细菌糖糖缀合物疫苗的剂量和施用的制作方法

1.本发明属于糖缀合物抗原领域，尤其是初免和加强施用方案及相关方面。


背景技术：

2.糖缀合物抗原，也称为糖缀合物(glycoconjugates)，是通过将糖共价连接至载体蛋白而获得的。糖缀合物已被证明是用于预防b型流感嗜血杆菌(schneerson，1980)、肺炎链球菌(geno，2015)、脑膜炎奈瑟氏球菌a、c、w135和y(pace，2007)和伤寒沙门氏菌(acharya，1987；klugman 1987；tacket，1988)的疫苗的有效且具有成本效益的方法。
3.糖缀合物使非缀合糖疫苗的局限性得以克服。糖是非t细胞依赖性的抗原，虽然它们在成人中可能是有效的，但当用作疫苗时，它们通常无法引起免疫记忆和长效抗体的产生。此外，由非缀合糖引发的抗体应答的亲和力成熟通常低于由糖缀合物疫苗诱导的抗体应答的亲和力成熟。随后使用相同的非缀合糖抗原的疫苗接种甚至可以诱导低反应性(pace，2013；jackson，2013；greenberg，2014)。糖缀合物中存在的蛋白表位提供的t细胞辅助赋予碳水化合物诱导持久和可加强的igg抗体产生的能力，包括在2岁以下的儿童中(constantino，2011)。糖缀合物疫苗已被证明减少脑膜炎奈瑟氏球菌的携带或对其传播的影响，而非缀合糖抗原疫苗不具有上述作用(ramsey，2003)。
4.四价脑膜炎球菌疫苗menveo指示肌内施用于(a)2月龄儿童，作为2、4、6和12月龄的4-剂量系列，(b)第一剂量在7月龄至23月龄的儿童，作为在第一剂量后至少3个月施用第二剂量的2-剂量系列；和(c)2岁至55岁的个体，作为单一剂量。每个剂量的menveo包含10ug mena、5ug menc、5ug menw和5ug meny糖，各自缀合至总计32.7至64.1ug的crm197载体，体积为500μl(menveo包装说明书，09/2019)。
5.十价肺炎球菌疫苗synflorix指示用于肌内施用于(a)2月龄儿童，作为2、4和12月龄的3-剂量系列，(b)65岁以上的个体，作为单一剂量；和(c)具有高于普通人群的肺炎球菌感染风险2至64岁的儿童和成人，作为单一剂量。每个剂量的synflorix包含1ug的各血清型1、5、6b、7f、9v、14和23f糖和3ug的各血清型4、18c和19f糖，各自缀合至蛋白d、破伤风类毒素或白喉类毒素载体，其单独地吸附在磷酸铝上，500μl体积(synflorix包装说明书，11/2019)。
6.使用皮内给予的1/5分数剂量的menacwy-tt疫苗表明在4-6月前使用相同的1/5分数剂量初免的成年个体中诱导良好的抗脑膜炎球菌抗体应答，并且比使用1/10分数剂量初免和加强的效果更好(jonker，2018)。
7.幼婴可能与青少年和成人反应不同，推荐的方案可能仅产生疫苗可诱导的最大抗体滴度的10至35％(rappuoli，2018)。
8.仍然需要替代的或改进的施用糖缀合物的方法。此种方法可以提供例如减少抗原使用、增加免疫应答、改进免疫应答的质量、降低剂量数量、更持久免疫应答和/或更快速获得保护性反应的益处。


技术实现要素：

9.本公开涉及可用于引发针对糖缀合物抗原的免疫应答的组合物和方法。
10.本发明提供了一种向受试者施用糖缀合物的方法，所述方法包括以下步骤：
11.(i)施用第一剂量的糖缀合物；
12.(ii)随后施用第二剂量的糖缀合物；
13.其中所述第一剂量中糖缀合物的量为第二剂量中糖缀合物的量的1/5至1/500。
14.还提供了一种用于在包括以下步骤的方法中向受试者施用的糖缀合物：
15.(i)施用第一剂量的糖缀合物；
16.(ii)随后施用第二剂量的糖缀合物；
17.其中所述第一剂量中糖缀合物的量为第二剂量中糖缀合物的量的1/5至1/500。
18.另外提供了糖缀合物在制备用于在包括以下步骤的方法中向受试者施用的药物中的用途：
19.(i)施用第一剂量的糖缀合物；
