、约43％、约44％、约45％、约46％、约47％、约48％、约49％、约50％、约51％、约52％、约53％、约54％、约55％、约56％、约57％、约58％、约59％、约60％、约61％、约62％、约63％、约64％、约65％、约66％、约67％、约68％、约69％、约70％、约71％、约72％、约73％、约74％、约75％、约76％、约77％、约78％、约79％、约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％。
[0113]
在还又另一方面，在分析物的存在下(例如，当分析物结合区结合一种或多种分析物时)，氧化酶或脱氢酶结构域不与一种或多种反应物结合或反应或者表现出与一种或多种反应物的降低(例如，抑制)结合和/或反应，并且酶(例如，氧化酶或脱氢酶)的活性可能降低。具体地，所产生的产物(例如，信号)的量降低。酶(例如，氧化酶或脱氢酶)的活性可能降低(当相比于野生型酶时)约0.1％、约0.5％、约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约11％、约12％、约13％、约14％、约15％、约16％、约17％、约18％、约19％、约20％、约21％、约22％、约23％、约24％、约25％、约26％、约27％、约28％、约29％、约30％、约40％、约41％、约42％、约43％、约44％、约45％、约46％、约47％、约48％、约49％、约50％、约51％、约52％、约53％、约54％、约55％、约56％、约57％、约58％、约59％、约60％、约61％、约62％、约63％、约64％、约65％、约66％、约67％、约68％、约69％、约70％、约71％、约72％、约73％、约74％、约75％、约76％、约77％、约78％、约79％、约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％(例如，酶(例如，氧化酶或
脱氢酶)的活性的完全抑制)。
[0114]
在一方面，分析物结合结构域可以衍生自结合或能够结合一种或多种目的分析物的任何蛋白质或多肽。例如，在一方面，分析物结合结构域可以衍生自一种或多种affimer、抗体、肽、受体(包括全长和单链受体)、小分子、人工结合蛋白(诸如使用支架、展示技术等制得的那些)或者其任何功能片段或变体。在另一方面，分析物结合结构域可以衍生自已经被突变和/或修饰为诸如含有一个或多个氨基酸突变、缺失、取代和/或截短的多肽或蛋白质(诸如氧化酶或脱氢酶)。在一些方面，分析物结合结构域对分析物的结合亲和力允许蛋白质开关检测生理水平下的一种或多种分析物。
[0115]
分析物结合结构域的长度不是关键的，前提是分析物结合结构域结合或能够结合一种或多种目的分析物。例如，分析物结合结构域的长度可以为3个连续氨基酸、4个连续氨基酸、5个连续氨基酸、6个连续氨基酸、7个连续氨基酸、8个连续氨基酸、9个连续氨基酸、10个连续氨基酸、11个连续氨基酸、12个连续氨基酸、13个连续氨基酸、14个连续氨基酸、15个连续氨基酸、16个连续氨基酸、17个连续氨基酸、18个连续氨基酸、19个连续氨基酸、20个连续氨基酸、21个连续氨基酸、22个连续氨基酸、23个连续氨基酸、24个连续氨基酸、25个连续氨基酸、26个连续氨基酸、27个连续氨基酸、28个连续氨基酸、29个连续氨基酸、30个连续氨基酸、31个连续氨基酸、32个连续氨基酸、33个连续氨基酸、34个连续氨基酸、35个连续氨基酸、36个连续氨基酸、37个连续氨基酸、38个连续氨基酸、39个连续氨基酸、40个连续氨基酸、41个连续氨基酸、42个连续氨基酸、43个连续氨基酸、44个连续氨基酸、45个连续氨基酸、46个连续氨基酸、47个连续氨基酸、48个连续氨基酸、49个连续氨基酸、50个连续氨基酸、个连续氨基酸、75个连续氨基酸、80个连续氨基酸、85个连续氨基酸、90个连续氨基酸、95个连续氨基酸、100个连续氨基酸、125个连续氨基酸、150个连续氨基酸、175个连续氨基酸、200个连续氨基酸、225个连续氨基酸、250个连续氨基酸、275个连续氨基酸、300个连续氨基酸、325个连续氨基酸、350个连续氨基酸、375个连续氨基酸、400个连续氨基酸、425个连续氨基酸、450个连续氨基酸、475个连续氨基酸或500个连续氨基酸。
[0116]
在另一方面，至少一个氧化酶或脱氢酶结构域或部分包含编码具有酶活性(例如催化活性)的至少一种氧化酶和/或至少一种脱氢酶的氨基酸序列，并且与至少一种反应物和任选的辅因子结合、反应、能够与其结合和/或反应以产生产物(例如信号)。编码氧化酶或脱氢酶的氨基酸序列可以从一种或多种微生物，诸如从细菌、病毒或真菌、或哺乳动物细胞衍生、获得和/或合成的天然(野生型)序列。氨基酸序列可以编码整个酶或其功能片段(前提是功能片段具有酶活性)。可替代地，氧化酶或脱氢酶结构域的氨基酸序列可以是编码具有酶活性的氧化酶或脱氢酶的天然(野生型)序列的变体。与分析物结合结构域一样，氧化酶或脱氢酶结构域的长度不是关键的，前提是它编码具有酶(例如，氧化酶或脱氢酶)活性的酶(例如，整个酶)、其功能片段或变体。例如，氧化酶或脱氢酶结构域的长度可以为3个连续氨基酸、4个连续氨基酸、5个连续氨基酸、6个连续氨基酸、7个连续氨基酸、8个连续氨基酸、9个连续氨基酸、10个连续氨基酸、11个连续氨基酸、12个连续氨基酸、13个连续氨基酸、14个连续氨基酸、15个连续氨基酸、16个连续氨基酸、17个连续氨基酸、18个连续氨基酸、19个连续氨基酸、20个连续氨基酸、21个连续氨基酸、22个连续氨基酸、23个连续氨基酸、24个连续氨基酸、25个连续氨基酸、26个连续氨基酸、27个连续氨基酸、28个连续氨基酸、29个连续氨基酸、30个连续氨基酸、31个连续氨基酸、32个连续氨基酸、33个连续氨基
酸、34个连续氨基酸、35个连续氨基酸、36个连续氨基酸、37个连续氨基酸、38个连续氨基酸、39个连续氨基酸、40个连续氨基酸、41个连续氨基酸、42个连续氨基酸、43个连续氨基酸、44个连续氨基酸、45个连续氨基酸、46个连续氨基酸、47个连续氨基酸、48个连续氨基酸、49个连续氨基酸、50个连续氨基酸、个连续氨基酸、75个连续氨基酸、80个连续氨基酸、85个连续氨基酸、90个连续氨基酸、95个连续氨基酸、100个连续氨基酸、125个连续氨基酸、150个连续氨基酸、175个连续氨基酸、200个连续氨基酸、225个连续氨基酸、250个连续氨基酸、275个连续氨基酸、300个连续氨基酸、325个连续氨基酸、350个连续氨基酸、375个连续氨基酸、400个连续氨基酸、425个连续氨基酸、450个连续氨基酸、475个连续氨基酸或500个连续氨基酸。
[0117]
可以在至少一个氧化酶或脱氢酶结构域中使用的酶包括(i)一种或多种氧化酶，诸如例如葡萄糖氧化酶或乳酸氧化酶；(ii)一种或多种脱氢酶，诸如例如葡萄糖脱氢酶或乳酸脱氢酶；或(iii)(i)和(ii)的任何组合。在一些方面，氧化酶是葡萄糖氧化酶。在其他方面，氧化酶是乳酸氧化酶。在一些方面，氧化酶是谷氨酸氧化酶。在还另外的方面，脱氢酶是葡萄糖脱氢酶。在又另外的方面，脱氢酶是乳酸脱氢酶。在又其他方面，脱氢酶是谷氨酸脱氢酶。
[0118]
氧化酶和/或脱氢酶结构域中使用的氧化酶和/或脱氢酶可以衍生自微生物诸如细菌、病毒或真菌或者由其编码。本文所述的蛋白质开关中使用的氧化酶或脱氢酶结构域的来源的实例提供于下表1和2中。
[0119]
表1：氧化酶
[0120]
表1
[0121][0122]
表2：脱氢酶
[0123]
表2
[0124]
[0125][0126]
使用表1和2中的氧化酶和脱氢酶与一种或多种反应物(和一种或多种辅因子诸如例如吡咯喹啉醌(pqq)、黄素腺嘌呤二核苷酸(fad)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad)、黄素单核苷酸(fmn))的组合以产生或生成可检测产物(例如，信号)的方法是本领域熟知的。通过举例的方式，现将公开用于用葡萄糖氧化酶和葡萄糖脱氢酶生成可检测产物的方法。
[0127]
酶葡萄糖氧化酶由两个相同的蛋白质亚基和在其活性位点的辅因子(即黄素腺嘌呤二核苷酸(fad))构成。由于fad，葡萄糖氧化酶利用分子氧作为电子受体催化其反应物葡萄糖在其第一羟基处的氧化，以产生产物葡糖酸内酯和过氧化氢。可以使用本领域已知的常规技术检测(诸如例如，通过电极处的电化学氧化和检测到的电子转移数)所产生的过氧化氢产物。反应可以概述为如下所示：
[0128]
葡萄糖 葡萄糖氧化酶(gox)-fad

→
葡糖酸内酯 gox-fadh2[0129]
gox-fadh2 o2→
gox-fad h2o2[0130]
h2o2→
2h

o2 2e-[0131]
可替代地，可以测量耗氧量。
[0132]
葡萄糖脱氢酶可以利用多种不同的辅因子(例如，nad、pqq等)。当nad用作辅因子时，葡萄糖脱氢酶催化葡萄糖的氧化以产生葡糖酸内酯和nadh。nadh可以在电极处电化学氧化并且检测电子转移数。反应可以概述为如下所示：
[0133]
葡萄糖 葡萄糖脱氢酶(gdh)-nad

→
葡糖酸内酯 gdh-nadh
[0134]
nadh
→
nad

h

2e-[0135]
通过蛋白质开关检测的目标分析物对于患者的健康和/或良好状态可以是预后性或诊断性的。可替代地，或除此之外，目标分析物可以用于监测患者的健康和/或良好状态的情况。例如，分析物可以是原降钙素(pct)、心肌肌钙蛋白(诸如心肌肌钙蛋白i或心肌肌钙蛋白t)、肌酸、尿素、胍基琥珀酸、硫酸对甲酚、指示剂、二甲基胺、cmpf、假尿苷、草酸、乙二醛、2-氧化戊二酸、葡萄糖、乳酸、脑脊髓液葡萄糖、谷氨酸、苹果酸、乙酰肉碱、次黄嘌呤、乙酰神经氨酸、肌酐、假尿苷、羟基苯基乳酸、己酰肉毒碱、神经肽y、食欲素a、降钙素基因相关肽、5-羟色胺、糠源性神经营养因子(bdnf)、γ-氨基丁酸(gaba)、多巴胺、n-甲基-d-天冬氨酸(nmda)、二十二碳六烯酸(dha)、二十碳五烯酸(epa)、溶血磷脂酰胆碱(22:6和20:5)、溶血磷脂酰-乙醇胺(22:6和20:5)、3-羧基-40-甲基-5-丙基-2-呋喃并丙酸(furanopropanoic acid)(cmpf)、乙酰胆碱、皮质醇、雌激素、雌三醇、雌酮、孕酮、催产素、促滤泡激素(fsh)、促黄体激素(lh)、促甲状腺激素(tsh)、三碘甲状腺氨酸(t3)、甲状腺素(t4)、三碘甲状腺素(triiodothryxin)、人生长激素、细胞因子、趋化因子、白介素、原降钙素、凝血因子、c反应蛋白(crp)、原降钙素、髓系细胞上表达的可溶性触发受体-1(strem-1)、胰石蛋白(psp)、循环补体(c3和c4)、铁蛋白、胆固醇、白蛋白和嗜中性粒细胞明胶酶相关脂钙蛋白。对于心脏功能或心脏疾病诊断性的分析物包括例如心肌肌钙蛋白、2-氧基戊二酸、肌酸激酶(ck-mb)、糖原磷酸化酶同工酶bd、bnp、肌红蛋白、局部缺血修饰性白蛋白、心脏利尿钠肽和/或乳酸脱氢酶同工酶。分析物也可以是受试者中存在的可以对于受试者的健康和/或良好状态为诊断性的核酸(例如，血浆或血清中的微小rna、cpg岛和其他核酸标记物)、多肽、代谢物、脂质、碳水化合物或其他分子。对于肾脏功能或肾脏疾病诊断性的分析物包括例如肌酸和尿素。对于肝脏功能或肝脏疾病诊断性的分析物包括例如葡萄糖、尿素、白蛋白和肌酸。对于神经功能或神经疾病诊断性的分析物包括gfap、uch-l1、s100b和nf-l。对于感染性疾病和/或败血症诊断性的分析物包括例如乳酸、脑脊髓液葡萄糖、谷氨酸、苹果酸、乙酰肉碱、次黄嘌呤、甘油磷酰胆碱、乙酰神经氨酸、肌酐、假尿苷、羟基苯基乳酸、己酰肉毒碱、c反应蛋白(crp)、原降钙素、髓系细胞上表达的可溶性触发受体-1(strem-1)、胰石蛋白(psp)、循环补体(c3和c4)、铁蛋白、胆固醇、白蛋白、皮质醇和嗜中性粒细胞明胶酶相关脂钙蛋白。还其他的分析物包括药物或药物代谢物。例如，华法林、甲氨蝶呤、环孢菌素a、甲氨蝶呤和环孢菌素。在一方面，分析物是华法林、皮质醇、甲氨蝶呤、三碘甲状腺氨酸、环孢菌素a、gfap、uch-l1、s100b、nf-l或心肌肌钙蛋白。在又另一方面，分析物是华法林。在还另一方面，分析物是皮质醇。在又另外的方面，分析物是甲氨蝶呤。在还另外的方面，分析物是三碘甲状腺氨酸。在还另外的方面，分析物是环孢菌素a。在还另外的方面，分析物是gfap。在还另外的方面，分析物是uch-l1。在还另外的方面，分析物是s100b。在又还另外的方面，分析物是nf-l。在还另外的方面，分析物是心肌肌钙蛋白(例如，肌钙蛋白i或肌钙蛋白t)。在还另外的方面，分析物是心肌肌钙蛋白i。
[0136]
结合蛋白质开关的分析物结合结构域的分析物和与氧化酶或脱氢酶结构域结合和/或反应的反应物必须是不同的(例如，不能是相同的)。例如，如果结合分析物结合结构域的分析物是葡萄糖，则与氧化酶或脱氢酶结构域的结合或反应的反应物不能是葡萄糖，而必须是不同的反应物诸如乳酸。可替代地，如果结合蛋白质开关的分析物结合结构域的分析物是华法林，则与氧化酶或脱氢酶结合或反应的反应物可以是葡萄糖或乳酸。
[0137]
如本文先前论述的，当分析物结合分析物结合结构域时，氧化酶或脱氢酶活性改变。在一些方面，当分析物结合分析物结合结构域时，氧化酶或脱氢酶活性增加(例如，所产生的产物的量增加)。在其他方面，当分析物结合分析物结合结构域时，氧化酶或脱氢酶活性降低(例如，所产生的产物的量降低)。
[0138]
本领域已知的与酶配对的任何反应物适于与本文所述的蛋白质开关一起使用的。可以使用的反应物的实例包括葡萄糖或乳酸。在一些方面，反应物是葡萄糖。在其他方面，反应物是乳酸。
[0139]
