用于超快细胞染色的碳量子点双光子荧光染料

1.本发明涉及纳米材料领域，特别涉及一种用于超快细胞染色的碳量子点双光子荧光染料。


背景技术：

2.生物成像是了解生物体组织结构、阐明生物体各种生理功能的重要研究手段。由于具有高灵敏度、高分辨率、成像直观、成像速度快、无损检测等优点，生物成像已广泛应用于科学研究和生物医学诊断领域。生物成像在探索疾病的发病机制、临床表现和遗传病变，了解相应的生理病理信息，诊断疾病，开发新的医学方法等方面也具有重要的实际应用价值。目前，生物成像包括荧光成像、磁共振成像(mri)、计算机断层扫描(ct)、发射计算机断层扫描(ect)、光热成像(pti)、拉曼成像(ri)、超声成像(usi)和光声成像(pai)。其中，荧光成像具有更高的信号强度、更长的持续时间、更低的实验成本，以及从体内到离体成像的可行性，荧光生物成像因此得到了广泛的应用。
3.在已报道的荧光标记分子中，碳量子点(cds)由于其易于制备、独特的光学性质、优异的光稳定性和良好的生物相容性等固有优势而引起了极大的关注。因此，cd被广泛用作细胞成像中的新型荧光探针。然而，目前的cds成像存在绝对量子效率低、荧光成像时间长、无法进行双光子成像等缺点。低绝对量子效率意味着，如果要获得清晰明亮的图像需要高cds浓度，而这将直接影响细胞活力。此外，大多数使用cds的细胞成像需要1-24小时，而细胞环境变化迅速，这使得快速成像和检测细胞内活动变得困难。此外，单光子荧光成像具有空间分布低、组织渗透性差、成像深度浅等特点。为了满足组织深度成像所需的空间和时间分辨率以及更好的成像性能，使用cds进行双光子成像(tp)似乎是解决此问题的好方法。双光子吸收/激发是指分子在强光激发下，同时吸收两个光子，从基态跃迁到光子能量为两倍的激发态的过程。在双光子荧光成像中，吸收的近红外光导致紫外光发射。长波红外光不易被细胞散射，深入样品，可用于检测较厚的样品。此外，长波光源对生物体造成的光学损伤较小。被吸收的长波长光子的波长是荧光分子的单光子激发光波长的两倍。这样，需要单光子紫外光激发的荧光分子可以被近红外甚至红外波长范围内的两个光子激发。因此，双光子技术可以显着降低活体样品检测中的光毒性。但现在缺少可靠的双光子荧光染料。


