一种利用双光信号比率传感器体系检测食品中龙葵素的方法

1.本发明属于生物碱毒素检测技术领域，具体涉及一种利用双光信号比率传感器体系检测食品中龙葵素的方法。


背景技术：

2.龙葵素是一种广泛存在于马铃薯、番茄和茄子等茄科植物中的弱碱性糖苷生物碱，是植物为抵御病虫、动物、微生物生物胁迫和干旱、冷害等非生物胁迫而合成的次生代谢产物，主要包含α-茄碱和α-卡茄碱，约占总龙葵素含量的95％左右。龙葵素又称马铃薯毒素，研究表明，当含量低于10mg/100g时，龙葵素会对鲜薯风味产生积极影响；一旦其含量超过14mg/100g，会导致马铃薯产生苦味等不利风味。在存储和运输过程中，绿皮与发芽的马铃薯个体中龙葵素含量剧增，当龙葵素的含量超过20mg/100g时食用后会引起急性中毒，严重者更会有致畸或死亡的危险。龙葵素的致毒机理是抑制体内胆碱酯酶的活性，胆碱酯酶催化神经递质乙酰胆碱水解，生成胆碱和乙酸。该酶被抑制失活后，造成乙酰胆碱积累，而胆碱会使神经兴奋增强，引起胃肠肌肉痉挛等一系列中毒症状。
3.现阶段对龙葵素的检测主要分为传统方法、化学方法以及无损检测方法。传统方法主要凭借人工剔除明显变绿及发芽的个体，费时费力；常用的化学检测方法分为比色法、酶联免疫法(elisa)、高效液相色谱法(hplc)等。比色法准确度低，难以应用于高灵敏度定量分析；elisa灵敏度高，特异性强，但缺少特异抗体；hplc灵敏度高和回收率好，但操作繁杂、耗时，不能被广泛使用。常用的无损检测方法主要包括近红外检测和机器视觉，如发明专利cn103394472a，开发了一种基于色调值判别法对表皮发绿的马铃薯进行检测分级的方法。此检测方法与人工检测相比虽然提高了检测速度，但其仅依据马铃薯外部颜色特征进行划分，未测定样本内部龙葵素含量，不能进一步确定样本是否可食。因此探索一种准确性好、灵敏度高，以龙葵素含量为判定依据的快速检测方法变得尤为重要。


技术实现要素：

4.为了克服现有检测技术的不足，本发明提供了一种利用双光信号比率传感器检测食品中龙葵素的方法，实现食品中龙葵素的快速与准确检测。
5.为了实现上述技术目的，本发明的具体步骤如下：
6.步骤一：在一定温度下，取乙酰胆碱酯酶(ache)、乙酰硫代胆碱(atch)、mno2纳米片、荧光碳量子点(cds)和超纯水混合均匀，静置孵育一段时间后得到的溶液记为溶液a；
7.步骤二：制备不同浓度的龙葵素标准溶液，分别与步骤一制备的溶液a混合均匀得到混合溶液，然后经静置孵育后，依次在激发波长λ条件下检测混合溶液在波长λ_1处的荧光信号，记为f，以及在波长λ_2处的二阶散射信号，记为s，并计算其峰值强度i＝f/s；以龙葵素标准溶液的浓度为横坐标，以相对应的峰值强度为纵坐标，建立龙葵素含量与峰值强度间的标准曲线；所述激发波长λ为310～380nm，波长λ_1为390～500nm内，波长λ_2为680～750nm；
8.步骤三：取待测品样品，经预处理后得到提取液，记为待测样品液；在待测样品液中添加步骤一中制备的溶液a，混合均匀得到混合溶液，静置孵育后在激发波长λ条件下检测混合溶液在波长λ_1处的荧光信号f及在波长λ_2处的二阶散射信号s，并计算其峰值强度，代入步骤二中构建的标准曲线，即可实现未知样品中龙葵素含量的检测；所述激发波长λ为310～380nm，波长λ_1为390～500nm内，波长λ_2为680～750nm。
9.优选的，步骤一中，所述溶液a中mno2纳米片的浓度为10～500mg/l，乙酰硫代胆碱(atch)的浓度为1～30mm，乙酰胆碱酯酶(ache)的浓度为1.00～1100.00u/l，荧光碳量子点的浓度为10mg/l。
10.更优选的，步骤一中，所述atch的浓度为20mm；所述mno2纳米片的浓度为300mg/l；所述ache浓度为700.00u/l。
11.优选的，步骤一中，所述一定温度为15～40℃，所述静置孵育一段时间为10～60min；所述溶液a的ph为7～8。
12.更优选的，步骤一中，所述一定温度为35℃，孵育时间为40min。
13.优选的，步骤二中，所述龙葵素标准溶液中龙葵素的终浓度为1～800μg/l。
14.优选的，步骤二中，所述标准溶液与溶液a的体积比为1:6～8；所述静置孵育的时间为10～60min。
15.优选的，步骤三中，所述待测样品液与溶液a的体积比为1:6～8；所述孵育一段时间为10～60min。
