包含活性剂沉淀物的递送系统复合物和使用方法

包含活性剂沉淀物的递送系统复合物和使用方法
1.联邦政府资助的研究或开发
2.本发明是根据由美国国立卫生研究院(national institutes of health)授予的批准号ca198999在政府支持下进行。美国政府享有本发明的一定权利。
技术领域
3.本发明涉及使用包含脂质的递送系统复合物递送生物活性化合物。


背景技术：

4.folfox是亚叶酸(fna)、5-氟尿嘧啶(5-fu)和奥沙利铂(oxp)的三剂组合，已经在几十年来用于治疗结直肠癌(crc)。尽管存活率有所提高，但患者仍然受一些缺点的影响，诸如毒性、高成本和长疗程。
5.因此，需要新的策略来解决这些问题，以进一步提供临床益处。本文所述的主题部分地通过提高安全性和功效来解决当前可用的folfox治疗方式的这些和其他缺点。


技术实现要素：

6.在某些实施方式中，本文所述的主题涉及一种具有以下结构的化合物：
[0007][0008]
在某些实施方式中，本文所述的主题涉及包含式i化合物的递送系统复合物。在某些实施方式中，本文所述的主题涉及包含式i化合物和药学上可接受的赋形剂的药物组合物。
[0009]
在某些实施方式中，本文所述的主题涉及包含式i化合物的递送系统复合物，其中所述递送系统复合物包含脂质体包封的式i化合物。
[0010]
在某些实施方式中，本文所述的主题涉及包含式i化合物的递送系统复合物，其中所述递送系统复合物包含脂质体包封的式i化合物，其中所述脂质体包含脂质双层。
[0011]
在某些实施方式中，本文所述的主题涉及治疗癌症的方法，其中所述方法包括向受试者施用式i化合物或包含式i化合物的递送系统复合物。在某些实施方式中，这些方法还包括施用抗代谢药物，诸如5-氟尿嘧啶(5-fu)或含有fdump(5-fu活性代谢物)的纳米制剂，即纳米-fdump。
[0012]
在某些实施方式中，本文所述的主题涉及一种递送系统复合物，其包含：包含抗代谢复合物的第一类稳定化单脂质层核心、包含式i化合物的第二类稳定化单脂质层核心，其
中所述核心被聚合物包封，诸如plga、plga-peg或plga-peg-aeaa。
[0013]
在某些实施方式中，本文所述的主题涉及一种递送系统复合物，其包含：包含抗代谢复合物的第一类稳定化单脂质层核心、包含式i化合物的第二类稳定化单脂质层核心和伊立替康(sn-38)，其中所述核心和sn-38被聚合物包封，诸如plga、plga-peg或plga-peg-aeaa。
[0014]
在某些实施方式中，本文所述的主题涉及治疗癌症的方法，其中所述方法包括向受试者施用递送系统复合物，所述递送系统复合物包含：包含抗代谢复合物的核心，所述抗代谢复合物包含5-氟尿嘧啶活性代谢物，其中所述核心被脂质体包封。
[0015]
在某些实施方式中，本文所述的主题涉及一种递送系统复合物，其包含：包含抗代谢复合物的核心，所述抗代谢复合物包含5-氟尿嘧啶活性代谢物，其中所述核心被脂质体包封。
[0016]
在某些实施方式中，所述递送系统复合物可以包含靶向配体并且被称为靶向递送系统复合物。这些靶向递送系统复合物靶向患病细胞，从而增强递送系统复合物的有效性并使毒性最小化。
[0017]
在某些实施方式中，本文所述的主题涉及制备式i化合物或包含式i化合物的递送系统复合物的方法。
[0018]
本文描述了这些和其他实施方式。
附图说明
[0019]
图1描绘了纳米-folox的配制。(a)使用纳米沉淀工艺在微乳液中配制的纳米-folox的示意图。(b)针对协同化学免疫治疗作用提出的纳米-folox机制。(c)pt(dach).fna沉淀物的maldi-tof质谱和预测的化学结构(预测的精确质量：780.23，观察到的m/z 780.96)。
[0020]
图2描绘了纳米-folox的物理化学表征。(a)pt(dach).fna和纳米-folox的tem图像(比例尺＝100nm)。(b)纳米-folox的粒度(～120nm，多分散性指数＝0.3)和ζ电位(～5mv)(还参见照片)。(c)在ph＝5.5和7.4时铂从纳米-folox的体外释放(n＝5)。
[0021]
图3描绘了纳米-folox的体外研究。(a)使用icp-ms检测ct26-fl3细胞中来自oxp和纳米-folox的铂的细胞摄取(n＝5,*p《0.05)。(b)使用mtt测定评定用oxp和纳米-folox处理的ct26-fl3细胞的细胞毒性(n＝3,*p《0.05)。(c)通过膜联蛋白v-ftic和碘化丙啶(pi)测定测量用oxp和纳米-folox处理的凋亡ct26-fl3细胞(％)(n＝3,*p《0.05,**p《0.01)。(d)使用免疫荧光染色测定研究用oxp和纳米-folox处理的ct26-fl3细胞的crt暴露和hmgb1释放(n＝3,*p《0.05)。结果显示在纳米-folox处理后，在～53％和～95％的ct26-fl3细胞中观察到crt暴露和hmgb1释放。
[0022]
图4描绘了纳米-folox的药代动力学和组织分布。(a)在通过小鼠尾静脉单次i.v.注射后来自oxp和纳米-folox的铂的血浆浓度(1mg/kg)。使用半对数标度绘制铂的浓度(n＝4)。来自oxp和纳米-folox的铂的药代动力学参数在表中示出，其中t
1/2
＝半衰期，auc＝曲线下面积，cl＝清除率，并且vd＝分布容积(n＝4,*p《0.05,**p《0.01)。(b)单次i.v.注射之后八小时，通过ivis动力学光学系统检查具有/没有aeaa靶向配体的did标记的纳米-folox(1.5mg/kg铂)的生物分布(n＝4,*p《0.05)。(c)还使用icp-ms评定来自oxp和具有/没
有aeaa靶向配体的纳米-folox的铂(1.5mg/kg)的组织分布(n＝4,*p《0.05)。
[0023]
图5描绘了纳米-folox在原位crc小鼠中的抗肿瘤作用。(a)处理方案。在pbs、纳米-folox(1.5mg/kg铂)、folfox(3mg/kg铂、90mg/kg fna和50mg/kg5-fu)和纳米-folox/5-fu处理后第32天原位ct26-fl3肿瘤的ivis图像。(b)在不同处理后35天时间段内的原位ct26-fl3肿瘤生长(n＝6,*p《0.05,**p《0.01)。(c)在不同处理后原位crc小鼠的存活期(中位存活期：pbs＝41天，纳米-folox＝49天，folfox＝54天，并且纳米-folox/5-fu＝68天)(n＝6,***p《0.001)。
[0024]
图6描绘了纳米-folox在原位crc小鼠中的化学免疫治疗机制。(a)在如图5所示的处理方案后，在第27天来自用pbs、纳米-folox(1.5mg/kg铂，i.v.)、folfox(3mg/kg铂，90mg/kg fna和50mg/kg 5-fu，i.p.)和纳米-folox/5-fu处理的动物的肿瘤组织的tunel染色(绿色)(使用4’,6-二脒基-2-苯基吲哚dapi对细胞核进行染色，蓝色)。纳米-folox/5-fu在肿瘤中诱导～7.2％的细胞凋亡率，这显著高于其他组(n＝4,*p《0.05,**p《0.01)。(b)在第27天使用dapi和抗cd3抗体(红色)对来自用不同组处理的动物的肿瘤进行的免疫荧光染色。相对于其他组纳米-folox/5-fu显著提高了t细胞浸润率(～4.3％)(n＝4,*p《0.05,**p《0.01)。(c)第27天肿瘤中cd8

细胞、cd4

细胞、mhc ii

dc、cd86

dc、mdsc、m2细胞、treg细胞、pd-l1的水平，使用流式细胞术分析(n＝4,*p《0.05,**p《0.01)。(d)ccl2、cxcl9、cxcl10、cxcl12、cxcl13、tnf-α和ifn-γ在来自相对于pbs用治疗组处理的动物的肿瘤中的mrna表达，使用定量rt-pcr评定(n＝4,*p《0.05,**p《0.01)。
[0025]
图7描绘了纳米-folox的体内毒性评估。(a)在如图5所示的处理方案后，在35天时间段内记录动物体重(n＝6)。(b)在第27天，采集主要组织(心脏、肝、脾、肺和肾)并使用苏木精和伊红(h&e)染色测定进行分析，以便确定组织病理学变化。在pbs与治疗组之间没有观察到显著的组织学变化。(c)在第27天采集血液和血清样品并分析以确定血液学毒性和肝/肾损伤(n＝4)。在pbs与治疗组之间没有观察到显著的毒性现象。
[0026]
图8描绘了纳米-folox在具有肝转移的小鼠中的抗肿瘤作用。(a)处理方案(红色＝纳米-folox 5-fu，紫色＝α-pd-l1抗体)。在pbs、抗pd-l1抗体(100μg/动物，i.p.)、纳米-folox(1.5mg/kg铂，i.v.) 5-fu(50mg/kg，i.p.)和组合的处理后在第8、12和16天ct26-fl3肝转移的ivis图像。(b)在不同处理后16天时间段内的肝转移(n＝5,*p《0.05)。第16天肝转移的离体ivis图像。(c)在不同处理后患病动物的存活期(中位存活期：pbs＝19天，抗pd-l1＝21天，纳米-folox/5-fu＝34天，并且组合＝48天)(n＝5,*p《0.05,**p《0.01)。
[0027]
图9描绘了纳米-fdump的制备和物理化学表征。使用纳米沉淀技术在微乳液中开发的纳米-fdump的示意图(a)。tem图像(比例尺＝100nm)(b)。纳米-fdump的大小分布(～35nm，多分散性指数≈0.3)和表面电荷(～2mv)(c)。在ph＝5.5和7.4时氟药物从纳米-fdump中的纳米沉淀物的体外释放(n＝4)(d)。纳米-fdump在37℃下在含10％血清的培养基中温育1、2、4和8h后的稳定性(e)。
[0028]
图10描绘了纳米-fdump的体外研究。用5-fu和纳米-fdump处理的ct26和hepa1-6细胞的细胞毒性(n＝3,**p《0.01)(a)。通过膜联蛋白v-ftic和pi测定测量用pbs、5-fu、纳米-dump和纳米-fdump处理的凋亡ct26和hepa1-6细胞(％)(n＝3,*p《0.05,**p《0.01,相对于纳米-dump)(b)。用pbs、5-fu、纳米-dump和纳米-fdump处理的ct26和hepa1-6细胞中的ros水平(n＝3,*p《0.05,**p《0.01,相对于纳米-dump)(c)。在具有或没有nac的情况下温育
后通过纳米-fdump处理的凋亡ct26和hepa1-6细胞(％)(n＝3,*p《0.05,**p《0.01,相对于pbs)(d)。
[0029]
图11描绘了通过纳米-fdump和纳米-folox实现的协同icd作用。在具有或没有nac的情况下温育后，用pbs、纳米-fdump、纳米-folox和纳米-folox/纳米-fdump处理的ct26和hepa1-6细胞中crt的暴露(n＝3,*p《0.05,**p《0.01,***p《0.001,相对于纳米-fdump)(a)。在具有或没有nac的情况下温育后，atp从用pbs、纳米-fdump、纳米-folox和纳米-folox/纳米-fdump处理的ct26和hepa1-6细胞释放到细胞外环境中(n＝3,*p《0.05,**p《0.01,相对于pbs)(b)。在具有或没有nac的情况下温育后，用pbs、纳米-fdump、纳米-folox和纳米-folox/纳米-fdump处理的ct26和hepa1-6细胞中hmbg1的分泌(n＝3,*p《0.05,相对于纳米-fdump)(c)。
[0030]
图12描绘了纳米-fdump的血液循环和生物分布。将5-fu和纳米-fdump i.v.注射到原位crc和hcc小鼠模型中。绘制氟药物在不同时间点的浓度(n＝4)。使用单室模型评定5-fu和纳米-fdump的半衰期(a)。i.v.施用后十二小时，使用ivis动力学光学系统(n＝4，*p《0.05)在移植有crc(b)和hcc(c)的小鼠中检测(640nm/670nm)did标记的纳米制剂在组织和肿瘤中的分布。在hcc模型中，aeaa靶向的纳米制剂在肝肿瘤内特异性积累，这通过np(来自did染料的荧光成像)和肿瘤组织(来自通过荧光素酶与荧光素之间的相互作用产生的可见光的生物发光成像)的共定位得到确认。
[0031]
图13描绘了两种纳米制剂在原位crc小鼠模型中的血液免疫治疗作用。处理方案和ivis图像(a)。在35天时间段内的ct26-fl3肿瘤生长(n＝6,*p《0.05,**p《0.01)(b)。动物存活期(中位存活期：pbs＝40天，纳米-fdump＝45天，纳米-fdump与oxp和fna＝49天，并且纳米-folox与5-fu＝56天)(n＝6,**p《0.01)(c)。第24天对肿瘤进行免疫荧光染色(dna片段＝绿色；细胞核＝蓝色)以确定细胞凋亡(n＝4,*p《0.05,相对于纳米-folox/5-fu)(d)。第24天对肿瘤进行免疫荧光染色(cd3＝红色；细胞核＝蓝色)以确定t细胞浸润(n＝4,**p《0.01,相对于纳米-folox/5-fu)(e)。第24天肿瘤中cd8

t细胞、cd4

t细胞、记忆cd8

t细胞、记忆cd4

t细胞、激活的dc、mdsc、treg和m2细胞的水平，通过流式细胞术分析(n＝4,*p《0.05,**p《0.01,相对于纳米-folox/5-fu)(f)。第24天肿瘤中ifn-γ、tnf-α、il-12、il-4、il-6和il-10的mrna表达(n＝4,*p《0.05,相对于纳米-folox/5-fu)(g)。去除cd4

或cd8

t细胞之后用纳米-fdump/纳米-folox处理的原位ct26-fl3肿瘤生长(n＝4,*p《0.05,**p《0.01)(h)。
[0032]
图14描绘了两种纳米制剂在原位hcc小鼠模型中的化学免疫治疗作用。处理方案和ivis图像(a)。在32天时间段内的hepa1-6-luc肿瘤生长(n＝6,*p《0.05,**p《0.01)(b)。动物存活期(中位存活期：pbs＝36天，纳米-fdump＝43天，纳米-fdump与oxp和fna＝47天，并且纳米-folox与5-fu＝53天)(n＝6,***p《0.001)(c)。第23天对肿瘤进行免疫荧光染色(dna片段＝绿色；细胞核＝蓝色)以确定细胞凋亡(n＝4,*p《0.05,相对于纳米-folox/5-fu)(d)。第23天对肿瘤进行免疫荧光染色(cd3＝红色；细胞核＝蓝色)以确定t细胞浸润(n＝4,**p《0.01,相对于纳米-folox/5-fu)(e)。第23天肿瘤中cd8

t细胞、cd4

t细胞、记忆cd8

t细胞、记忆cd4

t细胞、激活的dc、mdsc、treg和m2细胞的水平，通过流式细胞术分析(n＝4,*p《0.05,相对于纳米-folox/5-fu)(f)。第23天肿瘤中ifn-γ、tnf-α、il-12、il-4、il-6和il-10的mrna表达(n＝4,*p《0.05,相对于纳米-folox/5-fu)(g)。去除cd4

或cd8

t细胞之
后用纳米-fdump/纳米-folox处理的原位hepa1-6-luc肿瘤生长(n＝4,*p《0.05,**p《0.01)(h)。
[0033]
图15描绘了用于crc肝转移小鼠模型的纳米-fdump/纳米-folox和抗pd-l1抗体的组合疗法。处理方案和ivis图像(a)。在16天时间段内的肝转移(n＝6,*p《0.05,**p《0.01)(b)。动物存活期(中位存活期：pbs＝20天，抗pd-l1抗体＝21天，并且纳米-fdump/纳米-folox＝48天)(n＝6,***p《0.01)(c)。第12天对肿瘤进行免疫荧光染色(dna片段＝绿色；细胞核＝蓝色)以确定细胞凋亡(n＝4,**p《0.01,相对于纳米-fdump/纳米-folox)(d)。第12天对肿瘤进行免疫荧光染色(cd3＝红色；细胞核＝蓝色)以确定t细胞浸润(n＝4,**p《0.01,相对于纳米-fdump/纳米-folox)(e)。第12天肿瘤中cd8

