用于生产来自日本曲霉的果糖基转移酶的核酸、载体、宿主细胞和方法与流程

1.本发明涉及基因工程的领域。更具体地，本发明涉及获得作为分泌蛋白的新重组果糖基转移酶的改良生产，该重组果糖基转移酶由日本曲霉的ft基因编码。


背景技术：

2.也称为低聚果糖(fos)的果糖低聚物构成一系列同源低聚糖。低聚果糖通常由式gfn表示，并且主要由1-蔗果三糖(gf2)、蔗果四糖(gf3)和蔗果五糖(β-fructofuranosylnystose)(gf4)组成，其中两个、三个和四个果糖基单元结合在葡萄糖的β-2,1位置。
3.低聚果糖(fos)的特征在于许多有益特性，比如低甜味强度和可作为益生元。由于低聚果糖的低甜味强度(约为蔗糖的三分之一至三分之二)和低热值(约为0至3kcal/g)，低聚果糖可作为糖替代品用于各种食品中。此外，作为益生元，已有报道低聚果糖用作针对结肠癌的保护剂，增强免疫系统的各种参数，改善矿物质吸收，对血脂和胆固醇浓度的有益影响，并且展示出对于控制肥胖和糖尿病的血糖控制(dominguez，ana luisa等人，“an overview of the recent developments on fructooligosaccharide production and applications.”food and bioprocess technology 7.2(2014):324-337)。
4.然而，低聚果糖仅在水果、蔬菜和蜂蜜中作为天然成分微量存在。由于这种低浓度，从食品中提取低聚果糖在实践中是不可能的。
5.已尝试通过具有转糖基化活性的微生物酶由蔗糖酶促合成低聚果糖。然而，之前尝试中的主要限制因素是较低的催化效率，葡萄糖对酶的反馈抑制导致fos产量较低，而且通过在重组宿主系统中表达的酶来转化蔗糖需要更长的时间。此外，由于与酶的大规模表达、酶的稳定性、发酵和纯化过程相关的另外限制，具有转果糖基化活性的微生物酶的工业生产具有挑战性。
6.低聚果糖的商业规模生产需要鉴定和大规模生产高效的酶。由于上述限制，生产具有高效转糖基化活性的微生物酶是一项成本高昂的工作，而这又增加了低聚果糖的生产成本。
7.因此，长期以来都需要鉴定和提供高效、廉价并且可工业大规模生产具有优良转糖基化活性的微生物酶的方法，该方法又能够降低低聚果糖的生产成本。


技术实现要素：

8.技术问题
9.本发明要解决的技术问题是鉴定和提高生产来自日本曲霉(aspergillus japonicus)的新果糖基转移酶(uniprotkb:f1adk9_aspja)的产量。
10.问题的解决方案
11.通过对核酸序列、蛋白质序列、启动子、重组载体、宿主细胞和分泌信号肽进行工
程化改造实现日本曲霉的新果糖基转移酶的过表达解决了这一问题，从而实现新重组果糖基转移酶的高产量。
12.另外，对发酵策略进行了修改，以获得约2至5gm/l重组果糖基转移酶的高产量。
13.发明概述
14.本发明涉及用于重组表达新果糖基转移酶的核酸、蛋白质序列、载体和宿主细胞。本发明还涉及含有融合至新果糖基转移酶的信号肽的前体肽，其能够产生更高产率的作为分泌蛋白的高效酶。
15.本发明还涉及用于表达作为分泌蛋白的新重组果糖基转移酶的方法。该果糖基转移酶的浓度约为2至5gm/l。过滤后，酶的纯度接近85％，无需成本高昂的色谱程序。
附图说明
16.从结合附图的下述描述，本公开的特征将变得更显而易见。应理解，附图仅描述了根据本公开的几种实施方式，并且不应被视为对其范围的限制，以下将通过利用附图来进一步描述本发明。
17.图1描绘了编码果糖基转移酶的天然ft基因和修饰的ft基因的序列比对。
18.图2表示ppiczαa载体的构建方案。
19.图3描绘了对重组质粒ppiczαa-ft进行限制性酶切分析的结果。
20.图4描绘了由重组毕赤酵母宿主细胞诱导果糖基转移酶的表达。
21.图5(a)描绘了在表达重组果糖基转移酶的毕赤酵母km71h菌株发酵过程中的不同时间点间隔采集的样品的sds-page分析。图5(b)描绘了纯化后的重组果糖基转移酶的sds-page分析。
22.图6描绘了用于估计果糖基转移酶的活性的葡萄糖标准曲线。
23.图7描绘了由蔗糖和重组果糖基转移酶生成低聚果糖(fos)的过程。
24.图8描绘了fos样品的hplc分析色谱图。
25.序列和序列表的简要描述
26.seq id no:1-新果糖基转移酶的氨基酸序列(654个氨基酸)
27.seq id no:2-编码新果糖基转移酶的修饰的核酸序列(1965个碱基对)
28.表1：使用的修饰的信号肽
[0029][0030]
