测量蛋白酶介导的IV型胶原蛋白降解的新表位特异性测定的制作方法

测量蛋白酶介导的iv型胶原蛋白降解的新表位特异性测定
技术领域
1.本发明涉及一种测量蛋白酶介导的iv型胶原蛋白降解及其生物标志物潜力的测定，用于鉴定具有t细胞允许性肿瘤微环境的癌症患者。


背景技术：

2.具有免疫检查点抑制剂的免疫疗法通过给予持久响应的机会，彻底改变了癌症治疗(1)。免疫检查点抑制剂治疗涉及抗体，如抗ctla-4、抗pd1和抗pd-l1抗体，它们可以重新激活细胞毒性t淋巴细胞，从而能够消除肿瘤细胞。但是，尽管这些免疫检查点抑制剂在临床上取得了成功，但只有一部分癌症患者具有长期生存获益。因此，重要的是确定可以鉴定将响应于免疫检查点抑制剂治疗的癌症患者的非侵入性生物标志物，以避免错误的治疗和不良事件。为了鉴定预测性生物标志物，了解影响响应和抗性的一些因素至关重要。
3.已确定接受治疗前患者的三种不同免疫特征与人对于免疫检查点治疗的响应相关(2)。临床响应最常发生在患有免疫炎症肿瘤类型的患者中，其特征是表达cd4和cd8的t细胞存在于肿瘤细胞附近的肿瘤微环境中。免疫豁免表型的特征是存在免疫细胞，但它们保留在周围的基质中，从而阻止t细胞浸润。在免疫沙漠表型中，肿瘤实质或基质中都没有t细胞。具有免疫豁免表型或免疫沙漠表型的患者很少响应于免疫检查点抑制剂治疗，因此鉴定免疫炎症肿瘤类型的生物标志物可以是非常有用的预测工具。对于有效的癌症免疫疗法，重要的是t细胞既被激活又被募集到定义免疫炎症表型(“热肿瘤”)的肿瘤微环境中(3)。
4.细胞外基质(ecm)的组成已被证明影响t细胞的定位和迁移，并已确定其在免疫疗法抗性中起关键作用(4-7)。我们之前已经表明，反映过度iii型胶原蛋白形成(结缔组织增生)的血清学生物标志物pro-c3和反映基质金属蛋白酶(mmp)-9降解的iv型胶原蛋白的生物标志物c4m与对免疫检查点阻断的不良响应相关(8)。除此之外，c4m在不同的癌症患者中升高(9,10)。
5.有趣的是，t细胞还表达诱导t细胞中侵袭行为的蛋白酶(11,12)。已经表明，迁移中的t细胞分泌mmp和丝氨酸蛋白酶(颗粒酶b)，以通过路径上的基底膜进入下层组织(11,13-15)。


技术实现要素：

6.iv型胶原蛋白是基底膜的主要成分，因此本发明人假设特定蛋白酶产生的iv型胶原蛋白片段作为t细胞从循环系统迁移到肿瘤微环境的一部分被释放到癌症患者的循环系统中。因此，这些iv型胶原蛋白片段可以具有鉴定患有t细胞允许性肿瘤微环境的癌症患者响应于免疫检查点抑制剂治疗的生物标志物潜力。本发明人现已开发了一种竞争性电化学发光免疫测定(eclia)法，该测定法靶向蛋白酶介导的iv型胶原蛋白降解的新表位，并表明其水平在来自用免疫检查点抑制剂伊匹单抗(ipilimumab)成功治疗的转移性黑色素瘤患者的血清中升高。为了进一步评估潜力，该生物标志物也在来自患有不同类型癌症的患者
的血清中进行了评估。该生物标志物还可用于提供患有癌症，特别是患有胰腺导管腺癌的患者的生存率预后。
7.因此，在第一方面，本发明涉及特异性识别并结合具有n末端氨基酸序列mgntgptgav(seq id no.1)的肽(在本文中也称为靶肽或c4aa
1355
)。该肽序列代表通过用蛋白酶例如丝氨酸蛋白酶(例如颗粒酶b)或基质金属蛋白酶(例如mmp-9)(导致氨基酸f
1354
和m
1355
之间的切割)消化iv型胶原蛋白α2链产生的新表位。
8.优选地，所述单克隆抗体不识别或特异性结合所述n末端氨基酸序列的延长形式，其为xmgntgptgav(seq id no.2)，其中x是任意氨基酸。优选地，x是f。优选地，所述单克隆抗体不识别或特异性结合所述n末端氨基酸序列的截短形式，特别是gntgptgav(seq id no.3)的肽。优选地，所述单克隆抗体不识别或特异性结合所述n末端氨基酸序列的突变形式，其为mgqtgptgav(seq id no.4)、mgnsgptgav(seq id no.5)和/或qgntgptgav(seq id no.6)。
9.优选地，所述抗体对n末端氨基酸序列mgntgptgav(seq id no.1)的亲和力与所述抗体对延长的n末端氨基酸序列fmgntgptgav(seq id no.7)的亲和力之比为至少10∶1，更优选地为至少50∶1、至少100∶1、至少500∶1、至少1,000∶1、至少10,000∶1、至少100,000∶1或至少1,000,000∶1。
10.优选地，所述抗体对n末端氨基酸序列mgntgptgav(seq id no.1)的亲和力与所述抗体对截短的n末端氨基酸序列gntgptgav(seq id no.3)的亲和力之比为至少10∶1，更优选地为至少50∶1、至少100∶1、至少500∶1、至少1,000∶1、至少10,000∶1、至少100,000∶1或至少1,000,000∶1。
11.优选地，所述抗体对n末端氨基酸序列mgntgptgav(seq id no.1)的亲和力与所述抗体对突变的n末端氨基酸序列mgqtgptgav(seq id no.4)的亲和力之比为至少10∶1，更优选地为至少50∶1、至少100∶1、至少500∶1、至少1,000∶1、至少10,000∶1、至少100,000∶1或至少1,000,000∶1。
12.优选地，所述抗体对n末端氨基酸序列mgntgptgav(seq id no.1)的亲和力与所述抗体对突变的n末端氨基酸序列mgnsgptgav(seq id no.5)的亲和力之比为至少10∶1，更优选地为至少50∶1、至少100∶1、至少500∶1、至少1,000∶1、至少10,000∶1、至少100,000∶1或至少1,000,000∶1。
13.优选地，所述抗体对n末端氨基酸序列mgntgptgav(seq id no.1)的亲和力与所述抗体对突变的n末端氨基酸序列qgntgptgav(seq id no.6)的亲和力之比为至少10∶1，更优选地为至少50∶1、至少100∶1、至少500∶1、至少1,000∶1、至少10,000∶1、至少100,000∶1或至少1,000,000∶1。
