用于X连锁青少年型视网膜劈裂症疗法的CRISPR和AAV策略的制作方法

技术特征：
1.一种用于整合到靶基因组基因座中的核酸构建体，其中所述核酸构建体是双向的并且包括：(a)第一区段，所述第一区段包括第一视网膜劈裂素蛋白或其片段的第一编码序列；以及(b)第二区段，所述第二区段包括第二视网膜劈裂素蛋白或其片段的第二编码序列的反向补体。2.根据权利要求1所述的核酸构建体，其中所述第二区段定位于所述第一区段的3'端。3.根据权利要求1或2所述的核酸构建体，其中所述第一视网膜劈裂素蛋白或其片段是人视网膜劈裂素蛋白或其片段，所述第二视网膜劈裂素蛋白或其片段是人视网膜劈裂素蛋白或其片段，或者所述第一视网膜劈裂素蛋白或其片段和所述第二视网膜劈裂素蛋白或其片段两者均是人视网膜劈裂素蛋白或其片段。4.根据权利要求1到3中任一项所述的核酸构建体，其中所述第一编码序列包括互补dna(cdna)、基本上由其组成或由其组成，所述第二编码序列包括cdna、基本上由其组成或由其组成，或者所述第一编码序列和所述第二编码序列两者均包括cdna、基本上由其组成或由其组成。5.根据权利要求1到4中任一项所述的核酸构建体，其中所述第一编码序列包括人rs1或其简并变体的外显子2-6、基本上由其组成或由其组成，所述第二编码序列包括人rs1或其简并变体的外显子2-6、基本上由其组成或由其组成，或者所述第一编码序列和所述第二编码序列两者均包括人rs1或其简并变体的外显子2-6、基本上由其组成或由其组成。6.根据权利要求1到5中任一项所述的核酸构建体，其中所述第一区段包括定位于所述第一编码序列的5'端的人rs1的第一内含子的片段或部分，和/或所述第二区段包括定位于所述第二编码序列的所述反向补体的3'端的人rs1的第二内含子的片段或部分的反向补体。7.根据权利要求1到6中任一项所述的核酸构建体，其中所述第一视网膜劈裂素蛋白或其片段与所述第二视网膜劈裂素蛋白或其片段相同。8.根据权利要求1到7中任一项所述的核酸构建体，其中所述第二编码序列采用与所述第一编码序列的密码子使用不同的密码子使用。9.根据权利要求1到8中任一项所述的核酸构建体，其中所述第二区段与所述第一区段具有至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约97％或至少约99％互补性。10.根据权利要求1到9中任一项所述的核酸构建体，其中所述第二区段与所述第一区段具有小于约30％、小于约35％、小于约40％、小于约45％、小于约50％、小于约55％、小于约60％、小于约65％、小于约70％、小于约75％、小于约80％、小于约85％、小于约90％、小于约95％、小于约97％或小于约99％互补性。11.根据权利要求1到10中任一项所述的核酸构建体，其中所述第二编码序列的所述反向补体：(a)与所述第一编码序列没有明显互补；(b)与所述第一编码序列的片段没有明显互补；
(c)与所述第一编码序列高度互补；(d)与所述第一编码序列的所述片段高度互补；(e)与所述第一编码序列的所述反向补体至少约60％、至少约70％、至少约80％或至少约90％相同；(f)与所述第一编码序列的所述反向补体约50％到约80％相同；或者(g)与所述第一编码序列的所述反向补体约60％到约100％相同。12.根据权利要求1到11中任一项所述的核酸构建体，其中所述第一区段通过连接子与所述第二区段连接。13.根据权利要求12所述的核酸构建体，其中所述连接子的长度为约5到约2000个核苷酸。14.根据权利要求1到13中任一项所述的核酸构建体，其中所述第一区段包括定位于所述第一编码序列的3'端的第一聚腺苷酸化信号序列，并且所述第二区段包括定位于所述第二编码序列的所述反向补体的5'端的第二聚腺苷酸化信号序列的反向补体。15.根据权利要求14所述的核酸构建体，其中所述第一聚腺苷酸化信号序列不同于所述第二聚腺苷酸化信号序列。16.根据权利要求1到15中任一项所述的核酸构建体，其中所述核酸构建体不包括驱动所述第一视网膜劈裂素蛋白或其片段或所述第二视网膜劈裂素蛋白或其片段的表达的启动子。17.根据权利要求1到16中任一项所述的核酸构建体，其中所述第一区段包括定位于所述第一编码序列的5'端的第一剪接受体位点，并且所述第二区段包括定位于所述第二编码序列的所述反向补体的3'端的第二剪接受体位点的反向补体。18.根据权利要求17所述的核酸构建体，其中所述第一剪接受体位点来自rs1基因，所述第二剪接受体位点来自rs1基因，或者所述第一剪接受体位点和所述第二剪接受体位点两者均来自rs1基因。19.根据权利要求18所述的核酸构建体，其中所述第一剪接受体位点来自人rs1的内含子1，所述第二剪接受体位点来自人rs1的内含子1，或者所述第一受体位点和所述第二剪接受体位点两者均来自人rs1的内含子1。20.根据权利要求1到19中任一项所述的核酸构建体，其中所述核酸构建体不包括同源臂。21.根据权利要求1到19中任一项所述的核酸构建体，其中所述核酸构建体包括同源臂。