在所有分泌信号肽序列中，为了前体蛋白的有效kex2处理而添加了一段四个氨基酸片段(lekr)。
[0031]
表2：融合至信号肽的果糖基转移酶(ft)基因的修饰的核酸序列
[0032][0033]
seq id no:23-编码分泌型果糖基转移酶的ft基因(1965个碱基对)的天然核酸序列。
[0034]
表3：果糖基转移酶(ft)基因的生物活性片段是保守的并且使得其具有催化活性
[0035]
位置片段seo id no57-62qigdpcseq id no:24119-132dgavipvgvnntptseq id no:25320-330sglpivpqvsseq id no:26401-416gdqyeqadgfptaqqgseq id no:27
[0036]
定义
[0037]
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本方法所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。尽管在载体、宿主细胞、方法和组合物的实践或测试中也可使用与本文中描述的那些类似或等效的任何载体、宿主细胞、方法和组合物，但是现在描述代表性示例。
[0038]
应理解，在提供数值范围的情况下，该范围的上限和下限以及在该叙述的范围内的任何其他叙述值或中间值之间的每个中间值均囊括在该方法和组合物中。这些较小范围的上限和下限可独立地包括在较小范围内，并且也囊括在方法和组成的范围内，以该范围内任何具体排除的限制为准。在叙述的范围包括一个或两个界限的情况，则不包括其中一个或两个界限的范围也包括在方法和组合中。
[0039]
应理解，为清楚起见，在分开的实施方式的上下文中描述的方法的某些特征也可组合在单个实施方式中提供。相反，为简洁起见，在单个实施方式的上下文中描述的方法和组合的各种特征也可分开提供或以任何合适的子组合提供。应注意，如本文和所附权利要求中所使用的，除非上下文另有明确规定，否则单数形式“一个(a)”、“一个(an)”和“所述”包括复数指物。需要进一步指出的是，权利要求的撰写可排除任何可选的元素。因此，本声明旨在作为在表示权利要求要素或使用“否定式”限制时使用“只有”、“仅”等排他性术语的先决条件。
[0040]
对于本领域技术人员而言，在阅读本发明后显而易见的是，本文中描述和阐释的每个单独实施方式具有分开的组件和特征，在不背离本方法的范围或精神的情况下，这些组件和特征可以容易地与任何其他实施方式的特征分开或组合。任何引用的方法都可以按照引用事件顺序或逻辑上可能的任何其他顺序进行。
[0041]
术语“宿主细胞”包括单个细胞或细胞培养物，其可以是或曾经是表达构建物的受体。宿主细胞包括单个宿主细胞的后代。用于本发明目的的宿主细胞指任何可适当用于本发明目的的毕赤酵母(pichia pastoris)的菌株。可用于本发明目的的菌株的示例包括毕赤酵母的野生型菌株、mut 菌株、mut s菌株、mut-菌株，比如km71h、km71、smd1168h、smd1168、gs115、x33。
[0042]
术语“重组菌株”或“重组宿主细胞”指已经用本发明的表达构建体或载体转染或转化的宿主细胞。
[0043]
术语“表达载体”指设计用于使插入的核酸序列在转化到宿主后能够表达的任何载体、质粒或载体。
[0044]
术语“启动子”指定义基因转录起始的dna序列。启动子序列通常直接位于转录起始位点的上游或5’端。rna聚合酶和必要的转录因子与启动子序列结合并且启动转录。启动子可为组成型启动子或诱导型启动子。组成型启动子为允许相关基因持续转录的启动子，因为它们的表达通常不受环境和发育因素的制约。组成型启动子是基因工程中非常有用的工具，因为组成型启动子在无诱导剂的条件下驱动基因表达，并且通常比常用的诱导型启动子表现出更好的特性。诱导型启动子是由生物或非生物以及化学或物理因素的存在或不存在而诱导的启动子。诱导型启动子是基因工程中的一种非常强大的工具，因为在生物体的发育或生长的特定阶段，或在特定的组织或细胞类型中，可操作地连接至它们的基因的表达可以被开启或关闭。
[0045]
术语“可操作地连接”指核酸序列结合在单个核酸片段上，从而使一个片段的功能受另一个片段的调节。例如，当启动子能够调节编码序列的表达(即，编码序列在启动子的转录控制下)时，启动子与编码序列可操作地连接。
[0046]
术语“转录”指制造基因序列的rna拷贝的过程。这种称为信使rna(mrna)分子的拷贝离开细胞核并且进入细胞质，在细胞质中指导其编码的蛋白质的合成。
[0047]
