以新型核酸为基础的流感疫苗组合物的制作方法

1.本发明涉及一种以具有佐剂和抗原捕获双重功能的新型核糖核酸为基础的流感疫苗组合物。
2.具体地，本发明针对在新型混合结构核糖核酸(hsrna)的佐剂中含有流感抗原的疫苗组合物及其预防或治疗流感病毒感染的用途进行描述。所述新型混合结构核糖核酸(hsrna)是通过体内脾脏树突状细胞活化试验来选择的，其可以定义为特定的长度或序列。在将流感抗原，例如流感全病毒抗原或表面抗原负载到所述混合结构核糖核酸的疫苗组合物施用于体内(例如，通过鼻腔传递)时，可以有效防止因致命性感染而导致的个体死亡。


背景技术：

3.a)流感病毒
4.流感病毒(iv)属于正黏液病毒科(orthomyxoviridae family)，是一种由表达10至13种蛋白质的单负链的8个rna区段组成的病毒(single-stranded,negative-sense rna virus)。其根据附着在病毒表面的结构蛋白质，即核抗原(np，nucleoprotein)，和基质(m，matrix)蛋白质引起的抗原性，分为甲(a)型、乙(b)型以及丙(c)型，已知甲(a)型和乙(b)型主要对人类具有致病性。甲(a)型不仅可以感染人类，还可以感染猪和鸟类。乙(b)型唯一的宿主是人类。
5.流感病毒由两种表面糖蛋白(表面抗原)，即血凝素(hemagglutinin)和神经氨酸酶(neuraminidase)组成。根据与宿主细胞的受体(唾液酸，sialic acid)结合的抗原性突起即血凝素(hemmaglutinin)以及为了使与唾液酸结合的病毒游离到细胞内而切割唾液酸的神经氨酸酶的种类与组合，流感病毒分为各个亚型(subtype)。所述亚型主要以甲(a)型流感为中心来进行区分，目前已发现从h1至h18的18种血凝素与从n1至n11的11种神经氨酸酶，当进行组合时理论上能够组合198种亚型甲(a)型流感。乙(b)型流感病毒根据抗原类型分为维多利亚(victoria)和山形(yamagata)两个系。
6.如rna病毒的典型特征，流感具有抗原性变异几乎每年略微发生或剧烈发生的特征。由于以甲(a)型和乙(b)型流感为中心，几乎每年都会发生抗原性漂移(antigenic drift)，因此成为季节性流行(seasonal epidemic)流感的原因。因此，世界卫生组织(who)综合病毒流行信息后，于每年的2月左右决定该年度季节的疫苗推荐毒株并予以公布。抗原性漂移(antigenic drift)为同一亚型内的点突变(point mutation)，是通过轻微的抗原性变异，被抗原性略微改变的新的血凝素或神经氨酸酶取代的现象，抗原性转变(antigenic shift)则是像h3n2
→
h2n2一样，通过改变亚型产生新的病毒。除所述两种变异之外，由于在含胚卵(embryonated egg)中培养时可能发生变异，因而有可能导致抗原性差异，但在细胞培养中未发现所述变异，因此优选使用在哺乳动物细胞中培养的病毒的疫苗。
7.在血凝素和神经氨酸酶表面抗原中，尤其对血凝素的免疫与流感预防、疾病的严重程度相关联。因此，流感疫苗最重要的构成要素是血凝素，对此在体内生成的中和抗体对预防流感病毒感染起到决定性作用。
8.1918年甲(a)型人类流感病毒(h1n1)从鸟类传播到人类和猪而引起大流行，1957年出现人类甲(a)型流感(h2n2)。1977年人类甲(a)型流感(h1n1)再次出现，与1968年出现的人类甲(a)型流感(h3n2)一同成为引起季节性流感的主要病毒。2009年4月以来在全世界流行的新型流感病毒(pandemic influenza h1n1 2009)是通过基因重组发生抗原性转变而新产生的流感病毒。