16.此外，本发明还提供了一种mno2纳米片及cds的制备方法，具体步骤如下：
17.s1、制备具有荧光猝灭和光散射能力的mno2纳米片，其具体步骤如下:
18.s1.1：将十二烷基苯磺酸钠、硫酸、无水乙醇溶于超纯水中，加热搅拌后加入高锰酸钾溶液，经反应后得到红棕色溶液b；
19.s1.2：待溶液b冷却至室温，离心后弃上清液，使用超纯水和乙醇反复多次洗脱沉淀物；经洗脱后的沉淀物即为mno2纳米片；
20.上述s1.1中，所述十二烷基苯磺酸钠、硫酸、无水乙醇的质量比为10：1：150；所述十二烷基苯磺酸钠、硫酸、无水乙醇的总体积与超纯水的体积比为1：2～4；所述加热温度为70～110℃，加热搅拌时间为10～40min；所述；反应的时间为20～60min。
21.上述s1.2中，所述离心的具体条件为：转速8000～10000rpm，离心5～20min；所述超纯水和乙醇洗脱沉淀物次数为三次；所述mno2纳米片的激发波长w1在330～390nm内，二阶散射信号在700～800nm之间；所述保存温度为4℃。
22.s2、制备具有优异荧光性能的cds，其具体步骤如下：
23.s2.1：将碳源溶于超纯水中，混合搅拌均匀后转移至对位聚苯酚(ppl)内衬高压反应釜中，加热至160～280℃，保温5～15h，待反应结束后将溶液冷却至室温，得到含热解产物的溶液c。
24.s2.2：将溶液c进行离心，取上清液，接着过滤得到透明淡黄色溶液即为cds原液。
25.上述s2.1中，所述碳源为柠檬酸铵，其与超纯水的质量比为1：50；所述混合搅拌的时间为10～20min；所述加热温度为220～260℃，保温8～12h。
26.上述s2.2中，所述离心的具体条件为：转速8000～10000rpm，离心5～20min；所述过滤优选使用0.22μm孔径的微孔过滤膜进行过滤；所述cds的激发波长λ在310～380nm内，
发射波长在可见光范围内且对mno2纳米片有荧光响应；所述保存温度为4℃。
27.本发明的有益效果：
28.(1)由于优异的光吸收性能和更大的尺寸，本发明制备的mno2纳米片具有二阶散射信号供体和cds荧光信号猝灭剂的双重作用。ache催化水解atch获得的硫代胆碱(tch)可以将mno2纳米片还原为mn
2
，导致荧光信号增强和二阶散射信号猝灭。而龙葵素对ache具有抑制作用，当龙葵素存在时，ache的活性被抑制，tch减少，导致荧光信号猝灭和二阶散射信号增强。基于荧光和二阶散射双重信号的相反响应，本发明实现了龙葵素含量的比率传感分析。
29.(2)龙葵素检测时效性强，本发明检测周期仅需30～80min，极大地节约了时间成本；本发明的龙葵素检测限比现有标准方法低一个数量级，在相同条件下可以检测出更低含量的龙葵素，而且数据精确；本发明创造性地从龙葵素对于胆碱酯酶的抑制作用入手，构建了一种高效的双光信号比率传感体系，并进一步优化了双光的信号强度，在此条件下才可实现龙葵素的灵敏检测；并且，本发明不需要借助昂贵精密仪器检测，极大地降低了实际样品中龙葵素的检测成本。
附图说明
30.图1为实施例1中所制备的mno2纳米片的透射电镜图。
31.图2为实施例1中所制备的荧光碳量子点的透射电镜图。
32.图3为实施例1中双光信号比率传感器中mno2纳米片添加量参数优化结果。
33.图4为实施例1中双光信号比率传感器中atch浓度参数优化结果。
34.图5为实施例1中双光信号比率传感器中ache浓度参数优化结果。
35.图6为实施例1中双光信号比率传感器中反应温度t参数优化结果。
36.图7为实施例1中双光信号比率传感器中孵育时间t参数优化结果。
37.图8为实施例2中双光信号比率传感器检测龙葵素的可行性分析。
38.图9为实施例2中峰值强度与龙葵素浓度的标准曲线图。
39.具体实施方法
40.下面结合一些具体实施例为本发明进一步详细说明，但本发明的保护范围不仅限于这些
实施例
41.实施例1：
42.s1、制备mno2纳米片；
43.s1.1：将十二烷基苯磺酸钠(0.5m，5ml)、硫酸(0.1m，0.25ml)、无水乙醇(3.5ml)溶于超纯水中，加热至90℃搅拌30min。再缓慢加入高锰酸钾溶液(0.05m，2ml)，待其充分反应后得到红棕色溶液b。
44.s1.2：待溶液b冷却至室温，9000rpm离心10min后弃去上清液，使用超纯水和乙醇洗脱沉淀物三次后干燥。最后将mno2纳米片均匀分散在超纯水中，得到mno2纳米片储备液(1g/l)置于4℃下保存备用；