术语“翻译”指在蛋白质合成过程中，将信使rna(mrna)分子序列翻译成氨基酸序列的过程。遗传密码描述了基因中碱基对序列与其编码的相应氨基酸序列之间的关系。在细胞质中，核糖体以三个碱基为一组读取mrna序列以组装蛋白质。
[0048]
术语“表达”指由编码序列编码的产物的生物生产。在大多数情况下，包括编码序列的dna序列被转录而形成信使rna(mrna)。信使rna随后被翻译成具有相关生物活性的多
肽产物。而且，表达过程可涉及转录的rna产物的进一步处理步骤，比如剪接以去除内含子，和/或多肽产物的翻译后处理。
[0049]
本文所使用的术语“修饰的核酸”用于指编码果糖基转移酶并且融合至信号肽的核酸。在实施方式中，修饰的核酸由seq id no:13、seq id no:14、seq id no:15、seq id no:16、seq id no:17、seq id no:18、seq id no:19、seq id no:20、seq id no:21、seq id no:22或其功能等效变体表示。功能变体包括任何与seq id no:13-22具有实质性或显著序列同一性或相似性并且保留其生物活性的核酸。
[0050]
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中互换使用，指通过肽键或修饰的肽键彼此连接的两个或更多个氨基酸残基。这些术语适用于氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基是相应天然氨基酸的人工化学模拟物，以及天然存在的氨基酸聚合物、含有修饰的残基的聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。“多肽”指短链(通常称为肽、寡肽或寡聚物)和长链(通常称为蛋白质)二者。多肽可以含有除20种基因编码的氨基酸以外的氨基酸。同样，“蛋白质”指至少两个共价连接的氨基酸，包括蛋白质、多肽、寡肽和肽。蛋白质可由天然存在的氨基酸和肽键或合成的拟肽结构组成。因此，本文使用的“氨基酸”或“肽残基”指天然存在的氨基酸和合成的氨基酸。“氨基酸”包括亚氨基酸残基，比如脯氨酸和羟脯氨酸。侧链可为(r)构型或(s)构型。
[0051]
术语“信号肽”或“信号肽序列”在本文中定义为通常存在于新合成的分泌或膜多肽的n端的肽序列，其引导多肽穿过或进入细胞的细胞膜(原核生物中的质膜和真核生物中的内质网膜)。其通常随后被移除。尤其是，所述信号肽可将多肽引导到细胞的分泌途径中。
[0052]
本文使用的术语“前体肽”指包括可操作地连接至日本曲霉果糖基转移酶的信号肽(也称为先导序列)的肽。在毕赤酵母宿主细胞内的翻译后修饰过程中，信号肽被切断，并且成熟的果糖基转移酶(seq id no:1)被释放至培养基中。
[0053]
本文提及前体肽/蛋白质时使用的术语“变体”指具有不会显著降低信号肽或酶的活性的氨基酸置换、添加、缺失或改变的肽。变体包括结构变体和功能变体。术语变体还包括使用取代的氨基酸代替未取代的亲代氨基酸。
[0054]
提供功能相似氨基酸的氨基酸替换表为本领域普通技术人员公知的。以下六组是视为彼此变体的氨基酸的示例：
[0055]
表4:氨基酸替换表
[0056] 氨基酸第1组丙氨酸(a)、丝氨酸(s)、苏氨酸(t)、甘氨酸(g)、脯氨酸(p)第2组天冬氨酸(d)、谷氨酸(e)、天冬酰胺(n)、谷氨酰胺(q)第3组精氨酸(r)、赖氨酸(k),组氨酸(h)第4组异亮氨酸(i)、亮氨酸(l)、蛋氨酸(m)、缬氨酸(v)第5组苯丙氨酸(f)、酪氨酸(y)、色氨酸(w)第6组半胱氨酸(c)
具体实施方式
[0057]
本发明公开了用于高效生产作为分泌蛋白的日本曲霉的生物活性和可溶性重组果糖基转移酶的核酸、载体和重组宿主细胞。此外，本发明提供了用于商业化规模生产重组
果糖基转移酶的方法。
[0058]
本发明考虑用于在异源宿主中获得高产量的新重组果糖基转移酶的多维度方法。果糖基转移酶的天然基因已经被修饰以在毕赤酵母中表达。此外，修饰的基因已经融合至一个或多个信号肽。
[0059]
在一个实施方式中，编码日本曲霉的新果糖基转移酶的修饰的核酸由seq id no:2表示。
[0060]
在另一实施方式中，修饰的核酸融合至一个或多个信号肽。
[0061]
在另一实施方式中，信号肽选自酿酒酵母(s.cerevisiae)的α因子(fak)、酿酒酵母的所有α因子(faks)、酿酒酵母的α因子_t(at)、黑曲霉(aspergillus niger)的α淀粉酶(aa)、泡盛曲霉(aspergillus awamori)的葡糖淀粉酶(ga)、马克思克鲁维酵母(kluyveromyces maxianus)的菊糖酶(in)、酿酒酵母的转化酶(iv)、酿酒酵母的杀手蛋白(kp)、原鸡(gallus gallus)的溶菌酶(lz)、智人(homo sapiens)的血清白蛋白(sa)。