14.可通过本领域已知的任何合适技术产生特异性结合n末端氨基酸序列mgntgptgav(seq id no.1)的单克隆抗体。例如，单克隆抗体可以针对具有氨基酸序列mgntgptgav(seq id no.1)的合成肽产生，例如如通过：用由序列mgntgptgav(seq id no.1)组成的合成肽免疫啮齿动物(或其他合适的哺乳动物)，序列mgntgptgav(seq id no.1)可任选地连接至免疫原性载体蛋白(例如匙孔血蓝蛋白)；分离和克隆单个抗体产生细胞；以及测定所得单克隆抗体以确保它们具有期望的特异性。用于产生特异性结合n末端氨基酸序列mgntgptgav(seq id no.1)的单克隆抗体的示例性方案在下文中描述。
15.优选地，单克隆抗体或其片段可以优选地包含一个或多个选自以下的互补决定区(cdr)：
16.cdr-l1：kssqsllysdgktyln(seq id no.8)
17.cdr-l2：lvsklds(seq id no.9)
18.cdr-l3：wqgthfvt(seq id no.10)
19.cdr-h1：tynigvg(seq id no.11)
20.cdr-h2：hiwyndikyyntalks(seq id no.12)
21.cdr-h3：lrpsfdy(seq id no.13)
22.优选地，抗体或其片段包含至少2、3、4、5或6个以上列出的cdr序列。
23.优选地，单克隆抗体或其片段具有包含以下cdr序列的轻链可变区：
24.cdr-l1：kssqsllysdgktyln(seq id no.8)
25.cdr-l2：lvsklds(seq id no.9)和
26.cdr-l3：wqgthfvt(seq id no.10)
27.优选地，单克隆抗体或其片段具有包含cdr之间的框架序列的轻链，其中所述框架序列与以下轻链序列中cdr之间的框架序列基本上相同或基本上相似(其中cdr以粗体和下划线显示，框架序列以斜体显示)
[0028][0029]
优选地，单克隆抗体或其片段具有包含以下cdr序列的重链可变区：
[0030]
cdr-h1：tynigvg(seq id no.11)
[0031]
cdr-h2：hiwyndikyyntalks(seq id no.12)和
[0032]
cdr-h3：lrpdsfdy(seq id no.13)
[0033]
优选地，单克隆抗体或其片段具有包含cdr之间的框架序列的重链，其中所述框架序列与以下轻链序列中cdr之间的框架序列基本上相同或基本上相似(其中cdr以粗体和下划线显示，框架序列以斜体显示)
[0034][0035]
如本文所用，如果一种抗体的cdr之间的框架氨基酸序列与另一种抗体的cdr之间的框架氨基酸序列具有至少70％、80％、90％或至少95％的相似性或同一性，则上述两种抗体的cdrr之间的框架氨基酸序列为基本上相同或基本上相似。相似或相同的氨基酸可以是连续的或不连续的。
[0036]
框架序列可以包含一个或多个氨基酸取代、插入和/或缺失。氨基酸取代可以是保守的，这意味着取代的氨基酸具有与原始氨基酸相似的化学性质。技术人员会理解哪些氨基酸具有相似的化学性质。例如，以下氨基酸组具有相似的化学性质，例如大小、电荷和极性：第1组ala、ser、thr、pro、gly；第2组asp、asn、glu、gln；第3组his、arg、lys；第4组met、leu、ile、val、cys；第5组phe thy trp。
[0037]
如clustal程序等程序可用于比较氨基酸序列。该程序比较氨基酸序列，并通过在任一序列中适当插入空格来找到最佳比对。可以计算氨基酸同一性或相似性(同一性加上
氨基酸类型的保守性)以获得最佳比对。像blastx这样的程序将比对相似序列的最长段(stretch)，并为拟合分配一个值。因此可以进行比较，以获得其中发现相似性的几个区域的比较，每个区域具有不同的评分。在本发明中考虑了这两种类型的分析。优选在框架序列的整个长度上计算同一性或相似性。
[0038]
在某些优选的实施方案中，单克隆抗体或其片段可以包含轻链可变区序列：
[0039][0040]
(cdr以粗体和下划线显示；框架序列以斜体显示)
[0041]
和/或重链可变区序列：
[0042][0043]
(cdr以粗体和下划线显示；框架序列以斜体显示)
[0044]
在第二方面，本发明涉及用于鉴定患有癌症的受试者是否响应于免疫疗法的方法，所述方法包括检测获自受试者的样品中具有n末端氨基酸mgntgptgav(seq id no.1)的肽的存在。样品优选地是生物流体样品，特别是人生物流体样品。
[0045]
优选地，免疫疗法包含至少一种免疫检查点抑制剂。免疫检查点抑制剂靶向一些免疫细胞上的分子，所述免疫细胞需要被激活(或灭活)以启动免疫应答。这些检查点蛋白包括pd-1、pd-l1和ctla-4。免疫检查点抑制剂可以靶向这些分子中的任何一种或多种。免疫检查点抑制剂包括伊匹单抗(ipilimumab)、帕博利珠单抗(pembrolizumab)、纳武单抗(nivolumab)、阿替利珠单抗(atezolizumab)、阿维鲁单抗(avelumab)、德瓦鲁单抗(durvalumab)、西米普利单抗(cemiplimab)或其组合。优选地，免疫检查点抑制剂可以靶向ctla-4，例如伊匹单抗。可替换地，免疫检查点抑制剂可以靶向pd-1，例如帕博利珠单抗、纳武单抗和/或西米普利单抗。可替换地，免疫检查点抑制剂可以靶向pd-l1，例如阿替利珠单抗、阿维鲁单抗或德瓦鲁单抗。优选地，具有至少一种免疫检查点抑制剂的免疫疗法包含施用伊匹单抗。
[0046]
优选地，该方法是免疫测定。更优选地，该方法包括使获自受试者的生物流体样品与根据本发明第一方面的单克隆抗体接触，并检测单克隆抗体与样品中的肽之间的结合。
[0047]
根据第二方面的方法利用了第一方面的单克隆抗体，因此第二方面的优选实施方案将从以上对第一方面的优选实施方式的讨论中显而易见。
[0048]
优选地，检测是定量的。因此，该方法可以包括检测和确定单克隆抗体和样品中的肽之间的结合量。
[0049]
优选地，免疫测定是竞争性免疫测定。
[0050]