t细胞、cd4

t细胞、记忆cd8

t细胞、记忆cd4

t细胞和激活的dc的水平，通过流式细胞术分析(n＝4,*p《0.05,**p《0.01,相对于抗pd-l1抗体)(f)。第12天肿瘤中ifn-γ、il-12、il-4、il-6和il-10的mrna表达(n＝4,*p《0.05,**p《0.01,相对于抗pd-l1抗体)(g)。
[0034]
图16描绘了非靶向纳米-fdump的物理化学表征。tem图像(比例尺＝100nm)(a)。大小分布(～38nm，多分散性指数≈0.3)和表面电荷(～5mv)(b)。在ph＝5.5和7.4时氟药物从纳米沉淀物的体外释放(n＝4)(c)。在37℃下，在含10％血清的培养基中长达8h没有引起显著的聚集(从～35至50nm)(d)。
[0035]
图17描绘了非靶向纳米-fdump在原位crc和hcc小鼠模型中的血液循环。绘制i.v.注射后氟药物在不同时间点的浓度(n＝4)。结果显示非靶向纳米-fdump表现出与靶向对应物记录的相似的血液循环。
[0036]
图18描绘了纳米-fdump在健康balb/c小鼠中的毒性。第1、3和5天用pbs和含有5、10、25和50mg/kg fdump的纳米-fdump处理后35天时间段内的体重。(a)。基于身体状况评分的动物整体状况(n＝5)[bcs、iacuc指南以及其他标准(例如，驼背姿势、被毛皱褶和不愿移动)](b)。在终点处，呈现符合bcs指数的动物数量。非靶向纳米-fdump的结果与在靶向对应物中观察到的结果相似(数据未示出)。
[0037]
图19描绘了纳米-fdump在原位crc和hcc小鼠模型中的治疗功效。在如图13和14所述的处理方案后，与pbs相比，10和25mg/kg fdump剂量下的纳米-fdump实现了显著提高的抗肿瘤功效(n＝5,*p《0.05)。
[0038]
图20描绘了在10mg/kg fdump剂量下具有/没有aeaa的纳米-fdump在原位crc和hcc小鼠模型中的治疗功效。在如图13和14所述的处理方案后，与pbs相比，非靶向纳米-fdump不能减慢肿瘤生长，但与pbs和非靶向纳米-fdump相比，aeaa靶向纳米-fdump实现了显著提高的抗肿瘤功效(n＝5,*p《0.05)。
[0039]
图21描绘了在10mg/kg fdump剂量下具有/没有aeaa的纳米-fdump在原位crc和hcc小鼠模型中的治疗功效。在如图13和14所述的处理方案后，与pbs相比，非靶向纳米-fdump不能减慢肿瘤生长，但与pbs和非靶向纳米-fdump相比，aeaa靶向纳米-fdump实现了显著提高的抗肿瘤功效(n＝5,*p《0.05)。
[0040]
图22描绘了两种纳米制剂的组合在健康balb/c(a)和c57bl/6(b)小鼠中的毒性研究。pbs和两种纳米制剂的组合的处理后在35天时间段内的体重(第1、3和5天将含有1.5mg/kg铂药物的纳米-folox i.v.注射到小鼠中。注射后八小时，将含有10mg/kg氟药物的纳米-fdump i.v.注射到小鼠中)。结果显示与pbs相比，两种纳米制剂的处理后没有发现体重和
血液学/肝/肾功能的显著变化(n＝5)。
[0041]
图23描绘了(a)使用纳米沉淀工艺在微乳液中配制的纳米-folox的示意图。(b)使用纳米沉淀工艺在微乳液中配制的纳米-fdump的示意图。
[0042]
图24描绘了(a)聚合物包封的颗粒，其包含稳定化单脂质层纳米-folox核心和稳定化单脂质层纳米-fdump核心。(b)聚合物包封的颗粒，其包含sn-38、稳定化单脂质层纳米-folox核心和稳定化单脂质层纳米-fdump核心。
具体实施方式
[0043]
现在将在后文中更详细地描述本发明公开的主题。然而，受益于前述描述中呈现的教导的本发明公开的主题所属领域的技术人员将想到本文阐述的本文公开的主题的许多修改和其他实施方式。因此，应理解，本发明公开的主题不限于所公开的特定实施方式，并且修改和其他实施方式旨在包括在所附权利要求的范围内。
[0044]
本文提供了用于递送用于治疗癌症的纳米-folox的方法和组合物。组合物包括递送系统复合物，其包含亚叶酸(fna)和5-氟尿嘧啶(5-fu)和奥沙利铂(oxp)的组合。在另一个实施方式中，组合物包括递送系统复合物，其包含亚叶酸(fna)或5-氟-2'-脱氧尿苷5'-单磷酸(fdump)或其组合的组合。方法包括将组合物与抗pdl1抗体一起施用。
[0045]
已知在疾病过程中，癌细胞可以在肿瘤和转移内/之间显示遗传、转录组、表观遗传和表型的多样性
50
。由于这种异质性，传统的单一治疗方法通常无法为患者提供安全且有效的治疗。因此，介导多种抗癌途径的治疗剂的合并可能实现协同效应
51 52 53 54
。实际上，化学疗法和免疫疗法的组合在引发比任一种单一疗法更好的抗癌结果方面大有希望
55
。最近，非病毒纳米递送技术的发展已经证明了同时配制化学治疗剂和免疫治疗剂、从而实现化学免疫治疗应答的可能性
56 57
。如本文所述，采用纳米沉淀技术来开发aeaa靶向的基于脂质的np，以用于共同配制oxp衍生物和fna，目的是促进crc的化学免疫疗法。
[0046]
所得的制剂，即纳米-folox，在粒度、表面电荷和药物释放方面表现出有利的物理化学特性。在i.v.施用后，通过纳米-folox实现了延长的全身暴露和增强的肿瘤铂积累。在将纳米-folox和5-fu的组合给予原位crc小鼠时，在更高剂量(2倍铂)下，抗肿瘤功效显著高于folfox。
[0047]
据报道，幼稚t细胞的分化与对dc的抗原可用性高度相关
76
，并且更高量和更长持续时间的抗原刺激产生更大数量的效应和记忆t细胞
77
。icd可以诱导正在死亡或已死亡癌细胞暴露于损伤相关分子模式(damp)，从而导致将抗原呈递给dc，以用于肿瘤特异性t细胞应答
78
。还据报道，icd的诱导伴随着活性氧(ros)的形成
78
，并且icd功效可以通过ros诱导策略来增强
79-81
。因此，我们假设通过使用纳米递送系统靶向递送5-fu可以安全且有效地实现ros诱导，这将与纳米-folox协同诱导效应和记忆t细胞以用于肿瘤特异性杀伤和保护性应答。因此，使用纳米沉淀技术产生aeaa靶向peg化脂质np(被称为纳米-fdump)，用于递送5-氟-2'-脱氧尿苷5'-单磷酸(fdump，一种活性5-fu代谢物)
82
。
[0048]
还有利地，抗pd-l1抗体与纳米-folox/5-fu协同作用，从而导致小鼠中肝转移的延迟。这种组合策略的抗癌机制可能是由于1)通过基于oxp的dna加合物形成和通过fna致敏的5-fu介导的dna损伤实现协同凋亡作用；2)作为icd诱导剂的oxp衍生物明显重塑肿瘤免疫微环境，从而产生有效的免疫疗法，尤其是在与5-fu组合时；3)应用抗pd-l1抗体阻断
pd-l1/pd-1抑制性信号传导，这增强通过纳米-folox/5-fu实现的t淋巴细胞的免疫应答。
[0049]
此外，免疫检查点抑制剂(例如，抗pd-l1 mab)已在不同的癌症中表现出功效，但在crc患者中的应答率仍然很差。被诊断为具有微卫星不稳定(msi)crc的仅一小部分患者(总群体的～15％)
114
对作为单一疗法的抗pd-l1 mab产生应答
115
。现在已知肿瘤(也被称为“冷”肿瘤)中缺乏t细胞浸润导致免疫检查点抑制剂的低效
116
。“冷”肿瘤向“热”肿瘤的转移潜在地增强检查点封闭的功效
117
。纳米-fdump和纳米-folox的组合能够诱导icd相关的抗肿瘤免疫性，这与抗pd-l1 mab组合显著重编程免疫抑制性tme，提高针对crc肝转移的抗肿瘤功效(由ct26-fl3细胞(一种mss crc细胞系)建立)
118,119
(图15)。纳米-folox/纳米-fdump和抗pd-l1抗体的组合显著抑制crc肝转移，诱导肿瘤特异性记忆应答，并且导致小鼠的长期存活。因此，“纳米-fdump/纳米-folox 抗pd-l1 mab”策略将潜在地在初级和转移阶段实现crc患者的优异结果(特别是对于微卫星稳定(mss)患者，高达总群体的85％)。
[0050]
结直肠癌(crc)与高发病率和死亡率相关，估计到2030年全球负荷增加至超过220万例新病例和110万例死亡1。手术切除为早期crc患者提供潜在治愈，并且化学疗法是晚期和转移性crc的主要治疗手段2。亚叶酸(fna，也被称为甲酰四氢叶酸)、5-氟尿嘧啶(5-fu)和奥沙利铂(oxp)的组合通常被称为folfox3，已应用于ii/iii期4和肝转移发生时5的crc患者。虽然folfox提高了存活率，但是需要改善治疗方式，因为剂量限制性副作用、高费用和长疗程仍然限制临床应用3。因此，在提高治疗功效的同时减少毒性、成本和不方便(即，耗时的治疗方案)方面，需要新的folfox策略。
[0051]
5-fu是一种抗代谢化学治疗药物，几十年来已广泛用于治疗crc。5-fu的治疗功效是由氟核苷酸嵌入rna/dna中并且由胸苷酸合成酶(ts，核苷酸合成酶)的失活导致的
16
。此外，5-fu的抗癌作用可以通过增强ts抑制由fna来提高
17 18
。
[0052]
据报道，幼稚t细胞的分化与对dc的抗原可用性高度相关
76
，并且更高量和更长持续时间的抗原刺激产生更大数量的效应和记忆t细胞
77
。icd可以诱导正在死亡或已死亡癌细胞暴露于损伤相关分子模式(damp)，从而导致将抗原呈递给dc，以用于肿瘤特异性t细胞应答
78
。还据报道，icd的诱导伴随着活性氧(ros)的形成
78
，并且icd功效可以通过ros诱导策略来增强
79-81
。因此，我们假设通过使用纳米递送系统靶向递送5-fu可以安全且有效地实现ros诱导，这将与纳米-folox协同诱导效应和记忆t细胞以用于肿瘤特异性杀伤和保护性应答。因此，使用纳米沉淀技术产生aeaa靶向peg化脂质np(被称为纳米-fdump)，用于递送5-氟-2'-脱氧尿苷5'-单磷酸(fdump，一种活性5-fu代谢物)
82
。在临床试验中，当与5-fu和fna组合时，oxp呈现相加或协同活性
19
。然而，这种组合策略(folfox)的临床应用仍然受到若干问题，诸如毒性作用、成本增加和不方便的阻碍。在此研究中，开发了一种基于np的folfox策略，目的是显著提高治疗功效并有效地克服局限性。
[0053]
基于微乳液脂质的顺铂纳米颗粒(np)是已知的
6 7 8
。如本文所述，通过二水合物(1,2-二氨基环己烷)铂(ii)([pt(dach)(h2o)2]
2
，oxp的活性形式)与fna之间的反应产生沉淀物，其通过1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸(dopa)稳定化。将稳定化的沉淀物配制成由1,2-二油酰-3-三甲基铵-丙烷(dotap)、胆固醇和与氨乙基茴香酰胺缀合的1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-聚乙二醇-2000(dspe-peg-aeaa)构成的np(图1)。研究与5-fu和抗pd-l1 mab组合的所得制剂(即纳米-folox)在患有原位crc和肝转移的小鼠中的协同化学免疫治疗功效。
[0054]
总之，本文所述的组合策略提供了一种潜在的folfox模式，其周期减少并且剂量降低，希望对患有原发性和转移性crc的患者实现优异的化学免疫治疗应答。
[0055]
i.组合物
[0056]
在某些实施方式中，本文所述的主题涉及一种具有以下结构的化合物：
[0057][0058]
此结构在本文中还被称为oxp-fna复合物、二水合物(1,2-二氨基环己烷)铂(ii)-亚叶酸的复合物、沉淀物或folox。方案1描绘了式i化合物的一般合成路线。
[0059][0060]
方案1。
[0061]
式i化合物可以呈通过缩合亚叶酸和pt(dach)(h2o)2]
2
制备的纳米沉淀物(c
26h35
n9o7pt)的形式，如本文其他地方所述。二水合物(1,2-二氨基环己烷)铂(ii)([pt(dach)(h2o)2]
2
，奥沙利铂的活性形式)与亚叶酸反应形成纳米沉淀物(c
26h35
n9o7pt，还参见图1)。在实施方式中，纳米沉淀物可以用具有一层或多层的涂层涂覆，其中所述层中的一层包含1,2-二油酰-3-三甲基铵-丙烷(dotap)、胆固醇、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-聚乙二醇-2000(dspe-peg)和与氨乙基茴香酰胺缀合的dspe-peg(dspe-peg-aeaa)。
[0062]
在某些实施方式中，本文所述的主题涉及包含式i化合物的递送系统复合物。如本文所用，“递送系统复合物”或“递送系统”是指包含式i化合物和用于将式i的生物活性化合物递送至细胞、生理位点或组织的装置的复合物。
[0063]
在某些实施方式中，本文所述的主题涉及包含式i化合物的递送系统复合物，其中所述递送系统复合物包含脂质体包封的式i化合物。
[0064]
在某些实施方式中，本文所述的主题涉及包含式i化合物的递送系统复合物，其中所述递送系统复合物包含脂质体包封的式i化合物，其中所述脂质体包含脂质双层。在某些实施方式中，所述递送系统包含不对称双层。
[0065]
在某些实施方式中，本文公开的主题涉及一种递送系统复合物，其包含核心，所述
核心包含二水合物(1,2-二氨基环己烷)铂(ii)-亚叶酸的复合物，其中所述核心被脂质体包封。有用的复合物是二水合物(1,2-二氨基环己烷)铂(ii)-亚叶酸，其具有以下结构：
[0066][0067]
在某些实施方式中，本文所述的主题涉及一种递送系统复合物，其包含：包含抗代谢复合物的核心，所述抗代谢复合物包含5-氟尿嘧啶活性代谢物，其中所述核心被脂质体包封。在某些实施方式中，所述复合物是沉淀物。在某些实施方式中，所述递送系统包含不对称双层。
[0068]
在某些实施方式中，本文公开的主题涉及一种递送系统复合物，其包含核心，所述核心包含由cacl2和(nh4)2hpo4制成的cap沉淀物和5-氟尿嘧啶活性代谢物，其中所述核心被脂质体包封。在一个实施方式中，所述5-氟尿嘧啶活性代谢物是5-氟-2'-脱氧尿苷5'-单磷酸。在某些实施方式中，所述递送系统包含不对称双层。
[0069]
在某些实施方式中，本文所述的主题涉及一种递送系统复合物，其包含：包含抗代谢复合物的第一类稳定化单脂质层核心、包含式i化合物的第二类稳定化单脂质层核心，其中所述核心被聚合物包封，诸如plga、plga-peg或plga-peg-aeaa。在某些实施方式中，所述单脂质是磷脂，dopa。
[0070]
在某些实施方式中，本文所述的主题涉及一种递送系统复合物，其包含：包含抗代谢复合物的第一类稳定化单脂质层核心、包含式i化合物的第二类稳定化单脂质层核心和伊立替康(sn-38)，其中所述核心和sn-38被聚合物包封，诸如plga、plga-peg或plga-peg-aeaa。在某些实施方式中，所述单脂质是磷脂，dopa。
[0071]
在某些实施方式中，所述递送系统复合物的脂质体包含具有内小叶和外小叶的脂质双层。
[0072]
在某些实施方式中，如本文所用的“抗代谢物复合物”是指由cacl2和(nh4)2hpo4制成的cap沉淀物和5-氟尿嘧啶活性代谢物。
[0073]
在某些实施方式中，外小叶包含脂质-聚乙二醇(脂质-peg)缀合物。在某些实施方式中，所述脂质-peg缀合物包含总表面脂质的约5mol％至约50mol％之间的量的peg。在某些实施方式中，所述脂质-peg缀合物包含具有约2000g/mol的分子量的peg分子。在某些实施方式中，所述脂质-peg缀合物包含1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-羧基-聚乙二醇
2000
(dspe-peg
2000
)。
[0074]
在某些实施方式中，所述外小叶包含靶向配体，从而形成靶向递送系统复合物，其中所述靶向配体将所述靶向递送系统复合物靶向至靶向细胞。在某些实施方式中，所述靶向配体是与氨乙基茴香酰胺缀合的dspe-peg(dspe-peg-aeaa)。此靶向配体在本文中显示共递送奥沙利铂和亚叶酸。
[0075]
本文所述的递送系统复合物可以含有许多核心。如本文所述，含有一种或多种类
型的核心的复合物可以含有任何数量的每种类型的核心。
[0076]
在某些实施方式中，所述递送系统复合物具有约50nm至约900nm的直径。在某些实施方式中，所述递送系统复合物具有约120nm的平均直径。
[0077]
在某些实施方式中，所述递送系统复合物的外小叶包含阳离子脂质。在某些实施方式中，所述阳离子脂质是dotap。
[0078]
在某些实施方式中，所述递送系统复合物的内小叶包含两亲性脂质。在某些实施方式中，所述两亲性脂质是dopa。
[0079]
本发明公开的递送系统复合物可以包含包封oxp-fna复合物的脂质体。脂质体是自组装的、基本上球形的囊泡，其包含围绕核心的脂质双层，所述核心可以是水性的，其中所述脂质双层包含具有亲水性头基和疏水性尾部的两亲性脂质，其中所述两亲性脂质分子的亲水性头基朝向核心或周围的溶液取向，而所述疏水性尾部朝向双层的内部取向。所述脂质双层结构因此包括两个相对的单层，被称为“内小叶”和“外小叶”，其中所述疏水性尾部被屏蔽以免与周围介质接触。所述“内小叶”是单层，其中所述亲水性头基朝向脂质体的核心取向。所述“外小叶”是包含两亲性脂质的单层，其中所述亲水性头基朝向脂质体的外表面取向。脂质体通常具有约25nm至约1μm范围内的直径。(参见例如shah(编)(1998)micelles,microemulsions,and monolayers:science and technology,marcel dekker；janoff(编)(1998)liposomes:rational design,marcel dekker)。术语“脂质体”涵盖包含两个至数百个与水相层交替的同心脂质双层的多层脂质体和包含单个脂质双层的单层囊泡两者。用于制备脂质体的方法是本领域熟知的并且在本文其他地方描述。
[0080]
如本文所用，术语“脂质”是指具有亲脂性或两亲性特性的一组有机化合物的成员，其包括但不限于脂肪、脂肪油、精油、蜡、类固醇、甾醇、磷脂、糖脂、硫脂、氨基脂、色脂(脂色素)和脂肪酸。术语“脂质”涵盖天然存在的和合成产生的脂质。“亲脂性”是指在脂肪、油、脂质和非极性溶剂诸如有机溶剂中溶解的那些有机化合物。亲脂性化合物微溶于水或不溶于水。因此，亲脂性化合物是疏水的。两亲性脂质，在本文中也被称为“两亲性脂质”是指具有亲水性和疏水性特征的脂质分子。如立即在下文更详细描述的，两亲性脂质的疏水性基团可以是长链烃基。两亲性脂质的亲水性基团可以包括带电基团，例如阴离子或阳离子基团，或极性不带电基团。两亲性脂质可以具有多个疏水性基团、多个亲水性基团及其组合。由于同时存在疏水性基团和亲水性基团，两亲性脂质可以溶于水，并且在一定程度上可以溶于有机溶剂。