22.根据权利要求1到21中任一项所述的核酸构建体，其中所述核酸构建体是单链的。23.根据权利要求1到21中任一项所述的核酸构建体，其中所述核酸构建体是双链的。24.根据权利要求1到23中任一项所述的核酸构建体，其中所述核酸构建体包括dna。25.根据权利要求1到24中任一项所述的核酸构建体，其中所述第一编码序列被密码子优化以在宿主细胞中表达，所述第二编码序列被密码子优化以在所述宿主细胞中表达，或者所述第一编码序列和所述第二编码序列两者均被密码子优化以在所述宿主细胞中表达。26.根据权利要求1到25中任一项所述的核酸构建体，其中所述核酸构建体包括以下末端结构中的一个或多个末端结构：发夹、环、反向末端重复序列(itr)或超环面。
27.根据权利要求26所述的核酸构建体，其中所述核酸构建体包括itr。28.根据权利要求1到27中任一项所述的核酸构建体，其中所述第一视网膜劈裂素蛋白或其片段和/或所述第二视网膜劈裂素蛋白或其片段包括与seq id no:5至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％相同的序列、基本上由其组成或由其组成。29.根据权利要求1到28中任一项所述的核酸构建体，其中所述第一编码序列和/或所述第二编码序列包括与seq id no:8或9至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％相同的序列、基本上由其组成或由其组成。30.根据权利要求1到29中任一项所述的核酸构建体，其中所述第一编码序列包括与seq id no:8至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％相同的序列、基本上由其组成或由其组成，并且其中所述第二编码序列包括与seq id no:9至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％相同的序列、基本上由其组成或由其组成。31.根据权利要求1到30中任一项所述的核酸构建体，其中所述核酸构建体包括与seq id no:46或47至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％相同的序列、基本上由其组成或由其组成。32.根据权利要求1到31中任一项所述的核酸构建体，其中所述第二区段定位于所述第一区段的3'端，其中所述第一视网膜劈裂素蛋白或其片段和所述第二视网膜劈裂素蛋白或其片段两者均是人视网膜劈裂素蛋白或其片段，其中所述第一视网膜劈裂素蛋白或其片段与所述第二视网膜劈裂素蛋白或其片段相同，其中所述第一编码序列和所述第二编码序列两者均包括互补dna(cdna)，所述cdna包括人rs1或其简并变体的外显子2-6，其中所述第二编码序列采用与所述第一编码序列的密码子使用不同的密码子使用，其中所述第一区段包括定位于所述第一编码序列的3'端的第一聚腺苷酸化信号序列，并且所述第二区段包括定位于所述第二编码序列的所述反向补体的5'端的第二聚腺苷酸化信号序列的反向补体，其中所述第一区段包括定位于所述第一编码序列的5'端的第一剪接受体位点，并且所述第二区段包括定位于所述第二编码序列的所述反向补体的3'端的第二剪接受体位点的反向补体，其中所述核酸构建体不包括驱动所述第一视网膜劈裂素蛋白或其片段或所述第二视网膜劈裂素蛋白或其片段的表达的启动子，并且其中所述核酸构建体不包括同源臂。33.一种载体，其包括根据权利要求1到32中任一项所述的核酸构建体。
34.根据权利要求33所述的载体，其中所述载体是病毒载体。35.根据权利要求34所述的载体，其中所述载体是腺相关病毒(aav)载体。36.根据权利要求35所述的载体，其中所述aav包括单链基因组(ssaav)。37.根据权利要求35所述的载体，其中所述aav包括自身互补型基因组(scaav)。38.根据权利要求35到37中任一项所述的载体，其中所述aav选自由以下组成的组：aav2、aav5、aav8或aav7m8。39.根据权利要求33到38中任一项所述的载体，其中所述载体不包括驱动所述第一视网膜劈裂素蛋白或其片段或所述第二视网膜劈裂素蛋白或其片段的表达的启动子。40.根据权利要求33到39中任一项所述的载体，其中所述载体不包括同源臂。41.根据权利要求33到39中任一项所述的载体，其中所述载体包括同源臂。42.一种脂质纳米颗粒，其包括根据权利要求1到32中任一项所述的核酸构建体。43.一种细胞，其包括根据权利要求1到32中任一项所述的核酸构建体。44.根据权利要求43所述的细胞，其中所述细胞在体外。45.根据权利要求43所述的细胞，其中所述细胞在体内。46.根据权利要求43到45中任一项所述的细胞，其中所述细胞是哺乳动物细胞。47.根据权利要求46所述的细胞，其中所述细胞是人细胞。48.根据权利要求43到47中任一项所述的细胞，其中所述细胞是视网膜细胞。49.