优选地，免疫测定是酶联免疫吸附测定(elisa)或电化学发光免疫测定(eclia)。优选地，elisa是竞争性elisa。优选地，eclia是竞争性eclia。
[0051]
生物流体样品可以是但不限于：血液、血清、血浆、尿液或来自细胞或组织培养物的上清液。优选地，生物流体是血清或血浆，最优选为血清。
[0052]
在第二方面的方法中，样品获自已被诊断患有癌症的受试者。癌症可以是转移性的。癌症优选选自黑色素瘤、乳腺癌、结肠直肠癌、胃癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、卵巢癌、前列腺癌或胰腺癌(包括胰腺导管腺癌)。优选地，受试者患有黑色素瘤，特别是转移性黑色素瘤。
[0053]
该方法可以进一步包括将检测到的肽的量与正常健康受试者相关的值和/或获自已临床响应于免疫疗法的癌症患者的值相关联，所述已临床响应于免疫疗法的癌症患者例如为治疗后具有延长的存活时间、肿瘤缩小和/或症状改善的患者。水平升高的肽表明受试者患有免疫炎症肿瘤类型，因此将响应于免疫疗法。
[0054]
如本文所用，术语“与正常健康受试者相关的值和/或获自已对响应于免疫疗法的癌症患者的值”是指对于被认为健康即没有癌症的受试者通过上述方法针对确定的标准化量；和/或对于已知患有癌症且已临床响应于用免疫疗法，优选地免疫检查点抑制剂治疗，例如肿瘤大小减小、症状改善和/或总生存时间延长的受试者，通过上述方法确定的标准化量。
[0055]
在根据第二方面的方法的一些实施方式中，对iv型胶原蛋白肽的表位具有特异性的单克隆抗体与n末端氨基酸序列mgntgptgav(seq id no.1)的结合量与一种或多种预定的截止值相关。
[0056]
如本文所用，“截止值”是指经统计学确定以指示响应于使用免疫检查点抑制剂的免疫疗法的高可能性的结合量。患者样品中生物标志物结合的测量值等于或高于以下统计截止值，该统计截止值对应于由肿瘤大小减小、症状改善和/或总生存时间延长指示的响应于免疫疗法，优选地响应于使用免疫检测点抑制剂的免疫疗法的存在或可能性的至少70％的概率，优选地至少80％的概率，优选地至少85％的概率，更优选地至少90％的概率，最优选地至少95％的概率。“截止值”可以通过比较获自被诊断患有癌症并且响应于免疫疗法的患者的结果与获得自被诊断患有相同癌症但不响应于免疫疗法的患者的结果来计算。
[0057]
如果测得的对n末端氨基酸序列mgntgptgav(seq id no.1)具有特异性的单克隆抗体的结合量处于癌症患者，特别是患有相同类型的癌症的患者中测得的水平的前三个四分位数(q2 q3 q4)，这表明患者可能响应于用免疫检查点抑制剂进行的治疗。
[0058]
对n末端氨基酸序列mgntgptgav(seq id no.1)具有特异性的单克隆抗体的结合量的预定截止值可以在10.0-20.0ng/ml的范围内。优选地，对n末端氨基酸序列mgntgptgav(seq id no.1)具有特异性的单克隆抗体的结合量的预定截止值至少为14.5ng/ml。在这点上，通过使用统计分析发现，对n末端氨基酸序列mgntgptgav(seq id no.1)具有特异性的单克隆抗体的测量的结合量为至少14.5ng/ml或更大可以是患者很可能响应于免疫疗法，优选地是使用免疫检查点抑制剂的免疫疗法的决定因素。通过具有至少14.5ng/ml的统计截止值，可以利用本发明的方法以高置信度预测对免疫疗法的响应。特别地，至少14.5ng/ml或更大可以是黑色素瘤患者很可能响应于免疫疗法的决定因素。应用这样的统计截止值特别有利，因为它会产生独立的诊断分析；即，它消除了与健康个体和/或已知响应于免疫疗法的患者，优选地是那些已响应于免疫检查点抑制剂治疗的患者进行任何直接比较以得出结论的需要。快速的结论性诊断可引起患者很可能在早期被治疗的响应，这反过来提高总体生存机会，和/或降低住院风险。
[0059]
该方法可以进一步包括向确定具有升高水平的存在的肽的受试者施用免疫疗法。
[0060]
在第三方面，本发明涉及一种测定试剂盒，其包含特异性识别并结合具有n末端氨基酸序列mgntgptgav(seq id no.1)的肽的单克隆抗体，和以下中的至少一个：
[0061]-链霉亲和素包被的孔板；
[0062]-具有n末端氨基酸序列mgntgptgav(seq id no.1)的c末端生物素化肽；
[0063]-具有n末端氨基酸序列mgntgptgav(seq id no.1)的校准肽，
[0064]-抗体生物素化试剂盒；
[0065]-抗体hrp标记试剂盒；
[0066]-抗体放射性标记试剂盒；和
[0067]-测定可视化试剂盒。
[0068]
该试剂盒可用于鉴定将响应于免疫疗法，优选地使用免疫检查点抑制剂治疗的癌症患者。
[0069]
免疫测定试剂盒适用于实施根据第二方面的方法并且含有根据第一方面的单克隆抗体，因此第三方面的优选实施方式将从以上对第一方面和第二方面的优选实施方式的讨论中变得显而易见。
[0070]
在第四方面，本发明还涉及用免疫疗法治疗已被诊断患有癌症并且已知具有升高水平的肽c4-aa
1355
的受试者。优选地，免疫疗法包含至少一种免疫检查点抑制剂。如本文所用，“升高水平的肽c4-aa
1355”是指肽的量显著高于在正常健康对照和/或已被诊断患有癌症但尚未响应于免疫疗法，特别是免疫检查点抑制剂的受试者中检测到的量。
[0071]
癌症可以是转移性的。癌症优选选自黑色素瘤、乳腺癌、结肠直肠癌、胃癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、卵巢癌、前列腺癌或包括胰腺导管腺癌的胰腺癌。优选地，受试者患有黑色素瘤，特别是转移性黑色素瘤。
[0072]
在第五方面，本发明还涉及预测患有癌症的受试者的存活结果的方法，所述方法包括检测具有n末端氨基酸序列mgntgptgav(seq id no.1)的肽的存在。
[0073]
优选地，该方法是免疫测定。更优选地，该方法包括将获自受试者的生物流体样品与根据本发明的第一方面的单克隆抗体接触，并检测单克隆抗体与样品中的肽之间的结合。
[0074]
根据第五方面的方法利用了第一方面的单克隆抗体，因此第五方面的优选实施方式将从以上对第一方面的优选实施方式的讨论中显而易见。