45.使用tem表征mno2纳米片的结构形貌，由图1可见，制备的mno2纳米片呈现片状结
构。由于优异的光吸收性能和大尺寸，在340nm的激发波长下。mno2纳米片在720nm处存在二阶散射峰。
46.s2、制备荧光碳量子点；
47.s2.1：将100mg的柠檬酸铵和200mg的bpdb溶于5ml超纯水中，混合搅拌均匀，转移至ppl内衬水热高压反应釜中，加热至240℃，保温10h。待冷却至室温后，得到含热解产物的溶液c；
48.s2.2：将溶液c在8500rpm速率下离心10min，弃去下沉物，得到上清液。使用0.22μm的微孔过滤膜过滤上清液，之后得到透明淡黄色溶液，并在365nm紫外灯下发射蓝色荧光，即为cds溶液原液，置于4℃下保存备用。
49.以硫酸奎宁二水合物(qy＝54％，360nm，n＝1.33)为标准样品，通过比较样品和标准样品的荧光强度，按照公式计算所制备碳量子点的荧光量子产率(qy)。
[0050][0051]
其中s下标为标准样品，即硫酸奎宁，ψ为荧光量子产率，i为荧光发射强度，a为吸光度，η为溶液折射率。计算可得该碳量子点荧光量子产率高达61.32％。
[0052]
使用tem表征碳量子点的结构形貌，由图2可见，制备的碳量子点为单分散颗粒，无团聚，形貌接近球形。使用荧光分光光度计进行三维扫描该碳量子点，得到其最佳激发波长为340nm，最佳发射波长为454nm且对mno2纳米片有荧光响应。
[0053]
s3、建立双光信号比率传感体系并对参数进行优化；
[0054]
s3.1：优化mno2纳米片添加量。
[0055]
在温度为35℃时，取200μl浓度为700.00u/l的ache溶液、200μl浓度为20mm的atch溶液、200μl不同浓度的mno2纳米片稀释液、200μl浓度为10mg/l的cds原液以及1200μl超纯水混合均匀，静置40min后在340nm激发波长下检测混合溶液的荧光及散射信号，计算其峰值强度其中mno2纳米片的浓度分别为10、100、200、300、400、500mg/l；如图3所示，当mno2纳米片的浓度为300mg/l时峰值强度i最高，此时记为最佳mno2纳米片添加量c
op1
＝300mg/l。
[0056]
s3.2：优化atch浓度。在温度为35℃时，取200μl浓度为700.00u/l的ache溶液、200μl不同浓度的atch溶液、200μl浓度为300mg/l的mno2纳米片稀释液、200μl浓度为10mg/l的cds原液以及1200μl超纯水混合均匀，静置40min后在340nm激发波长下检测混合溶液的荧光及散射信号，计算其峰值强度其中atch的浓度分别为1、5、10、15、20、25、30mm；如图4所示，当atch的浓度为20mm时峰值强度i最高，此时记为最佳atch浓度c
op2
＝20mm。
[0057]
s3.3：优化ache浓度。在温度为35℃时，取200μl不同浓度的ache溶液、200μl浓度为20mm的atch溶液、200μl浓度为300mg/l的mno2纳米片稀释液、200μl浓度为10mg/l的cds原液以及1200μl超纯水混合均匀，静置40min后在340nm激发波长下检测混合溶液的荧光及散射信号，计算其峰值强度其中ache的浓度范围为1.00、10.00、100.00、300.00、500.00、700.00、900.00、1100.00u/l；如图5所示，当ache的浓度为700.00u/l时峰值强度i最高，此时记为最佳ache浓度c
op3
＝700.00u/l。
[0058]
s3.4：优化反应温度。在15～40℃下，取200μl浓度为700.00u/l的ache溶液、200μl浓度为20mm的atch溶液、200μl浓度为300mg/l的mno2纳米片稀释液、200μl浓度为10mg/l的cds原液以及1200μl超纯水混合均匀，静置40min后在340nm激发波长下检测混合溶液的荧光及散射信号，计算其峰值强度其中反应温度分别为15、20、25、30、35、40℃；如图6所示，当反应温度为35℃时峰值强度i最高，此时记为最佳孵育时间t＝35℃。
[0059]