在另一方面，本公开内容的蛋白质开关是葡萄糖脱氢酶多肽。在又另一方面，蛋白质开关是在以下氨基酸序列中具有至少7个突变的葡萄糖脱氢酶多肽：mypdlkgkvvaitgaasglgkamairfgkeqakvvinyysnkqdpnevkeevikaggeavvvqgdvtkeedvknivqtaikefgtldiminnaglenpvpshemplkdwdkvigtnltgaflgsreaikyfvendikgnvinmssvhevipwplfvhyaaskggmklmtetlaleyapkgirvnnigpgainttinagkfadpkqkadvesmipmgyigepeeiaavaawlaskeasyvtgitlfadggmtqypsfqagrg(seq id no:20)。
[0140]
在一方面，蛋白质开关包含在seq id no:20的氨基酸位置96、155、156、159、170、198和252处的至少7个突变。可以在seq id no:20的氨基酸位置96、155、156、159、170、198和252处进行的突变示出于下表3a中。
[0141]
表3a
[0142]
氨基酸位置seq id no:20突变96ec、f、m、w、y155fa、g、i、l、v156vt、s159at、s170ek、r、h198ge、d252qa、g、i、l、v
[0143]
在另一方面，蛋白质开关包含如上表3a中所示的在seq id no:20的氨基酸位置96、155、156、159、170、198和252处的突变以及如下表3b中所示的在seq id no:20的氨基酸位置11、22、45、48、55、98、137、141、149、154、166、173、184、195、219、240和/或251处的至少一个突变。
[0144]
表3b
[0145]
氨基酸位置seq id no:20突变11ag、i、l、v22ag、i、l、v45pn、q48va、g、i、l55ad、e98pa、g、i、l、v137kf、w、y141ia、g、l、v
149va、g、i、l154la、g、i、v166ks、t173ag、i、l、v184ns、t195ih、l、r219gs、t240tn、q251ta、g、i、l、v
[0146]
在又另一方面，所述蛋白质开关包含在seq id no:20的氨基酸位置96、155、156、159、170、198和252处的7个突变。
[0147]
在另一方面，所述蛋白质开关包含在seq id no:20的氨基酸位置96、98、155、156、159、170、198和252处的8个突变。在另一方面，所述蛋白质开关包含在seq id no:20的氨基酸位置96、155、156、159、170、198、219和252处的8个突变。在另一方面，所述蛋白质开关包含在seq id no:20的氨基酸位置96、155、156、159、170、195、198和252处的8个突变。在另一方面，所述蛋白质开关包含在seq id no:20的氨基酸位置96、141、155、156、159、170、198和252处的8个突变。在另一方面，所述蛋白质开关包含在seq id no:20的氨基酸位置96、155、156、159、170、173、198和252处的8个突变。在另一方面，所述蛋白质开关包含在seq id no:20的氨基酸位置55、96、155、156、159、170、198和252处的8个突变。在另一方面，所述蛋白质开关包含在seq id no:20的氨基酸位置96、137、155、156、159、170、198和252处的8个突变。在另一方面，所述蛋白质开关包含在seq id no:20的氨基酸位置48、96、155、156、159、170、198和252处的8个突变。在另一方面，所述蛋白质开关包含在seq id no:20的氨基酸位置96、155、156、159、170、184、198和252处的8个突变。在另一方面，所述蛋白质开关包含在seq id no:20的氨基酸位置96、155、156、159、166、170、198和252处的8个突变。在另一方面，所述蛋白质开关包含在seq id no:20的氨基酸位置96、155、156、159、170、198、240和252处的8个突变。
[0148]
在还又另一方面，所述蛋白质开关包含在seq id no:20的氨基酸位置45、96、149、155、156、159、170、198和252处的9个突变。在还又另一方面，所述蛋白质开关包含在seq id no:20的氨基酸位置22、96、154、155、156、159、170、198和252处的9个突变。在又另一方面，所述蛋白质开关包含在seq id no:20的氨基酸位置96、141、154、155、156、159、170、198和252处的9个突变。
[0149]
在还又另外的方面，所述蛋白质开关包含在seq id no:20的氨基酸位置12、96、155、156、159、170、195、198、251和252处的10个突变。
[0150]
在又另一方面，所述蛋白质开关包含在seq id no:20的氨基酸位置96、155、156、159、170、198和252处的7个突变。在这些方面，所述蛋白质开关包含在seq id no:20的氨基酸位置96处的半胱氨酸或苯丙氨酸、氨基酸位置155处的丙氨酸、氨基酸位置156处的丝氨酸、氨基酸位置159处的酪氨酸、氨基酸位置170处的赖氨酸、氨基酸位置198处的谷氨酸和氨基酸位置252处的赖氨酸或缬氨酸。
[0151]
在另一方面，所述蛋白质开关包含在seq id no:20的氨基酸位置96、98、155、156、
159、170、198和252处的8个突变。在这些方面，所述蛋白质开关包含在seq id no:20的氨基酸位置96处的半胱氨酸或苯丙氨酸、氨基酸位置98处的亮氨酸、氨基酸位置155处的丙氨酸、氨基酸位置156处的丝氨酸、氨基酸位置159处的酪氨酸、氨基酸位置170处的赖氨酸、氨基酸位置198处的谷氨酸和氨基酸位置252处的赖氨酸或缬氨酸。
[0152]
在另一方面，所述蛋白质开关包含在seq id no:20的氨基酸位置96、155、156、159、170、198、219和252处的8个突变。在这些方面，所述蛋白质开关包含在seq id no:20的氨基酸位置96处的半胱氨酸或苯丙氨酸、氨基酸位置155处的丙氨酸、氨基酸位置156处的丝氨酸、氨基酸位置159处的酪氨酸、氨基酸位置170处的赖氨酸、氨基酸位置198处的谷氨酸、氨基酸位置219处的苏氨酸和氨基酸位置252处的赖氨酸或缬氨酸。
[0153]
在另一方面，所述蛋白质开关包含在seq id no:20的氨基酸位置96、155、156、159、170、195、198和252处的8个突变。在这些方面，所述蛋白质开关包含在seq id no:20的氨基酸位置96处的半胱氨酸或苯丙氨酸、氨基酸位置155处的丙氨酸、氨基酸位置156处的丝氨酸、氨基酸位置159处的酪氨酸、氨基酸位置170处的赖氨酸、氨基酸位置195处的精氨酸、氨基酸位置198处的谷氨酸和氨基酸位置252处的赖氨酸或缬氨酸。
[0154]
在另一方面，所述蛋白质开关包含在seq id no:20的氨基酸位置96、141、155、156、159、170、198和252处的8个突变。在这些方面，所述蛋白质开关包含在seq id no:20的氨基酸位置96处的半胱氨酸或苯丙氨酸、氨基酸位置141处的缬氨酸、氨基酸位置155处的丙氨酸、氨基酸位置156处的丝氨酸、氨基酸位置159处的酪氨酸、氨基酸位置170处的赖氨酸、氨基酸位置198处的谷氨酸和氨基酸位置252处的赖氨酸或缬氨酸。
[0155]
在另一方面，所述蛋白质开关包含在seq id no:20的氨基酸位置96、155、156、159、170、173、198和252处的8个突变。在这些方面，所述蛋白质开关包含在seq id no:20的氨基酸位置96处的半胱氨酸或苯丙氨酸、氨基酸位置155处的丙氨酸、氨基酸位置156处的丝氨酸、氨基酸位置159处的酪氨酸、氨基酸位置170处的赖氨酸、氨基酸位置173处的甘氨酸、氨基酸位置198处的谷氨酸和氨基酸位置252处的赖氨酸或缬氨酸。
[0156]
在另一方面，所述蛋白质开关包含在seq id no:20的氨基酸位置55、96、155、156、159、170、198和252处的8个突变。在这些方面，所述蛋白质开关包含在seq id no:20的氨基酸位置55处的谷氨酸、氨基酸位置96处的半胱氨酸或苯丙氨酸、氨基酸位置155处的丙氨酸、氨基酸位置156处的丝氨酸、氨基酸位置159处的酪氨酸、氨基酸位置170处的赖氨酸、氨基酸位置198处的谷氨酸和氨基酸位置252处的赖氨酸或缬氨酸。
[0157]
在另一方面，所述蛋白质开关包含在seq id no:20的氨基酸位置96、137、155、156、159、170、198和252处的8个突变。在这些方面，所述蛋白质开关包含在seq id no:20的氨基酸位置96处的半胱氨酸或苯丙氨酸、氨基酸位置137处的酪氨酸、氨基酸位置155处的丙氨酸、氨基酸位置156处的丝氨酸、氨基酸位置159处的酪氨酸、氨基酸位置170处的赖氨酸、氨基酸位置198处的谷氨酸和氨基酸位置252处的赖氨酸或缬氨酸。
[0158]
在另一方面，所述蛋白质开关包含在seq id no:20的氨基酸位置48、96、155、156、159、170、198和252处的8个突变。在这些方面，所述蛋白质开关包含在seq id no:20的氨基酸位置48处的丙氨酸、氨基酸位置96处的半胱氨酸或苯丙氨酸、氨基酸位置155处的丙氨酸、氨基酸位置156处的丝氨酸、氨基酸位置159处的酪氨酸、氨基酸位置170处的赖氨酸、氨基酸位置198处的谷氨酸和氨基酸位置252处的赖氨酸或缬氨酸。
[0159]
在另一方面，所述蛋白质开关包含在seq id no:20的氨基酸位置96、155、156、159、170、184、198和252处的8个突变。在这些方面，所述蛋白质开关包含在seq id no:20的氨基酸位置96处的半胱氨酸或苯丙氨酸、氨基酸位置155处的丙氨酸、氨基酸位置156处的丝氨酸、氨基酸位置159处的酪氨酸、氨基酸位置170处的赖氨酸、氨基酸位置184处的丝氨酸、氨基酸位置198处的谷氨酸和氨基酸位置252处的赖氨酸或缬氨酸。
[0160]
在另一方面，所述蛋白质开关包含在seq id no:20的氨基酸位置96、155、156、159、166、170、198和252处的8个突变。在这些方面，所述蛋白质开关包含在seq id no:20的氨基酸位置96处的半胱氨酸或苯丙氨酸、氨基酸位置155处的丙氨酸、氨基酸位置156处的丝氨酸、氨基酸位置159处的酪氨酸、氨基酸位置166处的丝氨酸、氨基酸位置170处的赖氨酸、氨基酸位置198处的谷氨酸和氨基酸位置252处的赖氨酸或缬氨酸。
[0161]
在另一方面，所述蛋白质开关包含在seq id no:20的氨基酸位置96、155、156、159、170、198、240和252处的8个突变。在这些方面，所述蛋白质开关包含在seq id no:20的氨基酸位置96处的半胱氨酸或苯丙氨酸、氨基酸位置155处的丙氨酸、氨基酸位置156处的丝氨酸、氨基酸位置159处的酪氨酸、氨基酸位置170处的赖氨酸、氨基酸位置198处的谷氨酸、氨基酸位置240处的谷氨酰胺和氨基酸位置252处的赖氨酸或缬氨酸。
[0162]
在还又另一方面，所述蛋白质开关包含在seq id no:20的氨基酸位置45、96、149、155、156、159、170、198和252处的9个突变。在这些方面，所述蛋白质开关包含在seq id no:20的氨基酸位置45处的天冬酰胺、氨基酸位置96处的半胱氨酸或苯丙氨酸、氨基酸位置149处的丙氨酸、氨基酸位置155处的丙氨酸、氨基酸位置156处的丝氨酸、氨基酸位置159处的酪氨酸、氨基酸位置170处的赖氨酸、氨基酸位置198处的谷氨酸和氨基酸位置252处的赖氨酸或缬氨酸。
[0163]
在还又另一方面，所述蛋白质开关包含在seq id no:20的氨基酸位置22、96、154、155、156、159、170、198和252处的9个突变。在这些方面，所述蛋白质开关包含在seq id no:20的氨基酸位置22处的甘氨酸、氨基酸位置96处的半胱氨酸或苯丙氨酸、氨基酸位置154处的甘氨酸、氨基酸位置155处的丙氨酸、氨基酸位置156处的丝氨酸、氨基酸位置159处的酪氨酸、氨基酸位置170处的赖氨酸、氨基酸位置198处的谷氨酸和氨基酸位置252处的赖氨酸或缬氨酸。
[0164]
在又另一方面，所述蛋白质开关包含在seq id no:20的氨基酸位置96、141、154、155、156、159、170、198和252处的9个突变。在这些方面，所述蛋白质开关包含在seq id no:20的氨基酸位置96处的半胱氨酸或苯丙氨酸、氨基酸位置141处的缬氨酸、氨基酸位置154处的甘氨酸、氨基酸位置155处的丙氨酸、氨基酸位置156处的丝氨酸、氨基酸位置159处的酪氨酸、氨基酸位置170处的赖氨酸、氨基酸位置198处的谷氨酸和氨基酸位置252处的赖氨酸或缬氨酸。
[0165]
在还又另外的方面，所述蛋白质开关包含在seq id no:20的氨基酸位置12、96、155、156、159、170、195、198、251和252处的10个突变。在这些方面，所述蛋白质开关包含在seq id no:20的氨基酸位置12处的赖氨酸、氨基酸位置96处的半胱氨酸或苯丙氨酸、氨基酸位置155处的丙氨酸、氨基酸位置156处的丝氨酸、氨基酸位置159处的酪氨酸、氨基酸位置170处的赖氨酸、氨基酸位置195处的精氨酸、氨基酸位置198处的谷氨酸、氨基酸位置251处的赖氨酸和氨基酸位置252处的赖氨酸或缬氨酸。
[0166]
在又另一方面，本公开内容的蛋白质开关具有seq id no:11的带有下表3c和图14中列出的至少一个以下突变(单一)或突变组合的氨基酸序列。
[0167]
表3c
[0168][0169][0170]
在另一方面，本公开内容的蛋白质开关具有seq id no.1-19中的任一个的氨基酸序列，与seq id no.1-19中的任一个具有至少60％序列同一性、与seq id no.1-19中的任一个具有至少65％序列同一性、与seq id no.1-10和12-19中的任一个具有至少70％序列