[0081]
如本文所用，“亲水性”是能够与水(h2o)分子形成氢键并且可溶于水和其他极性溶剂中的分子的物理特性。术语“亲水性”和“极性”可以互换使用。亲水性特征源于极性或带电基团的存在，诸如碳水化合物、磷酸盐、羧基、硫酸根合、氨基、巯基、硝基、羟基和其他类似基团。
[0082]
相反，术语“疏水性”是被大量水排斥的分子的物理特性，并且可以被称为“非极性”或“无极性”，所有这些都是可以与“疏水性”互换使用的术语。疏水性可以通过包含无极性基团来赋予，所述无极性基团包括但不限于长链饱和和不饱和脂族烃基以及被一个或多个芳族、脂环族或杂环基团取代的此类基团。两亲性化合物的实例包括但不限于磷脂、氨基脂和鞘脂。磷脂的代表性实例包括但不限于磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酸、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰
磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酸和二亚油酰磷脂酰胆碱。其他缺乏磷的化合物，诸如鞘脂、鞘糖脂家族、二酰基甘油和β-酰氧基酸，也在指定为两亲性脂质的组内。
[0083]
在一些实施方式中，脂质体或脂质双层包含阳离子脂质。如本文所用，术语“阳离子脂质”涵盖在生理ph下携带净正电荷的多种脂质种类中的任一种，其可以使用本领域技术人员已知的任何方法来确定。此类脂质包括但不限于国际申请号pct/us2009/042476中公开的式(i)的阳离子脂质，所述国际申请的标题为“methods and compositions comprising novel cationic lipids”，在2009年5月1日提交并且通过引用以其整体并入本文。这些包括但不限于n-甲基-n-(2-(精氨酰氨基)乙基)-n,n-二十八烷基氯化铵或二硬脂酰精氨酰氯化铵](dsaa)、n,n-二肉豆蔻酰基-n-甲基-n-2[n
’‑
(n
6-胍基-l-赖氨酰基)]氨基乙基氯化铵(dmgla)、n,n-二肉豆蔻酰基-n-甲基-n-2[n
2-胍基-l-赖氨酰基]氨基乙基氯化铵、n,n-二肉豆蔻酰基-n-甲基-n-2[n
’‑
(n2,n6-二胍基-l-赖氨酰基)]氨基乙基氯化铵和n,n-二硬脂酰基-n-甲基-n-2[n
’‑
(n6-胍基-l-赖氨酰基)]氨基乙基氯化铵(dsgla)。可以存在于本发明公开的递送系统复合物的脂质体或脂质双层中的阳离子脂质的其他非限制性实例包括n,n-二油基-n,n-二甲基氯化铵(“dodac”)；n-(2,3-二油酰氧基)丙基)-n,n,n-三甲基氯化铵(“dotap”)；n-(2,3-二油基氧基)丙基)-n,n,n-三甲基氯化铵(“dotma”)或其他n-(n,n-1-二烷氧基)-烷基-n,n,n-三取代铵表面活性剂；n,n-二硬脂基-n,n-二甲基溴化铵(“ddab”)；3-(n-(n',n'-二甲基氨基乙烷)-氨基甲酰基)胆固醇(“dc-chol”)和n-(1,2-二肉豆蔻氧基丙-3-基)-n,n-二甲基-n-羟乙基溴化铵(“dmrie”)；1,3-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷，n-(1-(2,3-二油基氧基)丙基)-n-(2-(精胺甲酰胺基)乙基)-n,n-二甲基-三氟乙酸铵(dospa)；gap-dlrie；dmdhp；3-β[4n-(1n,8n-二胍基亚精胺)-氨基甲酰基]胆固醇(bgsc)；3-β[n,n-二胍基乙基-氨基乙烷)-氨基甲酰基]胆固醇(bgtc)；n,n1,n2,n3四甲基四棕榈基精胺(cellfectin)；n-叔丁基-n'-十四烷基-3-十四烷基-氨基丙脒(clonfectin)；二甲基双十八烷基溴化铵(ddab)；1,3-二油酰氧基-2-(6-羧基精甲基)-丙基酰胺(dosper)；4-(2,3-双-棕榈酰氧基-丙基)-1-甲基-1h-咪唑(dpim)，n,n,n',n'-四甲基-n,n'-双(2-羟乙基)-2,3二油酰氧基-1,4-丁二碘化铵)(tfx-50)；1,2二油酰基-3-(4'-三甲基铵)丁醇-sn-甘油(dobt)或胆固醇基(4'三甲基氨)丁酸酯(chotb)，其中三甲基铵基团通过丁醇间隔臂连接到双链(对于dotb)或胆固醇基团(对于chotb)；dl-1,2-二油酰基-3-二甲基氨基丙基-β-羟乙基铵(dori)或dl-1,2-o-二油酰基-3-二甲氨基丙基-β-羟乙基铵(dorie)或如国际申请公布号wo 93/03709中公开的其类似物，所述国际申请通过引用以其整体并入本文；1,2-二油酰基-3-琥珀酰基-sn-甘油胆碱酯(dosc)；胆固醇基半琥珀酸酯(chosc)；脂多胺，诸如双十八烷基氨基甘氨酰精胺(dogs)和二棕榈酰磷脂酰乙醇戊基精胺(dppes)或如美国专利号5,283,185中公开的阳离子脂质，所述专利通过引用以其整体并入本文；胆固醇基-3β-羧基-氨基-乙烯三甲基碘化铵；1-二甲基氨基-3-三甲基铵-dl-2-丙基-胆固醇基羧酸盐碘化物；胆固醇基-3-β-羧胺亚乙基胺；胆固醇基-3-β-羟基琥珀酰氨基-亚乙基三甲基碘化铵；1-二甲基氨基-3-三甲基铵-dl-2-丙基-胆固醇基-3-β-氧基琥珀酸酯碘化物；2-(2-三甲基铵)-乙基甲基氨基乙基-胆固醇基-3-β-氧基琥珀酸酯碘化物；以及3-β-n-(聚乙烯亚胺)-氨基甲酰基胆固醇。
[0084]
在一些实施方式中，脂质体或脂质双层可以含有带负电荷或中性的辅助脂质。如
本文所用，“辅助脂质”是指非阳离子脂质，其包括中性(不带电)或阴离子脂质。术语“中性脂质”是指在生理ph下以不带电或中性两性离子形式存在的多种脂质种类中的任一种。术语“阴离子脂质”涵盖在生理ph下携带净负电荷的多种脂质种类中的任一种。辅助脂质可以包括但不限于二酰基磷脂酰胆碱、二酰基磷脂酰乙醇胺、神经酰胺、鞘磷脂、脑磷脂、胆固醇、脑苷脂和二酰基甘油、磷脂相关材料，诸如卵磷脂、磷脂酰乙醇胺、溶血卵磷脂、溶血磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、心磷脂、磷脂酸、双十六烷基磷酸、二硬脂酰磷脂酰胆碱(dspc)、二油酰磷脂酰胆碱(dopc)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(dppc)、二油酰磷脂酰甘油(dopg)、棕榈酰磷脂酰甘油(popg)、二棕榈酰磷脂酰甘油(dppg)、二油酰-磷脂酰乙醇胺(dope)、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(popc)、棕榈酰油酰-磷脂酰乙醇胺(pope)、二油酰-磷脂酰乙醇胺4-(n-马来酰亚胺甲基)-环己烷-1-羧酸盐(dope-mal)、二油酰磷脂酸(dopa)、硬脂胺、十二烷胺、十六烷胺、乙酰棕榈酸酯、蓖麻油酸甘油酯、硬脂酸十六烷酯、肉豆蔻酸异丙酯、两性丙烯酸聚合物、三乙醇胺-月桂基硫酸盐、烷基-芳基硫酸盐、聚乙氧基化脂肪酸酰胺、溶血磷脂酰胆碱和双十八烷基二甲基溴化铵等。辅助脂质还包括基于聚乙二醇的聚合物，诸如peg 2000、peg 5000和与磷脂或神经酰胺缀合的聚乙二醇，如美国专利号5,820,873中所述，所述专利通过引用以其整体并入本文。
[0085]
在一些实施方式中，递送系统复合物的脂质体是阳离子脂质体，并且在其他实施方式中，脂质体是阴离子的。如本文所用，术语“阳离子脂质体”旨在涵盖如上定义的任何脂质体，其在生理ph下具有净正电荷或具有大于0mv的ζ电位。可替代地，术语“阴离子脂质体”是指如上定义的脂质体，其在生理ph下具有净负电荷或小于0mv的ζ电位。可以使用本领域技术人员已知的任何方法来测量脂质体的ζ电位或电荷。应注意，脂质体本身是被确定为阳离子或阴离子的实体，这意味着在生理ph下分别具有可测量的正电荷或负电荷的脂质体可以在体内环境中，附着到其他物质或可以与脂质体的水性核心内的其他带电组分缔合，这从而可以导致形成不具有净电荷的结构。在产生包含阳离子或阴离子脂质体的递送系统复合物之后，如本文其他地方所述，可以将分子诸如脂质-peg缀合物后插入脂质体的双层中，从而屏蔽递送系统复合物的表面电荷。
[0086]
然而，在递送系统复合物的脂质体是阳离子脂质体的那些实施方式中，阳离子脂质体不需要完全包含阳离子脂质，但必须包含足量的阳离子脂质，使得脂质体在生理ph下具有正电荷。阳离子脂质体还可以含有带负电或中性的辅助脂质，只要脂质体的净电荷是正电荷和/或脂质体的表面在生理ph下是带正电的即可。在这些实施方式中，阳离子脂质与辅助脂质的比率使得所得脂质体的总电荷在生理ph下是正电荷。例如，阳离子脂质以总脂质体脂质的约10摩尔％至约100摩尔％，在一些实施方式中，约20摩尔％至约80摩尔％，并且在其他实施方式中，约20摩尔％至约60摩尔％存在于阳离子脂质体中。当包含在阳离子脂质体中时，中性脂质可以总脂质体脂质的约0摩尔％至约90摩尔％，在一些实施方式中约20摩尔％至约80摩尔％，并且在其他实施方式中约40摩尔％至约80摩尔％的浓度存在。当包含在阳离子脂质体中时，阴离子脂质可以总脂质体脂质的约0摩尔％至约49摩尔％，并且在某些实施方式中约0摩尔％至约40摩尔％范围内的浓度存在。
[0087]
在一些实施方式中，递送系统复合物的阳离子脂质体包含1:1摩尔比的阳离子脂质和中性辅助脂质胆固醇。在这些实施方式中的一些中，阳离子脂质包含dotap。
[0088]
同样，然而，在递送系统复合物的脂质体是阴离子脂质体的那些实施方式中，阴离
子脂质体不需要完全包含阴离子脂质，但必须包含足量的阴离子脂质，使得脂质体在生理ph下具有负电荷。阴离子脂质体还可以含有中性辅助脂质或阳离子脂质，只要脂质体的净电荷是负电荷和/或脂质体的表面在生理ph下是带负电的即可。在这些实施方式中，阴离子脂质与中性辅助脂质或阳离子脂质的比率使得所得脂质体的总电荷在生理ph下是负电荷。例如，阴离子脂质以总脂质体脂质的约10摩尔％至约100摩尔％，在一些实施方式中，约20摩尔％至约80摩尔％，并且在其他实施方式中，约20摩尔％至约60摩尔％存在于阴离子脂质体中。当包含在阴离子脂质体中时，中性脂质可以总脂质体脂质的约0摩尔％至约90摩尔％，在一些实施方式中约20摩尔％至约80摩尔％，并且在其他实施方式中约40摩尔％至约80摩尔％的浓度存在。当包含在阴离子脂质体中时，带正电的脂质可以总脂质体脂质的约0摩尔％至约49摩尔％，并且在某些实施方式中约0摩尔％至约40摩尔％范围内的浓度存在。
[0089]
在脂质载体是阳离子脂质体或阴离子脂质体的一些实施方式中，递送系统复合物整体上具有净正电荷。“净正电荷”意指递送系统复合物的组分的正电荷超过递送系统复合物的组分的负电荷。然而，应理解，本发明还涵盖具有带正电表面的递送系统复合物，无论复合物的净电荷是正电荷、中性电荷还是负电荷。递送系统复合物的表面的电荷可以通过本领域技术人员已知的方法通过复合物在电场中的迁移来测量，诸如通过测量ζ电位(martin,swarick和cammarata(1983)physical pharmacy&physical chemical principles in the pharmaceutical sciences,第3版lea and febiger)或通过递送系统复合物与细胞表面的结合亲和力。表现出带正电表面的复合物比具有中性或带负电表面的复合物具有对细胞表面更大的结合亲和力。此外，应理解，带正电的表面可以通过添加非离子极性化合物，例如聚乙二醇在空间上被屏蔽，如本文其他地方所述。
[0090]
在具体非限制性实施方式中，递送系统复合物具有在约0.5:1与约100:1之间，包括但不限于约0.5:1、约1:1、约2:1、约3:1、约4:1、约5:1、约6:1、约7:1、约8:1、约9:1、约10:1、约15:1、约20:1、约40:1或约100:1的正电荷与负电荷的电荷比( :-)。在特定非限制性实施方式中， :-电荷比是约1:1。
[0091]
本发明公开的递送系统复合物可以包含脂质体，其包封在脂质体的核心中的二水合物(1,2-二氨基环己烷)铂(ii)-亚叶酸沉淀物的复合物。核心内容物的释放对细胞或细胞器内的细胞内ph条件可以是敏感的。虽然不受任何特定理论或作用机制的束缚，但据信本发明公开的递送系统复合物通过内吞作用进入细胞并存在于表现出相对低ph(例如，ph 5.0)的内体中。因此，在一些实施方式中，二水合物(1,2-二氨基环己烷)铂(ii)-亚叶酸沉淀物的复合物在内体ph下易于溶解。在某些实施方式中，沉淀物在小于约6.5、小于约6.0、小于约5.5、小于约5.0、小于约4.5或小于约4.0，包括但不限于约6.5、约6.4、约6.3、约6.2、约6.1、约6.0、约5.9、约5.8、约5.7、约5.6、约5.5、约5.4、约5.3、约5.2、约5.1、约5.0、约4.9、约4.8、约4.7、约4.6、约4.5、约4.4、约4.3、约4.2、约4.1、约4.0或更小的ph水平下易于溶解。在特定实施方式中，沉淀物在5.0或更低的ph下易于溶解。在优选实施方式中，lcp-ii纳米颗粒包含酸敏感核心。酸敏感核心在低于7的ph水平下更易于溶解。在这些实施方式中，lcp-ii纳米颗粒可以在目标，例如细胞质处卸载比没有酸敏感核心的纳米颗粒更多的货物。
[0092]
递送系统复合物可以具有任何大小，只要复合物能够将并入的沉淀物递送至细胞
(例如体外、体内)、生理位点或组织即可。在一些实施方式中，递送系统复合物是纳米颗粒，其中纳米颗粒包含包封沉淀物，式i化合物的脂质体。如本文所用，术语“纳米颗粒”是指具有至少一个尺寸小于约1000nm的任何形状的颗粒。在一些实施方式中，纳米颗粒具有在约1nm至约1000nm范围内的至少一个尺寸，包括在1nm与1000nm之间的任何整数值(包括约1、2、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、500和1000)。在某些实施方式中，纳米颗粒具有至少一个约120nm的尺寸。多分散性指数可以是0.2至0.4，诸如0.3。粒度可以使用本领域已知的任何方法来确定，包括但不限于沉降场流分离、光子相关光谱、圆盘离心和动态光散射(使用例如亚微米粒度仪，诸如nicomp粒度分级系统，来自autodilutepat型号370；santa barbara,ca)。
[0093]
如本文其他地方所述，递送系统复合物的大小可以基于在生成包含沉淀物的油包水微乳液期间使用的非离子表面活性剂与有机溶剂的比率来调节。此外，递送系统复合物的大小取决于脂质体中脂质与沉淀物的比率。
[0094]
用于制备脂质体的方法是本领域已知的。例如，脂质体制备方法的综述可以见于liposome technology(cfc press ny 1984)；ostro的liposomes(marcel dekker,1987)；lichtenberg和barenholz(1988)methods biochem anal.33:337-462以及美国专利号5,283,185，其中的每一个通过引用以其整体并入本文。例如，阳离子脂质和任选的辅助脂质可以通过使用均质器乳化、冻干并熔融以获得多层脂质体。可替代地，单层脂质体可以通过反相蒸发方法产生(szoka和papahadjopoulos(1978)proc.natl.acad.sci.usa 75:4194-4198，其通过引用以其整体并入本文)。在一些实施方式中，脂质体使用薄膜水合产生(bangham等人(1965)j.mol.biol.13:238-252，其通过引用以其整体并入本文)。在某些实施方式中，脂质体制剂可以在大小分级之前进行短暂的超声处理并在50℃下温育较短的时间(例如，约10分钟)(参见templeton等人(1997)nature biotechnology 15:647-652，其通过引用以其整体并入本文)。
[0095]
乳液是一种液体在另一种不混溶的液体中的分散体。当提到两种液体时，术语“不混溶”是指这些液体不能混合或共混成均质溶液。两种不混溶液体添加在一起是总是形成两个单独的相。在本范明公开的方法中使用的有机溶剂基本上与水不混溶。乳液本质上是溶胀的胶束，尽管并非所有的胶束溶液都可以溶胀形成乳液。胶束是两亲性分子的胶体聚集体，它们在定义明确的浓度(被称为临界胶束浓度)下形成。胶束取向成脂质分子的位于胶束内部的疏水性部分和位于外表面的亲水性部分暴露于水。胶束中聚集分子的典型数量(聚集数)具有约50至约100的范围。术语“胶束”也是指反胶束或反胶束(inverse/reverse micelles)，其在有机溶剂中形成，其中疏水性部分位于外表面，暴露于有机溶剂，并且亲水性部分朝向胶束内部取向。
[0096]
水包油(o/w)乳液由分散在水中的有机化合物(例如，油)的液滴组成，并且油包水(w/o)乳液是其中各相反转的乳液，并且包含分散在有机化合物(例如油)中的液滴。油包水乳液在本文中也被称为反相乳液。热力学稳定的乳液是包含表面活性剂(例如，两亲性分子)并自发形成的那些乳液。术语“乳液”可以指微乳液或粗乳液，这取决于颗粒的大小。微乳液中的液滴直径通常在约10至约100nm的范围内。相比之下，术语粗乳液是指具有大于约100nm的直径的液滴。
[0097]
对本领域技术人员明显的是，将足量的水溶液、有机溶剂和表面活性剂添加到反
应溶液中以形成油包水乳液。
[0098]
将表面活性剂添加到反应溶液中以促进油包水微乳液的形成和稳定。表面活性剂是可以降低液体的表面张力的分子。表面活性剂具有亲水性和疏水性特性两者，并且因此可以在一定程度上溶解在水或有机溶剂中。表面活性剂主要分为四组：阳离子、阴离子、非离子和两性离子。本发明公开的方法使用非离子表面活性剂。非离子表面活性剂是溶解或分散在水溶液中时不带电荷的那些表面活性剂。因此，非离子表面活性剂的亲水性部分是不带电的极性基团。适用于本发明公开的方法和组合物的非离子表面活性剂的代表性非限制性实例包括聚乙二醇、聚山梨醇酯，包括但不限于聚乙氧基化脱水山梨糖醇脂肪酸酯(例如，tween化合物)和脱水山梨糖醇衍生物(例如，span化合物)；环氧乙烷/环氧丙烷共聚物(例如，pluronic化合物，也被称为泊洛沙姆)；聚氧乙烯醚化合物，诸如brij家族的那些，包括但不限于聚氧乙烯硬脂醚(也被称为聚氧乙烯(100)硬脂醚，并且商品名为brij700)；脂肪醇的醚。在具体实施方式中，非离子表面活性剂包含辛基酚乙氧基化物(即，triton x-100)，其从多个供应商(例如，sigma-aldrich,st.louis,mo)可商购获得。