s3.5：优化孵育时间。在温度为35℃时，取200μl浓度为700.00u/l的ache溶液、200μl浓度为20mm的atch溶液、200μl浓度为300mg/l的mno2纳米片稀释液、200μl浓度为10mg/l的cds原液以及1200μl超纯水混合均匀，静置不同时间后在340nm激发波长下检测混合溶液的荧光及散射信号，记录其峰值强度其中孵育时间分别为0、10、20、30、40、50、60min；如图7所示，当孵育时间为40min时峰值强度i最高，此时记为最佳孵育时间t＝40min。
[0060]
实施例2：
[0061]
基于双光信号比率传感体系检测龙葵素，具体步骤如下：
[0062]
s1.1：在35℃水浴加热下，200μl浓度为700.00u/l的ache溶液、200μl浓度为20mm的atch溶液、200μl浓度为300mg/l的mno2纳米片稀释液、200μl浓度为10mg/l的cds原液以及1200μl超纯水混合均匀，静置孵育40min后在340nm激发波长下检测混合溶液的荧光及二阶散射信号，记录其光谱图。取200μl浓度为300μg/l的龙葵素、200μl浓度为700.00u/l的ache溶液、200μl浓度为20mm的atch溶液、200μl浓度为300mg/l的mno2纳米片稀释液、200μl浓度为10mg/l的cds原液以及1000μl超纯水至石英荧光比色皿中并混合均匀，静置孵育40min后在340nm激发波长下检测混合溶液的荧光及二阶散射信号，记录其光谱图。
[0063]
以发射波长为横坐标，以荧光强度为纵坐标，分析双光信号比率传感器检测龙葵素的可行性。结果如图8所示，添加龙葵素的溶液中454nm处的荧光信号强度降低，720nm处的二阶散射信号强度增强。因此根据荧光和二阶散射双重信号的相反响应，可以实现龙葵素含量的比率传感分析。
[0064]
s1.2：在35℃水浴加热下，取200μl不同浓度的龙葵素标准品、200μl浓度为700.00u/l的ache溶液、200μl浓度为20mm的atch溶液、200μl浓度为300mg/l的mno2纳米片稀释液、200μl浓度为10mg/l的cds原液以及1000μl超纯水混合均匀，静置孵育40min后在340nm激发波长下检测混合溶液的荧光信号fi及二阶散射信号si，计算其峰值强度其峰值强度为纵坐标，建立龙葵素含量(ci)与峰值强度(ii)之间的标准曲线(如图9所示)：
[0065][0066]
r2＝0.9329
[0067]
所述龙葵素的终浓度分别为2、20、40、60、80、100、120、140、160、180、200、300、400、500μg/l。
[0068]
实施例3：
[0069]
基于双光信号比率传感体系检测马铃薯实际样品中的龙葵素，具体步骤如下：
[0070]
s1.1：将1g新鲜马铃薯样品切成小块，与3ml超纯水混合，并研磨成匀浆，往混合物中添加16ml乙腈，然后将混合物涡旋5min并静置30min。5000rpm离心10min后收集上清液。
然后通过氮气吹扫将溶液浓缩至1ml后得到含有龙葵素的提取液，记为待测样品液。
[0071]
s1.2：在35℃水浴加热下，取200μl待测样品液、200μl浓度为700.00u/l的ache溶液、200μl浓度为20mm的atch溶液、200μl浓度为300mg/l的mno2纳米片稀释液、200μl浓度为10mg/l的cds原液以及1000μl超纯水混合均匀，静置孵育40min后在340nm激发波长下检测混合溶液的荧光信号f及散射信号s；计算i值代入到标准曲线中，得到待测样品中龙葵素含量为37μg/l；
[0072]
s1.3：通过加标回收法评估本方法用于马铃薯中龙葵素的实用性，并使用高效液相色谱法对实验结果进行验证。
[0073]
利用上述所建立的双光信号比率传感体系检测龙葵素的回收率为86.4％～117.1％。利用高效液相色谱法对其同步测定，得到回收率为91.4％～110.1％，检测结果一致，证明该方法可实现实际样品中龙葵素的检测。
[0074]
依据3σ/k原则得到本方法的检测限为1.3μg/l。
[0075]
说明：以上实施例仅用以说明本发明而并非限制本发明所描述的技术方案；因此，尽管本说明书参照上述的实施例对本发明已进行了详细的说明，但是本领域的普通技术人员应当理解，仍然可以对本发明进行修改或等同替换；而一切不脱离本发明的精神和范围的技术方案及其改进，均应涵盖在本发明的权利要求范围内。