[0075]
优选地，检测是定量的。因此，该方法可以包括检测和确定单克隆抗体和样品中的肽之间的结合量。
[0076]
优选地，免疫测定是竞争性免疫测定。
[0077]
优选地，免疫测定是酶联免疫吸附测定(elisa)或电化学发光免疫测定(eclia)。优选地，elisa是竞争性elisa。优选地，eclia是竞争性eclia。
[0078]
生物流体样品可以是但不限于血液、血清、血浆、尿液或来自细胞或组织培养物的上清液。优选地，生物流体是血清或血浆，最优选是血清。
[0079]
在第二方面的方法中，样品获自已被诊断患有癌症的受试者。癌症优选选自黑色素瘤、乳腺癌、结肠直肠癌、胃癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、卵巢癌、前列腺癌或包括胰腺导管腺癌的胰腺癌。优选地，受试者患有胰腺癌，更优选地患有胰腺导管腺癌。
[0080]
该方法可以进一步包括将检测到的肽的量与正常健康受试者相关的值和/或获自
癌症患者例如已被诊断患有相同癌症的患者的值相关联。如果测得的对n末端氨基酸序列mgntgptgav(seq id no.1)具有特异性的单克隆抗体的结合量处于癌症患者，特别是患有相同类型癌症的患者中测量的水平的顶部或底部四分位数(q1或q4)，这表明患者很可能预后不良，死亡风险增加。如果测得的对n末端氨基酸序列mgntgptgav(seq id no.1)具有特异性的单克隆抗体的结合量处于癌症患者，特别是患有相同类型癌症的患者中测量的水平的中间的四分位数(q2 q3)，这表明患者具有降低的死亡风险。
[0081]
如本文所用，术语“与正常健康受试者相关的值和/或获自癌症患者的值”是指对于被认为健康即没有癌症的受试者通过上述方法确定的标准化量，和/或对于已知患有癌症的受试者通过上述方法确定的标准化量。
[0082]
在根据第五方面的方法的一些实施方式中，对iv型胶原蛋白肽的表位具有特异性的单克隆抗体与n末端氨基酸序列mgntgptgav(seq id no.1)的结合量与一种或多种相关预定的截止值相关联。
[0083]
如本文所用，“截止值”是指经统计学确定以指示死亡风险降低的结合量。在统计截止值内的患者样品中的生物标志物结合的测量值可以对应于死亡风险降低的至少70％的概率，优选地至少80％的概率，优选地至少85％的概率，更优选地至少90％的概率，最优选地至少95％的概率。“截止值”可以通过比较获自已被诊断患有癌症并具有已知生存时间的患者的结果来计算。
[0084]
定义
[0085]
如本文所用，术语“肽”和“多肽”同义使用。
[0086]
如本文所用，术语“单克隆抗体”是指完整抗体及其保留完整抗体的结合特异性的片段，例如fab片段、f(ab')2片段、单链fv片段或本领域技术人员已知的其他此类片段。众所周知，完整抗体通常具有两对相同的多肽链的“y形”结构，每对多肽链由一条“轻”链和一条“重”链组成。每条轻链和重链的n末端区域包含可变区，而每条重链和轻链的c末端部分构成恒定区。可变区包含三个互补决定区(cdr)，主要负责抗原识别。恒定区允许抗体招募免疫系统的细胞和分子。保留结合特异性的抗体片段至少包含cdr和剩余可变区的足以保留所述结合特异性的部分。
[0087]
在本发明中，单克隆抗体可以包含本领域已知的任何恒定区。人恒定轻链分为κ和λ轻链。恒定重链分为μ、δ、γ、α或ε，并将抗体的同种型分别定义为igm、igd、igg、iga和ige。igg同种型具有若干亚类，包括但不限于igg1、igg2、igg3和igg4。单克隆抗体可优选为igg同种型，包括igg1、igg2、igg3或igg4中的任一种。
[0088]
可以使用本领域已知的方法例如kabat等人
19
描述的方法来确定抗体的cdr。如实施例中所述，可以从b细胞克隆产生抗体。抗体的同种型可以通过对人igm、igg或iga同种型或人igg1、igg2、igg3或igg4亚类特异的elisa确定。产生的抗体的氨基酸序列可以使用标准技术确定。例如，可以从细胞中分离rna，并用于通过逆转录产生cdna。然后使用扩增抗体重链和轻链的引物对cdna进行pcr。例如，对所有vh(可变重链)序列的前导序列特异的引物可以与结合位于先前已确定的同种型恒定区中的序列的引物一起使用。轻链可以使用结合κ或λ链的3'末端的引物以及与vκ或vλ前导序列退火的引物一起扩增。可以生成全长重链和轻链并对所述全长重链和轻链测序。
[0089]
如本文所用，术语“c末端”是指多肽的末端，即在多肽的c末端，并且不应被解释为
在其一般方向上的含义。同样，术语“n末端”是指多肽的末端，即在多肽的n末端，并且不应被解释为在其一般方向上的含义。
[0090]
如本文所用，术语“竞争性免疫测定”是指一种免疫测定，其中样品中存在的靶肽(如果有的话)与已知量的肽靶标(例如与固定底物结合或被标记)竞争结合抗体，这是本领域技术人员已知的技术。
[0091]
如本文所用，术语“elisa”(酶联免疫吸附测定)是指一种免疫测定，其中使用与酶例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶连接的抗体检测样品中存在的靶肽(如果有的话)。然后通过与产生可测量产物的底物一起孵育评估酶的活性。从而可以检测和/或量化样品中靶肽的存在和/或量。elisa是本领域技术人员已知的技术。
[0092]
如本文所用，术语“eclia”(电化学连接的免疫吸附测定)是指一种免疫测定，其中使用与电化学发光标记例如sulfo-tag系统连接的抗体检测样品中存在的靶肽(如果有的话)。将电施加到样品上，引起电化学发光标记发光。然后测量光强度以量化样品中的靶肽。从而可以检测和/或量化样品中靶肽的存在和/或量。eclia是本领域技术人员已知的技术。
[0093]
如本文所用，术语“结合量”是指单克隆抗体与靶肽之间结合的量化，其中所述量化通过将生物流体样品中靶肽的测量值与校准曲线进行比较确定，其中校准曲线是使用已知浓度的靶肽的标准样品产生。在本文公开的测量生物流体中具有n末端氨基酸序列mgntgptgav(seq id no.1)的靶肽的特定测定中，使用已知浓度的具有n末端氨基酸序列mgntgptgav(seq id no.1)(并且其可以特别地由氨基酸序列mgntgptgav(seq id no.1)组成)的校准肽的标准样品产生校准曲线。将生物流体样品中的测量值与校准曲线进行比较，以确定样品中靶肽的实际数量。