[0099]
聚乙氧基化脱水山梨糖醇脂肪酸酯(聚山梨醇酯)以商品名tween从多个供应商(例如，sigma-aldrich,st louis,mo)可商购获得，并且包括但不限于聚氧乙烯(poe)脱水山梨糖醇单油酸酯(tween80)、poe脱水山梨糖醇单硬脂酸酯(tween60)、poe脱水山梨糖醇单月桂酸酯(tween20)和poe脱水山梨糖醇单棕榈酸酯(tween40)。
[0100]
环氧乙烷/环氧丙烷共聚物包括被称为泊洛沙姆的嵌段共聚物，其也以商品名pluronic已知并且可以从basf公司(florham park,new jersey)购买。泊洛沙姆由侧接聚氧乙烯(聚(环氧乙烷))的两条亲水链的聚氧丙烯(聚(环氧丙烷))的中央疏水链构成，并由以下化学结构表示：ho(c2h4o)a(c3h6o)b(c2h4o)ah；其中c2h4o亚基是环氧乙烷单体，并且c3h6o亚基是环氧丙烷单体，并且其中a和b可以是20至150范围内的任何整数。
[0101]
可以用于本发明公开的方法的有机溶剂包括与水不混溶或基本上不混溶的那些有机溶剂。可以用于本发明公开的方法的有机溶剂的非限制性实例包括氯仿、甲醇、乙醚、乙酸乙酯、己醇、环己烷和二氯甲烷。在具体实施方式中，有机溶剂是非极性的或基本上非极性的。
[0102]
在一些实施方式中，多于一种有机溶剂的混合物可以用于本发明公开的方法中。在这些实施方式中的一些中，有机溶剂包括环己烷和己醇的混合物。在具体实施方式中，有机溶剂包含体积/体积比为约7.5:1.7的环己烷和己醇。如本文其他地方所述，非离子表面活性剂可以单独添加到反应溶液(包含阳离子、阴离子、式i的生物活性化合物和有机溶剂的水溶液)中，或者它可以首先与有机溶剂混合，并且有机溶剂/表面活性剂混合物可以添加到阴离子、阳离子和式i的生物活性化合物的水溶液中。在这些实施方式中的一些中，将环己烷、己醇和triton x-100的混合物添加到反应溶液中。在具体实施方式中，添加到反应溶液中的混合物的环己烷:己醇:triton x-100的体积/体积/体积比为约7.5:1.7:1.8。
[0103]
应注意，非离子表面活性剂与有机溶剂的体积/体积比调节油包水微乳液的大小，并且因此调节其中所含的沉淀物和所得的递送系统复合物，其中更大的表面活性剂:有机溶剂比产生具有更大直径的递送系统复合物并且更小的表面活性剂:有机溶剂比产生具有更小直径的递送系统复合物。
[0104]
可以将反应溶液混合以形成油包水微乳液，并且也可以将溶液孵育一段时间。此
温育步骤可以在室温下进行。在一些实施方式中，反应溶液在室温下混合约5分钟与约60分钟之间的时间段，包括但不限于约5分钟、约10分钟、约15分钟、约20分钟、约25分钟、约30分钟、约35分钟、约40分钟、约45分钟、约50分钟、约55分钟和约60分钟。在具体实施方式中，反应溶液在室温下混合约15分钟。
[0105]
为了使沉淀物与脂质体复合，可以修饰沉淀物的表面。在一些实施方式中，沉淀物在其形成之后是中性的。在一些实施方式中，沉淀物在其形成后将具有带电表面。那些具有带正电表面的沉淀物可以与阴离子脂质体混合，而那些具有带负电表面的沉淀物可以与阳离子脂质体混合。具体地，oxp-fna的复合物是中性的并且可以通过两亲性脂质诸如dopa稳定化。在某些实施方式中，oxp-fna的稳定化复合物用阳离子脂质诸如dotap涂覆，以制备纳米-folox颗粒。术语“稳定化”是指能够被第二脂质涂层涂覆的沉淀物。
[0106]
在一些实施方式中，纳米-folox颗粒具有或被修饰为具有小于-10mv的ζ电位，并且在某些实施方式中，ζ电位在约-1mv与约-10mv之间，包括但不限于约-4mv、约-5mv和约-6mv。在具体实施方式中，沉淀物的ζ电位是约-16mv。
[0107]
在某些实施方式中，外小叶包含不同的脂质而不是单一的、相对纯的脂质。这在本文中也被称为不对称脂质膜。不对称脂质膜可以屏蔽纯脂质体上存在的电荷。优选地，正ζ电位的值低于纯脂质体。
[0108]
在产生油包水乳液后，沉淀物可以由非离子表面活性剂和有机溶剂纯化。可以使用本领域已知的任何方法纯化沉淀物，包括但不限于凝胶过滤色谱法。已经从非离子表面活性剂和有机溶剂纯化的沉淀物是基本上不含非离子表面活性剂或有机溶剂的沉淀物(例如，沉淀物包含按重量计小于10％、小于1％、小于0.1％的非离子表面活性剂或有机溶剂)。在其中使用凝胶过滤来纯化沉淀物的那些实施方式中的一些中，沉淀物被吸附到硅胶或类似类型的固定相，硅胶或类似的固定相用极性有机溶剂(例如，乙醇、甲醇、丙酮、dmso、dmf)洗涤以去除非离子表面活性剂和有机溶剂，并且用包含极性有机溶剂的水溶液将沉淀物从硅胶或其他固体表面洗脱。
[0109]
在这些实施方式中的一些中，用乙醇洗涤硅胶，并且用水和乙醇的混合物洗脱沉淀物。在具体实施方式中，用水和乙醇的混合物洗脱沉淀物，其中混合物包含约1:9与约1:1之间的体积/体积比，包括但不限于约1:9、约1:8、约1:7、约1:6、约1:5、约1:4、约1:3、约1:2和约1:1。在具体实施方式中，水与乙醇的体积/体积比为约1:3。在这些实施方式中的一些中，包含25ml水和75ml乙醇的混合物用于洗脱步骤。在使用例如旋转蒸发去除乙醇后，可以在与制备的脂质体混合之前将沉淀物分散在水溶液(例如，水)中。
[0110]
在某些实施方式中，制备递送系统复合物的方法还可以包括在产生递送系统复合物后的额外纯化步骤，其中递送系统复合物从过量的游离脂质体和未包封的沉淀物纯化。纯化可以通过本领域已知的任何方法实现，包括但不限于通过蔗糖密度梯度或适合形成密度梯度的其他介质离心。然而，应理解，也利用使用其他纯化方法，诸如色谱法、过滤、相分配、沉淀或吸收。在一种方法中，利用通过蔗糖密度梯度进行的离心纯化。蔗糖梯度可以在约0％蔗糖至约60％蔗糖或约5％蔗糖至约30％蔗糖的范围内。在其中制备蔗糖梯度的缓冲液可以是适于储存含有复合物的级分的任何水性缓冲液，并且在一些实施方式中，适于将复合物施用至细胞和组织的缓冲液。
[0111]
在一些实施方式中，靶向递送系统或peg化递送系统如本文其他地方所述制备，其
中所述方法还包括在脂质体制备后或产生递送系统复合物后的后插入步骤，其中脂质-靶向配体缀合物或peg化脂质被后插入到脂质体中。包含脂质-靶向配体缀合物或脂质-peg缀合物的脂质体或递送系统复合物可以按照本领域已知的技术制备，包括但不限于本文呈现的那些(参见实验部分；ishida等人(1999)febs lett.460:129-133；perouzel等人(2003)bioconjug.chem.14:884-898，其通过引用以其整体并入本文)。后插入步骤可以包括将脂质体或递送系统复合物与脂质-靶向配体缀合物或脂质-peg缀合物混合，并且将颗粒在约50℃至约60℃下温育短暂的时间段(例如，约5分钟、约10分钟)。在一些实施方式中，将递送系统复合物或脂质体与脂质-peg缀合物或脂质-peg-靶向配体缀合物在约5至约20mol％的浓度，包括但不限于约5mol％、约6mol％、约7mol％、约8mol％、约9mol％、约10mol％、约11mol％、约12mol％、约13mol％、约14mol％、约15mol％、约16mol％、约17mol％、约18mol％、约19mol％、约20mol％下温育，以形成隐形投送系统。在这些实施方式中的一些中，所述脂质-peg缀合物的浓度是约10mol％。所述脂质-peg缀合物的聚乙二醇部分可以具有约100至约20000g/mol范围内的分子量，包括但不限于约100g/mol、约200g/mol、约300g/mol、约400g/mol、约500g/mol、约600g/mol、约700g/mol、约800g/mol、约900g/mol、约1000g/mol、约5000g/mol、约10000g/mol、约15000g/mol和约20000g/mol。在某些实施方式中，所述脂质-peg缀合物包含具有约2000g/mol的分子量的peg分子。在一些实施方式中，所述脂质-peg缀合物包含dspe-peg
2000
。脂质-peg-靶向配体缀合物也可以使用以上所述的后插入方法后插入脂质体或递送系统复合物中。
[0112]
如本文其他地方所述，递送系统复合物可以具有表面电荷(例如，正电荷)。在一些实施方式中，递送系统的脂质体的表面电荷可以通过将包含聚乙二醇(peg)部分的脂质并入脂质体中来最小化。降低递送系统的脂质体的表面电荷可以减少递送系统复合物与血清蛋白之间的聚集量并增强复合物的循环半衰期(yan,scherphof和kamps(2005)j liposome res 15:109-139)。因此，在一些实施方式中，脂质体的外表面或递送系统的脂质双层的外小叶包含peg分子。这种复合物在本文中被称为peg化的递送系统复合物。在这些实施方式中，递送系统复合物的脂质体的脂质双层的外小叶包含脂质-peg缀合物。
[0113]
peg化的递送系统复合物可以通过将递送系统复合物与包含脂质-peg缀合物的胶束温育将脂质-peg缀合物后插入脂质双层中来生成，如本领域已知且在本文其他地方所述的(ishida等人(1999)febs lett.460:129-133；perouzel等人(2003)bioconjug.chem.14:884-898；参见实验部分)。“脂质-聚乙二醇缀合物”或“脂质-peg缀合物”是指与至少一个聚乙二醇分子共价结合的脂质分子。在一些实施方式中，所述脂质-peg缀合物包含1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-羧基-聚乙二醇(dspe-peg)。如立即在下文所述，可以进一步修饰这些脂质-peg缀合物以包含靶向配体，从而形成脂质-peg-靶向配体缀合物(例如，dspe-peg-aa)。术语“脂质-peg缀合物”还是指这些脂质-peg-靶向配体缀合物，并且包含具有脂质-peg靶向配体缀合物的脂质体的递送系统复合物被认为是peg化递送系统复合物和靶向递送系统复合物，如立即在下文所述。
[0114]
可替代地，递送系统复合物可以通过在脂质双层的外小叶形成期间添加脂质-peg缀合物来peg化。
[0115]
脂质体的peg化通过减少网状内皮(res)系统对复合物的清除来增强脂质体的循环半衰期。尽管不受任何特定理论或作用机制的束缚，但据信peg化的递送系统复合物可以
通过在空间上阻断复合物的调理作用来逃避res系统(owens和peppas(2006)int j pharm 307:93-102)。为了提供足够的空间位阻来避免调理作用，脂质体的外表面必须完全被呈“刷”构造的peg分子覆盖。在低表面覆盖下，peg链通常具有“蘑菇”构造，其中peg分子更靠近脂质体表面定位。在“刷”构造中，peg分子从脂质体表面延伸得更远，从而增强空间位阻效应。然而，peg在表面的过度拥挤可能降低聚合物链的流动性并且因此降低空间位阻效应(owens和peppas(2006)int j pharm 307:93-102)。
[0116]
peg的构造取决于脂质体表面上peg的表面密度和分子量。控制因素是相对于它们的flory维度rf的脂质双层(d)中peg链之间的距离，其被定义为an
3/5
，其中a是单体的持久长度，并且n是peg中单体单元的数量(参见nicholas等人(2000)biochim biophys acta 1463:167-178，其通过引用并入本文)。可以定义三种制度：(1)当d》2rf(叉指蘑菇)时；(2)当d《2rf(蘑菇)时；和(3)当d《rf(刷)时(nicholas等人)。
[0117]
在某些实施方式中，peg化的递送系统复合物包括隐形递送系统复合物。“隐形递送系统复合物”意指包含脂质体的递送系统复合物，其中脂质体的脂质双层的外小叶包含足够数量的脂质-peg缀合物，其构造允许与非peg化的递送系统复合物相比，所述递送系统复合物在向受试者施用时表现出肝中减少的res系统进行的摄取。res摄取可以使用本领域已知的测定来测量，包括但不限于2009年5月1日提交的国际申请号pct/us2009/042485中描述的肝灌注测定。在这些实施方式中的一些中，隐形递送系统复合物包含脂质体，其中脂质体的脂质双层的外小叶包含peg分子，其中所述d《rf。
[0118]
在其中peg化的递送系统是隐形多核苷酸系统的那些实施方式中的一些中，阳离子脂质体的脂质双层的外小叶包含脂质-peg缀合物，其浓度为外小叶脂质的约4mol％至约15mol％，包括但不限于约4mol％、约5mol％、约6mol％、约7mol％、8mol％、约9mol％、约10mol％、约11mol％、约12mol％、约13mol％、约14mol％和约15mol％peg。在某些实施方式中，隐形递送系统复合物的阳离子脂质体的脂质双层的外小叶包含约10.6mol％peg。还意外地发现更高百分比值(以mol％表示)的peg是有用的。有用的mol％值包括约12mol％至约50mol％的那些值。优选地，所述值是约15mol％至约40mol％。还优选约15mol％至约35mol％的值。最优选的值是约20mol％至约25mol％，例如23mol％。
[0119]
所述脂质-peg缀合物的聚乙二醇部分可以具有约100至约20000g/mol范围内的分子量，包括但不限于约100g/mol、约200g/mol、约300g/mol、约400g/mol、约500g/mol、约600g/mol、约700g/mol、约800g/mol、约900g/mol、约1000g/mol、约5000g/mol、约10000g/mol、约15000g/mol和约20000g/mol。在一些实施方式中，所述脂质-peg缀合物包含具有约2000g/mol的分子量的peg分子。在某些实施方式中，所述脂质-peg缀合物包含dspe-peg
2000
。
[0120]
在一些实施方式中，递送系统复合物包含脂质体，其中脂质体的外表面或递送系统复合物包含脂质双层，其中脂质双层的外小叶包含靶向配体，从而形成靶向递送系统。在这些实施方式中，脂质体的外小叶包含靶向配体。“靶向配体”意指将物理缔合的分子或复合物靶向到靶向细胞或组织的分子。如本文所用，术语“物理缔合”是指两个分子之间的共价或非共价相互作用。“缀合物”是指彼此共价结合的分子复合物。例如，与靶向配体共价结合的脂质的复合物可以被称为脂质-靶向配体缀合物。
[0121]
可替代地，靶向配体可以与脂质非共价结合。“非共价键”或“非共价相互作用”不
涉及电子对的共享，而是涉及电磁相互作用的更分散变型，并且可以包括氢键、离子相互作用、范德华相互作用和疏水键。
[0122]
靶向配体可以包括但不限于小分子、肽、脂质、糖、寡核苷酸、激素、维生素、抗原、抗体或其片段、特异性膜受体配体、能够与抗配体反应的配体、融合肽、核定位肽或此类化合物的组合。靶向配体的非限制性实例包括去唾液酸糖蛋白、胰岛素、低密度脂蛋白(ldl)、叶酸、苯甲酰胺衍生物、包含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(rgd)序列的肽以及针对细胞表面分子的单克隆和多克隆抗体。在一些实施方式中，所述小分子包含苯甲酰胺衍生物。在这些实施方式中的一些中，所述苯甲酰胺衍生物包括茴香酰胺。
[0123]
靶向配体可以与包含递送系统的脂质体或脂质双层的脂质(包括阳离子脂质或辅助脂质)共价结合，从而形成脂质-靶向配体缀合物。如上所述，脂质-靶向配体缀合物可以使用本领域已知和本文其他地方所述的技术后插入脂质体的脂质双层(ishida等人(1999)febs lett.460:129-133；perouzel等人(2003)bioconjug.chem.14:884-898；参见实验部分)。可替代地，所述脂质-靶向配体缀合物可以在脂质双层的外小叶形成期间添加。
[0124]
一些脂质-靶向配体缀合物包含在脂质与靶向配体之间的介入分子，其与脂质和靶向配体两者共价结合。在这些实施方式中的一些实施方式中，介入分子是聚乙二醇(peg)，从而形成脂质-peg-靶向配体缀合物。这种脂质-靶向缀合物的实例是dspe-peg-aa，其中脂质1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-羧基(dspe)与聚乙二醇(peg)结合，所述聚乙二醇与靶向配体茴香酰胺(aa)结合。因此，在一些实施方式中，递送系统的阳离子脂质载体包含脂质-靶向配体缀合物dspe-peg-aa。
[0125]“靶向细胞”意指靶向配体向其募集物理缔合的分子或复合物的细胞。靶向配体可以与靶细胞的一种或多种成分相互作用。靶细胞可以是任何细胞类型或处于任何发育阶段，表现出各种表型，并且可以处于各种病理状态(即，异常和正常状态)。例如，靶向配体可以与微生物(即，原核细胞(细菌)、病毒、真菌、原生动物或寄生虫)或真核细胞(例如，上皮细胞、肌肉细胞、神经细胞、感觉细胞、癌细胞、分泌细胞、恶性肿瘤细胞、红细胞和淋巴样细胞、干细胞)上的正常、异常和/或独特成分缔合。因此，靶向配体可以与靶细胞上的组成成分缔合，所述成分是疾病相关抗原，包括例如肿瘤相关抗原和自身免疫疾病相关抗原。此类疾病相关抗原包括例如生长因子受体、细胞周期调节子、血管生成因子和信号传导因子。
[0126]
在一些实施方式中，靶向配体与靶向细胞上的细胞表面蛋白相互作用。在这些实施方式中的一些中，能够与靶向配体结合的细胞表面蛋白的表达水平在靶向细胞中相对于其他细胞更高。例如，癌细胞过表达某些细胞表面分子，诸如her2受体(乳腺癌)或σ受体。在其中靶向配体包含苯甲酰胺衍生物诸如茴香酰胺的某些实施方式中，靶向配体将相关的递送系统复合物靶向至σ受体过表达细胞，其可以包括但不限于癌细胞，诸如小细胞和非小细胞肺癌、肾癌、结肠癌、肉瘤、乳腺癌、黑色素瘤、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤和前列腺癌(aydar,palmer和djamgoz(2004)cancer res.64:5029-5035)。
[0127]
因此，在一些实施方式中，所述靶细胞包括癌细胞。术语“癌症”和“癌性的”是指或描述哺乳动物中通常以不受调节的细胞生长为特征的生理状况。如本文所用，“癌细胞”或“肿瘤细胞”是指以这种不受调节的细胞生长为特征的细胞。术语“癌症”涵盖所有类型的癌症，包括但不限于所有形式的癌、黑色素瘤、肉瘤、淋巴瘤和白血病，包括但不限于膀胱癌、脑肿瘤、乳腺癌、宫颈癌、结直肠癌、食管癌、子宫内膜癌、肝细胞癌、喉癌、肺癌、骨肉瘤、卵
巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌和甲状腺癌。在一些实施方式中，靶向癌细胞包括结直肠癌(crc)细胞。
[0128]
在某些实施方式中，本文所述的主题涉及制备递送系统复合物的方法，所述方法包括：
[0129]
a)在溶剂诸如thf中接触一个或多个包含纳米-folox的单脂质层核心、一个或多个包含fdump的单脂质层核心和聚合物，诸如plga、plga-peg和/或plga-peg-aeaa(例如，全部三种以约4:4:2的比率存在)以形成溶液；
[0130]
b)使溶液与水接触以形成悬浮液；以及
[0131]
c)搅拌悬浮液；其中制备递送系统复合物。
[0132]
在某些实施方式中，本文所述的主题涉及制备递送系统复合物的方法，所述方法包括：
[0133]
a)在溶剂诸如thf中接触一个或多个包含纳米-folox的单脂质层核心；一个或多个包含fdump的单脂质层核心；聚合物，诸如plga、plga-peg和/或plga-peg-aeaa(例如，全部三种以约4:4:2的比率存在)；和sn-38，以形成溶液；
[0134]
b)使溶液与水接触以形成悬浮液；以及
[0135]
c)搅拌悬浮液；其中制备递送系统复合物。
[0136]
在某些实施方式中，本文所述的主题涉及制备递送系统复合物的方法，所述方法包括：
[0137]
a)制备二水合物(1,2-二氨基环己烷)铂(ii)([pt(dach)(h2o)2]
2
和亚叶酸的沉淀物；
[0138]
b)使所述沉淀物与两亲性脂质接触以稳定化；
[0139]
c)使所述稳定化的沉淀物与阳离子脂质接触以制备所述递送系统复合物。
[0140]
ii.递送和治疗的药物组合物和方法
[0141]
在某些实施方式中，本文所述的主题涉及一种治疗癌症的方法，其包括向受试者施用有效量的如本文所述的式i化合物或包含式i的递送系统复合物。化合物或递送系统复合物可以与赋形剂一起配制用于施用。
[0142]
在某些实施方式中，治疗方法还包括在所述递送系统复合物之前、之后或同时施用第二活性剂。在某些实施方式中，第二活性剂是抗代谢化疗药物或单克隆抗体。在某些实施方式中，抗代谢化疗药物是5-氟尿嘧啶或纳米-fdump。在某些实施方式中，单克隆抗体是抗pd-l1抗体。每种的施用方法和剂量在本领域技术人员的范围内或是本领域已知的。
[0143]
在某些实施方式中，癌症是结直肠癌。
[0144]
本文所述的递送系统复合物可用于哺乳动物组织培养系统、动物研究和治疗目的。已经显示递送系统复合物在引入细胞或组织时具有治疗活性。递送系统复合物可以出于治疗目的施用，或者包含递送系统复合物以及另外的药物载体的药物组合物可以被配制用于递送，即通过任何可用的途径向受试者施用，包括但不限于肠胃外(例如，静脉内)、皮内、皮下、口服、鼻腔、支气管、眼部、经皮(局部)、经粘膜、直肠和阴道途径。在一些实施方式中，递送途径是静脉内、肠胃外、经粘膜、鼻腔、支气管、阴道和口服。
[0145]
如本文所用，术语“药学上可接受的载体”包括与药物施用相容的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等。也可以将补充性活性化合物并入组合物
中。
[0146]
如本领域普通技术人员将理解的，将本发明公开的药物组合物被配制成与其预期的施用途径相容。用于肠胃外(例如，静脉内)、肌肉内、皮内或皮下施加的溶液或悬浮液可以包含以下组分：无菌稀释剂，诸如注射用水、盐水溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗细菌剂，诸如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，诸如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，诸如乙二胺四乙酸；缓冲液，诸如醋酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；以及用于调节张力的试剂，诸如氯化钠或右旋糖。可以用酸或碱，诸如盐酸或氢氧化钠调节ph。可以将肠胃外制剂封装在由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。
[0147]
适合于可注射使用的药物组合物通常包括无菌水溶液或分散体，诸如本文其他地方所述的那些，以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。对于静脉内施用，合适的载体包括生理盐水、抑菌水或磷酸盐缓冲盐水(pbs)。组合物必须是无菌的并且应当是易于注射的程度的流体。在一些实施方式中，在制造和储存条件下药物组合物是稳定的，并且应当被保存以防止微生物(诸如细菌和真菌)的污染作用。通常，相关载体可以是溶剂或分散介质，所述溶剂或分散介质含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其适合的混合物。防止微生物的作用可以通过多种抗细菌和抗真菌剂(例如，对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等)来实现。在一些实施方式中，在制剂中包括等渗剂，例如糖、多元醇(诸如甘露糖醇或山梨糖醇)或氯化钠。通过在所述制剂中包含延迟吸收的药剂，例如单硬脂酸铝和明胶，可以实现可注射制剂的延长吸收。
[0148]
无菌可注射溶液可以通过如本文其他地方所述的过滤灭菌来制备。在某些实施方式中，用于注射的溶液不含内毒素。通常，通过以下方式制备分散体：将递送系统复合物并入无菌媒介物中，所述媒介物含有基础分散介质和来自上文所列举的那些成分的所需其他成分。在其中无菌分泌用于制备无菌可注射溶液的那些实施方式中，所述溶液可以通过真空干燥和冷冻干燥来制备，所述真空干燥和冷冻干燥由先前无菌过滤的溶液产生活性成分和任何另外的所需成分的粉末。
[0149]
口服组合物通常包括惰性稀释剂或可食用的载体。口服组合物可以使用流体载体制备以用作漱口水。可以包括药学上相容的结合剂和/或佐剂材料作为组合物的一部分。口服组合物可以包括甜味剂，诸如蔗糖或糖精；或调味剂，诸如薄荷、水杨酸甲酯或橙香精。
[0150]
对于通过吸入施用，本发明公开的组合物可以气溶胶喷雾形式递送，所述气溶胶喷雾来自压力容器或含有适合推进剂(例如，气体，诸如二氧化碳)的分配器，或喷雾器。也可以使用液体气溶胶、干粉等。
[0151]
本发明公开的组合物的全身施用也可以通过经粘膜或经皮方式进行。对于经粘膜或经皮施用，在制剂中使用适合待渗透屏障的渗透剂。此类渗透剂是本领域通常已知的，并且对于经粘膜给予，包括例如洗涤剂、胆汁盐、和夫西地酸衍生物。经粘膜施用可以通过使用鼻喷雾剂或栓剂来完成。对于透皮施用，将活性化合物配制成如本领域通常已知的软膏、药膏、凝胶或乳膏。
[0152]
以剂量单位形式配制口服或肠胃外组合物是有利的，以便于施用和使剂量均匀。如本文所用的剂量单位形式是指适合作为待治疗受试者的单位剂量的物理上离散的单位；每个单位含有经计算与所需的药物或化妆品载体联合可产生所需治疗作用的预定量的活性化合物。本发明的剂量单位形式的规格由如下决定并且直接依赖于：(a)活性化合物的独
特特征和有待实现的具体治疗作用，和(b)本领域中混配用于治疗个体的这种活性化合物的固有局限性。本文其他地方提供了关于给药的指导。
[0153]
本发明的主题还包括一种提供本文所述的递送系统复合物的制品。所述制品可以包括小瓶或其他容器，其含有适用于本发明的方法的组合物以及干燥或液体形式的任何载体。所述制品还包括呈容器上的标签形式和/或呈包括在包装容器的盒中的插页形式的说明书，以用于实施本发明的方法。说明也可以印在包装小瓶的盒上。说明书含有诸如足够剂量和施用信息等的信息，以允许受试者或本领域的工作人员施用药物组合物。预期本领域的工作人员涵盖可以施用组合物的任何医生、护士、技术人员、配偶或其他看护者。药物组合物也可以由受试者自行施用。
[0154]
本发明的主题提供用于将式i的生物活性化合物递送至细胞并使用递送系统复合物治疗受试者的疾病或不想要的病状的方法，所述递送系统复合物包含具有针对所述疾病或不想要的病状的治疗活性的式i的生物活性化合物。本文还提供了用于制备本发明公开的递送系统复合物的方法。
[0155]
本发明公开的递送系统复合物可以用于通过使细胞与递送系统复合物接触来将式i的生物活性化合物递送至细胞。如本文其他地方所述，当提及式i的生物活性化合物时，术语“递送”是指导致将组合物置于细胞的细胞内空间或细胞周围的细胞外空间内的过程。术语“细胞”涵盖培养中的细胞和受试者内的细胞。在这些实施方式中，细胞与递送系统复合物以允许包含在递送系统复合物中的沉淀物进入细胞内部的方式接触。
[0156]
式i的生物活性化合物向细胞的递送可以包括体外方法，离体方法，其中式i的生物活性化合物向细胞中的递送发生在受试者的外部(然后转染的细胞可以被移植到受试者中)，和体内方法，其中递送发生在受试者自身内。
[0157]
以治疗有效量向受试者施用式i化合物或纳米-folox。当提及化合物或纳米-folox时，“治疗活性”意指所述化合物或纳米-folox在向有需要的受试者施用时能够引发所需的药理学或生理学作用。
[0158]
如本文所用，术语“治疗”或“预防”是指获得所需的药理学和/或生理学作用。作用就完全或部分预防特定感染或疾病或其现象或症状而言可以是预防性的和/或就部分或完全治愈感染或疾病和/或可归因于感染或疾病的副作用而言可以是治疗性的。因此，所述方法“预防”(即，延迟或抑制)和/或“减少”(即，降低、减慢或改善)接受本发明的组合物的受试者的疾病或病症的有害作用。受试者可以是任何动物，包括哺乳动物，诸如人，并且包括但不限于家畜，诸如猫科动物或犬科动物、农场动物，诸如但不限于牛、马、山羊、绵羊和猪受试者，野生动物(无论是在野外还是在动物园里)，研究动物，诸如小鼠、大鼠、兔、山羊、绵羊、猪、狗、猫等，鸟类，诸如鸡、火鸡、鸣禽等，即用于兽医医疗用途。
[0159]
待治疗的疾病或不想要的病状可以包括可以治疗性治疗的任何类型的病状或疾病。在一些实施方式中，待治疗的疾病或不想要的病状是癌症。如本文其他地方所述，术语“癌症”涵盖任何类型的不受调控的细胞生长并且包括所有形式的癌症。在一些实施方式中，待治疗的癌症是肺癌。检测癌症生长或进展的抑制的方法是本领域已知的并且包括但不限于测量原发性肿瘤的大小以检测其大小的减小、继发性肿瘤的出现延迟、继发性肿瘤的发展减慢、继发性肿瘤的发生减少以及疾病的继发性影响的减慢或严重程度降低。
[0160]
本领域技术人员将理解，递送系统复合物可以单独使用或与其他治疗方式结合使
用，包括但不限于手术疗法、放射疗法或用任何类型的治疗剂，诸如药物治疗。在其中受试者罹患癌症的那些实施方式中，递送系统复合物可以与本领域熟知的任何化疗剂组合递送。
[0161]
在向有需要的受试者施用时，递送系统复合物还可以包含靶向配体，如本文其他地方所讨论的。在这些实施方式中，靶向配体将物理缔合的复合物靶向至受试者内的靶向细胞或组织。在某些实施方式中，靶向细胞或组织包括患病细胞或组织或以不想要的病状为特征的细胞或组织。在这些实施方式中的一些中，递送系统复合物是隐形递送系统复合物，其中表面电荷通过peg分子的缔合而被屏蔽，并且脂质体还包含靶向配体以将递送系统复合物引导至靶向细胞。
[0162]
在一些实施方式中，尤其是其中递送系统复合物的直径小于100nm的那些实施方式中，递送系统复合物可以用于将式i化合物递送穿过血脑屏障(bbb)进入中枢神经系统或穿过胎盘屏障。可以用于靶向bbb的靶向配体的非限制性实例包括转移蛋白和乳铁蛋白(huang等人(2008)biomaterials 29(2):238-246，其通过引用以其整体并入本文)。此外，递送系统复合物可以跨内皮细胞转入到骨骼肌细胞和心肌细胞中。例如，可以递送外显子跳跃寡核苷酸来治疗杜氏肌营养不良症(moulton等人(2009)ann n y acad sci 1175:55-60，其通过引用以其整体并入本文)。
[0163]
递送治疗有效量的包含式i化合物的递送系统复合物可以通过施用包含治疗有效剂量的式i化合物或递送系统复合物的药物组合物来获得。“治疗有效量”或“剂量”意指足以引发所需的治疗作用的递送系统或其中包含的式i化合物的浓度。
[0164]
如本文所用，“有效量”是足以实现有益或所需的临床或生物化学结果的量。有效量可以一次或多次施用。
[0165]
递送系统复合物或式i化合物的有效量将根据受试者的体重、性别、年龄和病史而变化。影响有效量的其他因素可以包括但不限于受试者病状的严重程度、所治疗的病症、化合物或复合物的稳定性以及，如果需要，与多核苷酸递送系统一起施用的辅助治疗剂。用于确定功效和剂量的方法是本领域技术人员已知的。参见例如isselbacher等人(1996)harrison’s principles of internal medicine第13版,1814-1882，通过引用并入本文。
[0166]
可以在细胞培养物或实验动物中通过例如，用于确定ld
50
(群体的50％致死剂量)和ed
50
(群体的50％治疗有效剂量)的标准药学程序确定此类化合物的毒性和治疗功效。毒性(例如，免疫毒性)与治疗作用之间的剂量比是治疗指数，并且它可以表示为比率ld
50
/ed
50
。优选表现出高治疗指数的化合物。虽然可以使用表现出毒副作用的化合物，然而，应小心设计使此类化合物靶向至受影响组织的位点的递送系统，以使对未受影响的细胞的潜在损害减到最小，并由此降低副作用。
[0167]
可以在配制用于人的剂量范围中使用由细胞培养测定和动物研究获得的数据。此类化合物的剂量优选地处于包括ed
50
且具有很少或没有毒性的循环浓度的范围内。所述剂量可以根据所采用的剂型和所利用的施用途径在这个范围内变化。对于在本发明公开的方法中使用的任何化合物，治疗有效剂量最初可以从细胞培养测定中估计。可以在动物模型中配制剂量，以达到包括如在细胞培养中确定的ic
50
(即，测试化合物达到对症状的半最大抑制的浓度)在内的循环血浆浓度范围。这种信息可以用于更准确地确定在人类中的有用剂量。可以例如通过高效液相色谱测量血浆中的水平。
polar lipids,inc.获得1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸(dopa)和1,2-二油酰-3-三甲基铵-丙烷(dotap)。从selleckchem获得奥沙利铂(oxp)。从sigma-aldrich购买二氯(1,2-二氨基环己烷)铂(ii)、亚叶酸(fna)、环己烷、triton x-100和己醇、硝酸银(agno3)、胆固醇和牛血清白蛋白(bsa)。所有化学品均按原样使用不经任何进一步纯化。
[0179]
细胞培养。将稳定表达红色荧光蛋白/luc
30
的ct26-fl3细胞(由南卡罗来纳大学的maria pena博士友情提供的小鼠crc细胞系)维持在增补10％胎牛血清(gibco)、1％抗生素-抗真菌剂(gibco)和1μg/ml嘌呤霉素(thermofisher)的dulbecco改良的eagle培养基(dmem，高糖，gibco)中。细胞在37℃、5％co2和95％相对湿度下生长。
[0180]
纳米-folox的体外表征。使用mtt测定，使用3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴估计纳米-folox的细胞毒性
60
。将10000个ct26-fl3细胞/孔接种在96孔板中并温育一天。温育之后，在正常生长条件下向细胞添加oxp和纳米-folox，持续24h。随后，向细胞添加20μl mtt试剂(在pbs中5mg/ml)并在37℃下温育4h。使用150μl dmso来溶解紫色甲臜产物。使用微板读取器在570nm处测量结果。使用graphpad prism软件估计50％细胞生长抑制(ic50)。
[0181]
还将ct26-fl3细胞以5x104个细胞/孔的密度接种在24孔板中，持续24h。随后，在正常生长条件下将细胞与oxp(铂的[c]＝10μm)和纳米-folox一起温育4h。温育之后，将细胞用pbs洗涤两次并裂解以用于icp-ms分析，以便确定铂的摄取。
[0182]
此外，将5x104个ct26-fl3细胞/孔接种在24孔板中，持续一天。此后，在正常生长条件下将细胞与oxp(铂的[c]＝10μm)和纳米-folox一起温育24h。温育后，根据制造商的说明书(thermofisher)，将细胞用膜联蛋白v-fitc和碘化丙啶(pi)处理。使用becton dickinson lsr ii分析凋亡细胞。
[0183]
如先前所述确定crt暴露和hmgb1释放方面的免疫原性细胞死亡(icd)
61
。简而言之，将5x104个ct26-fl3细胞/孔接种在8孔腔式载玻片(nunc
tm lab-tek
tm ii cc2
tm
腔式载玻片系统，thermofisher)中，持续一天。随后，在正常生长条件下将细胞用oxp(铂的[c]＝10μm)和纳米-folox处理。2h温育后，将细胞用pbs洗涤并用pbs中的0.25％多聚甲醛(pfa)固定5min。然后将细胞用pbs洗涤，并且施加抗钙网蛋白(crt)一抗(ab2907，abcam)，持续1h。两次pbs洗涤后，将细胞与fitc缀合的二抗(ab150077，abcam)一起温育30min。然后将细胞用4％pfa固定20min，并且用具有dapi的prolong
tm gold antifade mountant(thermofisher)染色，之后进行共聚焦成像(zeiss lsm 710)。此外，8h温育后，将细胞用pbs洗涤，用4％pfa固定20min，并且用0.1％triton x-100透化10min。两次pbs洗涤后，将细胞与1％bsa一起温育30min。然后将细胞用pbs洗涤并与针对高迁移率族1蛋白(hmgb1)的一抗(ab18256，abcam)一起温育1h。此后，将细胞用pbs洗涤并与fitc缀合的二抗(ab150077，abcam)一起温育30min，然后进行共聚焦分析。
[0184]
药代动力学和生物分布。从charles river实验室购买雌性balb/c小鼠(～6周)。所有动物法规和程序都被北卡罗来纳大学教堂山分校动物护理和使用机构委员会接受。
[0185]
如先前所述建立原位ct26-fl3结直肠肿瘤模型
31