9.b)流感疫苗
10.由于抗原性漂移和效果持续时间不足一年，流感疫苗需要每年接种。考虑到流感流行期(12月至次年4月)和疫苗接种效果持续时间(平均6个月)，疫苗接种推荐时间指定为每年10月至12月。
11.目前的流感疫苗有灭活死疫苗和减毒活疫苗(laiv，live attenuated influenza vaccine)，(灭活)死疫苗通过福尔马林等灭活在受精蛋(孵化蛋)中培养的病毒来制成，或是在细胞培养中繁殖病毒并灭活从而获得表面抗原，并作为疫苗抗原注射到肌肉(i.m.)内。活疫苗通过向鼻腔内喷射施用。
12.死疫苗有使用整个病毒的全病毒疫苗(whole virus vaccine)，用乙醚等分离病毒包膜(envelope)的裂解疫苗(split vaccine，subvirion)，以及纯化血凝素和神经氨酸酶成分的亚单位疫苗(subunit vaccine)等。血凝素和神经氨酸酶是直接诱导中和抗体应答的抗原，并且血凝素是主要的中和抗原。由于全病毒疫苗会对儿童引起副作用，因此目前包括韩国在内的世界各地都不太使用全病毒疫苗，而实际上仅在一些国家使用。与此相反，裂解疫苗或亚单位疫苗等成分疫苗非常安全且效果得到认可，因此其使用率最高。
13.另外，为了增强免疫应答，包括mf-59等免疫增强剂(佐剂)的疫苗或形成类似于病毒形状的囊泡的virosome疫苗等被研发，并在部分国家使用。特别地，出于预防或治疗目的，如要针对流感病毒感染提供充分的保护性免疫功能，需要将强有力和安全的佐剂包括在疫苗中。
14.通过自然感染或疫苗获得的针对特定亚型或流感病毒的抗体，绝大部分无法对其它型或亚型的流感病毒形成保护抗体，并且存在对一种抗原内的新的变异(variant)也无法显示出足够免疫原性的问题。
15.由于流感病毒每年都会引起大大小小的变异，每年的流行株都会发生变化，因此很难期待上一年接种的疫苗带来的保护效果，因而需要每年接种。
16.以流感死疫苗为例，在研发阶段对小鼠进行免疫以评估新的候选疫苗物质，然后用病毒攻击通过存活率来评估候选疫苗的有效性和效价，但实际上在疫苗包括的各种疫苗蛋白质抗原中，主要通过ha(血凝素)的含量来评估效价。目前，通常主要以每个亚型包括15ug的ha来制备。疫苗的效力试验资料通过对易感动物免疫后的攻击试验(challenge test)来获得。需要提交可以确认防御性的资料或与此同等的能够确认防御性的资料。
17.在疫苗的非临床免疫原性研究当中，应评价在接种的实验动物中诱导的体液免疫和细胞介导免疫等适当的免疫反应。评估根据诱导的免疫应答，通过血清转阳率(seroconversion)、抗体的几何平均滴度(gmt，geometric mean titer)或细胞介导免疫等进行。流感疫苗的非临床免疫原性检测主要在实验动物中通过血球凝集抑制(hi，hemagglutinination inhibition)抗体(效)价来评估。即，已知接种死疫苗后血清的hi抗体效价大于或等于1:40，感染流感的风险就会下降，但这不是绝对的。已提出当hi的抗体效