20.(ii)随后施用第二剂量的糖缀合物；
21.其中所述第一剂量中糖缀合物的量为第二剂量中糖缀合物的量的1/5至1/500。
22.还提供了一种试剂盒，其包含：
23.(i)第一剂量的糖缀合物；
24.(ii)第二剂量的糖缀合物；
25.其中所述第一剂量中糖缀合物的量为第二剂量中糖缀合物的量的1/5至1/500。
26.本发明还提供了一种向受试者施用糖缀合物的方法，所述方法包括以下步骤：
27.(i)施用第一剂量的0.005至2ug的糖缀合物；
28.(ii)随后施用第二剂量的1至30ug的糖缀合物，
29.其中所述第二剂量中糖缀合物的量为第一剂量中糖缀合物的量的至少两倍。
30.本发明还提供了一种向受试者施用糖缀合物的方法，所述方法包括以下步骤：
31.(i)施用第一剂量的1/5至1/500标准剂量的糖缀合物；
32.(ii)随后施用第二剂量的1/2至2倍标准剂量的糖缀合物。
33.本发明还提供了一种向受试者施用糖缀合物的方法，所述方法包括以下步骤：
34.(i)施用第一剂量的0.005至2ug的糖缀合物；
35.(ii)随后施用第二剂量的0.005至2ug的糖缀合物，
36.其中所述第二剂量中糖缀合物的量为第一剂量中糖缀合物的量的1/2至5倍。
37.本发明还提供了一种向受试者施用糖缀合物的方法，所述方法包括以下步骤：
38.(i)施用第一剂量的1/5至1/500标准剂量的糖缀合物；
39.(ii)随后施用第二剂量的1/5至1/500标准剂量的糖缀合物，
40.其中所述第二剂量中糖缀合物的量为第一剂量中糖缀合物的量的1/2至5倍。
41.本发明提供了一种向受试者施用糖缀合物的方法，所述方法包括以下步骤：
42.(i)施用第一剂量的糖缀合物；
43.(ii)随后施用第二剂量的糖缀合物；
44.其中所述第一剂量中糖缀合物的量为第二剂量中糖缀合物的量的1/20至1/5000。
45.还提供了一种用于在包括以下步骤的方法中向受试者施用的糖缀合物：
46.(i)施用第一剂量的糖缀合物；
47.(ii)随后施用第二剂量的糖缀合物；
48.其中所述第一剂量中糖缀合物的量为第二剂量中糖缀合物的量的1/20至1/5000。
49.另外提供了糖缀合物在制备用于在包括以下步骤的方法中向受试者施用的药物中的用途：
50.(i)施用第一剂量的糖缀合物；
51.(ii)随后施用第二剂量的糖缀合物；
52.其中所述第一剂量中糖缀合物的量为第二剂量中糖缀合物的量的1/20至1/5000。
53.还提供了一种试剂盒，其包含：
54.(i)第一剂量的糖缀合物；
55.(ii)第二剂量的糖缀合物；
56.其中所述第一剂量中糖缀合物的量为第二剂量中糖缀合物的量的1/20至1/5000。
附图说明
57.图1小鼠在免疫前(pi)和如实施例1所述的施用gbs糖缀合物疫苗后第35天的gbs 1a igg滴度。显示个体动物的值(点)，具有几何平均值(柱)和置信区间(条)。
58.图2如实施例2所述施用多价men糖缀合物疫苗后第28天和第42天小鼠中的mena igg滴度。显示个体动物的值(点)，具有几何平均值(柱)和置信区间(条)。
59.图3如实施例2所述的施用多价men糖缀合物疫苗后第28天和第42天小鼠中的menc igg滴度。显示个体动物的值(点)，具有几何平均值(柱)和置信区间(条)。
60.图4如实施例2所述的施用多价men糖缀合物疫苗后第28天和第42天小鼠中的menw igg滴度。显示个体动物的值(点)，具有几何平均值(柱)和置信区间(条)。
61.图5如实施例2所述的施用多价men糖缀合物疫苗后第28天和第42天小鼠中的meny igg滴度。显示个体动物的值(点)，具有几何平均值(柱)和置信区间(条)。
62.图6如实施例2所述的施用多价men糖缀合物疫苗后第28天和第42天的mena杀菌测定结果：使用人血浆作为补体源(hsba)的人体杀菌测定-上图；幼兔补体(ht-rsba)-下图。