。肿瘤接种之后(第0天)，向小鼠腹膜内(i.p.)注射100μl 10mg/ml d-荧光素(pierce
tm
)，并且使用ivis动力学光学系统(perkin elmer，ca)通过生物发光分析定期监测肿瘤发展。当发光强度达到～1x109p/sec/cm2/sr(第14天)时，如下进行药代动力学和组织分布研究。
[0186]
将荷瘤小鼠(n＝4)用含有1.5mg/kg铂的纳米-folox进行静脉内(i.v.)处理。针对icp-ms在1、3、6、15、30min和1、4和12h处采集血液样品(～50μl)，以确定铂的浓度。使用das 2.0计算药代动力学参数。
[0187]
此外，使用～0.05％(wt)的亲脂性羰花青did(thermofisher)来配制did标记的纳米-folox(1.5mg/kg铂)。8h i.v.注射did标记的纳米-folox后，采集主要器官和肿瘤并使用ivis动力学光学系统分析，其中激发波长为640nm并且发射波长为670nm。还使用icp-ms测量主要器官和肿瘤中铂的浓度8。
[0188]
原位crc模型中纳米-folox的治疗研究。当发光强度达到～0.5至1x109p/sec/cm2/sr时，在第14、17和20天处向原位crc小鼠i.v.注射含有1.5mg/kg铂的纳米-folox。2h注射后，将动物用或不用50mg/kg 5-氟尿嘧啶(5-fu)进行i.p.处理。此外，如下使用folfox：向小鼠i.p.注射oxp(3mg/kg铂)，接着2h注射fna(90mg/kg)和5-fu(50mg/kg)
41 42
。使用ivis动力学光学系统定期测量发光强度(p/sec/cm2/sr)，并且将肿瘤生长确定为相对于初始的强度(n＝6)。在单独研究中，在预先确定的时间点处，采集肿瘤用于tunel测定(n＝4)
61
、免疫荧光染色(n＝4)
24 62
、流式细胞术分析(n＝4)
30 63
和rt-pcr测定(n＝4)
31
。
[0189]
为了评定体内毒性，除含有3mg/kg铂的纳米-folox外，如上所述处理荷瘤小鼠(n＝6)。定期记录体重，并且在第35天采集动物全血和血清，以确定骨髓抑制(即，红细胞、白细胞、血小板和血红蛋白)和肝/肾功能(即，天冬氨酸氨基转移酶、丙氨酸氨基转移酶、肌酐和血尿素氮)。此外，采集主要器官并使用苏木精和伊红(h&e)染色测定分析
64
。
[0190]
肝转移模型中纳米-folox的治疗研究。如先前所述建立半脾ct26-fl3来源的肝转移模型
31
。肿瘤接种之后(第0天)，将小鼠用100μl d-荧光素(10mg/ml；pierce
tm
)进行i.p.处理，并且使用ivis动力学光学系统定期监测肿瘤负荷。当发光强度达到～0.5至1x108p/sec/cm2/sr时，向动物i.v.注射含有1.5mg/kg pt的纳米-folox(第8、12和16天)，接着在2h注射后i.p.注射50mg/kg 5-fu。随后，将动物用或不用抗小鼠pd-l1 mab(α-pd-l1，bioxcell，克隆10f.9g2，100μg/动物)处理。使用ivis动力学光学系统定期测量发光强度(p/sec/cm2/sr)，并且将肿瘤生长确定为相对于初始的强度(n＝5)。
[0191]
统计分析。结果呈现为平均值
±
标准偏差(sd)。使用未配对的学生t检验(双尾)来测试两个平均值之间差异的显著性。使用单向anova(bonferroni事后检验)来测试三组或更多组的差异的显著性。在所有实验中，p《0.05被认为是统计上显著的。
[0192]
实施例1
[0193]
纳米-folox的制备和物理化学表征。如图1所示，为了产生二水合物(1,2-二氨基环己烷)铂(ii)，将agno3(64.5mg，0.38mmol)添加到二氯(1,2-二氨基环己烷)铂(ii)(76mg，0.2mmol)在1ml去离子水中的悬浮液中。将此混合物在60℃下加热3h并在黑暗中在室温(rt)下搅拌过夜。随后，将混合物在15000rpm下离心10min两次以去除agcl沉淀物，并且通过0.2μm膜过滤上清液。使用电感耦合等离子体质谱法(icp-ms)测量二水合物(1,2-二氨基环己烷)铂(ii)的浓度。
[0194]
此外，将100μl 100mm二水合物(1,2-二氨基环己烷)铂(ii)水溶液分散到25ml由环己烷、triton x-100和己醇(75:15:10，v:v:v)构成的油相中，以产生油包水反相微乳液。此外，通过将2ml 10mm fna水溶液添加到75ml油相中来制备微乳液。然后在搅拌下将200μl dopa(20mm)添加到含有fna的油相中。～10至20min后，将两个油相混合并搅拌～30至
45min。随后，添加100ml乙醇，持续～15min，并且混合物在12000g下离心20min以采集沉淀物(图1a)。将沉淀物用乙醇完全洗涤两次，并且再分散在氯仿中。
[0195]
为了产生纳米-folox，将1mg核心、10μl 20mm dotap、10μl 20mm胆固醇和5μl 20mm dspe-peg/dspe-peg-aeaa(摩尔比＝4:1)溶解在氯仿中。氯仿蒸发之后，将脂质膜在去离子水中再水化以形成纳米-folox。
[0196]
使用malvern nano-zs(malvern instruments,uk)测量纳米-folox的粒度和ζ电位
59
。使用透射电子显微镜(tem)分析纳米沉淀物和纳米-folox的形态。简而言之，将5μl纳米-folox添加在400目碳膜铜网格(agar scientific)上，持续2min。将样品用2％(w/w)乙酸双氧铀染色，之后使用jem1230(jeol)tem进行分析。可替代地，在没有负染色的情况下分析核心的形态。
[0197]
根据不同药物的铂含量8，将含有250μg铂的纳米-folox在0.01m pbs(ph＝5.5和7.4)中的悬浮液在37℃下在轻微摇动下温育。在不同的时间点处，将样品在15000rpm下离心30min，并且使用icp-ms测量铂到上清液中的释放。
[0198]
纳米-folox的制备和物理化学表征。oxp是具有1,2-二氨基环己烷(dach)环和草酸盐基团的第三代铂基药物，主要用于治疗晚期crc并且在肝转移生长时应用9。已经提出oxp在生理情况下经历一系列非酶促生物转化
10,11
。oxp的草酸盐配体被亲核试剂(例如，氯化物)自发替代，从而形成二氯(1,2-二氨基环己烷)铂(ii)(pt(dach)cl2，中间体衍生物)
12
。当氯化物部分被水性配体化学取代时，pt(dach)cl2转化为[pt(dach)(h2o)2]
2
(oxp的活性形式)
13
。除了上述生物转化之外，oxp的羧酸盐配体也可能直接被水性配体替代，从而形成[pt(dach)(h2o)2]
2 14
。因此，[pt(dach)(h2o)2]
2
与dna反应生成pt-dna加合物，这抑制dna的复制和转录，从而导致dna链断裂和细胞凋亡
15
。
[0199]
实施例2.二水合物(1,2-二氨基环己烷)铂(ii)的合成
[0200]
在此研究中，如图1a所示，[pt(dach)(h2o)2]
2
通过pt(dach)cl2与agno3之间的反应合成，其中氯化物部分被水性配体化学取代
6 7 8
。随后通过在油包水反相微乳液中以等摩尔比缀合[pt(dach)(h2o)2]
2
和fna来形成pt(dach).fna沉淀物。沉淀物(c
26h35
n9o7pt)的形成由(图1c)质谱(预测的精确质量：780.23，观察到的m/z 780.96)支持。使用过量的fna来使沉淀最大化(如通过icp-ms确定，铂的产率为～55％)。dopa可以强烈结合在铂阳离子的表面上
20
，其用于使沉淀物稳定并有助于控制粒度(～100nm)(图2a)。稳定化的纳米沉淀物难溶于水；因此，沉淀核心的外表面涂覆dotap、胆固醇、dspe-peg和dspe-peg-aeaa，以便实现水溶液中的靶向制剂(即，纳米-folox，载药效率≈70wt％)(图1a)。
[0201]
纳米-folox展示出纳米级粒度(～120nm，多分散性指数＝0.3)和接近中性的ζ电位(～5mv)(图2b)。从纳米-folox观察到的粒度增加表明dotap、胆固醇、dspe-peg和dspe-peg-aeaa附着到纳米沉淀物上。此外，在纳米-folox的表面上观察到一层薄的“晕状”层(图2a)，这与稳定化的纳米沉淀物的形态不同，从而进一步表明涂覆成功。
[0202]
实施例3.释放动力学
[0203]
为了实现化疗剂的安全且有效递送，需要药物载体避免在系统性循环中的突发释放，但可以在癌细胞内提供药物释放。如图2c所示，～20％的pt在48h处在中性pbs中从纳米-folox释放；相反，当ph从7.4变为5.5时，释放率(》90％)显著增加。我们先前已经证明了lpi在pbs中是稳定的，并且可以在脂肪酶或表面活性剂的存在下释放货物8，其释放曲线让
人想起从doxil观察到的释放曲线(结晶阿霉素包封在内部)
21
。由于纳米-folox的涂层结构与lpi相似，这些结果表明纳米-folox可以在血液循环过程中维持稳定性，并且当纳米-folox到达癌细胞内时，脂质层可能裂解，从而从其中存在脂肪酶并且ph变为～5-6的晚期内体释放铂药物。
[0204]
实施例4.纳米-folox的体外表征
[0205]
ct26-fl3作为ct26(一种小鼠结肠癌细胞系)的转移性最高的亚型，在植入小鼠盲肠壁时导致原发性肿瘤和肝转移
22
。在此研究中，ct26-fl3细胞用于纳米-folox的体外表征，如下所讨论的。
[0206]
氨乙基茴香酰胺(aeaa)靶向配体已经在我们的实验室中被开发用于将药物/基因特异性递送到σ受体过表达癌细胞中，并且在黑色素瘤
23 24
、乳腺癌
25 26
、胰腺癌
27 28
、膀胱癌
29
和crc
30 31
的小鼠模型中进行表征。此前，aeaa介导的靶向作用已经通过在ct26-fl3细胞中转染质粒dna得到确认
30 31
。在此研究中，与oxp相比，纳米-folox实现了显著更高的铂的细胞摄取(高达4倍)(图3a)，这意味着纳米-folox的递送也可能由于aeaa靶向作用而增强(参见如下讨论的生物分布)。
[0207]
在有效的细胞摄取后，pt(dach).fna沉淀物已准备好从纳米-folox中释放。沉淀物具有羧酸盐配体，类似于oxp的那些(图1b)。因此，这表明oxp转化为[pt(dach)(h2o)2]
2
中涉及的配体交换反应也发生在pt(dach).fna沉淀物中。如图1b所示，在氯化物存在的情况下，沉淀物可能解离，从而形成pt(dach)cl2和fna。在水性配体的取代后，pt(dach)cl2进一步转化为[pt(dach)(h2o)2]
2
(图1b)。此外，[pt(dach)(h2o)2]
2
也可能在pt(dach).fna的羧酸盐配体被水性配体替代时直接生成。实际上，pt(dach).fna沉淀物的结构也让人想起在卡铂中观察到的结构，卡铂是具有二齿二羧酸盐螯合离去基团的第二代铂基药物
32
。卡铂一旦进入细胞，就会逐步水化形成[pt(nh3)2(h2o)2]
2 33
，其随后产生铂-dna加合物结构。未来将研究pt(dach).fna的代谢活性以确认这些假设。
[0208]
实施例5.纳米-folox的抗增殖特性
[0209]
如图3b所示，纳米-folox显著减慢ct26-fl3细胞的增殖(p《0.05；ic50≈10μm pt，24h温育)，而oxp实现较小的抗增殖效力(ic50≈24μm pt，24h温育)(由于纳米沉淀物在水溶液中的不溶性和无效悬浮，选择oxp作为对照)。fna通常被认为是无毒的，但可以增强5-fu的抗肿瘤功效。实际上，ct26-fl3细胞的增殖没有被fna单独抑制(数据未示出)，这指示纳米-folox实现的抗癌作用主要来自oxp衍生物。此外，与oxp相比，纳米-folox在ct26-fl3细胞中诱导显著水平的细胞凋亡(p《0.05，24h温育)(图3c)，这指示纳米-folox实现的抗增殖作用至少部分是由于细胞凋亡。这些结果进一步证实了pt(dach).fna可以在ct26-fl3细胞内代谢以实现抗癌活性。
[0210]
最近，已经据报道一种被称为免疫原性细胞死亡(icd，还被称为免疫原性细胞凋亡)的细胞凋亡形式可以通过一组化疗药物(例如，蒽环类和oxp)和物理治疗(例如，电离辐射和光动力疗法)来诱导
34
。icd被描述为以诱导免疫应答以激活t淋巴细胞以识别肿瘤特异性抗原的方式导致癌细胞死亡
35 36
。icd诱导剂介导损伤相关分子模式(damp)分子的激活，主要包括钙网蛋白(crt)暴露、三磷酸腺苷(atp)分泌和高迁移率族b1(hmgb1)释放
37
。在此研究中，在crt暴露和hmgb1释放方面评定纳米-folox对于icd诱导的癌细胞免疫原性的潜力
38
(图3d)。结果表明，与相同条件下的oxp相比，纳米-folox(p《0.05；10μm pt，2h温育)显
着诱导了crt在细胞表面上的暴露。此外，与相同条件下的oxp相比，纳米-folox(10μm pt，8h温育)显示hmgb1从细胞核释放到细胞质中的轻微增加(p》0.05)(图3d)。相比之下，在pbs对照组中，crt暴露和hmgb1释放均不明显。这些结果指示纳米-folox作为用于crc的纳米颗粒icd诱导剂递送系统的潜力。
[0211]
实施例6.纳米-folox的药代动力学和生物分布
[0212]
使用原位crc小鼠模型来研究纳米-folox的药代动力学。在单次静脉内(i.v.)注射oxp和纳米-folox后，铂的血浆浓度相对于时间(n＝4只小鼠/组)如图4a所示。oxp的血浆中铂的浓度迅速下降，并且注射后不到4h仅检测到残留水平。相比之下，纳米-folox中的铂在注射后12h内更缓慢地从血浆中去除(图4a)。
[0213]
通过拟合单室模型来分析药代动力学曲线(图4b)。纳米-folox实现比oxp显著更高的曲线下面积(auc)值(p《0.05)。与oxp相比，纳米-folox还显著降低了清除率值(cl)(p《0.05)。相应地，纳米-folox(～80min)记录的半衰期(t
1/2
)显著长于oxp(～8min)(图4b)。这些药代动力学参数指示相对于oxp，纳米-folox导致铂在系统性循环中的～10倍增加。
[0214]
还使用原位crc小鼠评估纳米-folox的组织分布。i.v.注射含有did标记的np的单剂量之后8h(n＝4)，采集主要组织和肿瘤并使用ivis动力学光学系统成像(图4c)。结果显示与非靶向对应物相比，具有aeaa靶向配体的纳米-folox在肿瘤中实现显著更高的保留(p《0.05)；相比之下，在aeaa靶向的纳米-folox中发现肝和脾中显著更少的积累(p《0.05)。此外，i.v.施用oxp和具有/没有aeaa的纳米-folox之后8h，使用icp-ms离体测量铂的组织分布(n＝4)(图4d)。与使用成像系统获得的结果相似，aeaa靶向纳米-folox实现比非靶向对应物(～25％id/g)和oxp(～15％id/g)显著更高的铂的肿瘤积累(～45％id/g)。相比之下，oxp的铂的肝摄取(～35％id/g)显著高于具有/没有aeaa的纳米-folox(分别为～20％id/g和～25％id/g)(图4d)。因此，这些结果指示添加aeaa靶向配体增强了肿瘤保留并减少了非特异性组织积累。
[0215]
已经报道了在i.v.施用oxp时，铂不可逆地被吸收到血浆蛋白和红细胞上
11
，这显著降低了oxp的治疗功效。因此，结合的pt倾向于通过肾清除迅速地系统性消除
39
。通常，crc患者被给予多个周期的folfox以实现治疗效果。例如，在奥沙利铂/5-氟尿嘧啶/甲酰四氢叶酸在辅助治疗结肠癌的多中心国际研究试验(mosaic)中，需要12个周期的folfox来实现ii/iii期crc患者的增加的总体存活率
40
。然而，副作用或毒性往往是由这种强化治疗引起的，并且患者还遭受高昂的费用和耗时的治疗计划(例如，总周期》24周)。
[0216]
如图4a和图4b所示，与oxp相比，纳米-folox显著增强了铂的血液循环，这指示可能减少治疗周期数以实现相同的治疗益处。此外，由于通过aeaa介导的靶向作用实现的增强的肿瘤积累(图4c和图4d)，纳米-folox潜在地提供足以治疗患者的低剂量策略。总之，纳米-folox展示出克服与folfox相关的限制的显著潜力。然后研究了纳米-folox与5-fu的组合作为新型folfox方案的治疗潜力。
[0217]
实施例7.纳米-folox和5-fu的组合在原位crc小鼠中实现增强的化学-免疫疗法
[0218]
在i.v.注射pbs、纳米-folox、folfox以及纳米-folox和5-fu的组合后评定纳米-folox在原位小鼠模型中的治疗功效(n＝6，参见图5a中的治疗方案)。因为ct26-fl3细胞稳定表达催化萤光素氧化以生成生物发光的萤火虫萤光素酶基因
30
，所以可以使用ivis动力学光学系统来监测原位肿瘤的发展(图5a)。纳米-folox的治疗功效取决于施用剂量(0.5
至5mg/kg pt，数据未示出)，并且含有1.5mg/kg铂的纳米-folox可以相对于pbs对照组显著(p《0.05)减慢肿瘤生长(图5b)。在将纳米-folox(1.5mg/kg铂)和5-fu(50mg/kg)的组合给予荷瘤动物时，抗肿瘤功效显著(p《0.01)高于单独的纳米-folox和folfox(3mg/kg铂、90mg/kg fna和50mg/kg 5-fu；此药物给药方案是基于
41 42
中发表的研究)(图5b)。因此，与其他组相比，纳米-folox和5-fu的组合显著(p《0.001)提高了患病小鼠的存活率(图5c)。因此，与folfox相比，具有5-fu的纳米-folox在较低剂量的铂下显示改善的治疗作用。
[0219]
还使用原位crc小鼠研究纳米-folox的抗肿瘤机制(图6)。结果显示相对于pbs对照组，纳米-folox显著(p《0.05)诱导细胞凋亡(图6a)。这意味着pt(dach).fna沉淀物在细胞内成功解离为[pt(dach)(h2o)2]
2
和fna，其中[pt(dach)(h2o)2]
2
形成导致细胞凋亡的dna-加合物。此外，通过纳米-folox和5-fu的组合实现了改善的细胞凋亡作用(图6a)，这可能是通过从纳米-folox释放的fna增强了5-fu的抗肿瘤功效。因此，相对于单独的纳米-folox和folfox，纳米-folox和5-fu的组合显著(p《0.05)增强细胞凋亡(图6a)。
[0220]
此外，流式细胞术结果表明，组合治疗后肿瘤内cd8