同一性、与seq id no.1-19中的任一个具有至少75％序列同一性、与seq id no.1-19中的任一个具有至少80％序列同一性、与seq id no.1-19中的任一个具有至少85％序列同一性、与seq id no.1-19中的任一个具有至少90％序列同一性、与seq id no.1-19中的任一个具有至少95％序列同一性、与seq id no.1-19中的任一个具有至少96％序列同一性、与seq id no.1-19中的任一个具有至少97％序列同一性、与seq id no.1-19中的任一个具有至少98％序列同一性、与seq id no.1-19中的任一个具有至少99％序列同一性或与seq id no.1-19中的任一个具有至少100％序列同一性的氨基酸序列。包含seq id no.1-19的氨基酸序列的蛋白质开关结合分析物华法林。
[0171]
在另一方面，本公开内容的蛋白质开关具有seq id no.1、7、12或15中的任一个的氨基酸序列，与seq id no.1、7、12或15中的任一个具有至少60％序列同一性、与seq id no.1、7、12或15中的任一个具有至少65％序列同一性、与seq id no.1、7、12或15中的任一个具有至少70％序列同一性、与seq id no.1、7、12或15中的任一个具有至少75％序列同一性、与seq id no.1、7、12或15中的任一个具有至少80％序列同一性、与seq id no.1、7、12或15中的任一个具有至少85％序列同一性、与seq id no.1、7、12或15中的任一个具有至少90％序列同一性、与seq id no.1、7、12或15中的任一个具有至少95％序列同一性、与seq id no.1、7、12或15中的任一个具有至少96％序列同一性、与seq id no.1、7、12或15中的任一个具有至少97％序列同一性、与seq id no.1、7、12或15中的任一个具有至少98％序列同一性、与seq id no.1、7、12或15中的任一个具有至少99％序列同一性或与seq id no.seq id no.1、7、12或15中的任一个具有至少100％序列同一性的氨基酸序列。
[0172]
在又另一方面，本公开内容的蛋白质开关包括实施例1或2的任一种酶。
[0173]
如本文将更详细论述的，可以使用本领域已知的常规技术将本公开内容的一种或多种蛋白质开关并入一种或多种传感器中以便在感测系统中检测样品中的一种或多种分析物。
[0174]
c.用于制作蛋白质开关的方法
[0175]
在一些方面，本公开内容涉及鉴定、制作和/或制备蛋白质开关的方法。在某些方面，本公开内容的蛋白质开关可以通过使用本领域已知的生物化学技术使用具有一种或多种目的分析物筛选非天然存在的变体多肽表达库来制得。例如，编码氧化酶(例如，葡萄糖氧化酶或乳酸氧化酶)或脱氢酶(例如，葡萄糖脱氢酶或乳酸脱氢酶)的变体多肽表达库可以使用一种或多种目的分析物筛选。在一方面，可以针对吸光度或荧光的增加或降低监测nadh、nadph、fadh2或其他还原的辅因子的形成速率，并且选择出表现出酶活性的这种增加或降低的多肽。在一些方面，选择出作为使用目的分析物筛选的结果而表现出酶活性降低的多肽。在其他方面，选择出作为使用目的分析物筛选的结果而表现出酶活性增加的多肽。
[0176]
一旦鉴定出表现出酶活性增加或降低的氧化酶或脱氢酶变体，可以使用本领域已知的常规技术容易地生成具有增加或降低的氧化酶或脱氢酶活性的突变和/或演变的蛋白质开关(例如，酶)。参见例如ling等人,anal.biochem.,254(2):157-78(1997)；dale等人,methods mol.biol.,57:369-74(1996)；smith,ann.rev.genet.,19:423-462(1985)；botstein等人,science,229:1193-1201(1985)；carter,"site-directed mutagenesis,"biochem.j.,237:1-7(1986)；kramer等人,cell,38:879-887(1984)；wells等人,gene,34:315-323(1985)；current opinion in chemical biology,3:284-290(1999)；christians
等人,nature biotechnology,17:259-264(1999)；crameri等人,nature,391:288-291；crameri等人,nature biotechnology,15:436-438(1997)；zhang等人,proceedings of the national academy of sciences u.s.a.,94:45-4-4509；crameri等人,nature biotechnology14:315-319(1996)；stemmer,nature,370:389-391(1994)；stemmer,proceedings of the national academy of sciences,u.s.a.,91:10747-10751(1994)；wo 95/22625；wo 97/0078；wo 97/35966；wo 98/27230；wo 00/42651；wo 01/75767和美国专利号6,537,746。为了使任何多样性最大化，可以依序使用若干种上述技术。通常，变体多核苷酸库是通过一种诱变或进化技术产生的，并且其表达产物被筛选以找到氧化酶或脱氢酶活性增加或减少的多肽。然后，将第二诱变或演变技术应用于编码最多或最少酶活性的多核苷酸以产生第二库，进而通过相同技术针对氧化酶或脱氢酶活性筛选所述第二库。可以根据需要重复多次突变和筛选的过程(包括插入点突变)，以得到编码具有所需活性、热稳定性、辅因子偏好或其他特征的蛋白质开关的多核苷酸。
[0177]
d.装置和传感器系统
[0178]
在其他方面，本公开内容涉及采用和/或含有本文所述的一种或多种(例如，多种)蛋白质开关以便检测和/或监测至少一种分析物的一种或多种传感器。如本文将更详细论述的，可以使用本领域的常规技术制备此类传感器。然后可以将此类传感器用于一种或多种传感器系统中。提供了采用这些利用本公开内容的蛋白质开关的传感器的合适的传感器配置和传感器系统的一般描述。然而，此描述应当理解为对于本文公开的方面是非限制性的，并且替代性传感器和系统被考虑为仍然在本公开内容的范围内。
[0179]
图1提供了并入包括本公开内容的一种或多种蛋白质开关的传感器的说明性感测系统的图。如图所示，感测系统100包括被配置为在本地通信路径或链路上彼此通信的传感器控制装置102和阅读器装置120(例如，信号检测装置)，所述本地通信路径或链路可以是有线的或无线的、单向的或双向的以及加密的或未加密的。阅读器装置120可以构成用于察看通过传感器/传感器104或与其相关的处理器确定的分析物浓度和警告或通知以及允许一个或多个用户输入的输出介质。阅读器装置120可以是多用途智能电话或专用电子读出仪器。虽然仅示出了一个阅读器装置120，但在某些情况下可以存在多个阅读器装置120。阅读器装置120也可以与分别经由通信路径/链路141和/或142的远程终端170和/或可信计算机系统180通信，所述通信路径/链路也可以是有线的或无线的、单向的或双向的以及加密的或未加密的。阅读器装置120也可以或可替代性地可以经由通信路径/链路151与网络150(例如，移动电话网络、互联网或云服务器)通信。网络150可以经由通信路径/链路152进一步通信地耦合至远程终端170和/或经由通信路径/链路153进一步通信地耦合至可信计算机系统180。可替代地，传感器104可以在不存在中间阅读器装置120的情况下与其他信号检测装置诸如远程终端170和/或可信计算机系统180直接通信。例如，根据一些方面，传感器104可以通过与网络150的直接通信链路与远程终端170和/或可信计算机系统180，如美国专利申请公布2011/0213225(通过引用以其全文并入本文)中所述的。任何合适的电子通信协议都可以用于通信路径或链路中的每一者，诸如近场通信(nfc)、射频识别(rfid)、或低能协议、wi-fi等。根据一些方面，远程终端170和/或可信计算机系统180可以是可由除主用户之外的对用户分析物水平感兴趣的个体访问的。阅读器装置120可以包括显示器122和任选的输入部件121。根据一些方面，显示器122
可以包括触摸屏。
[0180]
传感器控制装置102包括传感器外壳103，其可以容纳用于操作传感器104的电路和电源。任选地，可以省去电源和/或有源电路。处理器(未示出)可以通信地耦合至传感器104，其中处理器物理上位于传感器外壳103或阅读器装置120内。传感器104从传感器外壳103的下侧突出并且延伸通过粘合剂层105，根据一些方面，所述粘合剂层适于将传感器外壳103粘附至组织表面，诸如皮肤。
[0181]
传感器104适于至少部分地插入至目的组织中，诸如插入在皮肤的真皮或皮下层内。传感器104可以包括具有足够长度以便在给定组织中插入至所需深度的传感器尾部。传感器尾部可以包括至少一个工作电极和一个或多个活性区域(感测层或感测区/斑点)，所述一个或多个活性区域位于至少一个工作电极上并且对于感测一种或多种目的分析物是有效的。总起来说，一个或多个活性区域可以包括一种或多种蛋白质开关。活性区域可以包括一种或多种蛋白质开关中的至少一些与其共价键合的聚合物材料。在各个方面，分析物可以在任何目的生物流体，诸如真皮流体、间质流体、皮下流体、血液(例如静脉内或毛细血管)中进行监测。在特定方面，传感器可以适于测定真皮流体或间质流体。
[0182]
在一些方面，传感器104可以自动地将数据转送(例如，诸如通过传输信号)至阅读器装置120。例如，分析物浓度数据(例如，代表一种或多种分析物的水平的信号)可以自动和周期性地发送，诸如在获得数据时或在经过一定时间段之后以一定频率发送，并且将数据存储在存储器中直到传输(例如，每分钟、每五分钟或其他预定时间段)。在其他方面，传感器104可以以非自动方式而不是根据设定的时间表与阅读器装置120通信。例如，当将电子器件的传感器进入阅读器装置120的通信范围内时，可以使用rfid技术从传感器104发送数据。数据可以保持存储在传感器104的存储器中，直到被发送至阅读器装置120。因此，患者不必始终保持紧密接近阅读器装置120，而是可以在方便的时间上载数据。在又其他方面，可以实现自动和非自动数据传输的组合。例如，数据传输可以在自动基础上继续，直到阅读器装置120不再处于传感器104的通信范围内。
[0183]
可以暂时存在导引器以促进将传感器104引入至组织中。在一些方面，导引器可以包括针头或类似尖锐物。应当认识到，在替代性方面中可以存在其他类型的导引器，诸如鞘或刀片。更具体地，在插入组织前，针头或其他导引器可以暂时驻留在传感器104的附近，并且然后在之后撤回。存在时，针头或其他导引器可以通过打开供传感器104随行的进入通路来促进传感器104插入至组织中。例如，针头可以促进对作为通向真皮的进入通路的表皮的穿透以允许植入传感器104。在打开进入通路之后，可以撤回针头或其他导引器，使得其不表现出尖锐物危险。在其他方面，合适的针头可以是截面为实心或空心的、斜角或非斜角的和/或圆形或非圆形的。在更特定的方面，合适的针头可以在截面直径和/或尖端设计方面与针灸针头(其可以具有约250微米的截面直径)相当。然而，应当认识到，如果特定应用需要，合适的针头可以具有更大或更小的截面直径。
[0184]
在又另外的方面，针头(存在时)的尖端可以相对于(over)传感器104的末端是成角度的，使得针头首先穿透组织并且为传感器104打开进入通路。在其他说明性方面，传感器104可以驻留在针头的内腔或凹槽内，其中针头类似地为传感器104打开进入通路。在任一种情况下，在促进传感器插入之后，针头随后被撤回。
[0185]
传感器可以含有或包括在单一工作电极的活性区域上或在两个或更多个单独的
工作电极上的一种或多种(例如，多种)蛋白质开关。用于传感器的单一工作电极配置可以采用两电极或三电极检测模体(motif)。特征在于单一工作电极的传感器配置在下文参考图2a-2c描述。特征在于多个工作电极的传感器配置在其后参考图3单独描述。多种蛋白质开关可以并入下文所述的任一种传感器配置中，其中适于并入多种蛋白质开关的具体配置在下文进一步详细描述。
[0186]
当在传感器中存在单一工作电极时，三电极检测模体可以包括工作电极、对电极和参比电极。相关的两电极检测模体可以包括工作电极和第二电极，其中第二电极作为对电极和参比电极(即对/参比电极)两者起作用。在两电极和三电极检测模体两者中，可以使传感器的一个或多个活性区域与工作电极接触。一个或多个活性区域可以包括多种蛋白质开关，其中一种或多种(例如，多种)蛋白质开关存在于单一活性区域中和/或多个活性区域中。在一些方面，各个电极可以是至少部分地堆叠(层叠)在彼此上，如下文进一步详细描述的。在一些或其他方面，各个电极可以在传感器尾部上彼此横向间隔开。类似地，每个电极上的相关活性区域可以竖直堆叠在彼此的顶部上或横向间隔开。在任一种情况下，各个电极可以通过电介质材料或类似绝缘体彼此电分离。
[0187]
图2a示出了具有单一工作电极的说明性两电极传感器配置的图，所述两电极传感器配置适合在本文公开内容的一些方面中使用。如图所示，传感器200包括基板212，所述基板设置在工作电极214与对/参比电极216之间。可替代地，工作电极214和对/参比电极216可以位于基板212的相同侧上，在两者间插置有电介质材料(未示出配置)。活性区域218设置为工作电极214的至少一部分上的至少一个层。在各个方面，活性区域218可以包括被配置用于检测一种或多种目的分析物的多个斑点或单一斑点。活性区域218中(即，单一斑点或多个斑点中)可以存在有一种或多种(例如多种)蛋白质开关。
[0188]
仍参考图2a，膜220至少外包覆活性区域218并且可以任选地外包覆工作电极214和/或对/参比电极216的一些或全部，或者根据一些方面，传感器200的全部。传感器200的一个或两个面可以外包覆有膜220。膜220可以包含具有将分析物通量限制至活性区域218的能力的一种或多种聚合物膜材料。根据分析物的身份，膜220的组成可以改变，如本文进一步所述的。