[0062]
在另一实施方式中，下表5中提供了信号肽。
[0063]
表5：信号肽
[0064][0065]
在另一实施方式中，从表1中描述的修饰信号肽列表中选择信号肽。
[0066]
在另一实施方式中，融合至一个或多个修饰信号肽的核酸选自包括下述的组中：seq id no:13、seq id no:14、seq id no:15、seq id no:16、seq id no:17、seq id no:18、seq id no:19、seq id no:20、seq id no:21、seq id no:22和其变体。
[0067]
在另一实施方式中，在表达载体中克隆修饰的核酸。
[0068]
在另一实施方式中，表达载体被构建为用于分泌或细胞内表达来自日本曲霉的重组果糖基转移酶。
[0069]
在又一实施方式中，表达载体选自包括ppiczαa、ppiczαb、ppiczαc、pgapzαa、pgapzαb、pgapzαc、ppic3、ppic3.5、ppic3.5k、pao815、ppic9、ppic9k、il-d2和phil-s1的组中。
[0070]
融合至信号肽的修饰的果糖基转移酶(ft)基因的表达优选地由组成型启动子或诱导型启动子驱动。
[0071]
在另一实施方式中，待表达的核酸可操作地连接至启动子。
[0072]
在另一实施方式中，组成型启动子或诱导型启动子选自表6中列举的组中。
[0073]
表6：使用的启动子的列表
[0074][0075]
在另一实施方式中，启动子为aox1启动子，其由甲醇诱导并且由葡萄糖抑制。
[0076]
在实施方式中，在适当的宿主中转化含有修饰的目标基因(与核酸编码信号肽融合的果糖基转移酶基因)的表达载体。
[0077]
在另一实施方式中，在酵母细胞中转化含有感兴趣的基因的表达载体。
[0078]
在另一实施方式中，酵母细胞为毕赤酵母。
[0079]
在又一实施方式中，毕赤酵母宿主细胞是mut 菌株、mut s菌株或mut-菌株。mut 代表甲醇利用率 表型。
[0080]
在又一实施方式中，毕赤酵母宿主细胞株选自包括km71h、km71、smd1168h、smd1168、gs115、x33的组中。
[0081]
在另一实施方式中，本发明提供了果糖基转移酶前体肽，其中日本曲霉的果糖基转移酶融合至一个或多个信号肽。
[0082]
在另一实施方式中，日本曲霉的果糖基转移酶具有seq id no:l中表示的氨基酸
序列及其功能变体。功能变体包括与seq id no:l具有实质性或显著性序列同一性或相似性，或与seq id no:l具有实质性或显著性结构同一性或相似性，并保留其生物活性的任何蛋白质序列。
[0083]
在另一实施方式中，信号肽选自包括seq id no:3中表示的酿酒酵母(fak)的所有α因子、seq id no:4中表示的酿酒酵母(fak)的所有α因子、seq id no:5中表示的酿酒酵母(at)的α因子_t、seq id no:6中表示的黑曲霉(aa)的α淀粉酶，seq id no.7中表示的泡盛曲霉的葡糖淀粉酶(ga)、seq id no.8中表示的马克思克鲁维酵母的菊糖酶(in)、seq id no.9中表示的酿酒酵母的转化酶(iv)、seq id no.10中表示的酿酒酵母的杀手蛋白(kp)、seq id no.11中表示的原鸡的溶菌酶(lz)、seq id no.12中表示的智人血清白蛋白(sa)及它们的变体的组中。
[0084]
在一个实施方式中，提供了日本曲霉重组果糖基转移酶的生产方法。
[0085]
本发明的多个方面涉及含有修饰的重组果糖基转移酶(ft)基因的重组毕赤酵母细胞的发酵。发酵完成后，对发酵液进行离心，并使用微滤过滤，然后分离重组酶。回收的重组酶通过切向流超滤或蒸发浓缩，最后配制成浓缩酶。
[0086]
在一个实施方式中，高水平表达日本曲霉果糖基转移酶的方法包括下述步骤：
[0087]
a、在合适的发酵培养基中培养重组宿主细胞，以获得分泌至发酵液中的重组果糖基转移酶；
[0088]
b、从发酵液收获上清，其中上清中含有重组果糖基转移酶；和
[0089]
c、纯化重组果糖基转移酶。
[0090]
在另一实施方式中，发酵培养基为表7描述的基础盐培养基。
[0091]
在另一实施方式中，使用离心收集发酵液的上清。
[0092]
在一个实施方式中，用于启动发酵罐培养的接种物或发酵剂培养物的百分比在2.0％至15.0％(v/v)的范围内。