细胞毒性t细胞和cd4

辅助t细胞的水平显著增加(图6c)，其伴随着t淋巴细胞募集的增强(图6b)。另外，mhc ii

和cd86

树突细胞(dc)通过组合方法显著激活(图6c)。对应于这些免疫刺激作用，组合疗法之后抑制性免疫细胞(例如，髓源性抑制细胞(mdsc)、调节t细胞(treg)和肿瘤相关巨噬细胞(m2))的量显着降低(图6c)。此外，相对于单独纳米-folox和folfox，在用纳米-folox/5-fu治疗的肿瘤中，促炎细胞因子(例如，ccl2、cxcl12和cxcl13)被显著激活(p《0.05)(图6d)。对于组合策略，有利于t细胞浸润的细胞因子cxcl9和cxcl10也越来越多地被诱导(图6d)。th1型细胞因子ifn-γ和tnf-α也对应地显著提高(图6d)。这些结果表明纳米-folox和5-fu的组合可以有效地触发肿瘤中的icd作用，这可以释放癌细胞相关抗原并介导具有对于cd8

细胞毒性t细胞的交叉致敏能力的dc成熟。因此，激活的cd8

细胞毒性t细胞被募集以诱导穿孔素/颗粒酶细胞死亡途径，从而实现对肿瘤生长的抑制
43
。
[0221]
实施例8.体内毒性研究
[0222]
对原位crc小鼠i.v.注射pbs、纳米-folox、folfox以及纳米-folox和5-fu的组合(n＝4只小鼠/组)(图7)。动物体重监测显示相对于pbs对照组，治疗组在3周时间段内没有显著降低(图7a)。使用h&e染色测定分析包括心脏、肝、脾、肺和肾的主要组织。在来自用pbs治疗的动物与治疗组的样品之间未检测到显著的组织学损伤(图7b)。此外，对全血细胞组分(图7c)和血清肝/肾功能标记物(图7d)进行分析，以进一步评定系统性毒性。结果显示与pbs对照组相比，治疗后没有显著的血液学毒性(图7c)。此外，治疗组未显著改变血清中天冬氨酸氨基转移酶(ast)、丙氨酸氨基转移酶(alt)、肌酐(cre)和血尿素氮(bun)的水平(图7d)。因此，这些毒理学研究指示纳米-folox与5-fu的组合没有显著的系统性毒性迹象。
[0223]
实施例9.抗pd-l1单克隆抗体与纳米-folox和5-fu的组合协同减少肝转移
[0224]
如图6c所示，虽然纳米-folox和5-fu的组合诱导有效的抗肿瘤免疫应答，但在肿瘤组织中检测到增加的程序性死亡配体1(pd-l1)蛋白水平。已知pd-l1与程序性死亡1(pd-1)结合，这激活pd-1/pd-l1信号传导途径，从而促进癌细胞免疫逃避
44
。最近，抗pd-l1抗体(例如，派姆单抗和纳武单抗)已被用于治疗微卫星不稳定性(msi)-高或错配修复(mmr)缺陷型crc
45 46
。在此研究中，使用具有实验性肝转移的小鼠评定抗pd-l1单克隆抗体(mab)增强纳米-folox/5-fu的治疗功效的潜力(图8a)。通过门静脉系统将ct26-fl3细胞半脾接种
到肝中来建立患病模型
47
，这高度再现晚期人类crc的转移模式。如图8b所示，与pbs对照组相比，抗pd-l1 mab没有实现显著的抗转移作用，这与先前研究中获得的结果相似
30 31
。可以解释，ct26是一种mmr精通的crc细胞系
48 49
，并且抗pd-l1 mab在mmr精通的肿瘤模型中提供治疗功效的能力较差
30 31
。相比之下，与抗pd-l1 mab和pbs相比，纳米-folox/5-fu显著减少肝转移(p《0.05)(图8b)。此外，纳米-folox/5-fu和抗pd-l1 mab的组合显示出相对于任一种治疗策略的协同治疗作用(图8b)，从而显著(p《0.05)延长动物的存活(图8c)。因此，这些结果指示这种组合策略在治疗转移性crc中的治疗潜力。
[0225]
实施例10-15的材料和方法
[0226]
材料
[0227]
从sigma-aldrich获得5-氟-2'-脱氧尿苷5'-单磷酸(fdump)、2'-脱氧尿苷5'-单磷酸(dump)、igepalco-520、环己烷、triton x-100、cacl2、(nh4)2hpo4、胆固醇、亚叶酸(fna)和5-氟尿嘧啶(5-fu)。从selleckchem获得奥沙利铂(oxp)。从avanti polar lipids购买1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸(dopa)和1,2-二油酰-3-三甲基铵-丙烷(dotap)。从nof corp获得n-(羰基-甲氧基聚乙二醇2000)-1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(sunbrightdspe-020cn；dspe-peg)。如先前在我们实验室所证明的那样合成dspe-peg-aeaa
123
。
[0228]
纳米制剂的制备和表征
[0229]
在具有修改的情况下如先前所述制备纳米-fdump
84,85
。简而言之，将1ml fdump溶液(1mg/ml)添加到2ml cacl2溶液(2.5m)中，并且将此混合物添加到由igepalco-520和环己烷(30:70，v:v)构成的80ml油相中以用于生成油包水反相微乳液。通过添加2ml(nh4)2hpo4溶液(50mm)和1ml dopa溶液(20mm在氯仿中)来制备另一种微乳液(80ml)。将两种微乳液完全搅拌～15至20min。此后，在搅拌下添加160ml乙醇，持续～15至20min，接着在10000g下离心20min以采集纳米沉淀物。使用乙醇洗涤纳米沉淀物，使用氮气干燥并储存在氯仿中。
[0230]
纳米-fdump的纳米沉淀物与外小叶脂质之间的最佳比率如下：1,500μg纳米沉淀物，30μl dotap(25mm)，30μl胆固醇(25mm)和20μl dspe-peg/dspe-peg-aeaa(20mm，摩尔比＝5:1)，在2ml氯仿中。这在理论上在每个制剂的外脂质表面上实现～3.5mol％的aeaa。在氯仿蒸发后，使用水溶液将脂质膜重悬浮以形成纳米-fdump。使用hplc(shimadzu,japan)(c18柱，uv 250nm，流动相＝水和甲醇，85:15)评定包封效率和负载能力。如上所提及制备纳米-dump和非靶向纳米-fdump，不同的是分别使用dump和缺乏dspe-peg-aeaa。如先前所述制备纳米-folox
71
。
[0231]
使用malvern nano-zs测量np的流体动力学直径和ζ电位。如先前所述，使用jem1230(jeol)透射电子显微镜(tem)观察np的形态
116
。此外，将具有200μg fdump的np溶液在37℃下在0.01m pbs(ph＝5.5和7.4)中在摇动下温育。在不同时间点处获得样品，以用于在10000g下离心～30min。使用hplc确定上清液内游离fdump的浓度(从纳米沉淀物解离)。
[0232]
细胞培养
[0233]
使用具有10％胎牛血清(hyclone)和1％抗生素-抗真菌剂(gibco)的dmem(gibco)培养ct26(小鼠crc细胞系)、hepa1-6(小鼠hcc细胞系)、4t1(小鼠乳腺癌细胞系)和b16(小鼠黑色素瘤细胞系)细胞。使用上述具有1μg/ml嘌呤霉素(thermofisher)的生长培养基培
养ct26-fl3(ct26的亚型，其经工程改造以稳定表达萤光素酶)和hepa1-6-luc(其经工程改造以稳定表达萤光素酶)细胞
71,124
。将细胞维持在37℃、5％co2和95％相对湿度下。
[0234]
体外研究
[0235]
应用mtt测定以确定体外细胞毒性。分别在96孔板内培养ct26和hepa1-6细胞(1x104/孔)。一天温育后，将5-fu、纳米-dump和纳米-fdump添加到细胞中，持续24h。然后在37℃下向细胞中添加mtt试剂，持续～4h，然后在570nm处测量。使用graphpad prism软件计算ic
50
。
[0236]
将ct26和hepa1-6细胞(5x104/孔)分别置于24孔板中。在一天温育之后，用或不用n-乙酰半胱氨酸(nac；5mm)处理细胞4h。用新鲜的生长培养基替换细胞并添加5-fu、纳米-dump和纳米-fdump(全部在15μm处)，持续24h。随后，使用膜联蛋白v-fitc/碘化丙啶测定(promega)检测凋亡细胞，并且通过becton dickinson facscalibur测量。在单独实验中，通过微板读取器(488nm/525nm)使用基于2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯的活性氧测定试剂盒(yiasen biotech)检测细胞中的ros水平。
[0237]
如先前所述，使用免疫荧光染色检测crt和hmgb1
7,60
。在8孔腔式载玻片(thermofisher)中培养ct26和hepa1-6细胞(60000/孔)。在一天温育后，用或不用nac(5mm)处理细胞4h。然后用新鲜的生长培养基替换细胞并用纳米-fdump(15μm)、纳米-folox(5μm)或两者处理(首先添加纳米-folox，并且在2h后添加fdump；除非另有提及，否则这种顺序施用对于体外研究是相同的)。处理后2h，将细胞与0.25％多聚甲醛(pfa)一起温育。5min温育后，用pbs洗涤细胞，接着施加抗crt抗体(ab2907，abcam，1:500)，持续1h。pbs洗涤之后，将fitc缀合的二抗(ab150077，abcam)添加到细胞中，持续30min。随后，通过4％pfa处理细胞20min并使用dapi(thermofisher)染色以用于共聚焦成像(lsm-710，zeiss)。在单独实验中，在纳米-fdump(15μm)、纳米-folox(5μm)或两者处理后8h，用4％pfa处理细胞30min并用0.1％triton x-100处理10min。pbs洗涤后，将细胞与1％牛血清白蛋白(bsa)一起温育30min。用pbs洗涤细胞并添加抗hmgb1抗体(ab18256，abcam)，持续1h。pbs洗涤之后，将fitc缀合的二抗添加到细胞中，持续30min以用于共聚焦成像。
[0238]
为了测量细胞外atp，将ct26和hepa1-6细胞以60000个细胞/孔的密度置于24孔板中。在一天温育之后，用或不用nac(5mm)处理细胞4h。用新鲜的生长培养基替换细胞，并且添加纳米-fdump(15μm)、纳米-folox(5μm)或两者，持续24h。随后，使用enlitenatp测定系统生物发光检测试剂盒检测细胞外atp。
[0239]
体内毒性、药代动力学和生物分布
[0240]
从charles river实验室购买六周龄雌性balb/c和雄性c57bl/6小鼠。此研究中使用的程序经北卡罗来纳大学教堂山分校动物护理和使用机构委员会和吉林大学动物伦理委员会批准。
[0241]
用纳米制剂治疗健康小鼠，如图18和图22所述(n＝5)。定期记录体重，并且第35天采集动物全血和血清，以分析骨髓抑制和肝/肾功能。
[0242]
如先前所述实现原位crc小鼠模型
71
。简而言之，将balb/c小鼠通过2.5％异氟醚麻醉，并且向盲肠壁注射～1
×
106个ct26-fl3细胞。此外，如先前所述建立原位hcc小鼠
61
。简而言之，将c57bl/6小鼠通过2.5％异氟醚麻醉，并且向肝注射～1
×
106个hepa1-6-luc细胞。肿瘤接种后(第0天)，向动物腹膜内(i.p.)注射100μl荧光素(10mg/ml；pierce
tm
)，并且
使用ivis动力学光学系统(perkin elmer)测量肿瘤生长。当肿瘤生长达到～0.5至1x109p/sec/cm2/sr时，如下研究药代动力学和组织分布研究：1)i.v.施用5-fu(10mg/kg)或含有10mg/kg氟药物的纳米-fdump，并且在1、5、10和15min以及0.5、1、4、8和12h处采集血液(～50μl)(n＝4)。如先前所述
62
，用乙酸乙酯萃取血浆样品，用氮气干燥，并且在流动相(水/甲醇，85:15)中重构。使用hplc(shimadzu,japan)(c18柱，对于5-fu，uv为265nm，并且对于fdump，uv为250nm)评定浓度。使用das 2.0软件评估半衰期。在单独研究中，将～0.05wt％的did(thermofisher)配制到纳米-fdump或非靶向对应物(10mg/kg氟药物)中。i.v.施用后12h，使用ivis动力学光学系统(n＝4)检测(640nm/670nm)did标记的纳米制剂在组织和肿瘤中的分布。
[0243]
纳米-fdump和纳米-folox在原位crc和hcc小鼠模型中的协同功效
[0244]
当肿瘤生长达到～0.5至1x109p/sec/cm2/sr时，向荷瘤小鼠注射oxp/fna(1.5mg/kg和4.5mg/kg，i.v.)或含有1.5mg/kg铂药物的纳米-folox(i.v.；其含有～4.5mg/kg fna)，如图13和图14所述。注射后8h(纳米-folox的t
1/2
≈1.4h)，用5-fu(10mg/kg；i.v.)或含有10mg/kg氟药物的纳米-fdump(i.v.)处理荷瘤小鼠。使用ivis动力学光学系统观察肿瘤生长(n＝6)。
[0245]
在单独实验中，两次注射之后3天(分析化疗和免疫治疗作用的时间点通常在治疗后一周内选择，以确保可靠的分析)
74,91,127,128
，在第24天(crc)和第23天(hcc)获得肿瘤以用于以下测定：1)tunel测定
71,124
。其使用deadend
tm fluorometric tunel系统(promega)进行(n＝4)。通过共聚焦显微镜检测dna片段(fitc)和细胞核(dapi)；2)免疫荧光测定
71,124
。向肿瘤添加4％pfa，持续～24h并在石蜡包埋切片上进行(n＝4)。将切片用脱石蜡、抗原修复、透化和1％bsa封闭处理。在4℃下将具有荧光团的抗体添加到载玻片中过夜(参见补充表1)，并使用共聚焦显微镜进行分析。3)流式细胞术
71,124
。在37℃下使用胶原酶a(1mg/ml；sigma)和dna酶(200μg/ml；invitrogen)处理肿瘤(n＝4)30min以产生单细胞。在用ack缓冲液(gibco)裂解红细胞之后，通过荧光团标记的抗体处理细胞(参见补充表1)，使用4％pfa固定，并使用becton dickinson lsr ii进行评定。4)rt-pcr测定
71,124
。使用qiagen rneasy微阵列组织微型试剂盒获得总rna样品(n＝4)。通过bio-rad iscript
tm cdna合成试剂盒生成cdna。使用taqman基因表达主混合物(bio-rad)通过7500实时pcr系统进行rt-pcr反应。引物的信息在表1中示出。
[0246]
表1.研究中用于rt-pcr的引物。
[0247][0248]
如先前所述进行cd4