技术实现要素：

4.本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足，提供一种用于超快细胞染色的碳量子点双光子荧光染料。
5.为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种用于超快细胞染色的碳量子点双光子荧光染料，其通过以下方法制备得到：
6.1)以间苯二胺为前驱体采用一步溶剂热法制备碳量子溶液；
7.2)采用硅胶柱色谱法从步骤1)制备的碳量子中分离出绿色荧光组分，即为该碳量子点双光子荧光染料。
8.优选的是，所述步骤1)包括：将间苯二胺加入到无水乙醇中，然后加入盐酸，将得到的混合物在高压釜中进行水热处理，反应结束后冷却至室温，产物离心，去除沉淀，得到碳量子溶液。
9.优选的是，所述步骤1)中加入的盐酸的质量浓度为：36-38％。
10.优选的是，所述步骤1)中加入的盐酸的质量浓度为：36.5％。
11.优选的是，所述步骤1)中的高压釜为聚四氟乙烯衬里的不锈钢高压釜。
12.优选的是，所述步骤1)中，水热处理的温度为180℃。
13.优选的是，所述步骤1)包括：将0.2g间苯二胺加入到20ml无水乙醇中，然后加入672μl盐酸，将得到的混合物在聚四氟乙烯衬里的不锈钢高压釜中于180℃进行水热处理2小时，反应结束后冷却至室温，产物以10000rpm离心20分钟，去除沉淀，得到碳量子溶液。
14.优选的是，所述步骤2)包括：使用二氯甲烷和甲醇的混合物作为洗脱剂，通过硅胶柱色谱法对步骤1)制备的碳量子进行纯化，选择绿色荧光组分，然后蒸发溶剂并在真空下干燥，收集固体粉末，即为该碳量子点双光子荧光染料。
15.优选的是，所述步骤2)中的洗脱剂中，二氯甲烷和甲醇的体积比为10:1。
16.优选的是，该碳量子点双光子荧光染料作为荧光染料应用于荧光成像和双光子成像。
17.本发明的有益效果是：本发明提供的用于超快细胞染色的碳量子点双光子荧光染料的绝对量子效率高达58.65％，表现出了良好的生物相容性，即使在低浓度下也表现出优异的成像效果；最重要的是，该碳量子点双光子荧光染料可以在10秒钟进入细胞，这为快速荧光成像提供了坚实的基础；且其还可用于双光子成像，使用近红外(920nm)激发光源，该g-cds也表现出强烈的绿色荧光，并在4t1细胞中显示出优异的成像性能；本发明合成的碳量子点双光子荧光染料可为早期诊断和临床治疗提供优秀的生物成像工具。
附图说明
18.图1为本发明的实施例1制备的碳量子点双光子荧光染料的透射电镜照片；
19.图2为本发明的实施例1制备的碳量子点双光子荧光染料的x射线衍射图；
20.图3为本发明的实施例1制备的碳量子点双光子荧光染料的紫外吸收光谱与荧光光谱图；
21.图4为本发明的实施例1制备的碳量子点双光子荧光染料的红外图谱；
22.图5为本发明的实施例1制备的碳量子点双光子荧光染料的x射线光电子能谱；
23.图6为本发明的实施例1制备的碳量子点双光子荧光染料在不同激发光下的光谱；
24.图7为本发明的实施例1制备的碳量子点双光子荧光染料的全光谱扫描结果；
25.图8为本发明的实施例1制备的碳量子点双光子荧光染料的国际照明协会(cie)色度图；
26.图9为本发明的实施例1制备的碳量子点双光子荧光染料的ph稳定性试验结果；
27.图10为本发明的实施例1制备的碳量子点双光子荧光染料的离子干扰试验结果；
28.图11为本发明的实施例1制备的碳量子点双光子荧光染料的细胞毒性测试结果；
29.图12为本发明的实施例1制备的碳量子点双光子荧光染料在4t1细胞(a)与hela细胞(b)培养10秒、1分钟、10分钟和180分钟下的荧光成像结果；
30.图13为本发明的实施例1制备的碳量子点双光子荧光染料与dapi复染两种细胞的结果；
31.图14为本发明的实施例1制备的碳量子点双光子荧光染料在4t1细胞中的双光子成像效果。
具体实施方式
32.下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
33.应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
34.实施例1
35.本实施例的一种用于超快细胞染色的碳量子点双光子荧光染料，其通过以下方法制备得到：
36.1)以间苯二胺为前驱体采用一步溶剂热法制备碳量子溶液：
37.将0.2g间苯二胺加入到20ml无水乙醇中，然后加入672μl浓盐酸(质量浓度为：36.5％)，将得到的混合物在聚四氟乙烯衬里的不锈钢高压釜中于180℃进行水热处理2小时，反应结束后冷却至室温，产物以10000rpm离心20分钟，去除非荧光沉淀，得到碳量子溶液；
38.2)采用硅胶柱色谱法从步骤1)制备的碳量子中分离出绿色荧光组分，即为该碳量子点双光子荧光染料：
39.使用二氯甲烷和甲醇的混合物作为洗脱剂(ch2cl2/ch3oh，10:1v/v)，通过硅胶柱色谱法对步骤1)制备的碳量子进行纯化，选择强绿色荧光组分，然后蒸发溶剂并在真空下干燥，收集固体粉末，即为该碳量子点双光子荧光染料。
40.本发明使用间苯二胺(m-pd)和浓盐酸通过一步法合成了强绿色荧光碳量子点(g-cds)：即碳量子点双光子荧光染料，成的g-cds的绝对量子效率高达58.65％，表现出了良好的生物相容性，即使在低浓度下也表现出优异的成像效果；最重要的是，g-cds可以在10秒钟进入细胞，这为快速荧光成像提供了坚实的基础；g-cds还可用于双光子成像。使用近红外(920nm)激发光源，该g-cds也表现出强烈的绿色荧光，并在4t1细胞中显示出优异的成像性能。本发明的g-cds可为早期诊断和临床治疗提供优秀的生物成像工具。