[0093]
在另一实施方式中，发酵培养基的ph保持在4.0至7.5的范围内，因为分泌的酶在该ph范围内经历适当的折叠并且具有生物活性。
[0094]
在又一实施方式中，发酵过程的温度在15℃至40℃的范围内。
[0095]
在另一实施方式中，发酵过程的时间在50小时至150小时的范围内。
[0096]
在另一实施方式中，使用连续在线离心以2000xg至15000xg范围内的速度离心发酵液。
[0097]
离心后获得的上清经过微滤和纯化，以回收具有生物活性的重组果糖基转移酶。
[0098]
在一个实施方式中，使用基于切向流过滤的超滤系统浓缩离心后获得的上清。
[0099]
切向流过滤(tff)系统中用于去除杂质和浓缩收集的培养上清的膜的截止留分子量范围可以为5kda至100kda。
[0100]
在另一实施方式中，由于分泌酶的高产量和纯度，该过程不需要离心。
[0101]
本发明中获得的果糖基转移酶浓度在2gm/l至5gm/l的范围内，纯度约为85％。
[0102]
实施例
[0103]
以下的实施例具体描述了实施本发明的方式。但是，本文公开的实施方式不以任何方式限制本发明的范围。
[0104]
实施例1：用于在毕赤酵母中表达日本曲霉的重组果糖基转移酶的修饰的核酸
[0105]
日本曲霉的天然果糖基转移酶(ft)的cdna由seq id no:23表示，并且新果糖基转移酶的氨基酸序列由seq id no:1表示。
[0106]
为了最大限度地在毕赤酵母中表达，对天然cdna进行了修饰。修饰的核酸由seq id no:2表示。图1中描绘了天然序列和修饰的序列之间的差异。
[0107]
对编码果糖基转移酶的表达盒进行了修饰，以最大限度地提高其在毕赤酵母中的表达。修饰的开放阅读框包括编码与信号肽融合的果糖基转移酶的修饰的核苷酸序列(seq id no:2)。核酸的设计使得编码的信号肽包括一段另外的四个氨基酸片段(lekr)，用于前体肽的有效kex2处理。
[0108]
在毕赤酵母中表达的优选密码子已经代替稀有密码子。
[0109]
与修饰的信号肽融合的编码果糖基转移酶的修饰的开放阅读框的核苷酸序列如下：
[0110]
·
酿酒酵母的α因子(fak)由seq id no:13表示
[0111]
·
酿酒酵母的全部α因子(faks)由seq id no:14表示
[0112]
·
酿酒酵母的α因子_t(at)由seq id no.15表示
[0113]
·
黑曲霉的α淀粉酶由(aa)由seq id no:16表示
[0114]
·
泡盛曲霉的葡糖淀粉酶(ga)的糖化酶由seq id no:17表示
[0115]
·
马克思克鲁维酵母的菊糖酶(in)由seq id no:18表示
[0116]
·
酿酒酵母的转化酶(iv)由seq id no:19表示
[0117]
·
酿酒酵母的杀手蛋白(kp)由seq id no:20表示
[0118]
·
原鸡的溶菌酶(lz)由seq id no:21表示
[0119]
·
智人的血清白蛋白(sa)由seq id no:22表示。
[0120]
通过化学合成将seq id no:13核酸序列克隆至ppiczαa载体中，并且使用seq id no:13表达盒作为模板，通过重叠延伸pcr生成剩余修饰的核酸序列。
[0121]
实施例2：融合至信号肽的果糖基转移酶的多肽序列
[0122]
通过翻译与信号肽融合的编码日本曲霉的果糖基转移酶的基因而获得重组前体蛋白。
[0123]
在修饰的前体肽中使用的信号肽为由seq id no:3表示的酿酒酵母的α因子(fak)、由seq id no:4表示的酿酒酵母(fak)的所有α因子、由seq id no:5表示的酿酒酵母(at)的α因子_t、由seq id no:6表示的黑曲霉(aa)的α淀粉酶、由seq id no.7表示的泡盛曲霉的葡糖淀粉酶(ga)、由seq id no.8表示的马克思克鲁维酵母的菊糖酶(in)、由seq id no.9表示的酿酒酵母的转化酶(iv)、由seq id no.10表示的酿酒酵母的杀手蛋白(kp)、由seq id no.11表示的原鸡的溶菌酶(lz)和由seq id no.12表示的智人的血清白蛋白(sa)。修饰的信号肽含有另外的四个氨基酸片段(lekr)，用于前体肽的有效kex2处理。
[0124]
在毕赤酵母宿主细胞内的翻译后修饰期间，信号肽被切断，并且包括seq id no:1的氨基酸序列的成熟重组果糖基转移酶被释放至培养基中。
[0125]
实施例3：通过用重组质粒的转化来开发重组宿主细胞
[0126]