[0189]
图2b和2c示出了具有单一工作电极的说明性三电极传感器配置的图。采用单一工作电极的三电极传感器配置可以类似于对于图2a中的传感器200示出的配置，不同的是在传感器201和202(图2b和2c)中包括另外的电极217。在具有另外的电极217的情况下，对/参比电极216然后可以作为对电极或参比电极起作用，并且另外的电极217履行其他未考虑的电极功能。工作电极214继续履行其原始功能。另外的电极217可以设置在工作电极214或电极216上，在两者间具有电介质材料的分离层。例如，如图2b中所描绘，电介质层219a和219b将电极214、216和217彼此分离并且提供电隔离。可替代地，电极214、216和217中的至少一个可以位于基板212的相反面上，如图2c中所示。因此，在一些方面，电极214(工作电极)和电极216(对电极)可以位于基板212的相反面上，其中电极217(参比电极)位于电极214或216之一上并且用电介质材料与其间隔开。参比材料层230(例如，ag/agcl)可以存在于电极217上，其中参比材料层230的位置不限于图2b和2c中描绘的。与图2a中所示的传感器200一样，传感器201和202中的活性区域218可以包括被配置用于检测一种或多种目的分析物的多个斑点或单一斑点。传感器201和202的活性区域218中存在有一种或多种(例如，多种蛋
白质开关)于。
[0190]
像传感器200一样，膜220也可以外包覆传感器201和202中的活性区域218，以及其他传感器部件。在一些方面，另外的电极217可以外包覆有膜220。尽管图2b和2c将电极214、216和217中的全部描绘为外包覆有膜220，但应当认识到在一些方面，仅工作电极214可以是外包覆的。此外，在电极214、216和217中的每一个处膜220的厚度可以相同或不同。如在两电极传感器配置(图2a)中的，在图2b和2c的传感器配置中，传感器201和202的一个或两个面可以外包覆有膜220，或者传感器201和202的全部可以是外包覆的。因此，图2b和2c中所示的三电极传感器配置应被理解为对于本文公开的方面是非限制性的，并且替代性电极和/或层配置仍然在本公开内容的范围内。
[0191]
现将进一步详细地描述具有多个工作电极的传感器配置。尽管以下描述主要针对具有两个工作电极的传感器配置，但应当理解，可以通过扩展本文公开内容成功并入多于两个的工作电极。另外的工作电极可以允许将另外的活性区域和相应的感测能力给予至具有此类特征的传感器。
[0192]
图3示出了具有两个工作电极、一个参比电极和一个对电极的说明性传感器配置的图，所述传感器配置适合在本文的公开的一些方面中使用。如图3中所示，传感器300包括设置在基板302的相反面上的工作电极304和306。活性区域310设置在工作电极304的表面上，并且活性区域312设置在工作电极306的表面上。总起来说，一种或多种(例如，多种)蛋白质开关可以存在于活性区域310和312中，其中每个活性区域310、312含有一种或多种(例如，对照)蛋白质开关。例如，在特定方面，包含能够结合肌钙蛋白的分析物结合结构域和响应于葡萄糖的葡萄糖氧化酶结构域的第一蛋白质开关可以存在于活性区域310中，并且包含能够结合bnp的分析物结合结构域和响应于葡萄糖的葡萄糖氧化酶结构域的第二蛋白质开关可以存在于活性区域312中。可替代地，在特定方面，包含能够结合bnp的分析物结合结构域和响应于乳酸的乳酸氧化酶结构域的第二蛋白质开关可以存在于活性区域312中。对电极320通过电介质层322与工作电极304电隔离，并且参比电极321通过电介质层323与工作电极306电隔离。外电介质层330和332分别定位在参比电极321和对电极320上。根据各个方面，膜340可以至少外包覆活性区域310和312。传感器300的其他部件也可以外包覆有膜340，并且如上，传感器300的一个或两个面或其部分可以外包覆有膜340。
[0193]
具有多个工作电极并且不同于图3中所示的替代性传感器配置的特征可以在于对/参比电极而不是单独的对电极和参比电极320、321，和/或其特征可以在于与明确地示出的那些不同的层和/或膜布置。例如，对电极320和参比电极321的定位可以与图3中描绘的定位颠倒。此外，工作电极304和306不一定需要以图3中的方式驻留在基板302的相反面上。
[0194]
特征在于具有远离其的活性区域的工作电极的传感器配置示出于图5a和5b中，并且在下面进一步论述。
[0195]
根据一些方面，电子转移剂可以存在于本文公开的任一种传感器或传感器配置的一个或多个感测区(例如，活性区域)中。合适的电子转移剂/介体化合物可以当反应物经历氧化-还原反应时促进电子向工作电极的传输。每个活性区域内电子转移剂的选择可以决定对于每一个观察到的氧化-还原电位。当存在多个活性区域时，每个活性区域内的电子转移剂可以相同或不同。
[0196]
合适的电子转移剂可以包括具有高于或低于标准甘汞电极(sce)的氧化还原电势数百毫伏的氧化-还原电位的可电还原和可电氧化离子、络合物或分子(例如，醌)。根据一些方面，合适的电子转移剂可以包括低电位锇络合物，诸如美国专利号6,134,461和6,605,200中所述的那些，将所述专利通过引用以其全文并入本文。另外的实例包括美国专利号6,736,957、7,501,053和7,754,093中所述的那些，将所述专利中的每一个的公开内容通过引用以其全文并入本文。其他合适的电子转移剂可以例如包括钌、锇、铁(例如，聚乙烯基二茂铁或铁氰化物)或钴的金属化合物或络合物，包括其茂金属化合物。电子转移介体和聚合物结合电子转移介体的合适实例可以包括美国专利号8,444,834、8,268,143和6,605,201中所述的那些，将所述专利的公开内容通过引用以其全文并入本文。金属络合物的合适配体还可以包括例如二齿或更多齿配体，诸如例如联吡啶、联咪唑、菲咯啉或吡啶基(咪唑)。其他合适的二齿配体可以包括例如氨基酸、草酸、乙酰丙酮、二氨基烷烃或o-二氨基芳烃。单齿、二齿、三齿、四齿或更多齿配体任何组合可以存在于金属络合物中以实现完全配位层。
[0197]
在还其他方面，活性区域或感测区可以也可以包括辅因子，所述辅因子能够催化与蛋白质开关的至少一个氧化酶或脱氢酶结构域部分相关的反应物的反应。在一些方面，辅因子是非蛋白有机分子，诸如吡咯喹啉醌(pqq)、黄素腺嘌呤二核苷酸(fad)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad)、黄素单核苷酸(fmn)等)。在某些方面，可以将辅因子附接至聚合物，从而使辅因子与电子转移剂交联。在某些方面，也可以使用第二辅因子。
[0198]
在其他方面，聚合物可以存在于本文公开的任一种传感器或传感器配置的每个活性区域中。用于包含在活性区域中的合适聚合物可以包括但不限于聚乙烯吡啶(例如，聚(4-乙烯基吡啶))、聚乙烯基咪唑(例如，聚(1-乙烯基咪唑))或其任何共聚物。可以适于包含在活性区域中的说明性共聚物包括含有例如单体单元诸如苯乙烯、丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺或丙烯腈的那些。当存在多个活性区域时，每个活性区域内的聚合物可以相同或不同。
[0199]
在一些方面，电子转移剂可以共价键合至每个活性区域中的聚合物。共价键合的方式不被视为受特别限制的。电子转移剂与聚合物的共价键合可以通过使携带共价结合的电子转移剂的聚合单体单元聚合来发生，或者可以在已经合成聚合物之后使电子转移剂与聚合物单独反应。在其他方面，双官能间隔基可以将电子转移剂共价键合至活性区域内的聚合物，其中第一官能团与聚合物是反应性的(例如，能够使吡啶氮原子或咪唑氮原子四元化的官能团)并且第二官能团与电子转移剂是反应性的(例如，与配体配位金属离子具有反应性的官能团)。
[0200]
类似地，在又其他方面，具有一个或多个活性区域的蛋白质开关可以共价键合至聚合物。当多种蛋白质开关存在于单一活性区域中时，多种蛋白质开关中的全部在一些方面可以共价键合至聚合物，并且在其他方面，可以仅多种蛋白质开关的一部分共价键合至聚合物。例如，第一蛋白质开关可以共价键合至聚合物，而第二蛋白质开关可以与聚合物非共价缔合。根据更具体方面，蛋白质开关与聚合物的共价键合可以经由通过合适的交联剂引入的交联物来发生。适于与蛋白质开关中的游离氨基反应的交联剂可以包括诸如例如聚乙二醇二缩水甘油醚(pegdge)或其他聚环氧化物、氰尿酰氯、n-羟基琥珀酰亚胺、酰亚胺酯、表氯醇或其衍生化变体的交联剂。适于与蛋白质开关中的游离羧酸基团反应的合适交联剂可以包括例如碳二亚胺。交联通常是分子间的，但在一些方面可以是分子内的。
[0201]
电子转移剂和/或一种或多种(例如，多种)蛋白质开关也可以通过除共价键之外
的手段与活性区域中的聚合物缔合。在一些方面，电子转移剂和/或一种或多种(例如，多种)蛋白质开关可以与聚合物离子或配位缔合。例如，带电荷的聚合物可以与带相反电荷的电子转移剂或蛋白质开关离子缔合。在还其他方面，电子转移剂和/或蛋白质开关可以物理夹带在聚合物内而未与其键合。
[0202]
如先前所提及的，适于布置传感器中的多种蛋白质开关的各种配置考虑在本公开内容内。多种蛋白质开关可以设置在传感器的一个或多个活性区域内。活性区域的大小范围可以为约0.01mm2至约1mm2，但本文也考虑了更大或更小的活性区域。
[0203]
在其他方面，含有多种蛋白质开关(无论独立还是协同操作)的传感器可以在适当的稳定剂的存在下以增强稳定性起作用。可以使用的稳定剂包括例如过氧化氢酶或白蛋白(例如，牛血清白蛋白或人血清白蛋白)。
[0204]
在还又其他方面，多种蛋白质开关可以布置在单一工作电极上的单独活性区域内。当多种蛋白质开关以此方式布置时，每个活性区域可以促进单独(例如两种或更多种不同的)分析物的检测，如下文所述。至少一个活性区域可以独立于其他活性区域产生信号。
[0205]
根据一些方面，在单一工作电极上具有多个活性区域的传感器可以包括：传感器尾部，所述传感器尾部包括至少一个工作电极、和设置在工作电极的表面上的至少两个活性区域。每个活性区域包含蛋白质开关和聚合物，其中每个活性区域中的蛋白质开关是不同的。每个活性区域具有氧化-还原电位，并且第一活性区域的氧化-还原电位足以与第二活性区域的氧化-还原电位分离以允许独立于来自第二活性区域的信号来产生来自第一活性区域的信号。在更具体方面，此类传感器可以包括具有至少两个活性区域的单一工作电极。电子转移剂可以掺入在每个活性区域内以促进电子转移。
[0206]
替代性传感器配置可以包括含有第一蛋白质开关和第二蛋白质开关以及电子转移剂的单一活性区域。每种蛋白质开关可以共价键合至单一活性区域中聚合物的单独部分。在用于促进每种分析物的电子转移的感测化学在单一活性区域中未过度稀释的前提下，单一活性区域可以以类似于与下文针对单独活性区域描述的方式促进分析物检测。当待使用第一和第二蛋白质开关测定的分析物具有可比的膜渗透性值时，此类传感器配置可以是特别可行的。
[0207]
在更具体方面，传感器尾部可以被配置用于插入至组织中。合适的组织不被视为受特别限制的，并且在上文更详细地提出。同样，上文提出了用于将传感器尾部布局在组织内的特定位置处的考虑。
[0208]
在其他方面，与第一活性区域相关的氧化-还原电位可以通过与第二活性区域的氧化-还原电位分离至少约100mv或至少约150mv或至少约200mv。氧化-还原电位之间的分离的上限由体内电化学窗口决定。通过使活性区域的氧化-还原电位在幅度上彼此分离，电化学反应可以在第一活性区域内发生而在第二活性区域内基本上不诱导电化学反应。因此，来自第一活性区域的信号可以在处于或高于其相应的氧化-还原电位时独立地产生。相比之下，在处于或高于第二活性区域的氧化-还原电位时，电化学反应可以在两个活性区域内发生。因此，在处于或高于第二活性区域的氧化-还原电位时所产生的信号可以包括来自第一活性区域和第二活性区域两者的信号贡献，并且信号是复合信号。然后可以通过以下方式来确定在处于或高于其氧化-还原电位时来自第二活性区域的信号贡献：从复合信号中减去在处于或高于第一活性区域的相应氧化-还原电位时仅从第一活性区域获得的信
号。类似的考虑适用于分析来自含有在不同氧化-还原电位下产生信号的两种蛋白质开关的单一活性区域的信号贡献。
[0209]
在更具体方面，当活性区域位于相同的工作电极上时，第一和第二活性区域可以含有不同的电子转移剂，以便提供在幅度上足够分离的氧化-还原电位。更具体地，第一活性区域可以包含第一电子转移剂，并且第二活性区域可以包含第二电子转移剂，其中第一和第二电子转移剂是不同的。根据本公开内容的各个方面，给定电子转移剂中存在的金属中心和/或配体可以变化以提供第一和第二活性区域的氧化-还原电位的足够分离。根据还更具体方面，第一电子转移剂可以共价键合至第一活性区域中的聚合物，并且第二电子转移剂可以共价键合至第二活性区域中的聚合物。用于第一电子转移剂和第二电子转移剂的共价键合的方式可以相同或不同。类似的考虑适用于选择适于根据上文公开与包含在单一活性区域内的第一蛋白质开关和第二蛋白质开关结合使用的电子转移剂。
[0210]
在本公开内容的更具体方面，每个活性区域中的蛋白质开关可以共价键合(或以其他方式固定)至每个活性区域内的聚合物。在还更具体方面，每个活性区域中的蛋白质开关和电子转移剂可以共价键合至每个活性区域内的聚合物。当包含在单一活性区域中时，第一蛋白质开关和第一电子转移剂可以共价键合至聚合物的第一部分，并且第二蛋白质开关和第二电子转移剂可以共价键合至聚合物的第二部分。第一部分和第二部分中的聚合物可以相同或不同。
[0211]
在一些方面，位于单一工作电极上的第一和第二活性区域可以被配置为在给定电位下操作传感器时快速达到稳态电流。可以通过选择针对每个活性区域的电子转移剂来促进稳态电流的快速达到，所述电子转移剂在暴露于处于或高于所述活性区域的氧化-还原电位的电位时迅速改变其氧化态。使活性区域尽可能薄也可以促进稳态电流的快速达到。例如，第一和第二活性区域的合适厚度的范围可以为约0.1微米至约10微米。在一些或其他方面，将导电材料诸如例如碳纳米管、石墨烯或金属纳米颗粒组合在一个或多个活性区域内可以促进稳态电流的快速达到。导电颗粒的合适量的范围可以为活性区域的约0.1重量％至约50重量％、或约1重量％至约50重量％、或约0.1重量％至约10重量％或约1重量％至约10重量％。也可以采用稳定剂来促进响应稳定性。