价为1：15至1：65时，可以预防50％受试者的疾病，并且效价增加时预防率也会增加(hobson d et al,journal of hygiene 70:767-777,1972)(de jong jc et al,developmental biology.115:63-73,2003)。利用转阳率和gmt作为检测疫苗效价的方法。(committee for proprietary medicinal products(cpmp).note for guidance on harmonisation of requirements for influenza vaccines.cpmp/bwp/214/96.the european agency for the evaluation of medicinal products(emea),march 1997)(treanor j et al,vaccine.20:1099-1105,2002)。此外，也应评估与免疫应答的功能有关的中和抗体价，并且以减毒活疫苗为例，也需要针对粘膜的分泌型抗体、细胞介导免疫等进行评估。流感活疫苗在接种后生成的免疫应答方面，可能与死疫苗存在很大的差异。因为与死疫苗相比活疫苗的血清hi抗体价低，但分泌到黏膜的分泌型抗体和细胞介导免疫反应却被诱导得更多。因此，无法通过接种后生成的hi抗体价来预测疫苗的功效。
18.由于目前使用的季节性流感疫苗仅对疫苗中使用的毒株提供保护性免疫，因此需要研发能够对各种亚型提供足够程度的交叉保护性免疫的既经济又有效的流感疫苗。为了研发具有交叉免疫功能的通用疫苗，需要使用抗原变异最小的抗原或刺激黏膜免疫的方法。也存在将具有低抗原变异的ha的一个或多个ha2结构域重叠后用作疫苗抗原的情况(韩国注册专利10-1637955)。
19.c)流感黏膜疫苗
20.向肠胃外、鼻腔内施用的疫苗穿透到下呼吸道，通过诱导抗-血凝素igg抗体来起作用。黏膜免疫的关键抗体iga和血清igg均参与对流感病毒的免疫，尤其是通过鼻腔刺激黏膜免疫可以有效预防上气道感染(clements m.l.et al,j.clinical microbiology 24,157～160,1986)。尤其是在小鼠中，呼吸道iga对防御流感感染方面起到重要作用。刺激局部呼吸道iga对流感的应答的优点在于，局部呼吸道iga应答比血清反应显示出范围更广的保护性免疫，因而对具有疫苗抗原和其它血凝素分子的病毒也可以提供交叉-防御能力。因此，在局部分泌器官和血清中均诱导抗-血凝素应答的流感疫苗会提供比现有疫苗更优异的免疫。与此相反，肠胃外疫苗注射(肌内注射、皮下注射等)如果没有另外的黏膜暴露(即，感染)，对诱导局部抗体生成是无效的。即，为了刺激黏膜的免疫系统必须将疫苗局部适用于黏膜表面。
21.相比于属于传统肠胃外方法的肌肉内、皮下或静脉内施用，诸如鼻腔内喷射或点滴等通过黏膜施用流感疫苗所带来的优点中最值得注意的是，其更有效刺激呼吸系统的局部黏膜免疫系统，以及不受限于对针头的排斥和不安心理，从而能够提高接种率。实际上，相比于将活疫苗或减毒疫苗施用于肌肉内，在将具有低免疫原性的灭活疫苗施用于人体黏膜内时，反而会诱导强烈的抗体应答并提供保护性免疫(kuno-sakai et al,vaccine 12:1303～1310,1994)。但是，上述论文中提出的黏膜内施用方法存在缺点，即其对患者的用量是肌肉内施用时的3倍，因此未能实现商业化利用。
22.为了克服上述问题，曾有过通过口服或鼻腔内施用并提高流感疫苗免疫原性的其它尝试，例如，使用霍乱毒素(ctb)b亚基(tamura s.et al,vaccine 6:409,1988)，将疫苗抗原封装在各种微粒中(moldoveanu z et al,j.inf.dis.167:85-90.1993)，或使用减毒后的活菌株(maassab h.f.et al,vaccine,plotkin s.a.and mortimer f.a.jr.(eds)w.b.saunder philadelphia p435,1993)的方法。但是，通过将流感疫苗施用于感染途径的