根据权利要求43到48中任一项所述的细胞，其中所述细胞表达所述第一视网膜劈裂素蛋白或其片段或所述第二视网膜劈裂素蛋白或其片段。50.根据权利要求43到49中任一项所述的细胞，其中所述核酸构建体在基因组上整合在所述靶基因组基因座处。51.根据权利要求50所述的细胞，其中所述靶基因组基因座是内源性rs1基因座。52.根据权利要求50所述的细胞，其中所述核酸构建体在基因组上整合在所述内源性rs1基因座的内含子1中。53.根据权利要求52所述的细胞，其中内源性rs1外显子1剪接至所述核酸构建体的所述第一编码序列或所述第二编码序列中。54.根据权利要求53所述的细胞，其中包括在基因组上整合的核酸构建体的经修饰的rs1基因座编码包括与seq id no:2或4至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％相同的序列、基本上由其组成或由其组成的蛋白质。55.根据权利要求51到54中任一项所述的细胞，其中将所述核酸构建体整合到所述内源性rs1基因座中阻止整合位点下游的内源性rs1基因转录。56.根据权利要求55所述的细胞，其中所述将所述核酸构建体整合到所述内源性rs1基因座中减少或消除内源性视网膜劈裂素蛋白的表达，并且用由所述核酸构建体编码的所述视网膜劈裂素蛋白或其片段的表达替代所述内源性视网膜劈裂素蛋白的表达。57.根据权利要求55或56中任一项所述的细胞，其中所述内源性rs1基因座包括突变的rs1基因，所述突变的rs1基因包括引起x连锁青少年型视网膜劈裂症的突变，并且所述在基因组上整合的核酸构建体的表达降低或消除所述突变的rs1基因的表达。58.一种用于同源非依赖性靶向整合到靶基因组基因座中的核酸构建体，其中所述核
酸构建体包括视网膜劈裂素蛋白或其片段的在每一侧上侧接有核酸酶药剂的核酸酶靶序列的编码序列。59.根据权利要求58所述的核酸构建体，其中所述核酸构建体中的所述核酸酶靶序列与用于整合到所述靶基因组基因座中的核酸酶靶序列相同，其中所述靶基因组基因座中的所述核酸酶靶序列在所述核酸构建体以正确朝向插入时被破坏，但在所述核酸构建体以相反朝向插入到所述靶基因组基因座中时被重整。60.一种用于与靶基因组基因座同源重组的核酸构建体，其中所述核酸构建体包括视网膜劈裂素蛋白或其片段的在每一侧上侧接有同源臂的编码序列，任选地其中所述编码序列和所述同源臂在每一侧上进一步侧接有核酸酶药剂的核酸酶靶序列，并且任选地其中每个同源臂的长度介于约25个核苷酸与约2.5kb之间。61.根据权利要求58到60中任一项所述的核酸构建体，其中所述视网膜劈裂素蛋白或其片段是人视网膜劈裂素蛋白或其片段。62.根据权利要求58到61中任一项所述的核酸构建体，其中所述视网膜劈裂素蛋白或其片段的所述编码序列包括互补dna(cdna)、基本上由其组成或由其组成。63.根据权利要求58到62中任一项所述的核酸构建体，其中所述视网膜劈裂素蛋白或其片段的所述编码序列包括人rs1或其简并变体的外显子2-6、基本上由其组成或由其组成。64.根据权利要求58到63中任一项所述的核酸构建体，其中所述核酸构建体包括定位于所述编码序列的5'端的人rs1的第一内含子的片段或部分。65.根据权利要求58到64中任一项所述的核酸构建体，其中所述核酸构建体不包括驱动所述视网膜劈裂素蛋白或其片段的表达的启动子。66.根据权利要求58到65中任一项所述的核酸构建体，其中所述核酸构建体包括定位于所述编码序列的3'端的聚腺苷酸化信号序列。67.根据权利要求58到66中任一项所述的核酸构建体，其中所述核酸构建体包括定位于所述编码序列的5'端的剪接受体位点。68.根据权利要求67所述的核酸构建体，其中所述剪接受体位点来自rs1基因。69.根据权利要求68所述的核酸构建体，其中所述剪接受体位点来自人rs1的内含子1。70.根据权利要求58到69中任一项所述的核酸构建体，其中所述核酸构建体是单链的。71.根据权利要求58到69中任一项所述的核酸构建体，其中所述核酸构建体是双链的。72.根据权利要求58到71中任一项所述的核酸构建体，其中所述核酸构建体包括dna。73.根据权利要求58到72中任一项所述的核酸构建体，其中所述编码序列被密码子优化以在宿主细胞中表达。74.根据权利要求58到73中任一项所述的核酸构建体，其中所述构建体包括以下末端结构中的一个或多个末端结构：发夹、环、反向末端重复序列(itr)或超环面。75.根据权利要求74所述的核酸构建体，其中包括所述编码序列和所述核酸酶靶序列的所述核酸构建体的区侧接有itr。76.根据权利要求58到75中任一项所述的核酸构建体，其中所述核酸酶药剂为cas蛋白和向导rna，并且所述核酸酶靶序列为向导rna靶序列。77.根据权利要求76所述的核酸构建体，其中所述向导rna靶序列为反向向导rna靶序