63.图7如实施例2所述的施用多价men糖缀合物疫苗后第28天和第42天的menc杀菌测定结果：使用人血浆作为补体源(hsba)的人体杀菌测定-上图；幼兔补体(ht-rsba)-下图。
64.图8如实施例2所述的施用多价men糖缀合物疫苗后第28天和第42天的menw杀菌测定结果：使用人血浆作为补体源(hsba)的人体杀菌测定-上图；幼兔补体(ht-rsba)-下图。
65.图9如实施例2所述的施用多价men糖缀合物疫苗后第28天和第42天的meny杀菌测定结果：使用人血浆作为补体源(hsba)的人体杀菌测定-上图；幼兔补体(ht-rsba)-下图。
具体实施方式
66.本公开涉及可用于针对糖缀合物抗原引发免疫应答的组合物和方法。
67.本发明提供了一种向受试者施用糖缀合物的方法，所述方法包括以下步骤：
68.(i)施用第一剂量的糖缀合物；
69.(ii)随后施用第二剂量的糖缀合物；
70.其中所述第一剂量中糖缀合物的量为第二剂量中糖缀合物的量的1/5至1/500。
71.本发明还提供了一种向受试者施用糖缀合物的方法，所述方法包括以下步骤：
72.(i)施用第一剂量的0.005至2ug的糖缀合物；
73.(ii)随后施用第二剂量的1至30ug的糖缀合物，
74.其中所述第二剂量中糖缀合物的量为第一剂量中糖缀合物的量的至少两倍。
75.本发明还提供了一种向受试者施用糖缀合物的方法，所述方法包括以下步骤：
76.(i)施用第一剂量的1/5至1/500标准剂量的糖缀合物；
77.(ii)随后施用第二剂量的1/2至2倍标准剂量的糖缀合物。
78.还提供了一种用于在包括以下步骤的方法中向受试者施用的糖缀合物：
79.(i)施用第一剂量的糖缀合物；
80.(ii)随后施用第二剂量的糖缀合物；
81.其中所述第一剂量中糖缀合物的量为第二剂量中糖缀合物的量的1/5至1/500。
82.还提供了一种用于在包括以下步骤的方法中向受试者施用的糖缀合物：
83.(i)施用第一剂量的0.005至2ug的糖缀合物；
84.(ii)随后施用第二剂量的1至30ug的糖缀合物，
85.其中所述第二剂量中糖缀合物的量为第一剂量中糖缀合物的量的至少两倍。
86.还提供了一种用于在包括以下步骤的方法中向受试者施用的糖缀合物：
87.(i)施用第一剂量的1/5至1/500标准剂量的糖缀合物；
88.(ii)随后施用第二剂量的1/2至2倍标准剂量的糖缀合物。
89.另外提供了糖缀合物在制备用于在包括以下步骤的方法中向受试者施用的药物中的用途：
90.(i)施用第一剂量的糖缀合物；
91.(ii)随后施用第二剂量的糖缀合物；
92.其中所述第一剂量中糖缀合物的量为第二剂量中糖缀合物的量的1/5至1/500。
93.另外提供了糖缀合物在制备用于在包括以下步骤的方法中向受试者施用的药物中的用途：
94.(i)施用第一剂量的0.005至2ug的糖缀合物；
95.(ii)随后施用第二剂量的1至30ug的糖缀合物，
96.其中所述第二剂量中糖缀合物的量为第一剂量中糖缀合物的量的至少两倍。
97.另外提供了糖缀合物在制备用于在包括以下步骤的方法中向受试者施用的药物中的用途：
98.(i)施用第一剂量的1/5至1/500标准剂量的糖缀合物；
99.(ii)随后施用第二剂量的1/2至2倍标准剂量的糖缀合物。
100.还提供了一种试剂盒，其包含：
101.(i)第一剂量的糖缀合物；
102.(ii)第二剂量的糖缀合物；
103.其中所述第一剂量中糖缀合物的量为第二剂量中糖缀合物的量的1/5至1/500。
104.还提供了一种试剂盒，其包含：
105.(i)第一剂量的0.005至2ug的糖缀合物；
106.(ii)第二剂量的1至30ug的糖缀合物，
107.其中所述第二剂量中糖缀合物的量为第一剂量中糖缀合物的量的至少两倍。
108.还提供了一种试剂盒，其包含：
109.(i)施用第一剂量的1/5至1/500标准剂量的糖缀合物；
110.(ii)随后施用第二剂量的1/2至2倍标准剂量的糖缀合物。
111.本发明还提供了一种向受试者施用糖缀合物的方法，所述方法包括以下步骤：