黏膜来增强免疫原性的实用方法，迄今为止还未能研发。
23.d)疫苗与佐剂
24.疫苗或免疫接种是预防或治疗各种疾病的最有效的手段，但是仍然存在需要克服的问题。即，大部分疫苗有时无法有效提供保护性免疫，并且需要多次接种许多疫苗，而且疫苗效果会随着时间流逝而降低，因此需要另外再次接种。
25.佐剂或免疫增强剂大体上是其本身不足以诱导抗体生成或细胞应答的物质，包括增强抗原免疫原性的单一或混合化合物或活剂。与此不同，部分佐剂为了降低免疫原性和副作用而构成。总而言之，佐剂通过各种方式提供适度强有力和持续坚固的抗原特异性增强免疫应答，例如，可以促进向免疫系统的抗原呈递，减少抗原需求量，以及提供避免多次注射的额外优点。
26.先天免疫细胞识别入侵的传染性病原体或疫苗接种抗原中存在的异常模式或危险信号，将其传递到适应性免疫系统。根据模式的水平和特异性放大适应性应答固有的质和量的信号，其证明了先天免疫在适应性免疫应答中的重要性。佐剂疫苗组合物是预防或治疗疾病的最有效和最具成本效益的方法之一。
27.为了有效研发有针对性的疫苗，更强有力和安全的佐剂应包括在疫苗组合物中。所述新的佐剂提供诸多优点，例如对各种抗原的范围广的应答，有效诱导体液和细胞免疫应答，中和以及特别是杀死病原菌。另外，佐剂疫苗中的佐剂可以有助于减少抗原需求量，并在衰老过程中提供交叉防御和长期持久的免疫应答。
28.e)在先天免疫中作为tlr3配体的双链核糖核酸
29.树突状细胞来源于造血髓系祖细胞，初期分化为未成熟的树突状细胞，其特点是较高的内吞作用活动与低水平的t细胞活化能力。未成熟的树突状细胞持续观察存在病毒和细菌的周边环境，其通过等同于tlr的模式识别受体(prr；pattern recognition receptor)来实现。双链核糖核酸对病毒感染和单链核糖核酸的致病性或异常核糖核酸可以成为危险信号。tlr识别在病原体集中发现的特定化学标识，当树突状细胞遇到抗原时，其激活为成熟的树突状细胞并开始移动到淋巴结。未成熟的树突状细胞吞噬病原菌，并在成熟后使用主要组织相容性抗原(mhc；major histocompability antigen)分子，将其片段呈递到自体细胞表面。同时，在自体细胞上大大增强了激活t细胞的cd80(b7.1)、cd86(b7.2)以及cd40等t细胞激活共刺激因子的表达。树突状细胞还上调ccr7，该物质是一种诱导树突状细胞移动到脾脏或淋巴结的物质。此时，树突状细胞充当抗原呈递细胞的作用而呈递抗原，并激活辅助性t细胞、杀手t细胞以及b细胞。
30.如上所述，树突状细胞在先天免疫和适应性免疫应答中发挥重要作用，而这是因为具有共刺激因子的表达增加、促炎细胞因子的生成以及抗原呈递特征的树突状细胞(dc)的成熟。树突状细胞的其它子集显示出不同的特殊功能，cd8α阳性的经典树突状细胞(cdcs)具有通过mhcⅰ类交叉呈递细胞内抗原的选择性能力。这种功能对于生成针对病毒抗原或从坏死过程中的细胞的核抗原的ctl很重要。相比之下，细胞外抗原被捕获并转移到cd8α阴性cdc的内体/溶酶体进而被分解成抗原肽，与mhcⅱ类分子复合并被cd4t细胞识别。在树突状细胞成熟期间，加载有抗原的树突状细胞自发地移动到次级淋巴结并获得刺激t细胞的能力。所述树突状细胞生成促炎细胞因子，其对生成特定类型细胞因子的cd4辅助性t细胞和cd8 ctl的诱导起到决定性影响。
31.为了在肿瘤疫苗中诱导肿瘤抗原特异性ctl的激活，肿瘤抗原需被cd8α阳性树突状细胞交叉呈递。另外，需要被成熟的cd8α阴性树突状细胞诱导的cd4 t细胞的激活。作为小鼠脾脏中主要群体的cd8α阴性cdcs具有将细胞外抗原直接呈递给cd4 t细胞的选择性能力。在感染或免疫部位，病原体衍生物质或免疫增强剂激活树突状细胞从而诱导共刺激因子和细胞因子的表达，它们与mhc-抗原络合物一同作用，将cognate t细胞分化为抗原特异性ctl和辅助性t细胞。