列。78.根据权利要求76或77所述的核酸构建体，其中所述cas蛋白是cas9。79.根据权利要求58到78中任一项所述的核酸构建体，其中所述视网膜劈裂素蛋白或其片段包括与seq id no:5至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％相同的序列、基本上由其组成或由其组成。80.根据权利要求58到79中任一项所述的核酸构建体，其中所述视网膜劈裂素蛋白或其片段的所述编码序列包括与seq id no:8或9至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％相同的序列、基本上由其组成或由其组成。81.根据权利要求58到80中任一项所述的核酸构建体，其中所述核酸构建体包括与seq id no:45至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％相同的序列、基本上由其组成或由其组成。82.根据权利要求58、59和61到81中任一项所述的核酸构建体，其中所述核酸构建体是所述用于同源非依赖性靶向整合到所述靶基因组基因座中的核酸构建体，其中所述视网膜劈裂素蛋白或其片段是人视网膜劈裂素蛋白或其片段，其中所述视网膜劈裂素蛋白或其片段的所述编码序列包括包含人rs1或其简并变体的外显子2-6的互补dna(cdna)，其中所述核酸构建体不包括驱动所述视网膜劈裂素蛋白或其片段的表达的启动子，其中所述核酸构建体包括定位于所述编码序列的3'端的聚腺苷酸化信号序列，其中所述核酸构建体包括定位于所述编码序列的5'端的剪接受体位点，并且其中所述核酸构建体中的所述核酸酶靶序列与用于整合到所述靶基因组基因座中的核酸酶靶序列相同，其中所述靶基因组基因座中的所述核酸酶靶序列在所述核酸构建体以正确朝向插入时被破坏，但在所述核酸构建体以相反朝向插入到所述靶基因组基因座中时被重整。83.根据权利要求60到81中任一项所述的核酸构建体，其中所述核酸构建体是所述用于与所述靶基因组基因座同源重组的核酸构建体，其中所述视网膜劈裂素蛋白或其片段是人视网膜劈裂素蛋白或其片段，其中所述视网膜劈裂素蛋白或其片段的所述编码序列包括包含人rs1或其简并变体的外显子2-6的互补dna(cdna)，其中所述核酸构建体不包括驱动所述视网膜劈裂素蛋白或其片段的表达的启动子，其中所述核酸构建体包括定位于所述编码序列的3'端的聚腺苷酸化信号序列，其中所述核酸构建体包括定位于所述编码序列的5'端的剪接受体位点，并且其中每个同源臂的长度介于约25个核苷酸与约2.5kb之间。84.一种载体，其包括根据权利要求58到83中任一项所述的核酸构建体。85.根据权利要求84所述的载体，其中所述载体是病毒载体。86.根据权利要求85所述的载体，其中所述载体是腺相关病毒(aav)载体。87.根据权利要求86所述的载体，其中所述aav包括单链基因组(ssaav)。
88.根据权利要求86所述的载体，其中所述aav包括自身互补型基因组(scaav)。89.根据权利要求86到88中任一项所述的载体，其中所述aav选自由以下组成的组：aav2、aav5、aav8或aav7m8。90.根据权利要求84到89中任一项所述的载体，其中所述载体不包括驱动所述视网膜劈裂素蛋白或其片段的表达的启动子。91.根据权利要求84到90中任一项所述的载体，其中所述载体不包括同源臂。92.一种脂质纳米颗粒，其包括根据权利要求58到83中任一项所述的核酸构建体。93.一种细胞，其包括根据权利要求58到83中任一项所述的核酸构建体。94.根据权利要求93所述的细胞，其中所述细胞在体外。95.根据权利要求93所述的细胞，其中所述细胞在体内。96.根据权利要求93到95中任一项所述的细胞，其中所述细胞是哺乳动物细胞。97.根据权利要求96所述的细胞，其中所述细胞是人细胞。98.根据权利要求93到97中任一项所述的细胞，其中所述细胞是视网膜细胞。99.根据权利要求93到98中任一项所述的细胞，其中所述细胞表达所述视网膜劈裂素蛋白或其片段。100.根据权利要求93到99中任一项所述的细胞，其中所述核酸构建体在基因组上整合在所述靶基因组基因座处。101.根据权利要求100所述的细胞，其中所述靶基因组基因座是内源性rs1基因座。102.根据权利要求100所述的细胞，其中所述核酸构建体在基因组上整合在所述内源性rs1基因座的内含子1中。103.根据权利要求102所述的细胞，其中内源性rs1外显子1剪接至所述核酸构建体中的所述视网膜劈裂素蛋白或其片段的所述编码序列中。104.根据权利要求103所述的细胞，其中包括在基因组上整合的核酸构建体的经修饰的rs1基因座编码包括与seq id no:2或4至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％相同的序列、基本上由其组成或由其组成的蛋白质。105.根据权利要求101到104中任一项所述的细胞，其中将所述核酸构建体整合到所述内源性rs1基因座中阻止整合位点下游的内源性rs1基因转录。106.