112.(i)施用第一剂量的0.005至2ug的糖缀合物；
113.(ii)随后施用第二剂量的0.005至2ug的糖缀合物，
114.其中所述第二剂量中糖缀合物的量为第一剂量中糖缀合物的量的1/2至5倍。
115.本发明还提供了一种向受试者施用糖缀合物的方法，所述方法包括以下步骤：
116.(i)施用第一剂量的1/5至1/500标准剂量的糖缀合物；
117.(ii)随后施用第二剂量的1/5至1/500标准剂量的糖缀合物，
118.其中所述第二剂量中糖缀合物的量为第一剂量中糖缀合物的量的1/2至5倍。
119.还提供了一种用于在包括以下步骤的方法中向受试者施用的糖缀合物：
120.(i)施用第一剂量的0.005至2ug的糖缀合物；
121.(ii)随后施用第二剂量的0.005至2ug的糖缀合物，
122.其中所述第二剂量中糖缀合物的量为第一剂量中糖缀合物的量的1/2至5倍。
123.还提供了一种用于在包括以下步骤的方法中向受试者施用的糖缀合物：
124.(i)施用第一剂量的1/5至1/500标准剂量的糖缀合物；
125.(ii)随后施用第二剂量的1/5至1/500标准剂量的糖缀合物
126.其中所述第二剂量中糖缀合物的量为第一剂量中糖缀合物的量的1/2至5倍。
127.另外提供了一种糖缀合物在制备用于在包括以下步骤的方法中向受试者施用的药物中的用途：
128.(i)施用第一剂量的0.005至2ug的糖缀合物；
129.(ii)随后施用第二剂量的0.005至2ug的糖缀合物，
130.其中所述第二剂量中糖缀合物的量为第一剂量中糖缀合物的量的1/2至5倍。
131.另外提供了一种糖缀合物在制备用于在包括以下步骤的方法中向受试者施用的药物中的用途：
132.(i)施用第一剂量的1/5至1/500标准剂量的糖缀合物；
133.(ii)随后施用第二剂量的1/5至1/500标准剂量的糖缀合物，
134.其中所述第二剂量中糖缀合物的量为第一剂量中糖缀合物的量的1/2至5倍。
135.还提供了一种试剂盒，其包含：
136.(i)第一剂量的0.005至2ug的糖缀合物；
137.(ii)第二剂量的0.005至2ug的糖缀合物，
138.其中所述第一剂量中糖缀合物的量为第二剂量中糖缀合物的量的1/2至5倍。
139.还提供了一种试剂盒，其包含：
140.(i)第一剂量的1/5至1/500标准剂量的糖缀合物；
141.(ii)第二剂量的1/5至1/500标准剂量的糖缀合物，
142.其中所述第一剂量中糖缀合物的量为第二剂量中糖缀合物的量的1/2至5倍。
143.本发明提供了一种向受试者施用糖缀合物的方法，所述方法包括以下步骤：
144.(i)施用第一剂量的糖缀合物；
145.(ii)随后施用第二剂量的糖缀合物；
146.其中所述第一剂量中糖缀合物的量为第二剂量中糖缀合物的量的1/20至1/5000。
147.本发明还提供了一种向受试者施用糖缀合物的方法，所述方法包括以下步骤：
148.(i)施用第一剂量的0.0005至0.5ug的糖缀合物；
149.(ii)随后施用第二剂量的1至30ug的糖缀合物。
150.本发明还提供了一种向受试者施用糖缀合物的方法，所述方法包括以下步骤：
151.(i)施用第一剂量的1/10至1/2000标准剂量的糖缀合物；
152.(ii)随后施用第二剂量的1/2至2倍标准剂量的糖缀合物。
153.还提供了一种用于在包括以下步骤的方法中向受试者施用的糖缀合物：
154.(i)施用第一剂量的糖缀合物；
155.(ii)随后施用第二剂量的糖缀合物；
156.其中所述第一剂量中糖缀合物的量为第二剂量中糖缀合物的量的1/20至1/5000。
157.还提供了一种用于在包括以下步骤的方法中向受试者施用的糖缀合物：
158.(i)施用第一剂量的0.0005至0.5ug的糖缀合物；
159.(ii)随后施用第二剂量的1至30ug的糖缀合物。
160.还提供了一种用于在包括以下步骤的方法中向受试者施用的糖缀合物：