该过程中使用的载体是ppiczαa。载体包括如实施例1中描述的修饰的开放阅读框和诱型导启动子aox1。将编码重组蛋白的修饰的序列克隆至ppiczαa载体中。
[0127]
编码果糖基转移酶(ft)基因的修饰的核酸seq id no:2克隆在存在于ppiczαa载
体的mcs中的xhoi/sacii限制性位点之间，以使酿酒酵母的信号序列α因子(fak)进入框架，从而使用常规分子生物学程序产生seq id no:13表达盒。ppiczαa的载体图如图2中表示。
[0128]
在含有25μg/ml吉欧霉素(zeocin)的低盐lb培养基上选择推定的重组质粒，并且通过xhoi/sacii限制性酶切分析进行筛选。
[0129]
经最终释放出1980bp的片段的xhoi/sacii限制性酶切分析确认重组质粒ppiczαa-ft。限制性酶切分析的结果描绘在图3中。
[0130]
此后，用线性化的重组ppiczαa-ft dna电穿孔毕赤酵母km71h细胞。在含有100μg/ml吉欧霉素(zeocin)的酵母提取物蛋白胨葡萄糖山梨醇琼脂(ypdsa)上选择毕赤酵母整合子。
[0131]
用克隆pcr(cpcr)对整合进行筛选。对于cpcr，通过碱裂解法从每个毕赤酵母整合子生成模板。
[0132]
将毕赤酵母整合子在bmd1培养基中培养48小时，并且进一步首先用bmm2诱导，然后继续用bmm10培养基诱导，该培养基中提供最终浓度为0.5％的甲醇。在96小时诱导期结束时，收集来自不同克隆的培养上清。用20％的tca沉淀每个收获的上清中的总蛋白，并且在sds-page上进行分析。
[0133]
诱导后，如图4中描绘的，在约110kda的尺寸处出现了果糖基转移酶蛋白条带。
[0134]
计算的分子量约为70.85kda。分子量的增加可能是由糖基化引起的。
[0135]
实施例4：表达日本曲霉的果糖基转移酶的重组毕赤酵母的发酵
[0136]
如实施例1中描述的，将含有修饰的果糖基转移酶(ft)基因的重组毕赤酵母细胞在50l的发酵罐中进行发酵。发酵在本文描述的基础盐培养基中进行。选择的重组宿主是km71h，其为缓慢代谢甲醇的mut s菌株。
[0137]
预处理种子和接种物的制备：
[0138]
通过将甘油原液接种至25ml无菌yepg培养基中，并在30℃的温度控制的摇床培养器中生长过夜，生成预处理种子(pre-seed)。为了产生种子，使接种物在基础盐培养基中，在温度控制的振荡培养器中在30℃的摇瓶中生长，直到od
600
达到15至25。
[0139]
发酵过程
[0140]
从接种种子培养的发酵罐到最终收获的整个发酵过程大约需要130小时。制备基础盐培养基，并在发酵罐中原位灭菌。
[0141]
为发酵过程优化的基础盐培养基的组成提供在表7中。
[0142]
表7：基础盐培养基的组成
[0143]
组分浓度硫酸钙1.4gm/l硫酸钾18.6gm/l硫酸镁.7h2o16.4gm/l甘油25gm/l磷酸二氢钾5gm/l硫酸铵5ml柠檬酸钠二水合物5gm/lptm24ml
生物素(20mg/100ml)4ml
[0144]
如表8中描述的制备毕赤酵母微量矿物质(ptm)盐溶液。将ptm盐溶解并且制成1l体积，并过滤消毒。将基础盐培养基灭菌后，以每升初始培养基体积4ml的速率加入ptm盐溶液。
[0145]
表8:ptm微量盐
[0146]
硫酸铜.5h2o2.0gm/l碘化钠0.08gm/l硫酸锰.h2o3.0gm/l钼酸钠.2h2o0.2gm/l硼酸0.02gm/l氯化钴0.5gm/l硫酸锌7.0gm/l硫酸亚铁.7h2o22.0gm/l氯化钾0.37gm/l硫酸1ml三氯化铁0.811gm/l氯化镍1.18gm/l硫酸镁1.23gm/l
[0147]
生长阶段：
[0148]
用5％的种子培养物接种50l发酵罐中的基础盐培养基，并且持续培养约24小时，开始生长阶段。连续监测溶解氧(do)水平，并且保持不得低于40％。
[0149]
18小时后，观察到do峰值，表明碳源(甘油)耗尽。通过添加50％的甘油(12毫升ptm盐/升进料)开始甘油分批次补料持续约6小时，直至od
600
达到200。
[0150]
诱导阶段：
[0151]
一旦产生足够的生物量，通过停止甘油进料并开始甲醇进料来启动诱导阶段。甲醇(补充有12毫升ptm盐/升进料)以0.5克至3克/升初始发酵体积的速率添加。使od保持在40％，并且也相应地调整甲醇进料。
[0152]
通过酶活性测定分析培养上清，以定期监测果糖基转移酶(ft)基因的诱导。诱导阶段持续约100小时，直到od
600
达到600，并且湿生物量达到～540克/升培养液。