根据权利要求105所述的细胞，其中所述将所述核酸构建体整合到所述内源性rs1基因座中减少或消除内源性视网膜劈裂素蛋白的表达，并且用由所述核酸构建体编码的所述视网膜劈裂素蛋白或其片段的表达替代所述内源性视网膜劈裂素蛋白的表达。107.根据权利要求105或106中任一项所述的细胞，其中所述内源性rs1基因座包括突变的rs1基因，所述突变的rs1基因包括引起x连锁青少年型视网膜劈裂症的突变，并且所述在基因组上整合的核酸构建体的表达降低或消除所述突变的rs1基因的表达。108.一种用于在细胞中表达视网膜劈裂素或用于将视网膜劈裂素蛋白或其片段的编码序列整合到细胞中的靶基因组基因座中的组合物，所述组合物包括：(a)核酸构建体，所述核酸构建体包括用于整合到所述靶基因组基因座中的所述视网膜劈裂素蛋白或其片段的所述编码序列；以及(b)核酸酶药剂或编码所述核酸酶药剂的核酸，其中所述核酸酶药剂靶向所述靶基因
组基因座中的核酸酶靶序列。109.一种用于在细胞中表达视网膜劈裂素或用于将视网膜劈裂素蛋白或其片段的编码序列整合到细胞中的靶基因组基因座中的组合物，所述组合物包括：(a)根据权利要求58到83中任一项所述的核酸构建体；以及(b)核酸酶药剂或编码所述核酸酶药剂的核酸，其中所述核酸酶药剂靶向所述靶基因组基因座中的核酸酶靶序列。110.根据权利要求109所述的组合物，其中所述靶基因组基因座中的所述核酸酶靶序列与所述核酸构建体中的所述核酸酶靶序列相同。111.根据权利要求110所述的组合物，其中所述靶基因组基因座中的所述核酸酶靶序列在所述核酸构建体以正确朝向插入时被破坏，但在所述核酸构建体以相反朝向插入到所述靶基因组基因座中时被重整。112.一种用于在细胞中表达视网膜劈裂素或用于将视网膜劈裂素蛋白或其片段的编码序列整合到细胞中的靶基因组基因座中的组合物，所述组合物包括：(a)根据权利要求1到32中任一项所述的核酸构建体；以及(b)核酸酶药剂或编码所述核酸酶药剂的核酸，其中所述核酸酶药剂靶向所述靶基因组基因座中的核酸酶靶序列。113.根据权利要求108到112中任一项所述的组合物，其中所述靶基因组基因座处于rs1基因中。114.根据权利要求113所述的组合物，其中所述靶基因组基因座中的所述核酸酶靶序列处于所述rs1基因中的第一内含子中。115.根据权利要求113或114所述的组合物，其中将所述核酸构建体整合到所述内源性rs1基因座中阻止整合位点下游的内源性rs1基因转录。116.根据权利要求115所述的组合物，其中所述将所述核酸构建体整合到所述细胞中的所述内源性rs1基因座中减少或消除内源性视网膜劈裂素蛋白的表达，并且用由所述核酸构建体编码的所述视网膜劈裂素蛋白或其片段的表达替代所述内源性视网膜劈裂素蛋白的表达。117.根据权利要求108到116中任一项所述的组合物，其中所述核酸构建体处于病毒载体中。118.根据权利要求117所述的组合物，其中所述病毒载体是腺相关病毒(aav)病毒载体。119.根据权利要求118所述的载体，其中所述aav选自由以下组成的组：aav2、aav5、aav8或aav7m8。120.根据权利要求108到119中任一项所述的组合物，其中所述核酸酶药剂为cas蛋白和向导rna，并且所述核酸酶靶序列为向导rna靶序列。121.一种组合物，其包括向导rna或编码所述向导rna的dna，其中所述向导rna包括靶向rs1基因中的向导rna靶序列的dna靶向区段，并且其中所述向导rna与cas蛋白结合，并且将所述cas蛋白靶向到所述rs1基因中的所述向导rna靶序列。122.根据权利要求121所述的组合物，其中所述组合物进一步包括所述cas蛋白或编码所述cas蛋白的核酸。
id no:27、6242或6246中所示的序列。141.根据权利要求120到140中任一项所述的组合物，其中所述向导rna靶序列处于所述rs1基因的内含子中。142.根据权利要求141所述的组合物，其中所述内含子是所述rs1基因的第一内含子。143.根据权利要求120到142中任一项所述的组合物，其中所述rs1基因是人rs1基因。144.根据权利要求120到143中任一项所述的组合物，其中所述dna靶向区段包括：(a)seq id no:3148-6241中的任一个中所示的序列的至少17、至少18、至少19或至少20个连续核苷酸；(b)seq id no:3148-4989中的任一个中所示的序列的至少17、至少18、至少19或至少20个连续核苷酸；(c)seq id no:3148-3151、3154-3186、3188-3247和3249-4351中的任一个中所示的序列的至少17、至少18、至少19或至少20个连续核苷酸；(d)seq id no:3150、3151、3159、3675、4297和4304中的任一个中所示的序列的至少17、至少18、至少19或至少20个连续核苷酸；或者(e)seq id no:4990-6241中的任一个中所示的序列的至少17、至少18、至少19或至少20个连续核苷酸。145.