161.(i)施用第一剂量的1/10至1/2000标准剂量的糖缀合物；
162.(ii)随后施用第二剂量的1/2至2倍标准剂量的糖缀合物。
163.另外提供了一种糖缀合物在制备用于在包括以下步骤的方法中向受试者施用的药物中的用途：
164.(i)施用第一剂量的糖缀合物；
165.(ii)随后施用第二剂量的糖缀合物；
166.其中所述第一剂量中糖缀合物的量为第二剂量中糖缀合物的量的1/20至1/5000。
167.另外提供了一种糖缀合物在制备用于在包括以下步骤的方法中向受试者施用的药物中的用途：
168.(i)施用第一剂量的0.0005至0.5ug的糖缀合物；
169.(ii)随后施用第二剂量的1至30ug的糖缀合物。
170.另外提供了一种糖缀合物在制备用于在包括以下步骤的方法中向受试者施用的药物中的用途：
171.(i)施用第一剂量的1/10至1/2000标准剂量的糖缀合物；
172.(ii)随后施用第二剂量的1/2至2倍标准剂量的糖缀合物。
173.还提供了一种试剂盒，其包含：
174.(i)第一剂量的糖缀合物；
175.(ii)第二剂量的糖缀合物；
176.其中所述第一剂量中糖缀合物的量为第二剂量中糖缀合物的量的1/20至1/5000。
177.还提供了一种试剂盒，其包含：
178.(i)第一剂量的0.0005至0.5ug的糖缀合物；
179.(ii)第二剂量的1至30ug的糖缀合物。
180.还提供了一种试剂盒，其包含：
181.(i)第一剂量的1/10至1/2000标准剂量的糖缀合物；
182.(ii)第二剂量的1/2至2倍标准剂量的糖缀合物。
183.糖缀合物
184.用于本发明的糖缀合物是通过将糖共价连接至载体蛋白而获得的。糖缀合物在本领域中是众所周知的，且关于糖、载体及其缀合物的选择的大量信息是可用的(参见，例如，berti，2018；micoli，2019)。因此，糖缀合物是人工构建体并且不是天然存在的。
185.糖
186.任何病毒、真菌、细菌或真核动物糖均可用于制备根据本发明用途的糖缀合物。糖可以简单地自一个来源中分离或自所述来源中分离并随后修饰。
187.修饰可以包括调整大小(sizing)(参见例如ep 497524和ep 497525；szu，1986)，例如通过微流化。可以对多糖进行调整大小，以降低多糖样品中的粘度和/或改善缀合产物的可过滤性。寡糖具有低数目的重复单位(通常为5-30个重复单位)，并且通常为水解的多糖。
188.合适的糖包括细菌糖，尤其是细菌荚膜糖。糖，例如细菌荚膜糖，可以源自选自以下细菌：脑膜炎奈瑟氏球菌例如血清型a(mena)、b(menb)、c(menc)、w135(menw)、y(meny)或x(menx)；肺炎链球菌例如血清型1、2、3、4、5、6a、6b、7f、8、9n、9v、10a、11a、12f、14、15b、17f、18c、19a、19f、20、22f、23f或33f；b组链球菌例如ia、ib、ii、iii、iv、v、vi或vii组；金黄色葡萄球菌5型；金黄色葡萄球菌8型；伤寒沙门氏菌(vi糖)，霍乱弧菌(vibrio cholerae)或b型流感嗜血杆菌。
189.糖的重均分子量可以为1000-2000000、5000-1000000、10000-500000、50000-400000、75000-300000或100000-200000da。本文中糖的分子量或平均分子量是指在缀合之前测定的糖的重均平均分子量(mw)并且通过malls测定。malls技术是在本领域中是众所周知的。对于糖的malls分析，可以组合使用两根柱，并且在水中洗脱糖。使用光散射检测器(例如，配备488nm的10mw氩激光器的wyatt dawn dsp)和干涉折射计(例如，配备p100池和在498nm的红色滤光片的wyatt otilab dsp)检测糖。在一个实施方案中，糖的多分散性为1-1.5、1-1.3、1-1.2、1-1.1或1-1.05并且在缀合至载体蛋白后，缀合物的多分散性为1.0-2.5、1.0-2.0、1.0-1.5、1.0-1.2、1.5-2.5、1.7-2.2或1.5-2.0。所有多分散性均通过malls测定。