[0212]
也应当理解，传感器对每种分析物的灵敏度(输出电流)可以通过改变活性区域的覆盖度(面积或大小)、活性区域相对于彼此的面积比、外包覆活性区域的传质限制膜的特性和厚度及其任何组合来改变。这些参数的改变可以由本领域的普通技术人员容易地进行。
[0213]
尽管前述描述主要针对被配置用于检测两种不同的分析物的传感器，但应当理解以上概念可以扩展用于使用位于单一工作电极上的相应数目的活性区域检测多于两种分析物。具体地，在本公开内容的另外方面，其中采用多于两个活性区域和相应数目的蛋白质开关(和电子转移剂)的传感器可以用于检测类似数目的不同分析物。在每个活性区域的氧化-还原电位与其他活性区域的氧化-还原电位足够分离的前提下，可以以与上文所述的方式相关的方式分析来自每个活性区域的信号贡献以提供每种分析物的浓度。
[0214]
例如，除了上文更详细论述的合适的电子转移剂，第一活性区域可以包含含有能够结合肌钙蛋白的分析物结合结构域和响应于葡萄糖的葡萄糖氧化酶结构域的第一蛋白质开关，并且第二活性区域可以包含含有能够结合bnp的分析物结合结构域和响应于乳酸
的乳酸氧化酶结构域的第二蛋白质开关。例如，适于检测肌钙蛋白和bnp的传感器可以包括工作电极，所述工作电极具有设置于其上的第一活性区域和第二活性区域，以及外包覆工作电极上的第一和第二活性区域的传质限制膜，其中第二活性区域包含聚合物以及共价键合至聚合物的能够结合bnp的分析物结合结构域和响应于乳酸的乳酸氧化酶结构域，并且第一活性区域包含共价键合至聚合物的能够结合肌钙蛋白的分析物结合结构域和响应于葡萄糖的葡萄糖氧化酶结构域。可替代地，乳酸氧化酶结构域可以被响应于葡萄糖的葡萄糖氧化酶结构域取代。彼此不同的第一和第二电子转移剂可以存在于每个活性区域中。在更具体方面，传质限制膜可以包含至少一种交联的聚乙烯基吡啶均聚物或共聚物。传质限制膜的组成可以相同或不同，其中传质限制膜外包覆每个活性区域。在特定方面，外包覆第一活性区域的传质限制膜可以是单组分的(含有单一膜聚合物)并且外包覆第二活性区域的传质限制膜可以是多组分的(含有两种或更多种不同的膜聚合物，其中一种是聚乙烯基吡啶均聚物或共聚物)，作为双层或均质混合物。
[0215]
类似地，还应当理解，具有位于给定工作电极上的两个或更多个活性区域的一些传感器可以在至少一个活性区域中包含两种或更多种蛋白质开关。根据更具体方面，给定活性区域中的两种或更多种蛋白质开关可以协同相互作用以生成与单一分析物的浓度成比例的信号。因此，在分析物的给定选择下，蛋白质开关不需要以1:1比率存在。在本文中进一步详细描述了含有协同相互作用的蛋白质开关的传感器。
[0216]
因此，本文还描述了采用特征在于布置在单一工作电极上的多种蛋白质开关的传感器的多分析物检测方法。在各个方面，此类方法可以包括：使传感器暴露于包含至少一种分析物的流体。传感器包括传感器尾部，所述传感器尾部包括至少一个工作电极、特别是单一工作电极，和设置在工作电极的表面上的至少两个活性区域。每个活性区域包含蛋白质开关和聚合物，并且每个活性区域中的蛋白质开关是不同的。每个活性区域具有氧化-还原电位，并且第一活性区域的氧化-还原电位与第二活性区域的氧化-还原电位足够分离以允许来自第一活性区域的信号的产生独立于来自第二活性区域的信号的产生。所述方法另外包括：在处于或高于第一活性区域的氧化-还原电位时获得第一信号，使得第一信号与第一分析物的浓度成比例；在处于或高于第二活性区域的氧化-还原电位时获得第二信号，使得第二信号是包含来自第一活性区域的信号贡献和来自第二活性区域的信号贡献的复合信号；以及从第二信号中减去第一信号以获得差值信号，所述差值信号与第二分析物的浓度成比例。
[0217]
在更具体方面，与第一活性区域相关的氧化-还原电位可以与第二活性区域的氧化-还原电位分离至少约100mv，或至少约150mv，或至少约200mv，以便提供足够的分离来独立产生来自第一活性区域的信号。
[0218]
在一些或其他更具体方面，流体是生物流体并且使传感器暴露于个体内的体内生物流体。适合用具有位于给定工作电极上的至少两个不同的活性区域的传感器分析的生物流体可以包括本文先前论述的任一种生物流体。
[0219]
在一些方面，可以通过査询每种分析物的查找表或校准曲线来将与每个活性区域相关的信号与相应分析物浓度相关联。每种分析物的查找表可以通过测定具有已知分析物浓度的多个样品并且记录每种分析物的每个浓度下的传感器响应来填充。类似地，每种分析物的校准曲线可以通过将每种分析物的传感器响应绘制为浓度的函数来确定。根据一些
方面，本公开内容的传感器的校准曲线可以是线性的。
[0220]
处理器可以确定查找表中的哪个传感器响应值最接近具有未知分析物浓度的样品测量的值，然后相应地报告分析物浓度。在一些或其他方面，如果具有未知分析物浓度的样品的传感器响应值在查找表中的记录值之间，则处理器可以在两个查找表值之间插值以估计分析物浓度。插值可以假设查找表中报告的两个值之间存在线性浓度变化。当传感器响应与查找表中的给定值相差足够量时，诸如约10％或更大的变化，可以采用插值。
[0221]
同样，根据一些或其他各种方面，处理器可以将具有未知分析物浓度的样品的传感器响应值输入至相应的校准曲线中。然后传感器可以相应地报告分析物浓度。
[0222]
具有设置在给定工作电极上的两个不同的活性区域的传感器的方面可以采用与图2a-2c中描绘的和上文所述的那些相关的传感器配置。然而，应当理解，合适的传感器的特征也可以在于多个工作电极，诸如图3中所示的传感器配置，其中至少一个工作电极具有彼此不同的至少两个活性区域。还应当理解，具有设置在给定工作电极的表面上的两个或更多个不同的活性区域的其他传感器配置也属于本公开内容的范围内。例如，工作电极和对和/或参比电极的位置、取向或功能性可以不同于本文图中所示的位置、取向或功能性。
[0223]
图4示出了适合在本文公开内容的一些方面中使用的说明性传感器配置，其中在单一工作电极的表面上设置有两个不同的活性区域。图4的传感器配置与图2c的传感器配置具有最大相似性。在适当的情况下，为了清楚起见，来自图2c的共同参考字符用于图4中，并且为了简洁起见，具有共同结构和/或功能的特征不再次进一步详细描述。同样，应当理解，其他传感器配置可以类似地并入下文针对图4所述的特征。
[0224]
参考图4，传感器400包括在工作电极214的表面上的活性区域218a和218b。活性区域218a包含第一电子转移剂和可以共价键合至构成活性区域218a的聚合物的第一蛋白质开关。活性区域218b类似地包含第二电子转移剂和可以共价键合至构成活性区域218b的聚合物的第二蛋白质开关。第一电子转移剂和第二电子转移剂可以在组成上不同，以便提供第一活性区域218a和第二活性区域218b的氧化-还原电位的分离。在特定方面，活性区域218b可以包含能够结合bnp的分析物结合结构域和响应于乳酸的乳酸氧化酶结构域，并且活性区域218a包含能够结合肌钙蛋白分析物结合结构域和响应于葡萄糖的葡萄糖氧化酶结构域。可替代地，乳酸氧化酶结构域可以被响应于葡萄糖的葡萄糖氧化酶结构域取代。
[0225]
第一活性区域218a和第二活性区域218b的氧化-还原电位可以彼此足够分离以允许来自第一活性区域218a的信号的产生独立于来自第二活性区域218b的信号产生。因此，传感器400可以以在第一活性区域218a内发生氧化-还原反应而在第二活性区域218b内不发生氧化-还原反应的第一电位下操作。因此，在处于或高于第一活性区域218a的氧化-还原电位时可以选择性地检测第一分析物(例如，肌钙蛋白)，前提是施加的电位未高至足以促进关于第二活性区域218b的氧化-还原反应。第一分析物的浓度可以通过参考查找表或校准曲线来从第一活性区域218a的传感器响应确定。
[0226]
在处于或高于第二活性区域218b的氧化-还原电位时，可以在第一活性区域218a和第二活性区域218b两者内同时或接近同时发生分离的氧化-还原反应。因此，在处于或高于第二活性区域218b的氧化-还原电位时产生的信号可以包括具有来自第一活性区域218a和第二活性区域218b两者的信号贡献的复合信号。为了从复合信号确定第二分析物(例如，bnp)的浓度，可以从复合信号中减去在处于或高于其相应氧化-还原电位时来自第一活性
区域218a的信号以提供与单独的第二活性区域218b相关联的差值信号。一旦已经确定差值信号，第二分析物的浓度可以通过参考查找表或校准曲线来确定。
[0227]
如先前所提及的，类似的考虑也适用于分离来自含有两种不同的蛋白质开关的单一活性区域的第一信号或第二信号，以便确定彼此不同的第一和第二分析物的浓度。
[0228]
如本文先前论述的，图2a-图4中所示的传感器配置全部都特征在于一个或多个工作电极，所述一个或多个工作电极具有直接设置在每个工作电极的表面上的一个或多个活性区域。相比之下，图5a和5b示出了工作电极的图，其中第一活性区域直接设置在工作电极的表面上并且第二活性区域通过膜与工作电极分离(间隔开或远离)。图5a和5b中描绘的工作电极配置可以取代图2a-图4中描绘的任一种特定工作电极配置。即，图5a和5b中描绘的工作电极配置可以与传感器中的对电极和/或参比电极、膜、基板和类似结构以任何合适方式组合。
[0229]
如图5a中所示，工作电极400具有直接设置在其表面上的活性区域402。活性区域402包含共价结合至第一聚合物的第一蛋白质开关。典型地，电子转移剂也存在于活性区域402中，其中电子转移剂也共价结合至聚合物。活性区域402外包覆有膜404。如描绘的，膜404也可以外包覆工作电极400的表面，以及工作电极400存在于其中的传感器的其他部分。膜404将活性区域406与工作电极400隔离，使得阻止两者间的电子交换。活性区域406包含共价结合至第二聚合物的第二蛋白质开关。典型地，电子转移剂也存在于活性区域406中，其中电子转移剂也共价结合至第二聚合物。尽管图5a示出了直接设置在活性区域402上的活性区域406，但应当理解，它们可以在也与本公开内容兼容的替代性配置中彼此横向间隔开。膜408外包覆活性区域406和任选的其他传感器部件，以提供质量传递限制特性。类似地，如图5b中所示，膜404在工作电极400上不一定延伸与膜408相同的横向距离。实际上，图5b中的膜404外包覆活性区域402，但仅外包覆工作电极400的表面的一部分，其中膜408外包覆活性区域406、膜404的表面和工作电极400的表面的未被膜404外包覆的剩余部分。在一些方面，活性区域402和406也可以彼此横向偏移。
[0230]
膜408对于分析物和促进活性区域406中的酶促反应所需的任何另外组分是可透过的。相比之下，膜404对于活性区域406中形成的产物是可透过的。即，分析物在活性区域406中反应以形成第一产物，所述第一产物然后扩散透过膜404并且随后在活性区域402中进一步反应以形成第二产物。第二产物随后基于与工作电极400的电子交换是可检测的。
[0231]
根据一些方面，第一膜聚合物和第二膜聚合物可以彼此不同。根据一些方面，第一膜聚合物可以是交联的聚乙烯基吡啶。在本公开内容的方面，交联的聚乙烯基吡啶对于乙醛是可容易地透过的。第二膜聚合物可以是交联的聚乙烯基吡啶-共-苯乙烯聚合物，其中吡啶氮原子的一部分被非交联的聚(乙二醇)尾部官能化并且吡啶氮原子的一部分被烷基磺酸基团官能化。此类第二膜聚合物对于葡萄糖和乙醇两者是可容易地透过的。
[0232]
在还又其他方面，多种蛋白质开关可以布置在单独工作电极的活性区域内。正因如此，与在每个活性区域内发生的酶促反应相关的信号可以通过同时或在不同的时间询问每个工作电极来单独测量。然后可以将与每个活性区域相关的信号与单独分析物的浓度相关联。
[0233]
如本文先前论述，膜(即，传质限制膜)可以外包覆传感器中的一个或多个活性区域以便增加生物相容性和改变至活性区域的分析物通量。此类膜可以存在于本文公开的任
一种传感器中。因为不同的分析物在给定膜中可以表现出改变的渗透性值，所以被配置为分析多种分析物的传感器对于每种分析物可以表现出相异灵敏度。用于解决不同灵敏度值的一种方法可以涉及在每个活性区域上利用不同膜厚度。尽管可行，但该方法可能难以从制造角度实行。即，它可能难以使用用于膜沉积的典型浸涂技术来改变不同位置处的膜厚度。其他可能的方法是对于每种分析物使用具有不同大小的活性区域。
[0234]
在一些方面，特征在于布置在单独工作电极上的两种或更多种蛋白质开关的传感器可以包括：传感器尾部，所述传感器尾部至少包括第一工作电极和第二工作电极、位于第一工作电极的表面上的第一活性区域、位于第二工作电极的表面上的第二活性区域、外包覆第一活性区域的多组分膜以及外包覆第二活性区域的均质膜。第一活性区域包含第一聚合物和与第一分析物反应的第一蛋白质开关，并且第二蛋白质开关包含第二聚合物和与第二分析物反应的蛋白质开关。第一蛋白质开关和第二蛋白质开关是不同的并且与不同的分析物具有反应性。多组分膜至少包含彼此不同的第一膜聚合物和第二膜聚合物。均质膜包含第一膜聚合物和第二膜聚合物之一。
[0235]
上文所述的多组分膜的特定配置在一些方面可以包括双层膜或在其他方面可以包括膜聚合物的掺和物。令人惊讶地，双层膜和掺和膜可以用于均化分析物渗透性，如下文进一步论述的。
[0236]
具有位于单独工作电极上的两个不同的活性区域的本公开内容传感器可以采用与上文在图3中所述的传感器配置或其变型类似的传感器配置。例如，在一些方面，对/参比电极可以置换具有两个或更多个工作电极的传感器中的单独对和参比电极。类似地，具有位于单独工作电极上的两个不同的活性区域的传感器内的层配置和布置可以不同于图3中描绘的。
[0237]