[0153]
在130小时后停止发酵，并且通过dns法测定发酵结束时发酵液中的酶活性为9545单位(miller，1959)。一单位被定义为在55℃条件下，从100mm柠檬酸缓冲液ph 5.5中的10％蔗糖溶液中释放1微摩尔还原糖(葡萄糖当量)所需的酶量。通过bradford分析估计培养液中重组果糖基转移酶的总量。
[0154]
发酵条件：
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所考虑的发酵参数提供在表9中。在发酵过程中监测基本参数。
[0156]
表9：发酵参数
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发酵参数生长阶段诱导期培养基基础盐培养基基础盐培养基ph55
温度3025搅拌(桨尖速度)1.2-2.5m/2.5m/sec通气0.5-1.5vvm1.5vvm溶解氧最少40％最少40％背压0.5kg/cm0.5kg/cm
[0158]
实施例5：细胞收获和纯化
[0159]
通过以8000rpm的转速连续离心来获取酶。利用0.1微米截留缠绕tff膜对离心后获得的透明上清进行微滤。利用10kda截留缠绕tff膜进一步对滤液进行超滤和渗滤，并充分浓缩，以达到期望的活性。将该酶的配制为包括35-50％的甘油和食品级防腐剂的最终制备物。sds-page分析表明，该酶的最终纯度为85％。
[0160]
图5(a)描绘了表达重组果糖基转移酶的毕赤酵母km71h菌株发酵过程中在不同时间间隔收集的样品的sds-page分析。图5(b)描绘了纯化后重组果糖基转移酶的sds-page分析。
[0161]
发现果糖基转移酶的浓度约为2.1gm/l。在大多数批次中，浓度为2-5gm/l。观察到重组果糖基转移酶的纯度约为85％。
[0162]
实施例6：果糖基转移酶活性的评估
[0163]
进行研究以评估果糖基转移酶的活性。在评估研究中，使用dns(3,5二硝基水杨酸)方法计算果糖基转移酶作用产生的还原糖量(g.l.miller,“use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar”，anal.15chem.,1959,31,426-428)。
[0164]
为了进行酶活性测定，使用10％蔗糖(溶解在100mm柠檬酸盐缓冲液中)作为底物。从发酵液中回收果糖基转移酶，并进行超滤处理。然后将超滤样品在100mm柠檬酸盐缓冲液中连续稀释25,000x备用。反应体积为2.5ml。使ph值保持在5.5，反应持续15分钟。
[0165]
孵育后，向每个反应混合物中添加3ml dns(3,5-二硝基水杨酸)，煮沸10分钟，冷却，并在540nm下以分光光度计读取吸光度。
[0166]
如表10中显示的和图6中描绘的，测量不同浓度下葡萄糖的od。此后，根据反应后的吸光度测量，计算酶的活性，如表11中显示。图6描绘了用于估计果糖基转移酶活性的葡萄糖标准曲线。
[0167]
表10：不同浓度下葡萄糖的od测量
[0168][0169]
表11：果糖基转移酶的活性的估算
[0170][0171]
实施例7：由蔗糖和重组果糖基转移酶生成低聚果糖(fos)
[0172]
开展研究以理解该酶形成低聚果糖的能力。在ph值为5.5的150mm柠檬酸钠缓冲液中制备100ml 80％(w/v)蔗糖溶液。向其中添加104.7μl果糖基转移酶，其活性为47725单位/ml(相当于5000单位酶的总量)。
[0173]
反应在250ml锥形烧瓶中进行，并在65℃和220rpm下孵育。每隔一定的时间间隔，取样并且在薄层色谱(tlc)板上进行分析。
[0174]
以葡萄糖、蔗糖、果糖和fos(蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖)为标准进行薄层色谱分析。使用的流动相为正丁醇:冰醋酸:水(4:2:2v/v)，使用的显影/染色溶液为尿素磷酸。
[0175]
图7描绘了由蔗糖和重组果糖基转移酶生成低聚果糖(fos)的tlc分析。
[0176]
进一步对样品进行高效液相色谱(hplc)以定量估计低聚果糖的产量。使用具有4.6(内径)
×
150mm(长度)和5μm(粒度)的胺柱(zorbax nh2柱，agilent technologies)进行hplc分析。运行不同浓度的葡萄糖、果糖、蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖和蔗糖的标准溶液，以生成标准曲线。
[0177]