32.tlr3在髓样树突状细胞(mdcs)、b细胞、单核细胞衍生的巨噬细胞以及许多肿瘤组织的内体分区中正常表达，并在感染的细胞中检测作为病毒感染或复制特征的病毒的双链核糖核酸。双链核糖核酸被tlr3、mda-5以及nlrp3识别后，刺激ⅰ型干扰素和促炎细胞因子。当mdc被激活为成熟的抗原呈递细胞(mapc)时，抗原表位被加载到mhc-1分子上呈递给天然τ细胞。被tlr3酶激活的树突状细胞不仅有助于诱导针对微生物病原体的先天免疫应答和适应性免疫应答，还刺激抗肿瘤cd8 t细胞从而促进自然杀伤(nk)细胞的激活与肿瘤细胞的死亡。
33.f)在先天免疫中作为tlr7配体的单链核糖核酸
34.包括(优选富含)鸟苷(g)和尿苷(u)的单链核糖核酸寡核苷酸可以源自侵入的病原体，该核苷酸刺激树突状细胞和巨噬细胞分泌干扰素α、促炎细胞因子以及调节因子。发现其被tlr7和tlr8识别。tlr7检测单链核糖核酸并通过nf-kappa-b激活、细胞因子分泌以及先天免疫中的myd88和traf6来诱导炎症反应。与tlr3和tlr9非常相似地，tlr7和tlr8也通常在内体的膜上表达。另外，tlr7对化学配体(例如，咪唑并喹啉)应答。晶体结构研究表明，tlr7是对含有鸟苷和尿苷的单链核糖核酸的双重受体。保守在tlr7中的配体结合第一区域用于小配体结合，第二区域用于单链核糖核酸结合。已知第一区域优先检测鸟苷，第二区域与单链核糖核酸的尿苷部分特异性结合。
35.由于目前的季节性流感疫苗仅对疫苗中使用的毒株提供保护性免疫，因此需要研发能够对各种亚型提供足够程度的交叉保护性免疫的既经济又有效的流感疫苗。
36.为了研发具有交叉免疫功能的通用疫苗，需要使用抗原变异最小的抗原或刺激粘膜免疫的方法。也存在将具有低抗原变异的ha的一个或多个ha2结构域重叠后用作疫苗抗原的情况(韩国注册专利10-1637955)。
37.【现有技术文献】
38.【专利文献】
39.(专利文献1)韩国注册专利10-1637955


技术实现要素：

40.技术问题
41.本发明的目的在于提供一种具有通用性增强的流感疫苗。
42.由于目前的季节性流感疫苗仅对疫苗中使用的毒株提供保护性免疫，因此需要研发能够对各种亚型提供足够程度的交叉保护性免疫的既经济又有效的流感疫苗。
43.本发明的目的在于提供一种新型流感通用疫苗，其不仅可以针对疫苗使用的抗原相同的亚型，还可以针对其它各种亚型的甲(a)型流感病毒提供保护性免疫，因此能够应对新型变体流感的出现。
44.技术方案
45.本发明提供一种作为佐剂以新型混合结构核糖核酸(hsrna)为基础的预防或治疗流感病毒感染的疫苗组合物。
46.具体地，本发明的特征在于，提供一种灭活流感病毒的全病毒或表面抗原负载到具有新型结构的hsrna的疫苗与药物组合物，从而提供不仅针对同源病毒还针对异源亚型病毒的保护性免疫。特别地，本发明的疫苗组合物尤其在施用于鼻腔内时，显示出强有力和安全的防御效果。
47.所述混合结构核糖核酸(hsrna)是通过体内脾脏树突状细胞活化试验来选择的，其可以定义为特定的长度或序列。在将流感抗原，例如流感全病毒或表面抗原负载到所述新型混合结构核糖核酸(hsrna)的疫苗组合物施用于体内(例如，施用于鼻腔内)时，可以有效防止因致命性感染而导致的个体死亡。