[0094]
如本文所用，“免疫疗法”是指在癌症治疗中人工刺激免疫系统的方法。存在许多不同类型的免疫疗法，包括但不限于t细胞衔接器、car t细胞疗法、细胞因子和免疫检查点抑制剂。优选地，免疫疗法包含施用至少一种免疫检查点抑制剂，例如伊匹单抗、帕博利珠单抗、纳武单抗、阿替利珠单抗、阿维鲁单抗、德瓦鲁单抗、西米普利单抗或其组合。优选地，免疫检查点抑制剂是伊匹单抗。
[0095]
如本文所用，术语“c4-aa
1355”或“c4g”是指具有由引起在氨基酸f
1354
和m
1355
之间裂解的蛋白酶产生的n末端氨基酸序列mgntgptgav(seq id no.1)的vi型胶原蛋白α2链新表位肽。优选地，蛋白酶是丝氨酸蛋白酶，例如颗粒酶b或基质金属蛋白酶，例如mmp-9。
附图说明
[0096]
现在将在参考以下附图的以下实施例中描述本发明：
[0097]
图1显示了c4-aa
1355
单克隆抗体的特异性。
[0098]
在竞争性c4-aa
1355 eclia中测试单克隆抗体对以下的反应性：a)选择肽(mgntgptgav(seq id no.1))、延长肽(fmgntgptgav(seq id no.7))、截短肽(gntgptgav(seq id no.3))、无义选择肽(llardfekny(seq id no.18))和无义包被肽(llardfekny-k-生物素)以及(b)选择肽(mgntgptgav(seq id no.1))和去选择肽1(mgqtgptgav(seq id no.4))、2(mgnsgptgav(seq id no.5))和3(qgntgptgav(seq id no.6))。％b/b0：b等于样品孔的强度(x ng/ml肽的od)，b0等于最大强度(od，0ng/ml肽的od)。
[0099]
图2显示了含有mmp-9或颗粒酶b的iv型胶原蛋白α2链的蛋白水解降解。
[0100]
iv型胶原蛋白α2链与mmp-9(a)或颗粒酶b(gzb)(b)孵育72小时，然后测量c4-aa
1355 eclia水平。
[0101]
图3显示了转移性黑色素瘤患者的血清c4-aa
1355
水平。
[0102]
基线和伊匹单抗治疗后3周血清中的c4-aa
1355
水平(n＝41)。使用wilcoxon配对秩检验比较血清水平。
[0103]
图4显示了总生存期的kaplan-meier分析。
[0104]
伊匹单抗治疗的转移性黑色素瘤患者的总生存期，对于c4-aa
1355
，为上四分位数(q2 q3 q4)的治疗前水平对比下四分位数(q1)的治疗前水平(截止值：14.5ng/ml)(a)，而对于c4m，它是上四分位数(q4)的治疗前水平对比下四分位数(q1 q2 q3)的治疗前水平(截止值：35.0ng/ml)(b)。对数秩检验用于确定生存曲线之间的差异，其中p《0.05的p值被认为具有统计学意义。
[0105]
图5显示了转移性黑色素瘤患者中c4-aa
1355
和c4m水平之间的相关性。
[0106]
进行皮尔森相关分析以描述来自用伊匹单抗治疗(n＝54)的转移性黑色素瘤的治疗前血清中c4-aa
1355
和c4m水平之间的关系。
[0107]
图6显示了癌症患者和健康对照的血清c4-aa1355水平。
[0108]
a)健康对照(n＝40)、乳腺癌(n＝13)、结肠直肠癌(crc)(n＝7)、胃癌(n＝9)、非小细胞肺癌(nsclc)(n＝12)、小细胞肺癌(sclc)(n＝7)、黑色素瘤(n＝7)、卵巢癌(n＝10)、胰腺癌(n＝2)和前列腺癌(n＝13)的血清c4-aa
1355
水平。使用针对dunn的多重比较调整的kruskal-wallis检验对各组进行比较。b)使用未配对的mann-whitney检验将来自健康对照(n＝40)的血清中的c4-aa
1355
水平与癌症患者的联合组(n＝80)进行比较。黑色水平线代表一式两份测量的患者的中值。c)进行皮尔森相关分析以描述来自癌症患者的联合组(n＝80)的血清中c4-aa
1355
和c4m水平之间的关系。
[0109]
图7显示了根据早期和晚期胰腺导管腺癌(pdac)的血清c4g(c4-aa
1355
)水平。*p《0.05
[0110]
图8显示了通过在第25个百分位和第75个百分位(q1 q4与q2 q3)分组(二分法)在基线评估与c4g(c4-aa
1355
)相关的总生存期(os)的kaplan meier曲线图。
具体实施方式
[0111]
在以下实施例中描述和公开了各种实施方式，这些实施例旨在帮助理解本公开并且不应被解释为以任何方式限制如在随后的权利要求书中定义的本发明的范围。提出以下实施例是为了向本领域的普通技术人员提供完整的公开内容以及如何制作和使用所描述的实施方式的描述，并不旨在限制本公开的范围，也不旨在表示以下实验是全部或唯一进行的实验。已努力确保所用数字的准确性(例如数量、温度等)，但应考虑一些实验误差和偏差。除非另有说明，否则份数是重量份数，分子量是重均分子量，温度是摄氏度，压力是大气压或接近大气压。
[0112]
材料和方法
[0113]
除非另有说明，否则用于实验的所有试剂都是来自merck(whitehouse station,nj,usa)和sigma-aldrich(st.louis,mo,usa)的标准化学品。
[0114]
通过质谱法鉴定肽
[0115]
将来自人胎盘的iv型胶原蛋白(sigma aldrich，目录号c5533)以10:1的比例在37℃下进行蛋白水解消化24小时和72小时，然后在-80℃下储存直到质谱分析。
[0116]