190.糖可以是天然糖，或可以通过不超过2、4、6、8、10或20倍的因子调整大小(例如通过微流化[例如通过emulsiflex c-50设备]或其它技术[例如热、化学、氧化、超声方法])。寡糖可以进一步实质上调整大小(例如通过已知的热、化学或氧化方法)。
[0191]
为了本发明的目的，“天然多糖”是指未经处理的糖，处理的目的是减小糖的大小。在常规纯化工艺中多糖的尺寸可被轻微减小。这样的糖仍是天然的。只要多糖经过调整大小的工艺或其它有意修饰，该多糖就不被认为是天然多糖。
[0192]
为了本发明的目的，“以最高x2的因子调整大小”是指糖经过目的是降低糖的大小，但仍保留超过天然多糖大小的一半的大小的处理。x3、x4等等以相同的方式解释，即对多糖进行目的是减少多糖的大小，但仍保留天然多糖大小的1/3、1/4等等以上的大小的处理。
[0193]
糖也可以通过包括化学合成或酶促方法的方法合成或半合成地制备(参见，例如，berti，2018)。
[0194]
载体
[0195]
术语“蛋白载体”意欲涵盖小肽和大的多肽(》10kda)。蛋白载体可以包含一个或多个t辅助表位的任何合适的肽或蛋白(pichichero，2013)。
[0196]
合适的载体蛋白包括细菌毒素或类毒素，例如白喉类毒素或破伤风类毒素。还可以使用毒素或类毒素的片段，例如破伤风类毒素片段c(wo 2005000346)。一种确定的载体蛋白为白喉棒状杆菌蛋白毒素的非毒性突变体，被称为交叉反应物质197(crm197或crm
197
)。crm197经过充分表征，并且目前在美国、欧洲及其它地区获得许可用于糖基结合疫苗(例如，b型流感嗜血杆菌、c型脑膜炎球菌和多价肺炎球菌结合疫苗)。
[0197]
其他合适的载体蛋白包括破伤风毒素的非毒性突变体和白喉毒素的非毒性突变体(例如crm176、crm228、crm45(uchida，1973)；crm9、crm102、crm103、crm107及nicholls和youle(1992)中描述的其他突变体；glu-148的缺失或至asp、gln或ser突变，和/或ala-158至gly的突变，及us 4709017或us 4950740中公开的其他突变；至少一个或多个残基lys-516、lys-526、phe-530和/或lys-534的突变及us5917017或us 6455673中公开的其他突变；或us 5843711中公开的片段)。其它合适的载体蛋白包括gbs表面蛋白或其片段，例如α样表面蛋白家族(alp1、alp2、alp3、alp4)、rib和alpha c表面蛋白的n-末端结构域，及其融合物(参见，例如，wo 94/10317；wo 94/21685；wo 2008127179；wo 2017068112；maeland，2015；lindahl，2007)。
[0198]
其它合适的载体蛋白为gbs菌毛蛋白，包括结构菌毛骨架蛋白(bp)和辅助蛋白ap1和ap2。参见，例如，wo 2013124473、wo 2011121576、wo 2016020413。
[0199]
可能的载体包括：
[0200]-肺炎球菌溶血素(kuo，1995)，如脱毒的溶血素(dply)，例如已经通过甲醛处理脱毒的溶血素；
[0201]-ompc(脑膜炎球菌外膜蛋白-通常自脑膜炎奈瑟氏球菌血清型b提取-ep 0372501；donnelly，1990)；
[0202]-合成肽(ep 0378881、ep 0427347)；
[0203]-热休克蛋白(wo 93/17712、wo 94/03208)；