48.在一实施方案中，本发明提供一种用于预防或治疗流感甲(a)型病毒感染的疫苗组合物，其特征在于，包括双链核糖核酸(dsrna)和单链核糖核酸(ssrna)的混合结构核糖核酸(hsrna)；以及人类流感甲(a)型抗原，其中，所述双链核糖核酸(dsrna)具有互补性，所述单链核糖核酸(ssrna)分别位于所述双链核糖核酸(dsrna)的两侧3'-末端，所述混合结构核糖核酸(hsrna)通过由seq id no：1的碱基序列和seq id no：2的碱基序列互补性结合的结果而形成。所述混合结构核糖核酸(hsrna)具有533的碱基长，在此也以简称“na”来使用。
49.所述双链核糖核酸(dsrna)可以具有424bp的碱基长和seq id no：3的碱基序列。
50.本发明中选择的核糖核酸表现出强有力的黏膜免疫激活。在将本发明的混合结构核糖核酸作为常规的施用途径，例如作为经鼻腔喷射的疫苗佐剂时，可以针对同源和异源亚型病毒获得强有力的交叉保护性免疫效果。
51.本发明的疫苗组合物可以通过鼻腔内施用来施用于黏膜。此时，所述核糖核酸发挥强有力和安全的免疫增强剂(佐剂)作用。
52.所述人类流感甲(a)型抗原可以是流感全病毒(whole virus)或表面抗原。在一实施方案中，所述人类流感抗原可以是(
ⅰ
)灭活或活的减毒流感全病毒(whole virus)；或(
ⅱ
)将部分或全部血凝素或神经氨酸酶作为表面抗原，并且所述血凝素或神经氨酸酶可以是从全病毒繁殖溶液中提取或以重组方式表达和纯化的。
53.本发明的疫苗组合物的特征在于，除了针对人类流感抗原的同源(homotypic)流感病毒之外，还针对异源亚型(heterosubtypic)病毒表现出保护性免疫效果。尤其是，向鼻腔内传递时实现了强有力和安全的防御效果。
54.在一实施方案中，本发明提供一种用于预防或治疗流感甲(a)型h1n1或h3n2病毒感染的疫苗组合物，其特征在于，所述人类流感甲(a)型抗原是人类流感甲(a)型抗原(h1n1)。
55.在具体的实施例中，将复合或掺入到本发明的混合结构核糖核酸佐剂的灭活a/h1n1流感病毒(iv)疫苗施用于鼻腔内(i.n.)途径时，可以预防个体因达到致死剂量的同源a/h1n1 iv的感染而死亡。在另一实施例中，也通过鼻腔接种相同的疫苗时，可以预防个体因达到致死剂量的亚型(例如，a/h3n2)的感染而死亡。
56.有益效果
57.本发明的将抗原(ag)负载到混合结构核糖核酸(hsrna)上的疫苗组合物，不仅刺激强烈的先天免疫，还能有效地将抗原络合物传递到抗原呈递细胞中，因而将抗原有效呈递到t细胞和b细胞，从而可以增强特异性适应性免疫。由此，本发明的疫苗组合物仅通过在鼻腔内喷射一次就可以均有效防御同源流感病毒和异源流感病毒的感染，从而可以诱导有益的交叉防御免疫。
附图说明
58.图1示出根据实施例1，将na复合的灭活a/h1n1流感病毒(iiv)(ipr8)疫苗(rna-conjugated vaccine)在鼻腔内(i.n.)施用一次后，当接种达到致死剂量的同源活流感病毒(liv)(pr8)时所证实的所述疫苗的100％防御效果。
59.图1a示出实验计划。
60.图1b示出小鼠接种病毒后的体重变化。
61.图1c示出接种病毒后到第11天的存活率(％)。
62.图2示出根据实施例2，将na复合的灭活a/h1n1流感病毒(iiv)(ipr8)疫苗(rna-conjugated vaccine)在鼻腔内(i.n.)施用一次后，当接种达到致死剂量的异源亚型(a/h3n2)活流感病毒时所证实的所述疫苗的防御效果。
63.图2a示出实验计划。
64.图2b示出接种病毒后到第14天的存活率(％)。
65.最佳模式