将1μg样品(对应于100μl 50mm tris、150mm nacl、ph7.5缓冲液中的消化或未消化的胶原蛋白)在56℃下用10mm二硫苏糖醇还原30分钟，然后用40mm碘乙酰胺在室温下于黑暗中进行60分钟烷基化。将任何剩余的碘乙酰胺在室温下用10mm二硫苏糖醇淬灭5分钟。样品在37℃下于振荡器上以1:20的酶:底物比(wako化学品，目录号125-05061)用lys-c消化16小时。在消化物中加入100μl具有1％甲酸的1m nacl后，通过30kda过滤器(pall life sciences,目录号od030c34)，以去除gag，并根据制造商的说明，用反相vydac ultramicro spin c18柱(harvard apparatus,目录号74-7206)脱盐。在配备有easy nano-lc 1000系统(thermofisher scientific)的四极杆orbitrap台式质谱仪qexactive,(thermo scientific)上进行非靶向质谱分析。在填充有2μm颗粒的75μm
×
25cm的acclaim pepmap
tm rslc c18毛细管柱(thermofisher scientific)上进行分离。使用 2000v的喷雾电压和275℃的加热离子转移设置进行去溶剂化。使用300nl/分钟的流速和85分钟的线性二元梯度进行在线反相分离。梯度从3％溶剂b开始，进行4 分钟，然后在64 分钟内升至35％溶剂b，然后在5 分钟内升至45％溶剂b。最后，有机溶剂浓度在5 分钟内增加到90％，并在90％下保持7 分钟。在orbitrap质量分析仪中记录ms扫描(400
–
1200m/z)，该质量分析仪设置为200m/z下分辨率为70,000，1
×
106自动增益控制(agc)目标和100ms最大离子注入时间。ms之后在2
×
104强度阈值、2m/z隔离宽度和启用30秒的动态排除下对15个最强的多电荷离子以17,500的分辨率进行数据相关的碰撞诱导解离ms/ms扫描。使用智人(homo sapiens)蛋白质组(uniprot蛋白质组id up000005640)利用proteome discoverer 2.1软件(thermofisher scientific)从发现数据中进行鉴定。处理工作流程由以下节点组成：用于光谱预处理的光谱选择器(spectrum selector)(前体质量范围：300
–
30000da；s/n阈值：1.5)、sequest-ht搜索引擎(蛋白质数据库：见上文；酶：lys-c(半)；最大缺失切割位点：2；肽长度范围6-144个氨基酸；前体质量耐受性：10ppm；片段质量耐受性：0.02da；静态修饰：半胱氨酸氨基甲酰甲基化(cysteine carbamidomethylation)；和用于肽验证的渗透器(fdr《1％基于肽q值)。过滤结果以仅保留具有至少一个独特肽的主蛋白，并根据简约原则允许蛋白质分组。对于无标记定量(lfq)，总和取每种蛋白质的前3个肽段来反映蛋白质的强度。肽段的强度使用在proteome discoverer 2.1(thermofisher scientific)中开发的专有算法进行量化。
[0117]
肽的选择
[0118]
通过质谱鉴定的来自iv型胶原蛋白的每个肽的n末端和c末端的前六个氨基酸被认为是蛋白酶产生的新表位。使用nps@：使用uniprot/swiss-prot数据库的网络蛋白质序列分析(16)分析蛋白酶生成的序列与其他人蛋白质和物种的同源性。发现切割位点f
1354
↓m1355
(
1355
mgntgptgav
1364
)的c末端氨基酸序列对于人iv型胶原蛋白α2链是独特的，并被选择为抗体生产的靶标。用于单克隆抗体生产和测量蛋白酶介导的iv型胶原蛋白(c4-aa
1355
)降解的eclia的技术评估的合成肽购自genscript，如表1所示。
[0119]
表1：用于c4-aa
1355
测试开发和验证的合成肽
nhs-酯接合,meso scale discovery,目录号r31aa-1)标记的单克隆抗体至终浓度为25ng/ml，板在4℃下在黑暗中震荡(300rpm)孵育20小时。在所有孵育步骤之后，在洗涤缓冲液(20mm tris、50mm nacl、ph 7.2)中洗涤板3次。最后，添加150μl/孔的msd gold读取缓冲液(meso scale discovery,目录号r92tg-2)，并在2分钟内立即在sector imager 6000(meso scale discovery)中读取板。sulfo-tag在通电时启用发光，并使用msd discovery workbench 4.0软件分析发光数据。使用4参数曲线拟合模型计算分析物浓度。
[0128]
c4-aa
1355
测定的技术评估
[0129]
使用背景平均值加上2.5倍的标准偏差从十次独立运行中确定检测下限。使用最高浓度的选择肽的反向校准浓度减去2.5倍的标准偏差，从相同的10次运行中确定检测上限。测定内和测定间变化由七个样品的十次独立运行确定，一式两份，浓度覆盖标准曲线的整个线性范围。样品由在测定缓冲液中具有不同量的选择肽的四个样品和三个不同的健康人血清样品组成。测定内变化计算为板内的平均变化系数(cv％)，测定间变化计算为十个板之间的平均cv％。为了确定测定的线性度，对人血清(n＝3)或edta血浆样品(n＝3)进行两倍稀释，并将线性度计算为未稀释样品的回收率百分比。通过人血清的四个重复冷冻/解冻循环(每个循环n＝3)测试分析物稳定性，并以第一个循环作为参考计算分析物回收率。此外，通过在4℃或20℃下孵育人血清样品24或48小时(每个时间点n＝3)测试分析物稳定性，并以储存在-20℃的样品作为参考来计算回收率。通过向血清样品中添加低/高含量的生物素(3.0/9.0ng/ml)、脂血(1.5/5.0mg/ml)和血红蛋白(2.5/5.0mg/ml)来测试干扰，并以血清样品作为参考计算回收率。
[0130]
体外iv型胶原蛋白的裂解
[0131]
将重组iv型胶原蛋白α2链(mybiosource)和mmp-9(giotto,目录号g04mp09c)或颗粒酶b(abcam,目录号ab168093)分别在37℃下以10:1(10μgiv型胶原蛋白和1μg蛋白酶)在mmp缓冲液(50mm tris-hcl、150nm nacl、10mm cacl2、10μm zncl、0.05％brij35，ph 7.5)或gzb缓冲液(50mm tris、150mm nacl，ph 7.5)中孵育72小时，然后在-80℃下储存直至分析。用mmp-9或gzb消化羧甲基化转铁蛋白作为阳性对照，单独添加mmp-9的mmp缓冲液和单独添加gzb的gzb缓冲液作为阴性对照。mmp-9和gzb的活性通过考马斯亮蓝染色得到证实(数据未显示)。