例如，在一些方面，具有多个工作电极的传感器可以包括活性区域，其中电子转移剂共价键合至每个活性区域中的聚合物。在一些或其他方面，此类传感器的特征可以在于共价键合至第一活性区域中的聚合物的第一蛋白质开关和共价键合至第二活性区域中的聚合物的第二蛋白质开关。同样，在特定方面，第一蛋白质开关可以包括含有能够结合肌钙蛋白的分析物结合结构域和响应于葡萄糖的葡萄糖氧化酶结构域的第一蛋白质开关，并且第二蛋白质开关可以包括含有能够结合bnp的分析物结合结构域和响应于乳酸的乳酸氧化酶结构域的第二蛋白质开关。可替代地，乳酸氧化酶结构域可以被响应于葡萄糖的葡萄糖氧化酶结构域取代。
[0238]
在还又另外的方面，具有多个工作电极的传感器可以包括被配置用于插入至组织中的传感器尾部。
[0239]
在一些方面，双层膜可以外包覆工作电极之一上的第一活性区域。双层膜包含在活性区域上方层叠在彼此上的第一膜聚合物和第二膜聚合物。在更具体方面，第一膜聚合物可以直接设置在第一工作电极的活性区域上，并且第二膜聚合物可以设置在第一膜聚合物上以限定双层膜。在此类方面，第二膜聚合物存在于位于第二工作电极上均质膜中。在一些方面，此类双层配置可以通过以下方式制备：将第一膜聚合物仅涂覆在第一工作电极上(例如，通过喷涂、涂漆、喷墨印刷、辊涂等)，然后将第二膜聚合物同时涂覆在两个工作电极上(例如，通过浸涂或类似技术)。在其他方面，双层膜可以如上配置，其中第一膜聚合物位于第二工作电极上。
[0240]
图6示出了传感器的一部分的说明性示意图，所述传感器具有两个工作电极并且特征在于外包覆两个工作电极之一的双层膜，适合用于在本文公开内容的一些方面中使用。如图6中所示，传感器特征在于具有设置在基板612的相反面上的工作电极614a和614b的传感器尾部600。活性区域618a设置在工作电极614a上，并且活性区域618b设置在工作电极614b上。根据本文公开内容，活性区域618a和618b含有不同的蛋白质开关，并且被配置为测定不同的分析物。尽管图6已经示出了相对于基板612大体上彼此相对设置的活性区域618a和618b，但应当理解，活性区域618a和618b可以在基板612的相反面上彼此横向间隔开(偏移)。活性区域618a和618b的横向间隔开的配置对于用传质限制膜外包覆每个活性区域618a和618b可能特别有利，如下文所论述。
[0241]
如图6中进一步示出的，活性区域618a外包覆有膜层620。膜层620是包含单一膜聚合物的均质膜。活性区域618b外包覆有双层膜621，所述双层膜包括与活性区域618b直接接触的膜层621a和覆盖膜层621a的膜层621b。膜层621a和621b包含不同的膜聚合物。如上所述，在特定方面，膜层620和膜层621b可以包含相同膜聚合物。
[0242]
根据一个或多个方面，具有在单独工作电极上的多个活性区域的传感器(其中一个活性区域外包覆有双层膜)可以展示均化或独立可变的分析物渗透性。即，与在不存在双层膜时相比，传感器可以对于两种不同的分析物具有彼此更接近的灵敏度。在此类传感器配置中，外包覆有均质膜(例如，图6中的膜层620)的活性区域可以对于第一分析物表现出其特定膜聚合物特征性的分析物渗透性。令人惊讶地，双层膜(例如，图6中的双层膜621)可以含有不负面影响第二分析物的渗透性的膜聚合物(即，具有中性渗透性影响的膜聚合物)，从而允许构成双层膜的其他膜聚合物好像不存在第一膜聚合物那样表现出其对第二分析物的特征性渗透性。因此，根据各个方面，具有中性渗透性影响的膜聚合物和构成均质膜的膜聚合物可以被视为相同聚合物。
[0243]
在一些或其他具体方面，具有中性渗透性影响的膜聚合物可以包括双层膜的内层。因此，根据此类方面，双层膜的内层和均质膜可以被视为相同膜聚合物。在其他具体方面，双层膜的外层和均质膜可以被视为相同膜聚合物。
[0244]
在还又其他方面，多组分膜可以包含第一膜聚合物和第二膜聚合物的掺和物(均质共混物)。此类传感器配置在外观上可以类似于图6中所示的，不同的是用包含呈均质共混物的两种不同的膜聚合物的混合膜替换双层膜621。与包括设置在活性区域之一上的双层膜的传感器一样，包含混合膜的第一膜聚合物或第二膜聚合物之一的均质膜可以外包覆第二工作电极上的其他活性区域。
[0245]
与双层膜类似，含有中性影响第二分析物的渗透性的膜聚合物的混合膜可以允许混合膜对于第二分析物表现出主要为混合物中另一种膜聚合物特征性的渗透性。因此，根据本公开内容的各个方面，可以将均质膜的膜聚合物和混合膜的膜聚合物之一选择为使得第二分析物通过混合膜的渗透性基本上未被膜聚合物改变。在特定方面，第一活性区域可以包含含有能够结合肌钙蛋白的分析物结合结构域和响应于葡萄糖的葡萄糖氧化酶结构域的第一蛋白质开关，并且第二活性区域可以包含含有能够结合bnp的分析物结合结构域和响应于乳酸的乳酸氧化酶结构域的第二蛋白质开关。因此，根据此类方面，含有第一蛋白质开关的第一活性区域可以外包覆有混合膜，并且含有第二蛋白质开关的第二活性区域可以外包覆有均质(单组分膜聚合物)膜。在又其他方面，第二活性区域可以包含聚合物、白蛋
白和共价键合聚合物的第二蛋白质开关。在又还更具体方面，外包覆第二活性区域的均质膜可以至少包含交联的聚乙烯基吡啶均聚物或共聚物，并且外包覆第一活性区域的混合膜也可以包含聚乙烯基吡啶均聚物或共聚物。
[0246]
如上所提及的，双层膜和混合膜可以均化本文所述的传感器中的分析物渗透性，其中两个或更多个活性区域彼此空间上分离并且可以外包覆有不同的传质限制膜。具体地，双层膜和混合膜可以均化具有单独工作电极并且包括具有不同蛋白质开关的两个或更多个活性区域(其中至少一个活性区域位于每个工作电极处)的传感器中的分析物渗透性。因此，此类膜可以有利地允许传感器灵敏度对于每种分析物独立地改变。膜厚度和/或第一膜聚合物与第二膜聚合物的相对比例代表可以经改变以调整每个工作电极处分析物的特征性渗透性的其他参数。
[0247]
因此，用于使用含有两个工作电极的传感器的方法可以包括使传感器暴露于包含至少一种分析物的流体。传感器包括传感器尾部，所述传感器尾部至少包括第一工作电极和第二工作电极。第一活性区域设置在第一工作电极的表面上，并且第二活性区域设置在第二工作电极的表面上。第一活性区域包含第一聚合物和与第一分析物反应的第一蛋白质开关，并且第二活性区域包含第二聚合物和与第二分析物反应的蛋白质开关。第一蛋白质开关和第二蛋白质开关是不同的。多组分膜外包覆第一活性区域，并且均质膜外包覆第二活性区域。多组分膜至少包含彼此不同的第一膜聚合物和第二膜聚合物，并且均质膜包含第一膜聚合物或第二膜聚合物之一。所述方法进一步包括在处于或高于第一活性区域的氧化-还原电位时获得第一信号，在处于或高于第二活性区域的氧化-还原电位时获得第二信号，并且将第一信号与流体中第一分析物的浓度相关联，并且将第二信号与流体中第二分析物的浓度相关联。第一信号与流体中第一分析物的浓度成比例，并且第二信号与流体中第二分析物的浓度成比例。
[0248]
在其他方面，第一信号和第二信号可以在不同时间测量。因此，在此类方面，可以向第一工作电极和第二工作电极交替地施加电位。在其他方面，第一信号和第二信号可以经由第一通道和第二通道同时测量，在这种情况下，可以同时向两个电极施加电位。
[0249]
在一些方面，传感器系统还可以含有反应物储存装置，其可以充当保持用于蛋白质开关的酶部分的反应物的储存器，其中反应物不是从含分析物样品获得的。反应物的实例是葡萄糖、乳酸等。反应物储存装置可以在延长的时间段内释放反应物。储存装置可以能够在至少1、2、3、4、5、10、15、20、30、40或50分钟、或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12小时、或1、2、3、4、5、6或7天、或2、3或4周、或2、3、4、5或6个月内将反应物递送至蛋白质开关。酶储存装置可以包括用于从酶储存装置中延长递送反应物的机械装置或渗透装置。酶储存装置可以包括用于从酶储存装置中延长递送反应物的机械装置或渗透装置。酶储存装置也可以具有用于提供反应物的延长释放的以上组合。也可以使用其他方法和技术来进行反应物的延长释放。
[0250]
储存装置可以具有反应物通过其释放的孔或洞。反应物可以通过其释放至蛋白质开关的孔或洞可以是很小的，并且反应物从储存装置中的递送可以在延长的时间段内发生。此类孔或洞可以通过蚀刻、激光加工、机械加工、钻孔和/或常规工艺制得。
[0251]
在储存装置的孔或洞上方可以放置膜或涂层以延长反应物从储存装置中的递送时间。储存装置可以由多孔材料构成或者储存装置的一部分可以由多孔材料构成，并且多
孔材料可以涂覆有延迟反应物从储存装置中的释放的聚合物涂层和/或膜，从而延迟反应物的释放时间。涂层可以由聚合物分散体诸如聚氨酯分散体(bayhdrol
tm
等)、丙烯酸胶乳分散体和制成。
[0252]
反应物储存装置可以通过渗透递送系统提供反应物的递送。可以使用的“标准渗透递送系统”是初级渗透泵(eop)系统。eop是熟知的。该系统可用于递送反应物，并且尤其适合给出“不稳定”释放曲线或提供不完全的释放曲线的反应物。参见例如，felix theeuwes,elementary osmotic pump,journal of pharmaceutical sciences,第64卷,第12期,第1987-1991页,1975年12月。反应物储存装置可以包括适于诱导渗透性的水溶性化合物，即渗透剂(osmotic agent)或渗透剂(osmogent)，包括在药典诸如united states pharmacopia中以及在remington:the science and practice of pharmacy；第19版；mack publishing company,easton,pa.(1995)中提及的药学上可接受和药理学上惰性的水溶性化合物。渗透剂可以选自无机或有机酸的药学上可接受的水溶性盐或具有高水溶性的非离子有机化合物，例如碳水化合物(诸如糖)或氨基酸。渗透剂还可以包括无机盐，诸如氯化镁或硫酸镁，氯化锂、氯化钠或氯化钾，磷酸氢锂、磷酸氢钠或磷酸氢钾，磷酸二氢锂、磷酸二氢钠或磷酸二氢钾；有机酸的盐，诸如乙酸钠或乙酸钾，琥珀酸镁，苯甲酸钠，柠檬酸钠或抗坏血酸钠；碳水化合物，诸如甘露醇、山梨糖醇、阿拉伯糖、核糖、木糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、棉子糖；水溶性氨基酸，诸如甘氨酸、亮氨酸、丙氨酸或甲硫氨酸；尿素等；及其混合物。可以使用的渗透剂的量取决于所使用的特定渗透剂，并且范围可以为反应物混合物的约1重量％至约60重量％。渗透递送系统还可以包括聚合物，诸如上文描述为药物洗脱聚合物的那些。渗透递送系统还可以包括充当酶与反应物之间的半透性屏障的涂层和/或膜。其他合适的膜和/或涂层是已知的并且可以使用。
[0253]
反应物储存装置可以包括用于将反应物递送至蛋白质开关的微流体系统或者可以是其一部分。用于基于延长的时间将反应物递送至酶的微流体系统在本领域中对于普通技术人员是熟知的。参见例如，美国专利号9,194,859和8,460,607；madou,fundamentals of microfabrication:the science of miniaturization,第二版(hardcover),crc出版,2002；nguyen等人,fundamentals and applications of microfluidics,artech house publishers,(2002)中公开的微流体。
[0254]
e.使用含蛋白质开关的装置和传感器系统的方法
[0255]
包含一种或多种蛋白质开关的装置可以检测、鉴定和/或监测下文第b部分中所述的任一种分析物。例如，包含蛋白质开关的装置可以用于监测有不良心脏事件风险的患者。例如，所述装置可以检测心肌肌钙蛋白，并且所述装置可以用于监测有心肌梗塞风险的患者。所述装置还可以用于监测在手术或其他治疗之后的心脏患者以监测心脏功能并且提供潜在不良心脏事件的早期警告。
[0256]
在一些方面，包含蛋白质开关的装置可以用于监测受试者对感染原的暴露。例如，所述装置可以用于监测在急性暴露于感染原之后的患者和/或跟踪感染的进展。在其他方面，所述装置可以用于监测受试者对施用至受试者以治疗感染性疾病的抗感染药物和/或程序的应答。在又另外的方面，所述装置还可以用于个人化治疗，使得受试者接受足够的治疗来治疗其败血症或感染。
[0257]
在还又另外的方面，所述装置还可以用于监测正在用一种或多种药物治疗的受试
者中的药物治疗。在又其他方面，包含蛋白质开关的装置可以用于检测一种或多种药物和/或药物代谢物的存在。
[0258]
含蛋白质开关的装置可以用于自动检测分析物。所述装置可以检测体液中分析物量或水平的改变。所述装置可以检测体液中分析物的改变速率。所述装置可以检测分析物达到阈值水平或量的时间。另外，所述装置可以自动监测受试者的体液中的多种分析物。
[0259]
本文公开内容将根据以下实验细节更好地理解。然而，本领域技术人员将容易地理解，所论述的具体方法和结果仅仅是说明性的，如在随后的权利要求中更充分描述。除非另外指明，否则本公开内容不限于具体程序、材料等，因此可以改变。还应当理解，本文所用的术语是仅仅出于描述具体方面的目的，并且不旨在是限制性的。
[0260]
实施例
[0261]
实施例1-蛋白质开关的产生和鉴定
[0262]
制备了包含使用gdh-105(codexis,redwood,ca)作为骨架开发的gdh多肽的葡萄糖脱氢酶(gdh)变体库。制备了大约2800种gdh变体。针对下表4中列出的分析物中的一种或多种筛选变体的葡萄糖活性。使用设置在uv340或uv 360下的分光光度计通过nadh动力学测定以不同时间间隔或通过使用rapidfire质谱仪对葡糖酸的终点测量来确定葡萄糖活性。
[0263]
表4：反应混合物和分析物的量
[0264]
表4
[0265][0266]
表5示出了被鉴定为结合测试分析物中的一种或多种的蛋白质开关以及分析物与蛋白质开关的结合是抑制还是激活葡萄糖活性。
[0267]
表5
[0268][0269][0270]
实施例2-针对华法林的蛋白质开关的演变
[0271]
使用本领域已知的常规技术演变具有seq id no:11的氨基酸序列的蛋白质开关gdh-2016(也称为rd2bb)以产生变体库。制备了大约3024种变体。
[0272]