41.实施例2
42.对实施例1制备的碳量子点双光子荧光染料进行相关性能测试，获得如下结果。
43.1、参照图1，为该碳量子点双光子荧光染料的透射电镜(tem)照片，可以看出，该碳点呈球形，晶格明显，晶格间距为0.21nm。
44.2、参照图2，为该碳量子点双光子荧光染料的x射线衍射图，可以看出，碳点的x射线衍射2θ角度为22
°
，与tem相符。
45.3、参照图3，为该碳量子点双光子荧光染料的紫外吸收光谱与荧光光谱图，从图中可以看出，其在248nm具有最大的吸收带，这代表了芳香族c＝c键的π-π*跃迁；在大约300nm处的弱吸收峰是由于n-π*电子跃迁，这表明在该碳量子点双光子荧光染料表面存在c＝n和c＝o；此外，其荧光发射峰位于500nm处，对应的激发峰位于460nm处。
46.4、参照图4，为该碳量子点双光子荧光染料的红外图谱，分析透射峰强度可知，其表面富含羟基、氨基等基团；位于3324cm-1
左右的特征吸收谱带是由于-nh2基团的伸缩振动导致的；位于2935cm-1
的吸收峰是由于c-h键伸缩振动导致的；位于1619cm-1
的峰是属于c＝c的伸缩振动导致的；位于1508cm-1
的峰被认为是属于-no2键的伸缩振动；位于1331cm-1
的吸收峰是由于c-n-c基团伸缩振动导致的；这些基团增强了该碳量子点双光子荧光染料的亲水性和稳定性。
47.5、参照图5，为该碳量子点双光子荧光染料的x射线光电子能谱，可以得知其由三种元素组成，分别是碳元素、氮元素以及氧元素，它们所占的比例分别为71.92％、14.10％、13.97％；进一步证实了该碳量子点双光子荧光染料表面具有丰富的氨基、羟基等基团。
48.6、参照图6，为该碳量子点双光子荧光染料在不同激发光下的光谱，可以看出碳点表现出激发不依赖的特性；
49.7、参照图7，为该碳量子点双光子荧光染料的全光谱扫描结果，可以确定碳点的发光区域；
50.8、参照图8，为该碳量子点双光子荧光染料的国际照明协会(cie)色度图，可以看出，cie色度图坐标为(0.169，0.502)，综上可得碳点为激发不依赖型碳点，发射绿色荧光。
51.9、参照图9，为该碳量子点双光子荧光染料的ph稳定性试验结果，可以看出在ph4.0-9.0的范围下，其光强几乎不受影响。
52.10、参照图10，为该碳量子点双光子荧光染料的离子干扰试验结果，可以看出，其对常见的金属离子和一些氨基酸表现出良好的稳定性，光强几乎不受影响。
53.11、参照图11，为该碳量子点双光子荧光染料的细胞毒性测试结果，本实施例中，通过wst-1细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒对碳点的细胞毒性进行了评估，在加入了40μg ml-1
的碳量子点双光子荧光染料时，细胞的活力几乎没有受到任何影响，这证明了在这个浓度下是几乎没有任何毒性的；在加入了100μg ml-1
的碳量子点双光子荧光染料后，细胞活力会些许下降但是仍在80％以上。证明了该碳量子点双光子荧光染料的毒性较低，生物相容性好。
54.12、参照图12，为该碳量子点双光子荧光染料在4t1细胞(a)与hela细胞(b)培养10秒、1分钟、10分钟和180分钟下的荧光成像结果，碳量子点双光子荧光染料浓度为40μg ml-1
，比例尺为20μm。该碳量子点双光子荧光染料可以在10秒内进入细胞，这就可以实现清晰和快速的成像；考虑到大多数常规碳点需要共孵育1-24小时才能进行细胞成像，而本发明的碳量子点双光子荧光染料在10s内的成像能力显著加快了这一过程，有助于及时研究细胞的生理状态。此外，本发明的碳量子点双光子荧光染料的细胞成像对培养时间的依赖性不大。从两种类型细胞的时间梯度细胞成像实验中，本实施例确定观察到1min细胞荧光成像场下的荧光强度与10min和180min的荧光强度无显著差异，所有成像结果均清晰明亮。主要归功于：粒径小、极高的绝对量子效率和低细胞毒性，使碳量子点双光子荧光染料可以在短时间内穿透细胞，表现出较强的绿色荧光，所以其在短期和长期成像方面都显示出了巨大的应用潜力。
55.13、参照图13，为该碳量子点双光子荧光染料与dapi复染两种细胞的结果，碳量子点双光子荧光染料浓度为40μg ml-1
，比例尺为20μm。本实施例中，将该碳量子点双光子荧光染料(40μg ml-1
)与4t1细胞与hela细胞共孵育60min后，用dapi复染，分别用绿色和蓝色来
区分碳点和dapi，最后得到图13所示的共聚焦图片。从图13可以看出，绿色和蓝色区域有很大重叠。使用color2和jacop两个软件包对荧光共定位结果进行分析，使用color2软件，得到13(a)和13(b)的皮尔逊系数分别为0.80和0.84；使用jacop软件，得到13(a)和13(b)的pearson系数分别为0.803和0.838，overlap重叠系数分别为0.962和0.994。综上，该碳量子点双光子荧光染料具有较强的靶核特性，扩宽了其在生物医学领域中的应用。
56.14、参照图14，为该碳量子点双光子荧光染料在4t1细胞中的双光子成像效果，本实施例中，使用920nm波长的光激发该碳量子点双光子荧光染料，得到其在4t1细胞中明亮清晰的成像结果，打破了单光子荧光成像空间分布率较低与渗透率组织较差的局限性。本发明制得的碳量子点双光子荧光染料在单光子和双光子激发条件下都能表现出清晰的绿色荧光，这为荧光成像、组织深度成像和空间高分辨率成像等领域提供了强大的工具。
57.尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。