[0132]
c4-aa
1355
测定的临床验证
[0133]
在知情同意后，在丹麦的herlev医院和aarhus大学医院(herlev hospital and aarhus university hospital,denmark)用从作为护理标准的伊匹单抗(3mg/kg体重)治疗的iv期黑色素瘤患者(n＝54)中收集血清样品。该研究已获得丹麦首都地区伦理委员会(ethics committee for the capital region of denmark)(h-2-2012-058)的批准，符合1975年赫尔辛基宣言(helsinki declaration)。在基线和第一次治疗后3周(第2次剂量治疗之前)收集血清样品。
[0134]
来自其他癌症患者的血清样品获自商业供应商asterand bioscience(detroit,mi,usa)并且包括乳腺癌(n＝13)、结肠直肠癌(crc)(n＝7)、胃癌(n＝9)、非小细胞肺癌(nsclc)(n＝12)、小细胞肺癌(sclc)(n＝7)、黑色素瘤(n＝7)、卵巢癌(n＝10)、胰腺癌(n＝2)和前列腺癌(n＝13)。这些样品是在知情同意并适当的机构审查委员会根据赫尔辛基宣言批准后收集的。
[0135]
在癌症患者的血清样品中评估c4m，以与新开发的生物标志物c4-aa
1355
进行比较。基于由nordic bioscience(herlev,denmark)制造的对mmp-9介导的iv型胶原蛋白降解的新表位具有特异性的单克隆抗体，c4m竞争性elisa是一种充分表征的测定方法，并根据制造商的规格进行测量(18)。
[0136]
统计分析
[0137]
wilcoxon匹配对符号秩检验(wilcoxon matched pairs signed rank test)用于比较黑色素瘤患者在基线与在第3周的生物标志物水平。kaplan-meier生存曲线用于分析黑色素瘤患者的总生存期(os)，对于c4-aa
1355
，为上四分位数(q2 q3 q4)的治疗前水平对比下四分位数(q1)的治疗前水平，而对于c4m，它是上四分位数(q4)的治疗前水平对比下四分位数(q1 q2 q3)的治疗前水平。
[0138]
使用针对dunn多重比较进行调整的kruskal-wallis检验将来自不同癌症患者的血清样品中的c4-aa
1355
水平与健康对照进行比较。使用未配对的mann-whitney检验将健康对照与癌症患者的联合组进行比较。进行皮尔森相关分析以分别描述来自转移性黑色素瘤和癌症患者联合组的血清中的c4-aa
1355
和c4m水平之间的关系。p《0.05的p值被认为具有统计学意义。使用graphpad prism版本7(graphpad software,ca,usa)进行图表和统计分析。
[0139]
结果
[0140]
新型c4-aa
1355
测定的特异性
[0141]
测试了新型竞争性c4-aa
1355 eclia中单克隆抗体的特异性。选择肽以剂量依赖性方式抑制信号，而延长肽、截短肽和无义选择肽不抑制信号(图1a)。使用无义生物素化肽时未观察到信号(图1a)。当对与选择肽相比只有一个氨基酸错配的肽进行反应性测试时，在0-30ng/ml的肽浓度下未检测到反应性，而去选择肽2在最高浓度下将信号抑制到65％(图1b)。总之，这些数据表明单克隆抗体对选择肽上的新表位具有高度特异性。
[0142]
通过mmp-9对iv型胶原蛋白的蛋白水解降解
[0143]
为了确认c4-aa
1355
抗体/测定识别蛋白酶产生的iv型胶原蛋白新表位，c4-aa
1355
在未消化的iv型胶原蛋白、mmp-9消化的iv型胶原蛋白和gzb消化的iv型胶原蛋白中测量。如图2所示，c4-aa
1355
仅在mmp-9消化的样品和gzb消化的样品中可检测到，而在未消化的(无蛋白酶)样品中未检测到水平，表明该抗体对蛋白酶产生的新表位具有特异性。
[0144]
c4-aa
1355
测定的技术评估
[0145]
通过表2中总结的不同技术验证步骤进一步评估了c4-aa
1355 eclia测定的技术性能。该测定的检测范围为0.6-832ng/ml。测定内和测定间的差异为6％和8％，分别低于10％和15％的接受标准。从未稀释到1:4的稀释度都检测到线性度，血清和edta血浆的稀释回收率分别为94％和106％。在4次冷冻/解冻循环后，血清中的分析物回收率为96％。人血清在4℃或20℃下48小时的长时间储存后，分析物回收率分别为122％和109％。血清中低或高含量的脂血或血红蛋白均未检测到干扰，回收率为92-111％。低含量的生物素不会干扰分析物，而高含量的生物素则会，回收率分别为94％和71％。回收率的可接受标准在100
±
20％以内。总之，这些结果表明c4-aa
1355 eclia是一种技术稳健的测定。
[0146]
表2：c4-aa
1355
测定的技术验证
[0147][0148]
百分比报告为平均值
[0149]
伊匹单抗治疗的转移性黑色素瘤患者中c4-aa
1355
测定的临床评估
[0150]
为了评估c4-aa
1355
的生物标志物潜力，在基线和伊匹单抗治疗后3周，在转移性黑色素瘤患者的血清中测量了c4-aa
1355
。当生物标志物水平配对时，治疗后3周c4-aa
1355
水平略有升高(p＝0.090)(图3)。
[0151]
接下来，通过kaplan-meier曲线评估c4-aa
1355
生物标志物与生存结果之间的关联。与低水平(q1)相比，c4-aa
1355
的高基线水平(q2 q3 q4)与更长的总生存期(os)显著相关(p＝0.040)(图4a)。生物标志物高患者的中位os为646天，而生物标志物低患者的中位os为290天。
[0152]
由于c4-aa
1355