根据权利要求120到144中任一项所述的组合物，其中所述dna靶向区段：(a)与seq id no:3148-6241中的任一个中所示的序列至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同；(b)与seq id no:3148-4989中的任一个中所示的序列至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同；(c)与seq id no:3148-3151、3154-3186、3188-3247和3249-4351中的任一个中所示的序列至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同；(d)与seq id no:3150、3151、3159、3675、4297和4304中的任一个中所示的序列至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同；或者(e)与seq id no:4990-6241中的任一个中所示的序列至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同。146.根据权利要求120到145中任一项所述的组合物，其中所述dna靶向区段包括以下中所示的序列、基本上由所述序列组成或由所述序列组成：(a)seq id no:3148-6241中的任一个；(b)seq id no:3148-4989中的任一个；(c)seq id no:3148-3151、3154-3186、3188-3247和3249-4351中的任一个；(d)seq id no:3150、3151、3159、3675、4297和4304中的任一个；或者(e)seq id no:4990-6241中的任一个。147.根据权利要求120到146中任一项所述的组合物，其中所述dna靶向区段包括seq id no:3150、3151、3159、3675、4297和4304中的任一个中所示的序列的至少17、至少18、至少19或至少20个连续核苷酸。
148.根据权利要求120到147中任一项所述的组合物，其中所述dna靶向区段与seq id no:3150、3151、3159、3675、4297和4304中的任一个中所示的序列至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同。149.根据权利要求120到148中任一项所述的组合物，其中所述dna靶向区段包括seq id no:3150、3151、3159、3675、4297和4304中的任一个中所示的序列、基本上由其组成或由其组成。150.根据权利要求120到149中任一项所述的组合物，其中所述组合物包括呈rna形式的所述向导rna。151.根据权利要求120到149中任一项所述的组合物，其中所述组合物包括编码所述向导rna的所述dna。152.根据权利要求120到150中任一项所述的组合物，其中所述向导rna包括至少一种修饰。153.根据权利要求152所述的组合物，其中所述至少一种修饰包括经2'-o-甲基修饰的核苷酸。154.根据权利要求152或153所述的组合物，其中所述至少一种修饰包括核苷酸之间的硫代磷酸酯键。155.根据权利要求152到154中任一项所述的组合物，其中所述至少一种修饰包括所述向导rna的5'端处的前五个核苷酸中的一个或多个核苷酸处的修饰。156.根据权利要求152到155中任一项所述的组合物，其中所述至少一种修饰包括所述向导rna的3'端处的最后五个核苷酸中的一个或多个核苷酸处的修饰。157.根据权利要求152到156中任一项所述的组合物，其中所述至少一种修饰包括所述向导rna的5'端处的前四个核苷酸之间的硫代磷酸酯键。158.根据权利要求152到157中任一项所述的组合物，其中所述至少一种修饰包括所述向导rna的3'端处的最后四个核苷酸之间的硫代磷酸酯键。159.根据权利要求152到158中任一项所述的组合物，其中所述至少一种修饰包括所述向导rna的5'端处的前三个核苷酸处的经2'-o-甲基修饰的核苷酸。160.根据权利要求152到159中任一项所述的组合物，其中所述至少一种修饰包括所述向导rna的3'端处的最后三个核苷酸处的经2'-o-甲基修饰的核苷酸。161.根据权利要求152到160中任一项所述的组合物，其中所述至少一种修饰包括：(i)所述向导rna的5'端处的前四个核苷酸之间的硫代磷酸酯键；(ii)所述向导rna的3'端处的最后四个核苷酸之间的硫代磷酸酯键；(iii)所述向导rna的5'端处的前三个核苷酸处的经2'-o-甲基修饰的核苷酸；以及(iv)所述向导rna的3'端处的最后三个核苷酸处的经2'-o-甲基修饰的核苷酸。162.根据权利要求152到161中任一项所述的组合物，其中所述向导rna包括seq id no:44的经修饰的核苷酸。163.根据权利要求120到162中任一项所述的组合物，其中所述向导rna是单向导rna(sgrna)。164.根据权利要求163所述的组合物，其中所述向导rna包括seq id no:33-39和53中的任一个中所示的序列、基本上由其组成或由其组成。