通过以下方式筛选每种变体的葡萄糖活性和华法林抑制(抑制％)：将每种变体与在具有或不具有0.1g/l华法林的情况下在50mm napo4(ph 7.0)中含有1.25g/l葡萄糖、5g/l nad 、20％htp gdh-nad裂解液的反应混合物组合。使用设定在uv 360下的分光光度计(molecular devices spectramax m5)通过nadh动力学测定评价葡萄糖活性，并且以1分钟间隔读取8分钟。将显示出改善抑制(相对于rd2bb)的顶级变体以摇瓶规模生长并且通过以下方式进一步测试华法林抑制(ki)：将每种变体与在50mm napo4(ph 7.0)中的含有0-10g/l葡萄糖、25g/l nad 、0-0.5g/l华法林、gdh-nad摇瓶粉末(根据单独变体在0.5至2.5g/l范围内加载)的反应混合物组合。鉴定出了如下表6中示出的表现出低ki(高葡萄糖抑制)和高葡萄糖活性(例如，催化效率)的蛋白质开关。确定这些蛋白质开关具有seq id no.:1-10中所示的氨基酸序列。选择具有seq id no.1的序列的蛋白质开关(gdh-2025；也称为rd3bb)进行进一步演变。
[0273]
表6
[0274][0275]
使用上文所述的相似技术演变蛋白质开关gdh-2025。制备了大约1680种变体。通过以下方式筛选每种变体的葡萄糖活性和抑制(ki)：将每种变体与在50mm napo4(ph 7.0)中的含有3.5g/l葡萄糖、12.5nad 、10％htp gdh-nad裂解液、0.003g/l华法林钠的反应混合物组合。使用设定在uv 360下的分光光度计(molecular devices spectramax m5)评价葡萄糖活性，并且以1分钟间隔读取8分钟。将显示出改善抑制(相对于rd3bb)的顶级变体以摇瓶规模生长并且通过以下方式进一步测试华法林抑制(ki)：将每种变体与在50mm napo4(ph 7.0)中的含有0-10g/l葡萄糖、25g/l nad 、0-0.5g/l华法林、0.5g/l gdh-nad摇瓶粉末的反应混合物组合。鉴定出了如下表7中示出的表现出低ki(高葡萄糖抑制)和高葡萄糖活性(例如，催化效率)的蛋白质开关。确定这些蛋白质开关具有seq id no.:12-19中所示的氨基酸序列。选择具有seq id no.15的序列的蛋白质开关(gdh-2028；也称为rd4bb)进行进一步演变。
[0276]
表7
[0277][0278]
实施例3-蛋白质开关传感器
[0279]
皮肤制备。使用单层活性区域系统制备实验性gdh-105(对照)、gdh-2004(甲氨蝶呤(mtx))、gdh-2007(mtx)、gdh-2008(mtx)、gdh-2009(mtx)、gdh-2010(mtx)、gdh-2011(mtx)、gdh-2015(mtx)、gdh-2018(t3)、gdh-2019(t3)、gdh-2004(皮质醇(ct))、gdh-2005(ct)、gdh-2004(华法林(wf))、gdh-2009(wf)、gdh-2013(wf)、gdh-2016(wf)和gdh-2024(wf)葡萄糖响应性活性区域。gdh从codexis,redwood city,ca获得。将活性区域以单层组合物(下表8)涂敷在碳工作电极上。在沉积活性区域(0.11mm2)后，将活性区域在室温下固化三天。然后，使用包含4ml 100mg/ml聚乙烯吡啶和200μl 100mg/ml pegdge 400的膜涂覆溶液将pvp膜施加至工作电极。将膜沉积在活性区域(3x1mm/秒浸渍)上，并且使其在25℃和60％相对湿度下固化两天。
[0280]
表8
[0281][0282]
烧杯校准。包括gdh-105的传感器和包括如上所述的蛋白质开关gdh-2004、gdh-2007、gdh-2008、gdh-2009、gdh-2010、gdh-2011、gdh-2015、gdh-2018、gdh-2019、gdh-2005、gdh-2013、gdh-2016和gdh-2024的传感器的葡萄糖感测分析通过以下方式进行：将电极浸没在室温下、不同葡萄糖浓度(1、2、3、5、7、10、15、20、25和30mm葡萄糖)下的100mm pbs缓冲溶液中。图7示出了gdh-105、gdh-2004、gdh-2007、gdh-2008、gdh-2009、gdh-2010、gdh-2011、gdh-2015、gdh-2018、gdh-2019、gdh-2005、gdh-2013、gdh-2016和gdh-2024传感器中的每一种的响应。如下表9中所示，每种gdh展示出对增加的葡萄糖浓度的可测量响应，其中灵敏度从0.09至0.73na/mm葡萄糖变化。图7示出了gdh-105、gdh-2004、gdh-2007、gdh-2008、gdh-2009、gdh-2010、gdh-2011、gdh-2015、gdh-2018、gdh-2019、gdh-2005、gdh-2013、gdh-2016和gdh-2024传感器的基于烧杯校准的线性灵敏度响应，其展示出正驱动力。
[0283]
表9
[0284]
项目id灵敏度(na/mm葡萄糖)gdh-105(对照)0.55gdh-2004(mtx)0.30gdh-2007(mtx0.40gdh-2008(mtx)0.49gdh-2009(mtx)0.62gdh-2010(mtx)0.30gdh-2011(mtx)0.34gdh-2015(mtx)0.13gdh-2018(t3)0.63gdh-2019(t3)0.67gdh-2004(ct)0.23
gdh-2005(ct)0.73gdh-2004(wf)0.28gdh-2009(wf)0.55gdh-2013(wf)0.46gdh-2016(wf)0.56gdh-2024(wf)0.09
[0285]
烧杯稳定性。将传感器gdh-105和包括上文所述的蛋白质开关gdh-2004、gdh-2007、gdh-2008、gdh-2009、gdh-2010、gdh-2011、gdh-2015、gdh-2018、gdh-2019、gdh-2005、gdh-2013、gdh-2016和gdh-2024的传感器的烧杯稳定性(长期稳定性)在33℃下在100mm pbs中的30mm葡萄糖中进行评价，如图8中所示。在4天后，每种信号以不同速率经历传感器下降(用于检测葡萄糖的稳定性下降)，如表10中所示。gdh-105和gdh-2018传感器的信号下降显著小于其他测试传感器的信号下降。
[0286]
表10
[0287]
项目id信号下降(4天)gdh-105(对照)-2％gdh-2004(mtx)-96％gdh-2007(mtx)-100％gdh-2008(mtx)-77％gdh-2009(mtx)-45％gdh-2010(mtx)-98％gdh-2011(mtx)-85％gdh-2015(mtx)-76％gdh-2018(t3)-8％gdh-2019(t3)-46％gdh-2004(ct)-56％gdh-2005(ct)-29％gdh-2004(wf)-89％gdh-2009(wf)-56％gdh-2013(wf)-76％gdh-2016(wf)-87％gdh-2024(wf)-100％
[0288]
实施例4-华法林传感器
[0289]
华法林传感器。使用单层活性区域系统制备实验性gdh-105和gdh-2016葡萄糖响应性活性区域。gdh从codexis,redwood city,ca获得。将活性区域以单层组合物(表8)涂敷在碳工作电极上。在沉积活性区域后，将活性区域在rt下固化三天。
[0290]
实验性程序。gdh-105和gdh-2016传感器的测试通过以下方式进行：将电极浸没在33℃nad

(5mm)下的100mm pbs缓冲溶液中，其中nad被提供至含有pbs缓冲液的测试烧杯，之后添加葡萄糖(1mm)。gdh-105和gdh-2016传感器两者均响应于葡萄糖添加。然后将华法林以不同浓度(10、30、80、180和300um华法林)添加至测试烧杯。图9a和b示出了gdh-2016传
感器对增加的华法林浓度的抑制(在300um华法林下约55％抑制)，而gdh-105传感器未受影响。
[0291]
演变的华法林传感器。使用单层活性区域系统制备实验性gdh-105(对照)、gdh-2025(wf)、gdh-2026(wf)、gdh-2027(wf)和gdh-2028(wf)葡萄糖响应性活性区域。gdh从codexis,redwood city,ca获得。将活性区域以单层组合物(表8)涂敷在碳工作电极上。在沉积活性区域(0.33mm2)后，将活性区域在室温下固化三天。然后，使用包含4ml 100mg/ml聚乙烯吡啶和200μl 100mg/ml pegdge 400的膜涂覆溶液将pvp膜施加至工作电极。将膜沉积在活性区域(3x1mm/秒浸渍)上，并且使其在25℃和60％相对湿度中固化两天。
[0292]
烧杯校准。如上所述制备的gdh-105、gdh-2025、gdh-2026、gdh-2027和gdh-2028传感器的葡萄糖感测分析通过以下方式进行：将电极浸没在室温下和不同葡萄糖浓度(1、2、3、5、7、10、15、20、25和30mm葡萄糖)下的100mm pbs缓冲溶液中。图10示出了gdh-105、gdh-2025、gdh-2026、gdh-2027和gdh-2028传感器中的每一种的响应。如表11中所示，每种gdh展示出对增加的葡萄糖浓度的可测量响应，其中灵敏度从0.09至1.53na/mm葡萄糖变化。图10示出了gdh-105、gdh-2025、gdh-2026、gdh-2027和gdh-2028传感器的基于烧杯校准的线性灵敏度响应，其展示出正驱动力。
[0293]
表11
[0294]
酶id灵敏度(na/mm)gdh-105(对照)1.53gdh-2025(wf)0.32gdh-2026(wf)0.22gdh-2027(wf)0.29gdh-2028(wf)0.09
[0295]
烧杯稳定性。将gdh-105、gdh-2025、gdh-2026、gdh-2027和gdh-2028传感器的烧杯稳定性(长期稳定性)在33℃下在100mm pbs中的30mm葡萄糖中进行评价，如图11中所示。在1天后，每种信号经历不同速率的传感器下降(用于检测葡萄糖的稳定性下降)，如表12中所提供。gdh-105传感器的信号下降显著小于其他测试传感器的信号下降。
[0296]
表12
[0297]
酶id信号下降(1天)gdh-105(对照)-0％gdh-2025(wf)-58％gdh-2026(wf)-69％gdh-2027(wf)-64％gdh-2028(wf)-68％
[0298]
演变的华法林传感器。使用单层活性区域系统制备gdh-105、gdh-2016、gdh-2025、gdh-2026、gdh-2027和gdh-2028葡萄糖响应性活性区域。gdh从codexis,redwood city,ca获得。将活性区域(0.33mm2)以单层组合物(表8)涂敷在碳工作电极上。在沉积活性区域后，将活性区域在室温下固化三天。
[0299]
实验性程序。gdh-105、gdh-2016、gdh-2025、gdh-2026、gdh-2027和gdh-2028传感器的测试通过以下方式进行：将电极浸没在33℃nad

(10mm)下的100mm pbs缓冲溶液中，其
中nad被提供至含有pbs缓冲液的测试烧杯，之后添加葡萄糖(5mm)。gdh-105、gdh-2016、gdh-2025、gdh-2026、gdh-2027和gdh-2028传感器对葡萄糖添加显示出响应。然后将华法林以不同浓度(10、30、80、180和300um华法林)添加至测试烧杯。图12a和12b以及图13显示出gdh-105、gdh-2016、gdh-2025、gdh-2026、gdh-2027和gdh-2028传感器针对增加的华法林浓度的抑制，而gdh-105传感器保持未受影响。华法林抑制百分比针对传感器gdh-105、gdh-2025、gdh-2026、gdh-2027和gdh-2028改变，如表13中所示。
[0300]
表13
[0301]
酶id0.3mm wf下的gdh抑制gdh-105(对照)5％gdh-2025(wf)79％gdh-2026(wf)78％gdh-2027(wf)79％gdh-2028(wf)84％
[0302]
本文论述和引用的所有出版物、专利和专利申请通过引用以其全文并入本文。应当理解，本文公开的方面不限于所描述的特定方法、方案和材料，因此这些方法、方案和材料可以改变。还应当理解，本文所用的术语仅出于描述特定方面的目的，并且不旨在限制本公开的范围，本发明的范围将仅由随附权利要求限定。
[0303]
本领域技术人员仅使用常规实验就将认识到或能够确定本文所述的本公开内容的具体方面的许多等效物。此类等效物旨在为以下权利要求所涵盖。
[0304]
出于完整性的原因，在以下编号条款中列出本公开内容的各个方面：
[0305]
条款1.一种蛋白质开关，其包括至少一种非天然存在的多肽，所述至少一种非天然存在的多肽具有：(a)能够与至少一种分析物结合的至少一个分析物结合结构域；和(b)具有氧化酶或脱氢酶活性并且能够与至少一种反应物结合或反应的至少一个氧化酶或脱氢酶结构域，其中(i)结合所述分析物结合结构域的所述分析物不同于与所述氧化酶或脱氢酶结构域结合或反应的所述反应物；并且(ii)当所述分析物结合所述分析物结合结构域时，所述氧化酶或脱氢酶活性改变。
[0306]
条款2.如条款1所述的蛋白质开关，其中所述氧化酶是葡萄糖氧化酶或乳酸氧化酶。
[0307]
条款3.如条款1所述的蛋白质开关，其中所述脱氢酶是葡萄糖脱氢酶或乳酸脱氢酶。
[0308]
条款4.如条款1-3中任一项所述的蛋白质开关，其中当所述分析物结合结构域结合所述分析物时，所述氧化酶或脱氢酶的活性降低。
[0309]
条款5.如条款1-3中任一项所述的蛋白质开关，其中当所述分析物结合结构域结合所述分析物时，所述氧化酶或脱氢酶的活性增加。
[0310]