[0204]-百日咳蛋白(wo 98/58668、ep 0471177)、细胞因子、淋巴因子、生长因子或激素(wo 91/01146)、包含来自各种病原体衍生抗原的多重人cd4 t细胞表位的人工蛋白(falugi，2001)例如n19蛋白(baraldoi，2004)、肺炎球菌表面蛋白pspa(wo 02/091998)、铁摄取蛋白(wo 01/72337)、艰难梭菌(c.difficile)的毒素a或b(wo 00/61761)；
[0205]-流感嗜血杆菌蛋白d(ep 594610和wo 00/56360)，例如，来自ep 0594610的图9(图9a和图9b共同，364个氨基酸)的蛋白d序列。蛋白d可作为全长蛋白或作为片段使用。例如，蛋白d可以包含ep0594610中描述的缺乏来自ep 0594610的图9的19n-末端氨基酸的蛋白d片段，任选地具有如wo 2017/067962a1中描述的与所述蛋白d片段的n-末端(348个氨基酸)融合的来自ns1的三肽mdp；
[0206]-肺炎球菌phta(wo 98/18930，也称为sp36)；
[0207]-肺炎球菌phtd(wo 00/37105中公开，并且也称为sp036d)；
[0208]-肺炎球菌phtb(wo 00/37105中公开，并且也称为sp036b)；以及
[0209]-肺炎球菌phte(wo 00/30299中公开，并且也称为bvh-3)。
[0210]
作为载体尤其感兴趣的是：
[0211]-破伤风类毒素；
[0212]-白喉类毒素；
[0213]-crm197；
[0214]-ompc；以及
[0215]-流感嗜血杆菌蛋白d。
[0216]
缀合
[0217]
糖共价缀合至载体。缀合可以是直接的或可以是通过接头间接的。糖和/或载体可经修饰以引入促进缀合的合适的反应性基团。
[0218]
糖与载体蛋白缀合是已知的技术(参见，例如，hermanson，bioconjugate techniques)(1996))。本发明中使用的糖缀合物可以通过任何合适的偶联技术制备。
[0219]
通常，在蛋白载体上以下类型的化学基团可以用于缀合：
[0220]
a)羧基(例如经由天冬氨酸或谷氨酸)，该基团可以利用碳二亚胺化学缀合至糖部分上的天然或衍生的氨基；
[0221]
b)氨基(例如经由赖氨酸)，该基团可以利用碳二亚胺化学缀合至糖部分上的天然或衍生的羧基；
[0222]
c)巯基(例如经由半胱氨酸)；
[0223]
d)羟基(例如经由酪氨酸)；
[0224]
e)咪唑基(例如经由组氨酸)；
[0225]
f)胍基(例如经由精氨酸)；以及
[0226]
g)吲哚基(例如经由色氨酸)。
[0227]
在糖上，通常以下基团可以用于偶联：oh、cooh或nh2。醛基可以在本领域已知的不同处理后生成，所述处理例如：高碘酸盐处理、酸水解、过氧化氢等。
[0228]
如wo 2007/000343和wo 2016/178123中公开了缀合方法，其为了描述用于实施本发明的缀合方法和缀合物的目的通过引用并入本文。
[0229]
缀合方法可以依赖糖用1-氰基-4-二甲基氨基吡啶鎓四氟硼酸盐(cdap)的活化，以形成氰酸酯(参见wo 95/08348和wo 96/29094)。缀合物还可以通过如us 4365170(jennings)和us 4673574(anderson)中描述的直接还原胺化方法进行制备。
[0230]
碳二亚胺化学(例如，使用edac)对于缀合反应是非常方便的，因为它利用糖和/或蛋白上的基团，这些基团可以天然存在或容易通过衍生化插入。它还方便地通过肽键连接部分。碳二亚胺(rn＝c＝nr')是具有丙二烯结构的不饱和化合物(nakajima，1995；hoare，1967)。
[0231]
衍生化可以通过加入异双功能的或同双功能的接头进行。它可以如以上对于糖-蛋白缀合步骤描述的类似化学反应(例如，cdap或碳二亚胺化学反应)发生。接头可以具有4-20、4-12或5-10个碳原子。它可以具有两个反应性氨基、两个反应性羧基或各自一个(例如己二胺、6-氨基己酸或己二酸二酰肼)。通常，衍生化通过使大量过量的接头与待衍生化的糖和/或蛋白载体反应进行。这允许衍生化以最小的部分内交联发生(否则如果例如使用
