通过编辑碳酸酐酶基因培育抗旱玉米的方法及其应用

1.本发明属于生物技术领域，尤其涉及通过编辑碳酸酐酶基因培育抗旱玉米的方法及其应用。


背景技术：

2.干旱是全球范围内最严重的非生物胁迫之一，干旱胁迫使植物生长发育受阻，植株矮小，作物产量和品质下降，给农业生产带来严重危害，是影响农业生产的世界性难题。因此，寻找参与植物干旱响应的基因，利用转基因过表达或基因编辑等技术突变这些基因，可以为分子育种和种质改良、提高作物抗逆性，提供候选基因资源。通过基因工程的方式进行抗逆新品种培育，可以提高育种效率，缩短杂交和筛选时间，且育种方向确定，是改良作物性状的有效方法之一，对增强作物抵抗生物和非生物逆境的能力，提高作物产量和品质，缓解粮食短缺具有重要意义。
3.玉米(zeamays)是三大粮食作物之一，也是重要的饲料作物，属于禾本科玉蜀黍属。随着b73和mo17等玉米自交系基因组测序的完成，玉米的遗传背景更加清楚。同时，易于遗传转化的自交系不断被测序和开发，使转基因过表达和基因编辑技术的效率大大提高，例如lh244自交系。该自交系转化效率高于目前已知的绝大多数自交系，易于通过转化获得转基因过表达或基因编辑植株，这些为利用分子育种进行遗传性状改良提供了技术支持，对减轻干旱等非生物胁迫造成的玉米减产具有应用价值。
4.ca(碳酸酐酶)是一种与光合作用密切相关的金属酶，能够高效可逆地催化co2与hco
3-之间的转化，是co2浓缩机制的重要组分。生物体内的碳酸酐酶是一个多基因家族，目前依据晶体结构和亚基组成，可将其分为α、β、γ、δ、ε及θ等6个亚家族。高等植物碳酸酐酶的主要功能是参与光合作用，如将衣原体ca基因过表达于烟草后显著提高了转基因植株的光合速率和生物学产量。此外，ca还参与植物呼吸作用、ph调节、氨基酸及脂质的代谢、气孔运动、非生物胁迫等生理过程。如玉米碳酸酐酶突变体植株的气孔导度明显高于野生型，并随着co2分压的增加，气孔关闭速度变慢。而气孔的打开与关闭和水分蒸腾速率有着密不可分的联系，因此研究碳酸酐酶ca的作用机制，在植物抗旱中具有重要的应用前景。目前植物中ca家族蛋白的功能研究主要集中在参与光合作用的调节。ca在单子叶作物玉米中参与干旱响应的作用还不十分清楚。


技术实现要素：

5.本发明所要解决的技术问题是如何提高植物的抗旱性。
6.为了解决上述技术问题，本发明提供了一种培育抗旱玉米的方法。
7.本发明所提供的培育抗旱玉米的方法，包括敲除目的玉米中碳酸酐酶基因，得到抗旱能力高于所述目的玉米的抗旱玉米。
8.上述方法中，所述碳酸酐酶基因，是如下a1-a3中任一的dna分子：
9.a1编码区如序列表中序列1或序列2所示的dna分子；
10.a2在严格条件下与a1限定的dna分子杂交且编码所述蛋白质的dna分子；
11.a3来源于玉米且与a1限定的dna分子至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码所述蛋白质的dna分子。
12.其中，序列表中的序列1由8517个核苷酸组成，序列表序列2为序列表序列1第2572位到第7616位核苷酸，cds为序列表序列2，编码序列表中的序列3所示的蛋白质。
13.上述方法中，所述敲除目的玉米中碳酸酐酶基因通过crispr/cas9基因编辑方法实现。
14.所述crispr/cas9基因编辑方法，其sgrna的靶序列为序列表序列1第2645-2663位。
15.本发明还提供培育抗旱玉米的方法在玉米育种中的应用。
16.本发明还保护上述表达所述sgrna的载体。
17.所述表达所述sgrna的载体在玉米育种中的应用，或在培育抗旱玉米中的应用，或在编辑碳酸酐酶基因中的应用也属于本发明的保护范围。
18.上述碳酸酐酶基因编码的蛋白质也是本发明保护的范围。
19.上述蛋白质，是如下a1-a4中任一蛋白质：
20.a1序列表中序列3所示的蛋白质；
21.a2将序列表中序列3所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗旱性相关的由其衍生的蛋白质；
22.a3在a1所述蛋白质的n端或/和c端连接标签得到的融合蛋白；
23.a4来源于玉米且与a1具有98％以上同一性且与植物抗旱性相关的蛋白质。
24.上述蛋白质中，序列表中的序列3由452个氨基酸残基组成。