66.下面，将通过实施例详细描述本发明，以有助于对本发明的理解。但是，以下实施例仅用于示例性提出本发明的内容，本发明的范围并不受限于以下实施例。对所属领域的技术人员来说，在本发明的范畴和技术范围内可以进行各种变换和修改是显而易见的，理所当然地，所述变换和修改属于所附权利要求。
67.【实施例1】
68.通过本发明的na复合(adjuvanted)的灭活流感(ipr8)疫苗的鼻腔内施用来确认保护性免疫效果(图1)
69.在本实施例中，将na(本发明中提出的具有特定长度和序列的核糖核酸抗原)复合的灭活a/h1n1流感病毒(ⅱv)(ipr8)疫苗(rna-conjugated vaccine)施用于鼻腔内，确认了所述疫苗对同源病毒感染致死性的保护性免疫效果。
70.根据表1和图1a所示的施用计划，将每个物质施用于小鼠。具体地，麻醉雌性balb/c小鼠(7周龄、各5只)后，用pbs(50μl)、0.5μg ipr8
±
5μg na、0.5μg ipr8 5μg poly(i:c)向鼻腔施用1次。3周后，以致死剂量100倍的量(100mld
50
)，将小鼠适应性活流感病毒pr8(a/h1n1)接种于小鼠。监测小鼠的体重变化(％)和存活率(％)，一直到接种后的第11天。结果示于图1b和图1c。
71.【表1】
[0072][0073]
如图1b和图1c所示，在仅预先施用pbs后接种pr8时(对照组1)，到接种后的第7天100％死亡，与此相反，根据预先施用ipr8 na后接种pr8的本发明的实验组存活了100％，并且体重增加率也在第11天恢复到几乎100％。在仅预先施用ipr8后接种pr8时(对照组2)只有40％存活了下来，并且存活的小鼠的体重增加率也减少。在预先施用ipr8 poly(i：c)后接种pr8时(对照组3)只有80％存活了下来，并且存活的小鼠的体重增加率也略微减少。
[0074]
通过上述结果可以证实，在将na复合的灭活流感(ipr8)疫苗向鼻腔内施用一次时，即使接种致死剂量的同源活流感病毒也保护所有(100％)小鼠，并且证实本发明的na复合的疫苗提供完全的保护性免疫。进一步地，证实na比poly(i：c)提供更优异的保护性免疫。
[0075]
【实施例2】
[0076]
针对本发明的na复合(adjuvanted)的灭活流感(ipr8)疫苗的鼻腔内施用所提供的异源亚型病毒的交叉保护性免疫效果(图2)
[0077]
在本实施例中，试验本发明的na复合的灭活a/h1n1流感病毒(iiv)(ipr8)疫苗(rna-conjugated vaccine)是否可以针对异源亚型菌株提供交叉保护性免疫。
[0078]
根据表2和图2a所示的施用计划，将每个物质施用于小鼠。具体地，麻醉雌性balb/c小鼠(7周龄、各5只)后，用pbs(50μl)或0.1至5μg na 0.5μg ipr8 20μl向鼻腔施用1次。3周后，以50mld
50
的量，将小鼠适应性活流感病毒a/hong kong/8/68(a/h3n2)接种于小鼠。监测小鼠的存活率(％)，一直到接种后的第14天。结果示于表2和图2b。
[0079]
【表2】
[0080] 施用物质是否接种a/h3n2存活率(第14天)正常对照组pbs(50ul)-100％对照组pbs(50ul)接种30％实验组1ipr8(0.5μg) na(0.5μg)接种60％实验组2ipr8(0.5μg) na(2.5μg)接种60％实验组3ipr8(0.5μg) na(5μg)接种100％
[0081]
如表2和图2b所示，ipr8 na组合针对异源亚型流感病毒a/h3n2也显示出了交叉保护性免疫效果。特别地，含有5μg na的疫苗显示出100％的防御效果。