条款6.如条款4-5中任一项所述的蛋白质开关，其中当所述分析物结合结构域结合所述分析物时，所述氧化酶或脱氢酶的活性由于竞争性抑制、无竞争性抑制或非竞争性抑制而增加或降低。
[0311]
条款7.如条款4-5中任一项所述的蛋白质开关，其中当所述分析物结合结构域结合所述分析物时，所述氧化酶或脱氢酶的活性由于竞争性抑制而降低。
[0312]
条款8.如条款1-7中任一项所述的蛋白质开关，其中所述分析物是华法林、皮质醇、甲氨蝶呤或三碘甲状腺氨酸。
[0313]
条款9.如条款1-8中任一项所述的蛋白质开关，其中所述反应物是葡萄糖或乳酸。
[0314]
条款10.一种蛋白质开关，其包含seq id no:20的氨基酸位置96、155、156、159、170、198和252处的至少7个突变。
[0315]
条款11.如条款10所述的蛋白质开关，其中所述蛋白质开关包含：
[0316]
seq id no:20的氨基酸位置96处的半胱氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸或酪氨酸；
[0317]
seq id no:20的氨基酸位置155处的丙氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸或缬氨酸；
[0318]
seq id no:20的氨基酸位置156处的苏氨酸或丝氨酸；
[0319]
seq id no:20的氨基酸位置159处的苏氨酸或丝氨酸；
[0320]
seq id no:20的氨基酸位置170处的赖氨酸、精氨酸或组氨酸；
[0321]
seq id no:20的氨基酸位置198处的谷氨酸或天冬氨酸；以及
[0322]
seq id no:20的氨基酸位置252处的丙氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸或缬氨酸。
[0323]
条款12.如条款11所述的蛋白质开关，其进一步包含以下中的一种或多种：
[0324]
seq id no:20的氨基酸位置11处的甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸或缬氨酸；
[0325]
seq id no:20的氨基酸位置22处的甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸或缬氨酸；
[0326]
seq id no:20的氨基酸位置45处的天冬酰胺或谷氨酰胺；
[0327]
seq id no:20的氨基酸位置48处的丙氨酸、甘氨酸、异亮氨酸或亮氨酸；
[0328]
seq id no:20的氨基酸位置55处的天冬氨酸或谷氨酸；
[0329]
seq id no:20的氨基酸位置98处的丙氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸或缬氨酸；
[0330]
seq id no:20的氨基酸位置137处的苯丙氨酸、色氨酸或酪氨酸；
[0331]
seq id no:20的氨基酸位置141处的丙氨酸、甘氨酸、亮氨酸或缬氨酸；
[0332]
seq id no:20的氨基酸位置149处的丙氨酸、甘氨酸、异亮氨酸或亮氨酸；
[0333]
seq id no:20的氨基酸位置154处的丙氨酸、甘氨酸、异亮氨酸或缬氨酸；
[0334]
seq id no:20的氨基酸位置166处的苏氨酸或丝氨酸；
[0335]
seq id no:20的氨基酸位置173处的甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸或缬氨酸；
[0336]
seq id no:20的氨基酸位置184处的苏氨酸或丝氨酸；
[0337]
seq id no:20的氨基酸位置195处的组氨酸、亮氨酸或精氨酸；
[0338]
seq id no:20的氨基酸位置219处的苏氨酸或丝氨酸；
[0339]
seq id no:20的氨基酸位置240处的天冬酰胺或谷氨酰胺；和/或
[0340]
seq id no:20的氨基酸位置251处的丙氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸或缬氨酸。
[0341]
条款13.一种蛋白质开关，其包含与seq id no.:11具有至少80％同一性的氨基酸序列。
[0342]
条款14.如条款13所述的蛋白质开关，其包含与seq id no.:11具有至少85％同一性的氨基酸序列。
[0343]
条款15.如条款13-14中任一项所述的蛋白质开关，其包含与seq id no.:11具有至少90％同一性的氨基酸序列。
[0344]
条款16.如条款13-15中任一项所述的蛋白质开关，其包含与seq id no.:11具有
至少95％同一性的氨基酸序列。
[0345]
条款17.如条款13-16中任一项所述的蛋白质开关，其包含与seq id no.:11具有至少96％同一性的氨基酸序列。
[0346]
条款18.如条款13-17中任一项所述的蛋白质开关，其包含与seq id no.:11具有至少97％同一性的氨基酸序列。
[0347]
条款19.如条款13-18中任一项所述的蛋白质开关，其包含与seq id no.:11具有至少98％同一性的氨基酸序列。
[0348]
条款20.如条款13-19中任一项所述的蛋白质开关，其包含与seq id no.:11具有至少99％同一性的氨基酸序列。
[0349]
条款21.如条款13-20中任一项所述的蛋白质开关，其包含与seq id no.:11具有至少100％同一性的氨基酸序列。
[0350]
条款22.如条款13-21中任一项所述的蛋白质开关，其中所述蛋白质开关包含seq id no.1-10或12-19中的任一个的氨基酸序列。
[0351]
条款23.一种组合物或试剂盒，其包含如条款1、10、11或13所述的至少一种蛋白质开关和至少一种反应物。
[0352]
条款24.如条款23所述的组合物，其中所述反应物是葡萄糖或乳酸。
[0353]
条款25.一种检测分析物的方法，所述方法包括：
[0354]
提供蛋白质开关，所述蛋白质开关包括至少一种多肽，所述至少一种多肽具有：(a)能够与至少一种分析物结合的至少一个分析物结合结构域；和(b)具有氧化酶或脱氢酶活性并且能够与至少一种反应物结合或反应的至少一个氧化酶或脱氢酶结构域，其中(i)结合所述分析物结合结构域的所述分析物不同于与所述氧化酶或脱氢酶结构域结合或反应的所述反应物；并且(ii)当所述分析物结合所述分析物结合结构域时，所述氧化酶或脱氢酶活性改变；
[0355]
使所述蛋白质开关与包含对所述蛋白质开关具有特异性的反应物的流体接触，其中所述分析物结合结构域结合所述流体中的所述分析物，由此所述氧化酶或脱氢酶活性改变；以及
[0356]
检测所述蛋白质开关的所述氧化酶或脱氢酶结构域对所述反应物的分解速率的改变。
[0357]
条款26.如条款25所述的方法，其中所述氧化酶是葡萄糖氧化酶或乳酸氧化酶。
[0358]
条款27.如条款25所述的方法，其中所述脱氢酶是葡萄糖脱氢酶或乳酸脱氢酶。
[0359]
条款28.如条款26-27中任一项所述的方法，其中所述反应物是葡萄糖或乳酸。
[0360]
条款29.一种检测分析物的方法，所述方法包括：
[0361]
提供如权利要求10、11和13中任一项所述的蛋白质开关，
[0362]
使所述蛋白质开关与包含对所述蛋白质开关具有特异性的至少一种反应物的流体接触，其中所述分析物结合结构域结合所述流体中的所述分析物，由此所述氧化酶或脱氢酶活性改变；以及
[0363]
检测所述蛋白质开关的所述氧化酶或脱氢酶结构域对所述反应物的分解速率的改变。
[0364]
条款30.如条款29所述的方法，其中所述蛋白质开关包含与seq id no.:11具有至
少85％同一性的氨基酸序列。
[0365]
条款31.如条款29或30所述的方法，其中所述蛋白质开关包含与seq id no.:11具有至少90％同一性的氨基酸序列。
[0366]
条款32.如条款29-31中任一项所述的方法，其中所述蛋白质开关包含与seq id no.:11具有至少95％同一性的氨基酸序列。
[0367]
条款33.如条款29-32中任一项所述的方法，其中所述蛋白质开关包含与seq id no.:11具有至少96％同一性的氨基酸序列。
[0368]
条款34.如条款29-33中任一项所述的方法，其中所述蛋白质开关包含与seq id no.:11具有至少97％同一性的氨基酸序列。
[0369]
条款35.如条款29-34中任一项所述的方法，其中所述蛋白质开关包含与seq id no.:11具有至少98％同一性的氨基酸序列。
[0370]
条款36.如条款29-35中任一项所述的方法，其中所述蛋白质开关包含与seq id no.:11具有至少99％同一性的氨基酸序列。
[0371]
条款37.如条款29-36中任一项所述的方法，其中所述蛋白质开关包含与seq id no.:11具有至少100％同一性的氨基酸序列。
[0372]
条款38.如条款29-37中任一项所述的方法，其中所述蛋白质开关包含seq id no.1-10或12-19中的任一个的氨基酸序列。
[0373]
条款39.如条款29-38中任一项所述的方法，其中所述氧化酶是葡萄糖氧化酶或乳酸氧化酶。
[0374]
条款40.如条款29-39中任一项所述的方法，其中所述脱氢酶是葡萄糖脱氢酶或乳酸脱氢酶。
[0375]
条款41.如条款29-40中任一项所述的方法，其中所述反应物是葡萄糖或乳酸。
[0376]
条款42.如条款29-41中任一项所述的方法，其中所述分析物是华法林、皮质醇、甲氨蝶呤或三碘甲状腺氨酸。
[0377]
条款43.一种用于检测或监测分析物浓度的系统，其包括传感器控制装置和信号检测装置，其中所述传感器控制装置包括至少一个传感器，所述至少一个传感器包括如条款1、10、11或13所述的蛋白质开关。
[0378]
条款44.如条款43所述的系统，其中所述氧化酶是葡萄糖氧化酶或乳酸氧化酶。
[0379]
条款45.如条款43所述的系统，其中所述脱氢酶是葡萄糖脱氢酶或乳酸脱氢酶。
[0380]
条款46.如条款43-45中任一项所述的系统，其中所述蛋白质开关包含与seq id no.:11具有至少85％同一性的氨基酸序列。
[0381]
条款47.如条款43-46中任一项所述的系统，其中所述蛋白质开关包含与seq id no.:11具有至少90％同一性的氨基酸序列。
[0382]
条款48.如条款43-47中任一项所述的系统，其中所述蛋白质开关包含与seq id no.:11具有至少95％同一性的氨基酸序列。
[0383]
条款49.如条款43-48中任一项所述的系统，其中所述蛋白质开关包含与seq id no.:11具有至少96％同一性的氨基酸序列。
[0384]
条款50.如条款43-49中任一项所述的系统，其中所述蛋白质开关包含与seq id no.:11具有至少97％同一性的氨基酸序列。
[0385]
条款51.如条款43-50中任一项所述的系统，其中所述蛋白质开关包含与seq id no.:11具有至少98％同一性的氨基酸序列。
[0386]
条款52.如条款43-51中任一项所述的系统，其中所述蛋白质开关包含与seq id no.:11具有至少99％同一性的氨基酸序列。
[0387]
条款53.如条款43-52中任一项所述的系统，其中所述蛋白质开关包含与seq id no.:11具有至少100％同一性的氨基酸序列。
[0388]
条款54.如条款43-53中任一项所述的系统，其中所述蛋白质开关包含seq id no.1-10或12-19中的任一个的氨基酸序列。
[0389]
条款55.一种分析物监测系统，其包括：传感器，所述传感器包括基板、工作电极和如条款1、10、11或13所述的蛋白质开关，所述传感器的至少一部分适于植入和与体液紧密接触，所述传感器被配置和布置为产生代表所述体液中分析物的水平的信号；和用于接收所述信号的信号检测装置，其中所述信号通过所述分析物与所述蛋白质开关的接触生成。
[0390]
条款56.如条款55所述的分析物监测系统，其中所述氧化酶是葡萄糖氧化酶或乳酸氧化酶。
[0391]
条款57.如条款55所述的分析物监测系统，其中所述脱氢酶是葡萄糖脱氢酶或乳酸脱氢酶。
[0392]
条款58.如条款55-57中任一项所述的分析物监测系统，其中所述蛋白质开关包含与seq id no.:11具有至少85％同一性的氨基酸序列。
[0393]
条款59.如条款55-58中任一项所述的分析物监测系统，其中所述蛋白质开关包含与seq id no.:11具有至少90％同一性的氨基酸序列。
[0394]
条款60.如条款55-59中任一项所述的分析物监测系统，其中所述蛋白质开关包含与seq id no.:11具有至少95％同一性的氨基酸序列。
[0395]
条款61.如条款55-60中任一项所述的分析物监测系统，其中所述蛋白质开关包含与seq id no.:11具有至少96％同一性的氨基酸序列。
[0396]
条款62.如条款55-61中任一项所述的分析物监测系统，其中所述蛋白质开关包含与seq id no.:11具有至少97％同一性的氨基酸序列。
[0397]
条款63.如条款55-62中任一项所述的分析物监测系统，其中所述蛋白质开关包含与seq id no.:11具有至少98％同一性的氨基酸序列。
[0398]
条款64.如条款55-63中任一项所述的分析物监测系统，其中所述蛋白质开关包含与seq id no.:11具有至少99％同一性的氨基酸序列。
[0399]
条款65.如条款55-64中任一项所述的分析物监测系统，其中所述蛋白质开关包含与seq id no.:11具有至少100％同一性的氨基酸序列。
[0400]
条款66.如条款55-65中任一项所述的分析物监测系统，其中所述蛋白质开关包含seq id no.1-10或12-19中的任一个的氨基酸序列。
[0401]
条款67.如条款55-66中任一项所述的分析物监测系统，其中所述分析物是华法林、皮质醇、甲氨蝶呤或三碘甲状腺氨酸。