25.上述蛋白质中，同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如ncbi主页网站的blast网页。例如，可在高级blast2.1中，通过使用blastp作为程序，将expect值设置为10，将所有filter设置为off，使用blosum62作为matrix，将gap existence cost，perresidue gap cost和lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
26.上述蛋白质中，所述80％以上的同一性可为至少81％、85％、90％、91％、92％、95％、96％、98％、99％或100％的同一性。
27.与上述蛋白质相关的生物材料也属于本发明的保护范围。
28.本发明提供的与蛋白质相关的生物材料，为下述b1)至b5)中的任一种：
29.b1)编码上述蛋白质的核酸分子；
30.b2)含有b1)所述核酸分子的表达盒；
31.b3)含有b1)所述核酸分子的重组载体、或含有b1)所述表达盒的重组载体；
32.b4)含有b1)所述核酸分子的重组微生物、或含有b2)所述表达盒的重组微生物、或含有b3)所述重组载体的重组微生物；
33.b5)含有b1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有b2)所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有b3)所述重组载体的转基因植物细胞系。
34.其中，所述核酸分子可以是dna，如cdna、基因组dna或重组dna；所述核酸分子也可以是rna，如mrna或hnrna等。
35.其中，b1)所述的核酸分子为如下a1-a3中任一的dna分子：
36.a1编码区如序列表中序列1或序列2所示的dna分子；
37.a2在严格条件下与a1限定的dna分子杂交且编码所述蛋白质的dna分子；
38.a3来源于玉米且与a1限定的dna分子至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码所述蛋白质的dna分子。
39.8、本发明还保护y1-y3中任一的应用：
40.y1上述蛋白质或上述生物材料在调控植物抗旱性中的应用。
41.y2降低上述蛋白质活性或含量的物质在提高植物抗旱性或培育抗旱植物中的应用；
42.y3抑制编码上述碳酸酐酶基因表达的物质在提高植物抗旱性或培育抗旱植物中的应用。
43.上述应用中，y2或y3所述物质为crispr/cas9系统；
44.所述crispr/cas9系统包括如下1)或2)：
45.1)sgrna，所述sgrna的靶点为序列1第2645-2663；
46.2)表达所述sgrna的crispr/cas9载体。
47.本发明还提供上述crispr/cas9系统。
48.本发明提供的碳酸酐酶基因经crispr-cas9基因编辑技术突变后，干旱处理条件下突变体植株生长明显优于对照植株，说明碳酸酐酶基因突变能够显著提高植物抗旱性。本发明实例中采用crispr-cas9基因编辑技术获得了抗旱植株，与传统育种方式相比时间短，目的性强，为培育和改良抗旱植物新品种提供了基因资源，为阐明碳酸酐酶基因在植物干旱逆境信号应答中的分子机制提供了理论依据。
49.本发明构建的crispr-cas9基因编辑技术突变碳酸酐酶基因的突变体植物的抗旱能力显著提高，在干旱条件下，其叶片萎蔫程度相较于野生型不明显，叶片相对含水量更高。本发明提供的抗旱植物选育方法，与传统育种方式相比，具有育种时间短，目的性强，显著缩短了抗旱育种的周期，提高了抗旱育种的效率。
附图说明
50.图1为玉米zmca1crispr-cas9突变位点突变位点。
51.图2为野生型玉米(对照)和突变株系干旱处理后植株生长情况照片。其中，wt为野生型玉米，0860-1为t2代zmca1 crispr-cas9突变株系。
具体实施方式
52.以下实施例用于说明本发明，但不限制本发明的范围。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
53.主要试剂包括：neb、toyobo等生物公司的限制性内切酶、dna聚合酶、t4连接酶等；
thermo公司的反转录试剂盒；magen公司的rna提取试剂盒；takara公司的定量pcr试剂；质粒提取试剂盒以及dna回收试剂盒购自天根公司；ms培养基、琼脂粉、琼脂糖、氨苄青霉素、卡那霉素、硫酸庆大霉素、利福平等抗生素等试剂购自sigma；实施例中所使用的各种其它化学试剂均为进口或国产分析纯试剂；引物合成和测序由英俊公司完成。