和cd8

t细胞的耗尽研究
71,124
。简而言之，根据相应的时间表(图13和图14)向每只小鼠i.p.注射100μg抗cd8(克隆53-6.72，bioxcell)、抗cd4(克隆gk1.5，bioxcell)或igg(bioxcell，多克隆)抗体，之后进行纳米-fdump/纳米-folox的处理。使用ivis动力学光学系统测量肿瘤生长(n＝4)。
[0249]
纳米-fdump和纳米-folox与pd-l1的组合疗法阻断crc肝转移小鼠模型
[0250]
如先前所述建立crc肝转移小鼠模型
71
。简而言之，使用2.5％异氟醚麻醉小鼠，并且将脾从腹内取出、绑扎并切开。之后，将～2
×
105个ct26-fl3细胞注射到脾的远端部分中。取出注射ct26-fl3细胞的半脾，并且将另一半放回腔内。在第0天接种肿瘤后，使用ivis动力学光学系统监测肿瘤生长。当肿瘤生长达到～0.5至1x108p/sec/cm2/sr时，向小鼠i.v.施用含有1.5mg/kg pt的纳米-folox(～4.5mg/kg fna)，如图15所述，接着在注射后8h i.v.施用纳米-fdump(10mg/kg氟药物)。此后，向小鼠i.p.注射或不注射抗pd-l1 mab(bioxcell，克隆10f.9g2，100μg/小鼠)。使用ivis动力学光学系统观察肿瘤生长(n＝6)。单独地，在两次注射后一天，在第12天获得肿瘤用于tunel分析(n＝4)、免疫荧光染色测定(n＝4)、流式细胞术(n＝4)和rt-pcr实验(n＝4)，如上所述。
[0251]
表2.用于流式细胞术和if显微镜实验的抗体
[0252][0253][0254]
数据以平均值
±
标准偏差(sd)示出。使用未配对的学生t检验(双尾)评估两组之间的显著性。使用双向anova(bonferroni事后模型)评定三个或更多组之间的显著性。在存活研究中使用对数秩检验进行比较。在此工作中，p《0.05被认为是统计上显著的。
[0255]
实施例10.纳米-fdump的制备和物理化学表征
[0256]
将一种含有cacl2和fdump的油包水微乳液与另一种含有na2hpo4的油包水微乳液混合，以生成ca3(po4)2无定形沉淀物，其中fdump被截留(图9a)。将ca3(po4)
2-fdump纳米沉淀物通过1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸(dopa)稳定化，并且将纳米沉淀物用1,2-二油酰-3-三甲基铵-丙烷(dotap)、胆固醇、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-peg
2000
(dspe-peg)和dspe-peg-aeaa涂覆，从而产生纳米-fdump(图9b)。纳米-fdump让人想起其他含有ca3(po4)
2-核酸纳米沉淀物的纳米制剂，所述纳米制剂也在我们的实验室中使用纳米沉淀工艺开发
83-91
。纳米-fdump显示纳米级粒度(～35nm，多分散性指数≈0.3)和中性表面电荷(～2mv)(图9c)。如使用hplc测量的，纳米-fdump中fdump的包封效率(ee％)和负载容量(lc％)分别为～98％和～38wt％，这与没有aeaa的纳米-fdump中fdump的ee％和lc％相似。
[0257]
如图9d所示，在中性pbs中，在24h处，～50％的fdump从纳米-fdump中的纳米沉淀物中释放，而在酸性pbs中药物释放明显增加(》95％)。这指示纳米-fdump显示ph敏感的药物释放，这最有可能是由于ca3(po4)2的酸敏感特性
92
。在含有血清的培养基中长达8h，纳米-fdump没有引起显著的聚集(从～35增加至50nm)(图9e)。此外，没有aeaa的纳米-fdump显示
出与针对纳米-fdump(图9)观察到的相似的形态、粒度、表面电荷、药物释放和血清稳定性(图16)。
[0258]
5-fu可以在癌细胞内代谢为fdump，并且fdump与胸苷酸合酶形成复合物以抑制脱氧胸苷一磷酸(dtmp)的产生
82
。然而，5-fu细胞内代谢为fdump是一个速率限制过程，其阻碍治疗功效；例如，超过80％的单剂量5-fu转化为无活性代谢物
93
。此外，虽然5-fu耐受性良好，但在缺乏二氢嘧啶脱氢酶(负责5-fu的代谢的酶)的患者中发现了严重的毒性迹象。这种毒性是由于5-fu而不是代谢物
93
。为了绕过这些阻力，使用我们的aeaa靶向peg化np(纳米-fdump)配制了fdump而不是5-fu(图9a)。游离fdump是一种磷酸核苷，其不能渗透到细胞中
94
，而纳米-fdump可以有效地将不渗透的fdump携带到癌细胞中(参见下文的结果)。值得注意的是，最近开发了各种纳米制剂用于在荷瘤小鼠模型中递送5-fu
95-97
。例如，li等人产生了聚(γ-苄基-l-谷氨酸)(pblg)和peg的聚合np，用于在皮下crc小鼠模型中递送5-fu，然而，ee％和lc％分别仅为～61％和～27％
95
。safwat和同事还开发了一种基于金np的系统，用于在皮肤癌小鼠模型中递送5-fu，但ee％小于70％
96
。此外，kazi和其同事设计了一种基于聚(乳酸-共-乙醇酸)(plga)的np，用于在黑色素瘤小鼠模型中递送5-fu，然而，ee％和lc％分别仅为～56％和～2％
97
。在此，与这些研究相比，纳米-fdump实现了显著更高的5-fu代谢物的ee％(～98％)和lc％(～38％)。总之，我们的结果指示，从作用机制、药物包封效率和负载能力的角度来看，纳米-fdump提供比这些先前报道的5-fu纳米制剂更大的优势。
[0259]
实施例11.纳米-fdump的体外抗癌作用
[0260]
相对于5-fu(ic
50
≈70μm，24h温育)，纳米-fdump在小鼠crc(ct26)和hcc(hepa1-6)细胞系中引起显著更高的细胞毒性(ic
50
≈20μm，24h温育；p《0.01)(图10a)。选择其中fdump被2'-脱氧尿苷5'-单磷酸(dump)替代的纳米-dump作为阴性对照。值得注意的是，在所测试的条件下无法确定纳米-dump的ic
50
，从而证明dump或aeaa靶向制剂都没有细胞毒性。此外，在ct26和hepa1-6细胞的细胞凋亡中没有观察到纳米-dump与pbs之间的显著差异(图10b)，而与纳米-dump和5-fu相比，纳米-fdump诱导显著更高水平的细胞凋亡(p《0.01，24h温育)(图10b)。这些指示纳米-fdump的细胞毒性和细胞凋亡作用主要是由于使用aeaa靶向纳米制剂递送氟药物。
[0261]
随后在ct26和hepa1-6细胞中评定纳米-fdump诱导ros的能力(图10c)。结果显示在纳米-dump与pbs之间没有发现癌细胞中ros形成的显著差异，而纳米-fdump引起比纳米-dump和5-fu显著更高的ros水平(p《0.01，24h)(图10c)。谷胱甘肽(gsh)被称为主要的内源性抗氧化剂，并且在通过直接和间接清除中和细胞内ros中起关键作用
98
。因为gsh的合成主要依赖于l-半胱氨酸
99
，并且n-乙酰基-l-半胱氨酸(nac)是l-半胱氨酸的乙酰化变体(前体)
100
，所以nac可以用于为gsh产生提供l-半胱氨酸。在此，nac用于研究纳米-fdump实现的ros在诱导细胞凋亡中的作用(图10d)。当用nac预处理癌细胞时，纳米-fdump的细胞凋亡功效从～30％显著降低(p《0.01，24h)至～15％(图10d)。图10c和图10d中的结果显示，crc和hcc细胞的细胞凋亡至少部分是由于纳米-fdump实现的ros形成。
[0262]
实施例12.纳米-fdump和纳米-folox的协同icd作用
[0263]
icd相关的免疫原性可以由ros诱发
78
，并且icd的功效可以通过ros诱导策略来提高
79-81
。纳米-folox导致针对抗癌免疫应答的oxp介导的icd 71
。在此，关于icd标志，即钙网蛋白(crt)的暴露、三磷酸腺苷(atp)的分泌和高迁移率族蛋白b1(hmgb1)的释放，使用ct26
和hepa1-6细胞评定纳米-fdump和纳米-folox的协同icd作用
78
。
[0264]
图11a中的结果显示，在纳米-fdump与pbs之间未观察到crt暴露的显著差异，这最有可能是由于5-fu或代谢物在促进crt的易位方面的效率低下
101
。相比之下，纳米-folox能够介导crt显著有效地暴露(p《0.01，～31至32％)到细胞膜上(图11a)。值得注意的是，纳米-fdump和纳米-folox的组合进一步改善crt的易位(p《0.001，～73至79％)(图11a)。虽然5-fu或代谢物不能有效地诱导crt暴露，但它们可以促进atp的释放和hmgb1的分泌
101
。实际上，与pbs相比，纳米-fdump显著激活atp分泌到细胞外环境中(p《0.05)，这与纳米-folox获得的结果相似(图11b)。值得注意的是，两种纳米制剂的组合进一步增强atp的分泌(p《0.01)(图11b)。此外，与pbs相比，纳米-fdump显著增强hmgb1从细胞核中释放到细胞质中，这与纳米-folox中的发现结果相似(图11c)。值得注意的是，两种纳米制剂的组合进一步促进hmgb1的释放(p《0.05)(图11c)。这些结果表明纳米-fdump可以与纳米-folox协同作用以改善icd作用。
[0265]
值得注意的是，当用nac预处理癌细胞时，icd标志的活性在纳米-fdump、纳米-folox或组合中被显著抑制(图11)，从而指示1)ros的产生对于纳米-folox介导的icd诱导至关重要，这最有可能是由于oxp通过内质网(er)应激和ros生成诱导icd的事实；2)通过纳米-fdump实现的ros在促进纳米-folox的icd作用中的关键作用。
[0266]
实施例13：纳米-fdump的药代动力学和生物分布
[0267]
通常，短血液循环和快速肾消除通过5-fu的i.v.施用导致
102
。peg化的纳米制剂可以显著增加血液中化疗剂的半衰期
103
。在此，分别使用原位ct26-fl3来源的crc和hepa1-6-luc来源的hcc小鼠模型来确定纳米-fdump的半衰期(图12a)。结果显示血浆中氟药物的浓度迅速下降，并且在注射后1h处检测到微量水平(分别对于crc和hcc模型中的fdump，t
1/2
≈6min和5min；图12a)。相比之下，纳米-fdump中的氟药物从血浆中更缓慢地消除(分别对于crc和hcc模型中的fdump，t
1/2
≈1.6h和1.4h；图12a)。此外，没有aeaa的纳米-fdump显示出与通过具有aeaa的纳米-fdump记录的半衰期(图12a)类似的半衰期(图17)。这些结果确认通过纳米-fdump显著改善了氟药物的半衰期，这最有可能是由于peg修饰。
[0268]
还分别使用原位crc和hcc小鼠模型研究纳米-fdump的组织分布。i.v.注射did标记的纳米制剂后，使用ivis动力学光学系统对肿瘤和主要组织进行离体成像(图12b和图12c)。在crc模型中，与非靶向纳米制剂相比，aeaa靶向的纳米-fdump在肿瘤中实现显着更高的保留(～2.5倍；p《0.05)，但在肝中实现显著更小的积累(～2倍；p《0.05)(图12b)。在hcc模型中，aeaa靶向的纳米制剂在肝肿瘤内特异性积累，这通过np(来自did染料的荧光成像)和肿瘤组织(来自通过肿瘤中的荧光素酶产生的可见光的生物发光成像)的共定位得到确认(图12c)。然而，非靶向纳米制剂主要存在于健康肝中而不是肿瘤中(图12c)。这些确认了aeaa靶向的纳米制剂显著改善肿瘤积累并缓解非特异性组织分布。
[0269]
癌症患者遭受耗时的folfox计划，并且这种过度治疗引起严重的副作用
68,69
。纳米-folox可以延长血液循环并增强铂药物和fna的肿瘤积累
71
。如图12所示，纳米-fdump显著增加氟药物的半衰期和肿瘤积累。因此，它表明纳米-fdump和纳米-folox的组合提供了一种具有减少的治疗周期和较低剂量的策略，其与常规folfox相比充分实现治疗结果。
[0270]
实施例14：纳米-fdump和纳米-folox的组合在原位crc和hcc小鼠模型中的协同化学-免疫疗法
[0271]
首先在健康小鼠中评定纳米-fdump的体内毒性(图18)。在5、10和25mg/kg fdump下的纳米-fdump中没有发现显著的体重减轻；然而，50mg/kg fdump下的纳米-fdump导致轻微的体重减轻(图18)。此外，在用较高剂量(50mg/kg)的纳米-fdump处理的小鼠中观察到毒性迹象(例如，驼背姿势、被毛皱褶和不愿移动)，但在较低剂量(5、10和25mg/kg)下没有观察到(图18)。此外，分别在原位ct26-fl3来源的crc和hepa1-6-luc来源的hcc小鼠模型中评定不同剂量下纳米-fdump的抗肿瘤功效(图19)。纳米-fdump的抗肿瘤功效是剂量依赖性剂的，并且crc和hcc的生长通过含有10和25mg/kg fdump的纳米-fdump显著减慢(图19)。此外，与pbs相比，通过非靶向纳米-fdump没有实现抗肿瘤功效，但是与非靶向纳米制剂相比，aeaa靶向的纳米-fdump显著减慢了肿瘤生长(p《0.05)(图20)，从而确认了aeaa介导的抗肿瘤作用。基于这些结果，选择含有10mg/kg fdump的纳米-fdump用于组合疗法的后续研究(图13和图14)。
[0272]
先前，“纳米-folox和游离5-fu”显示出与folfox(游离药物，用作阳性对照)相比显著改善的治疗效果
71
。因此，“纳米-folox和游离5-fu”在此被选择作为阳性对照。如图13a和图13b所示，与单独的纳米-fdump、纳米-fdump与oxp和fna以及纳米-folox与5-fu(10mg/kg)相比，纳米-fdump(10mg/kg fdump)和纳米-folox(1.5mg/kg铂药物和4.5mg/kg fna)的组合表现出显着改善的抗肿瘤功效(p《0.01)。值得注意的是，纳米-fdump和纳米-folox的组合对6只小鼠中的5只提供长期存活，其与pbs[中位存活期(ms)＝40天)]、纳米-fdump(ms＝45天)、纳米-fdump与oxp和fna(ms＝49天)以及纳米-folox与5-fu(ms＝56天)相比显著改善(p《0.001)(图13c)。
[0273]
纳米-folox导致铂-dna加合物用于细胞凋亡，并且在与5-fu组合时进一步增强细胞凋亡功效。在此，免疫荧光结果显示相对于pbs(～0.3％)、单独的纳米-fdump(～2％)、纳米-fdump与oxp和5-fu(～4％)以及纳米-folox与5-fu(～10％)，纳米-fdump和纳米-folox的组合显著(p《0.05)诱导肿瘤中的细胞凋亡(～32％)(图13d)。增强的细胞凋亡功效最有可能是由于以下事实：1)使用aeaa靶向的纳米制剂实现了5-fu代谢物的靶向递送；2)通过从纳米-folox释放的fna促进了5-fu代谢物的功效；3)5-fu代谢物/fna进一步增强了从纳米-folox释放的oxp衍生物的细胞凋亡作用
71
。此外，与其他对照相比，两种纳米制剂的组合诱导icd从“冷”肿瘤微环境(tme)转移到“热”t细胞炎性肿瘤微环境(～28％t细胞浸润；p《0.01)中(图13e)。通过组合策略实现的tme重塑由免疫刺激因子的增加和免疫抑制因子的减少进一步支持(图13f和图13g)。例如，cd8

t细胞、cd4

t细胞和树突细胞(dc)通过组合策略在肿瘤中显著激活(图13f)，其伴随着ifn-γ、tnf-α和il-12(用于激活抗肿瘤免疫的三种细胞因子)的上调(图13g)
104
。相反，通过组合策略，肿瘤中的髓源性抑制细胞(mdsc)、调节t细胞(treg)和肿瘤相关巨噬细胞(m2)显著降低(图13f)，其伴随着免疫抑制细胞因子诸如il-4、il-6和il-10的下调(图13g)
105
。已知icd相关的抗肿瘤免疫基本上依赖于效应t细胞的激活以用于杀伤肿瘤细胞
80
。为了确认免疫治疗机制，分别在用对应的单克隆抗cd8或cd4抗体耗尽cd8

或cd4

t细胞后，向原位crc动物施用纳米-fdump/纳米-folox(图13h)。因此，在注射这些抗体后纳米-fdump/纳米-folox的抗肿瘤功效被显著抑制(p《0.01)，但在同种型igg的情况下未被显著抑制(图13h)，从而确认了效应t细胞对于组合策略介导的抗肿瘤免疫的关键作用。因此，图13中的协同免疫作用最有可能是由于纳米-fdump显著促进了纳米-folox介导的icd功效的事实。
[0274]
folfox表现出生成记忆t细胞巨大潜力
106
，并且il-12在抗原特异性记忆t细胞的激活和增殖中起关键作用
107,108
。实际上，在纳米-fdump/纳米-folox的处理后，记忆cd8

和cd4

t细胞在肿瘤中被成功激活(图13f)。为了确认肿瘤特异性记忆应答，用4t1和ct26-fl3细胞再刺激通过纳米-fdump/纳米-folox的处理“治愈”的无肿瘤小鼠(图21)。结果显示4t1乳腺肿瘤生长不受影响，而ct26-fl3肿瘤生长在同一动物中被显著抑制(图21)。这些进一步确认了组合方法具有诱导针对crc的肿瘤特异性记忆应答的潜力，从而促进小鼠的长期存活(图13c)。
[0275]
此外，还通过组合策略在原位hcc小鼠中实现了比其他对照显著改善的抗肿瘤功效(p《0.01)(图14a和图14b)，其促进了6只小鼠中的4只的长期存活(图14c)。抗肿瘤效果主要由化学免疫治疗作用，包括通过组合策略实现的细胞凋亡(图14d)和tme重塑(图14e)产生。tme重塑由免疫刺激因子的增加和免疫抑制因子的减少支持(图14f和图14g)。在纳米-fdump/纳米-folox的处理后，cd8

t细胞、cd4

t细胞和dc在肿瘤中被显著激活(图14f)，其伴随着ifn-γ、tnf-α和il-12的增加(图14g)。相比之下，肿瘤中的mdsc、treg和m2细胞显著降低(图13f)，其伴随着il-4、il-6和il-10的缓解(图14g)。此外，在抗cd8或抗cd4抗体的预处理后，纳米-fdump/纳米-folox的抗肿瘤功效在hcc小鼠模型中也被显著抑制(p《0.01)(图14h)，从而确认了效应t细胞对于组合策略介导的抗肿瘤免疫的关键作用。此外，用b16黑色素瘤和hepa1-6-luc细胞再刺激通过组合方法“治愈”的无肿瘤小鼠(图21)。结果显示治愈小鼠中的b16肿瘤生长不受影响，而hepa1-6-luc肿瘤生长在同一动物中被显著抑制(图21)。这些结果显示组合方法也具有诱导针对hcc的肿瘤特异性记忆应答的潜力，从而促进小鼠的长期存活(图14c)。
[0276]
此外，与pbs相比，通过组合策略没有导致毒性迹象，这通过分析健康小鼠的体重、血液毒性和肝/肾损伤得到确认(图22)。总之，“纳米-fdump 纳米-folox”策略可以实现针对crc和hcc的协同化学免疫治疗疗效，以便在小鼠中实现长期存活而不导致显著的副作用。
[0277]
实施例15：阻断pd-l1增强纳米-fdump和纳米-folox组合抑制肝转移
[0278]
folfox已经被用于具有不可切除的crc肝转移的患者
67
；然而，由于快速肿瘤进展和高复发率，治疗效果仍然较差。在此，进一步应用“纳米-fdump 纳米-folox”策略来治疗具有实验性肝转移的小鼠(图15)。这种荷瘤模型紧密地再现转移阶段crc的侵略性模式
109
。如图15a和图15b所示，与pbs相比，组合方法能够显著(p《0.01)减慢小鼠中的肿瘤生长，其伴随着细胞凋亡(～11％)(图15d)和t细胞浸润(～12％)(图15e)。然而，给药之后通过组合策略没有实现长期存活(ms＝48天)(图15c)。阻断pd-l1与“纳米-folox 5-fu”组合显著提高了移植crc肝转移的动物的总体存活
71
。因此，假设抗pd-l1 mab可以进一步增强“纳米-fdump 纳米-folox”策略。实际上，与纳米-fdump/纳米-folox或抗pd-l1 mab相比，纳米-fdump/纳米-folox和抗pd-l1 mab的组合显著抑制肝转移(p《0.01)(图15a和图15b)，其伴随着改善的细胞凋亡(～40％)(图15d)和t细胞浸润(～40％)(图15e)。值得注意的是，纳米-fdump/纳米-folox和抗pd-l1 mab的组合能够在6只小鼠中的5只中提供长期存活(图15c)。这最有可能是由于以下事实：与fdump/纳米-folox或抗pd-l1 mab相比，纳米-fdump/纳米-folox和抗pd-l1 mab的组合显著(p《0.05和p《0.01)增加效应/记忆t细胞和dc的量(图15f)，上调ifn-γ和il-12的表达(图15g)并且降低il-4、il-6和il-10的水平(图15g)。
这些指示fdump/纳米-folox可以与免疫检查点阻断组合显著重塑免疫抑制tme以用于增强抗肿瘤效果，从而潜在地为转移crc提供化学免疫治疗策略。
[0279]
实施例16
[0280]
folfox是将三种药物在一起使用的组合疗法：亚叶酸、5-fu和奥沙利铂。先前的公开描述了纳米-folox和纳米-fdump以及它们组合用于治疗结直肠癌和肝癌的用途。两种纳米制剂的重要中间体是图23a和b中描述的“核心”结构。这些核心通过使用磷脂，即二油酰磷脂酸(dopa)来稳定化。因此，核心在两种情况下均是疏水的。这些纯化的核心是疏水的，并且可以在chcl3中溶解并储存至少一年。我们将这些核心包封在含有plga、plga-peg和plga-peg-aeaa(4:4:2摩尔比)的聚合物乳液中。将不同比率的核心和聚合物溶解在四氢呋喃(thf)中，并且在室温下不断搅拌下逐滴添加到2ml水中。将所得的np悬浮液在室温下不加盖地搅拌6h以去除thf。通过超滤进一步纯化np。然后将plga np重悬浮，用水洗涤，并在14000rpm下离心20min以去除游离脂质和胶束，重悬浮并在800rpm下再次离心以去除任何纳米核聚集体。folox的药物负载和包封效率将使用电感耦合等离子体质谱法(icp-ms)进行测量。fdump的负载和包封将通过紫外-可见光谱法进行测量。将制造具有不同比率的两个核心的制剂。因为这些plga纳米乳液含有所有三种药物。这种纳米制剂在本文中被称为“纳米-folfox并在图24a中描绘”[0281]
实施例17：纳米-fdump和纳米-folox和伊立替康的组合
[0282]
对于某些癌症，诸如胰腺导管腺癌，通常一种额外的药物，即伊立替康添加到组合疗法方案中。组合疗法被称为folfirinox。制剂在图24b中描绘。利用本文所述的化学可以制备组合纳米颗粒复合物。聚合物外层，诸如plga或plga-peg-aeaa，4种药物是亚叶酸、5-fu、伊立替康和奥沙利铂。伊立替康的活性代谢物，即sn-38，可以添加到含有以上所述的两个核心的thf溶液中。sn-38是疏水的并且可溶于thf。所得的纳米颗粒含有4种药物，即亚叶酸、fdump(5-fu的活性代谢物)、奥沙利铂和sn-38(伊立替康的活性代谢物)。这种纳米制剂在本文中被称为“纳米-folfirinox”。
[0283][0284]
说明书中提及的所有出版物和专利申请指明本发明所属领域的技术人员的水平。所有出版物和专利申请通过引用并入本文，其程度如同每个单独的出版物或专利申请被具体地且单独地指明通过引用并入一样。
[0285]
这些发明所属领域的技术人员将联想到得益于前文描述及相关附图中所呈现教义的本文所列出的本发明的许多修改方案和其他实施方式。因此，应理解，本发明不限于所公开的特定实施方式，并且修改和其他实施方式旨在包括在实施方式的前述列表和所附权利要求的范围内。尽管本文采用特定术语，但是仅在一般意义和描述性意义上而不是出于
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