图8描绘了fos样品的hplc分析色谱图。表12描绘了在60分钟反应时间结束时，低聚果糖(fos)形成以及回收的葡萄糖、果糖和蔗糖的百分比。
[0178]
表12：120分钟反应结束时，低聚果糖(fos)的形成以及回收的蔗糖、葡萄糖和果糖的百分比
[0179] 80％蔗糖底物基于100％蔗糖底物fos(％)48.47961.2484蔗糖(％)11.687514.7659葡萄糖(％)18.984223.9846果糖(％)0.000810.0010
[0180]
100毫升80％(w/v)蔗糖溶液与果糖基转移酶反应，将蔗糖转化为fos。在60分钟结束时通过加热终止反应后，测量从反应中回收的fos、蔗糖、葡萄糖和果糖的量，并且基于80％和100％的蔗糖表示。
[0181]
研究表明，纯化的酶能够有效地将大量的糖转化为低聚果糖。
[0182]
实施例8：日本曲霉的重组果糖基转移酶的表征
[0183]
对收获的日本曲霉果糖基转移酶进行表征，以鉴定生物活性片段。发现果糖基转移酶的以下生物活性片段是保守的，并使得其具有具有催化活性：
[0184]
表13：果糖基转移酶的生物活性片段是保守的，并使得其具有催化活性
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位置片段seo id no57-62qigdpcseq id no:24119-132dgavipvgvnntptseq id no:25320-330sglpivpqvsseq id no:26401-416gdqyeqadgfptaqqgseq id no:27
[0186]
进一步发现，日本曲霉的果糖基转移酶中的以下氨基酸残基参与了在催化三联体周围形成氢键网络。氢键网络对于催化三联体周围的稳定立体化学非常重要：
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arg-190
[0188]
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tyr-369
[0189]
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glu-318
[0190]
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his-332
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asp-191
[0192]
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thr-293
[0193]
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asp-119
[0194]
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his-144
[0195]
还发现日本曲霉的果糖基转移酶中的以下疏水残基参与在活性位点周围形成带负电荷的口袋：
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leu-78
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phe-118
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ala-370
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trp-398
[0200]
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lie-143
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此外，确认了日本曲霉的果糖基转移酶的以下重要残基参与了活性口袋的入口处的相互作用：
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glu-405
[0203]
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his-332
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tyr-404
[0205]
日本曲霉的果糖基转移酶保守生物活性片段(57-62位)。