54.玉米生态型为b73，记载在如下文献中：zhang et al.the genetic architecture of nodal root number in maize.plant journal,93(6):1032-1044,2018.。
55.以下实施例中所用转录本为t01，仅作为一个例子，不限制应用中的编辑位点。如未特别指明，实例均按照常规实验条件或产品说明书条件进行。
56.农杆菌菌株是eha105。
57.crispr/cas9载体pbue411，记载在如下文献中：xing hl,dong l,wang zp,zhang hy,han cy,liu b,wang xc,chen qj bmc plant biol.2014nov 29；14(1):327；a crispr/cas9 toolkit for multiplex genome editing in plants。
58.下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应dna/rna的5
′
末端核苷酸，末位均为相应dna/rna的3
′
末端核苷酸。
59.实施例1
60.一、基因的获得
61.为研究植物抗旱的分子机制，我们利用crispr/cas9技术从玉米(zea mays l.)基因组中定向突变了zmca1。
62.玉米zmca1基因由8517个核苷酸(核苷酸序列如序列表序列1所示)组成。t02转录本的读码框为序列1第2572位到第7616位核苷酸，cds为序列表序列2，编码序列表序列3所示的蛋白质。该基因由15个外显子组成，其中编码外显子13个，t02转录本读码框第1位到第141位核苷酸，第523位到第587位核苷酸，第716位到第764位核苷酸，第1594位到第1710位核苷酸，第1811位到第1950位核苷酸，第2096位到第2201位核苷酸，第2332位到第2463位核苷酸，第3326位到第3387位核苷酸，第3562位到第3610位核苷酸，第4236位到第4352位核苷酸，第4447位到第4586位核苷酸，第4721位到第4826位核苷酸，第4911位到第5045位核苷酸，其余为其内含子序列。基因来源于玉米自交系b73。由于玉米同一dna段序列可产生不同转录本，翻译出不同蛋白质，该段序列产生的不同转录本以及翻译出的不同具有抗旱功能的蛋白质均在本发明保护范围内。
63.二、构建编辑zmca1基因的crispr/cas9基因编辑载体
64.选取zmca1基因中cctcgtcactccttcagaa(序列1第2645-2663位)作为该基因的靶点，设计包含靶点信息的引物ca1-id-1f和ca1-id-1r:
65.ca1-id-1f：ggcgttctgaaggagtgacgagg(下划线指示的序列与ca1-id-1r中下划线指示的序列反向互补)；
66.ca1-id-1r：aaaccctcgtcactccttcagaa(下划线指示的序列与ca1-id-1f中下划线指示的序列反向互补)。
67.载体构建方法：
68.(1)退火
69.合成引物，稀释后进行退火，得到带粘性末端的双链dna片段grna，具体为：
70.将引物ca1-id-1f和ca1-id-1r退火获得带粘性末端的双链dna片段grna。
71.(2)pbue411载体(该载体含有3
×
flag-nls-zcas9-nls表达系统和用于插入靶序列的grna支架)用bsai(neb)酶切，得到酶切后的pbue411。
72.表1为酶切体系
[0073][0074][0075]
(3)连接
[0076]
针对zmca1基因的重组crispr载体：
[0077]
将步骤(1)的带粘性末端的双链dna片段grna、步骤(2)得到的酶切后pbue411连接，得到连接产物，即为重组crispr载体pbcxun-zmca1 crispr-cas9，该载体表达sgrna。sgrna识别区的编码序列为序列1第2645-2663位。
[0078]
上述连接体系如表2所示：
[0079]
表2为连接体系
[0080][0081]
(4)鉴定
[0082]
取5μl步骤(3)得到的连接产物转化大肠杆菌感受态。在含有50μg/ml卡那霉素的lb平板上筛选。菌落pcr鉴定单克隆。