165.根据权利要求120到161中任一项所述的组合物，其中所述向导rna是包括两个单独的rna分子的双向导rna(dgrna)，所述rna分子包括crispr rna(crrna)和反式激活crrna(tracrrna)。166.根据权利要求165所述的组合物，其中所述crrna包括seq id no:29和52中的任一个中所示的序列。167.根据权利要求165或166所述的组合物，其中所述tracrrna包括seq id no:30-32中的任一个中所示的序列。168.根据权利要求120到167中任一项所述的组合物，其中所述组合物与脂质纳米颗粒缔合，任选地其中所述组合物包括所述向导rna。169.根据权利要求120到167中任一项所述的组合物，其中所述编码所述向导rna的dna处于病毒载体中。170.根据权利要求169所述的组合物，其中所述病毒载体是腺相关病毒(aav)病毒载体。171.根据权利要求170所述的载体，其中所述aav选自由以下组成的组：aav2、aav5、aav8或aav7m8。172.根据权利要求120到171中任一项所述的组合物，其中所述组合物是包括药学上可接受的载体的药物组合物。173.根据权利要求120到172中任一项所述的组合物，其进一步包括第二向导rna或编码所述第二向导rna的dna，其中所述第二向导rna包括靶向所述rs1基因中的第二向导rna靶序列的dna靶向区段，并且其中所述第二向导rna与所述cas蛋白结合，并且将所述cas蛋白靶向到所述rs1基因中的所述第二向导rna靶序列。174.一种细胞，其包括根据权利要求108到173中任一项所述的组合物。175.一种细胞，其包括根据权利要求108到120和123到173中任一项所述的组合物。176.根据权利要求175所述的细胞，其中所述细胞在体外。177.根据权利要求175所述的细胞，其中所述细胞在体内。178.根据权利要求175到177中任一项所述的细胞，其中所述细胞是哺乳动物细胞。179.根据权利要求178所述的细胞，其中所述细胞是人细胞。180.根据权利要求175到179中任一项所述的细胞，其中所述细胞是视网膜细胞。181.根据权利要求175到180中任一项所述的细胞，其中所述细胞表达所述第一视网膜劈裂素蛋白或其片段或所述第二视网膜劈裂素蛋白或其片段。182.根据权利要求175到181中任一项所述的细胞，其中所述核酸构建体在基因组上整合在所述靶基因组基因座处。183.根据权利要求182所述的细胞，其中所述靶基因组基因座是内源性rs1基因座。184.根据权利要求182所述的细胞，其中所述核酸构建体在基因组上整合在所述内源性rs1基因座的内含子1中。185.根据权利要求184所述的细胞，其中内源性rs1外显子1剪接至所述核酸构建体的所述第一编码序列或所述第二编码序列中。186.根据权利要求185所述的细胞，其中包括在基因组上整合的核酸构建体的经修饰的rs1基因座编码包括与seq id no:2或4至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约
93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％相同的序列、基本上由其组成或由其组成的蛋白质。187.根据权利要求183到186中任一项所述的细胞，其中将所述核酸构建体整合到所述内源性rs1基因座中阻止整合位点下游的内源性rs1基因转录。188.根据权利要求187所述的细胞，其中所述将所述核酸构建体整合到所述内源性rs1基因座中减少或消除内源性视网膜劈裂素蛋白的表达，并且用由所述核酸构建体编码的所述视网膜劈裂素蛋白或其片段的表达替代所述内源性视网膜劈裂素蛋白的表达。189.根据权利要求187或188中任一项所述的细胞，其中所述内源性rs1基因座包括突变的rs1基因，所述突变的rs1基因包括引起x连锁青少年型视网膜劈裂症的突变，并且所述在基因组上整合的核酸构建体的表达降低或消除所述突变的rs1基因的表达。190.一种将视网膜劈裂素蛋白或其片段的编码序列整合到靶基因组基因座中并且在细胞中表达所述视网膜劈裂素蛋白或其片段的方法，所述方法包括将根据权利要求108到120和123到173中任一项所述的组合物施用于所述细胞，其中所述编码序列被整合到所述靶基因组基因座中，并且所述视网膜劈裂素蛋白或其片段在所述细胞中表达。191.根据权利要求190所述的方法，其中所述细胞是哺乳动物细胞。192.根据权利要求191所述的方法，其中所述细胞是人细胞。193.根据权利要求190到192中任一项所述的方法，其中所述细胞是视网膜细胞。194.根据权利要求190到193中任一项所述的方法，其中所述细胞在体外。195.根据权利要求190到193中任一项所述的方法，其中所述细胞在体内。