和c4m生物标志物测量iv型胶原蛋白上两种不同的蛋白酶产生的新表位，因此还评估了c4m和os之间的关联。这些关于c4m的发现先前已发表
(8)
，在54名患者中测量的c4m的结果如图4b所示。对于c4m生物标志物，与低水平(q1 q2 q3)相比，高基线水平(q4)与较短的os显著相关(p＝0.005)(图4b)。有趣的是，这两种生物标志物与结果显示出相反的关联。
[0153]
此外，研究了转移性黑色素瘤患者在基线的c4-aa
1355
和c4m水平之间的关联。c4-aa
1355
和c4m不相关(r＝0.021，p＝0.883)(图5)。
[0154]
c4-aa
1355
测定在其他癌症患者中的临床评估
[0155]
为了进一步评估c4-aa
1355
的生物标志物潜力，在患有乳腺癌、crc、胃癌、nsclc、sclc、黑色素瘤、卵巢癌、胰腺癌或前列腺癌的不同癌症患者的血清中和来自健康对照的血清中进行c4-aa
1355
的测量。观察到每组患者中c4-aa
1355
生物标志物水平的患者间变化(图6a)。将健康对照的中位c4-aa
1355
水平与每组癌症患者进行比较时，未观察到显著差异(图6a)。然而，当比较健康对照和癌症患者联合组中的c4-aa
1355
时，与健康对照(12.0ng/ml)相比，癌症患者中的c4-aa
1355
水平显著升高(14.8ng/ml)(p＝0.006)(图6b)。
[0156]
如第一个队列所示，这些癌症患者中的c4-aa
1355
和c4m水平再次不相关(r＝0.197，p＝0.080)(图6c)。
[0157]
在基线测量的血清c4-aa
1355
(c4g)预测化疗治疗的胰腺导管腺癌(pdac)患者的结果
[0158]
在来自40名胰腺导管腺癌(pdac)患者的治疗前血清样品中测量了c4-aa
1355
(c4g)。所有患者均来自danish biopac研究“胰腺癌患者的生物标志物”(nct03311776)。从2008年12月到2017年9月，从六家丹麦医院招募患者。pdac患者具有组织学证实的肿瘤。根据国家指南(www.gicancer.dk)，用各种类型的化疗治疗pdac患者。该研究是根据丹麦区域健康研究伦理委员会(danish regional committee on health research ethics)的建议进行的。biopac方案已获得丹麦区域健康研究伦理委员会(vek ref.ka-20060113)和数据保护局(j.nr.2006-41-6848)的批准。所有受试者均根据赫尔辛基宣言第8版签署书面知情同意书。在诊断时或手术前获得血样。根据国家批准的血液标准操作程序(www.herlevhospital.dk/biopac.dk)处理样品。前瞻性收集患者的血清样品和临床数据。对血清样品进行盲测。
[0159]
根据图7中的疾病阶段显示结果。晚期pdac患者与早期pdac患者相比，血清中的c4-aa
1355
显著降低(mann whitney检验，p值＝0.0132)。评估了pdac在基线和总生存期(os)与c4-aa
1355
的可能关联。使用第25个百分位和第75个百分位切点来定义具有“极端”c4-aa
1355
水平(《第25个百分位 》第75个百分位，即四分位1和四分位4，q1 q4)和kaplan meier分析的组，发现“非极端”水平(》第25个百分位至《第75个百分位，q2 q3)的c4-aa
1355
患者提高了总体存活率(图8)。支持单变量cox回归分析显示，具有“非极端”c4-aa
1355
水平的患者亚组的死亡风险降低(表3)。此外，多变量cox回归分析表明，c4-aa
1355
的预测值与阶段无关。
[0160][0161]
讨论和结论
[0162]
已经开发和验证了一种稳健且特定的竞争性eclia，其能够使得由蛋白酶介导的iv型胶原蛋白(c4-aa
1355
)降解产生的新表位进行非侵入性测量。这些黑色素瘤患者中c4-aa
1355
的高基线水平与对免疫检查点抑制剂治疗的临床响应(更长的总生存期)相关。相反，高基线水平的c4m与较短的总生存期相关。这些样品中的c4-aa
1355
和c4m水平不相关。c4-aa
1355
和c4m都测量iv型胶原蛋白上的新表位，但在两个不同的位点进行测量，有趣的是，这些数据表明这些不同的切割产物在两种不同的病理事件期间释放，当在基线测量时，一种与良好的结果相关，一种与不良的结果相关。此外，与基线相比，在免疫检查点抑制剂治疗后3周，在转移性黑色素瘤患者的血清中检测到c4-aa
1355
水平略有升高。
[0163]
c4-aa
1355
与这些黑色素瘤患者对免疫检查点抑制剂治疗的临床响应相关的发现表明，c4-aa
1355
测定在免疫肿瘤学环境中具有生物标志物潜力，以识别响应于治疗的具有t细胞允许性肿瘤微环境的癌症患者。c4-aa
1355
可以反映蛋白酶介导的t细胞从循环系统到
底层基质的迁移。相反，支持先前发现的c4m与不良响应相关表明c4m与肿瘤活性和反应性基质有关
(8-10)
。
[0164]
有趣的是，这项研究表明，一种iv型胶原蛋白新表位片段与肿瘤发生(c4m)相关，另一种iv型胶原蛋白新表位片段与t细胞浸润(c4-aa
1355
)相关，这支持了测量病理特异性新表位而不仅仅是总蛋白质的价值。
[0165]
c4-aa
1355
在黑色素瘤以外的其他癌症类型中也升高，这表明该生物标志物在其他适应症中具有潜力。此外，在这些癌症患者中，c4-aa
1355
和c4m水平之间再次没有关联，证实这些生物标志物反映了肿瘤微环境的病理不同方面。
[0166]
发现c4-aa
1355
在早期胰腺导管腺癌(pdac)患者中升高。此外，发现那些具有极端水平(即在第1或第4个四分位数)的标志物c4-aa
1355
的患者总体存活率降低。
[0167]
据我们所知，这是表明这种特定蛋白酶介导的iv型胶原蛋白(c4-aa
1355
)的降解在癌症中具有生物标志物潜力并与响应于免疫检查点抑制剂治疗相关的首次研究。
[0168]
参考文献
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