[0083]
针对转入zmca1基因的重组crispr载体的单克隆，pcr鉴定所需引物为osu3-fd3和tau3-rd。挑选阳性克隆(得到831bp的克隆为阳性)，提取质粒送去测序。
[0084]
测序引物均采用osu3-fd3和tau3-rd：
[0085]
osu3-fd3：gacaggcgtcttctactggtgctac
[0086]
tau3-rd:ctcacaaattatcagcacgctagtc
[0087]
测序结果显示，获得重组crispr载体pbcxun-zmca1 crispr-cas9(该载体针对zmca1基因，表达sgrna，sgrna识别区的编码序列为序列1第2645-2663位)。
[0088]
三、crispr/cas9基因编辑植株的构建和鉴定
[0089]
1、zmca1基因编辑植株的构建和鉴定
[0090]
将构建的crispr/cas9基因编辑载体pbcxun-zmca1 crispr-cas9通过热激法转化到感受态农杆菌eha105菌株中，菌落pcr鉴定出阳性克隆，命名为eha105/pbcxun-zmca1 crispr-cas9。
[0091]
将鉴定正确的农杆菌eha105/pbcxun-zmca1 crispr-cas9单菌落接种于2-3ml含有100μg/ml卡那霉素和50μg/ml利福平的液体培养基中，28℃振荡培养过夜，第二天转接大量含有抗生素的液体培养基中震荡培养，转接几次后收集菌体，重新悬浮至od
600
在0.8-1.0之间。
[0092]
将重组菌eha105/pbcxun-zmca1 crispr-cas9采用农杆菌介导法转入硬秆自交系b73(以下也称为野生型玉米)，b73的幼胚进行根癌农杆菌eha105侵染，将被根癌农杆菌eha105侵袭的幼胚放在选择培养基上进行多次筛选，获得抗性愈伤组织，将抗性愈伤组织再生成苗，得到t0代转化苗。构建方法参考：zhang et al.the genetic architecture ofnodal root number in maize.plant journal,93(6):1032-1044,2018。
[0093]
提取t0代转化苗的dna作为模板进行pcr扩增并测序，以b73玉米为对照。
[0094]
扩增所需引物为ca1-crispr-f和ca1-crispr-r，得到345bp为阳性。
[0095]
ca1-crispr-f:atgagcagctgcctctgc；
[0096]
ca1-crispr-r:cgatgttgcggacggtgaatg。
[0097]
测序引物为ca1-crispr-f。测序结果如图1所示，可以看出，与野生型玉米b73(下面序列)相比，t0代转化苗(上面序列)中zmca1基因中有突变造成移码(突变为序列1第2651位1bp缺失)，导致蛋白序列改变，蛋白功能被破坏。
[0098]
将含有该突变形式的转化苗命名为阳性zmca1基因t0代crispr-cas9突变玉米。
[0099]
阳性zmca1基因t0代crispr-cas9突变玉米经过自交去掉cas9，培育获得zmca1基因t2代crispr-cas9突变玉米，得到zmca1基因编辑的株系命名为0860-1。
[0100]
四、zmca1基因crispr-cas9突变玉米旱处理表型检测
[0101]
1、在装有110g营养土的小盆中播种t2代zmca1基因突变株系0860-1、野生型玉米b73(wt)种子各3盆，每盆播种4粒种子，覆盖50ml土，吸满水后将托盘中剩余的水倒掉，出苗后将长势不齐一株苗去掉，每盆留3株苗，在托盘里加入1l水，吸满后将水倒掉，持续不浇水14天(干旱处理)。观察对照和转基因植株旱处理表型。
[0102]
图2显示zmae1 crispr突变的植株0860-1生长状况均强于对照，叶片萎蔫程度低于对照，说明转基因植株比对照抗旱。
[0103]
统计干旱处理14天后，各株系的存活率(将表现为能正常生长植株定义为存活植株，将表现为严重受旱害且不能正常生长的植株定义为死亡植株；存活率为各株系中存活植株数目占总植株数的百分比)，可以看出，t2代crispr-cas9突变玉米干旱处理后，0860-1的存活率为78.5％，野生型玉米干旱处理后的存活率为49％。
[0104]
因此，抑制zmca1蛋白表达或者敲除zmca1基因能够提高玉米耐旱性。