196.根据权利要求195所述的方法，其中所述细胞是视网膜细胞，并且所述施用包括视网膜下注射或玻璃体内注射。197.一种治疗患有x连锁青少年型视网膜劈裂症的受试者的方法，所述方法包括将根据权利要求108到120和123到173中任一项所述的组合物施用于所述受试者，其中所述核酸构建体被整合到所述受试者的一个或多个视网膜细胞中的所述靶基因组基因座中并由所述靶基因组基因座表达，并且其中在所述受试者中实现了治疗有效水平的视网膜劈裂素表达。198.根据权利要求197所述的方法，其中所述受试者是人。199.根据权利要求197或198所述的方法，其中所述受试者具有内源性rs1基因，所述内源性rs1基因包括与x连锁青少年型视网膜劈裂症相关或引起x连锁青少年型视网膜劈裂症的至少一种突变。200.根据权利要求199所述的方法，其中所述突变是r141c突变。201.根据权利要求197到200中任一项所述的方法，其中所述施用包括视网膜下注射或玻璃体内注射。202.根据权利要求197到201中任一项所述的方法，其中所述核酸构建体的整合引起视网膜结构恢复。203.根据权利要求190到202中任一项所述的方法，其中所述核酸构建体和所述核酸酶药剂或所述编码所述核酸酶药剂的核酸是在不同的递送媒剂中施用的。204.根据权利要求190到202中任一项所述的方法，其中所述核酸构建体和所述核酸酶药剂或所述编码所述核酸酶药剂的核酸是在相同的递送媒剂中施用的。
205.根据权利要求190到204中任一项所述的方法，其中所述核酸构建体和所述核酸酶药剂或所述编码所述核酸酶药剂的核酸是同时施用的。206.根据权利要求190到203中任一项所述的方法，其中所述核酸构建体和所述核酸酶药剂或所述编码所述核酸酶药剂的核酸是以任何顺序依次施用的。207.根据权利要求206所述的方法，其中在所述核酸酶药剂或所述编码所述核酸酶药剂的核酸之前施用所述核酸构建体。208.根据权利要求206所述的方法，其中在所述核酸酶药剂或所述编码所述核酸酶药剂的核酸之后施用所述核酸构建体。209.根据权利要求207或208所述的方法，其中连续施用之间的时间为约2小时到约48小时。210.根据权利要求190到209中任一项所述的方法，其中所述靶基因组基因座处于内源性rs1基因中。211.根据权利要求210所述的方法，其中所述靶基因组基因座中的所述核酸酶靶序列处于所述内源性rs1基因中的第一内含子中。212.根据权利要求211所述的方法，其中所述核酸构建体在基因组上整合在所述内源性rs1基因座的内含子1中，并且其中内源性rs1外显子1剪接至所述核酸构建体中的所述视网膜劈裂素蛋白或其片段的所述编码序列中。213.根据权利要求212所述的方法，其中包括在基因组上整合的核酸构建体的经修饰的rs1基因座编码包括与seq id no:2或4至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％相同的序列、基本上由其组成或由其组成的蛋白质。214.根据权利要求210到213中任一项所述的方法，其中将所述核酸构建体整合到所述内源性rs1基因座中阻止整合位点下游的内源性rs1基因转录。215.根据权利要求214所述的方法，其中所述将所述核酸构建体整合到所述内源性rs1基因座中减少或消除来自所述内源性rs1基因座的内源性视网膜劈裂素蛋白的表达，并且用由所述核酸构建体编码的所述视网膜劈裂素蛋白或其片段的表达替代所述内源性视网膜劈裂素蛋白的表达。216.一种修饰细胞中的rs1基因的方法，所述方法包括将根据权利要求122到173中任一项所述的组合物施用于所述细胞，其中所述向导rna与所述cas蛋白结合，并且将所述cas蛋白靶向到所述rs1基因中的所述向导rna靶序列，并且所述cas蛋白切割所述向导rna靶序列。217.根据权利要求216所述的方法，其中所述细胞是哺乳动物细胞。218.根据权利要求217所述的方法，其中所述细胞是人细胞。219.根据权利要求216到218中任一项所述的方法，其中所述细胞是视网膜细胞。220.根据权利要求216到219中任一项所述的方法，其中所述细胞在体外。221.根据权利要求216到219中任一项所述的方法，其中所述细胞在体内。222.根据权利要求221所述的方法，其中所述细胞是视网膜细胞，并且所述施用包括视网膜下注射或玻璃体内注射。223.根据权利要求216到222中任一项所述的方法，其中所述向导rna靶序列处于所述
rs1基因中的第一内含子中。

技术总结
提供了允许插入和/或表达视网膜劈裂素编码序列的核酸构建体和组合物。提供了靶向RS1基因座的核酸酶药剂。还提供了使用用于整合到靶基因组基因座中和/或在细胞中表达的此类构建体的组合物和方法。还提供了使用所述核酸构建体和所述组合物治疗X连锁青少年型视网膜劈裂症的方法。裂症的方法。裂症的方法。


技术研发人员：查琳
受保护的技术使用者：瑞泽恩制药公司
技术研发日：2020.11.07
技术公布日：2022/7/12