碳二亚胺缩合将糖上的羧基用氨基衍生化，则这也许是可能的)。使用例如渗滤的技术容易地除去过量的接头。
[0232]
载体蛋白通常以10-100、20-90、20-80、30-70、35-60或40-50ug的总剂量存在于疫苗剂量中。
[0233]
组合物可包括少量游离(非缀合)载体分子。载体分子的非缀合形式作为整体优选地不超过组合物中载体蛋白的总量的5重量％，并且更优选地2重量％或更少。
[0234]
通常使用的糖缀合物具有糖：蛋白比率(w/w)在1：5(即过量蛋白)和5：1(即过量糖)范围内，特别地，比率在1：5和2：1范围内。缀合物中糖与载体蛋白的比率(w/w)可使用灭菌的缀合物测定。使用lowry测定法确定蛋白的量(例如，lowry等人(1951)或peterson等人(1979))并且可以使用标准技术确定糖的量。
[0235]
除了化学缀合之外，蛋白聚糖偶联技术(pgct)可简化缀合物制备，并且已被率先用于新型糖缀合物疫苗的设计。使用这种方法，糖抗原和载体蛋白均在宿主细胞中表达，例如大肠杆菌，并在体内偶联。(参见，例如，micoli，2019)。
[0236]
gbs
[0237]
无乳链球菌(b组链球菌或gbs)荚膜是帮助细菌逃避人先天免疫防御的主要毒力因子。gbs荚膜由多个相同的4-7个单糖的重复单元制成的高分子量聚合物组成。根据荚膜多糖重复单元的化学组成和糖苷键模式，gbs可以分类为10种血清型(ia、ib、ii、iii、iv、v、vi、vii、viii和ix)。还已知存在gbs的不可分型菌株。gbs cps的结构的描述可以在公开文献中找到(参见例如，wo 2012/035519；pinto，2014)。
[0238]
gbs疫苗设计面临的一个挑战是gbs荚膜多糖(cps)的天然多样性。已发现gbs的10种血清型抗原性上是独特的。gbs血清型之间几乎没有或没有交叉保护。据估计，全球65-95％的致病分离株是血清型ia、ib或iii(lin，1998；davies，2001)。据估计，这三种gbs血清型(ia、ib和iii)在欧洲和美国导致65％至75％的eod gbs疾病，以及80-90％的lod(参见，例如，edmond，2012；madhi，2013；phares，2008)。
[0239]
针对每种gbs血清型ia、ib、ii、iii、iv和v的糖缀合物疫苗已各自证明对人具有免疫原性。本发明使用的糖缀合物可以包含选自任何致病血清型的gbs荚膜糖。由于血清型的流行在地理区域之间不同，可以针对具体区域设计疫苗组合物。疫苗通常设计为包含在使用的地理区域最流行的致病血清型的gbs cps抗原。
[0240]
本发明可以利用包含来自gbs血清型的荚膜糖的糖缀合物，所述gbs血清型选自ia、ib、ii、iii、iv、v、vi、vii、viii或ix。本发明可以利用包含来自两种或更多种gbs血清型的荚膜糖的多种糖缀合物的组合物。在一个实施方案中，本发明利用包含gbs血清型ia cps的糖缀合物。在另一个实施方案中，本发明利用包含选自以下的gbs cps糖缀合物的组合的组合物：ia和ib；ia和iii；ib和iii；ia、ib和iii；以及ia、ib、iii和v。因此，本发明可以包括使用一价、二价、三价、四价、五价、六价、七价、八价、九价或十价组合物。合适的六价组合物包含来自gbs血清型ia、ib、ii、iii、iv和v的gbs cps糖缀合物。
[0241]
根据本发明使用的gbs荚膜糖可以是其天然形式或可以是经过修饰的。例如，糖可以比天然荚膜糖短，或者可以经化学修饰或解聚。参见例如，wo 2006050341或guttormsen，2008。
[0242]
与gbs多糖共同使用的特别感兴趣的载体是crm197、dt、tt或gbs蛋白(例如，gbs表
面蛋白或菌毛蛋白)，特别地crm197、dt或tt，例如crm197。
[0243]
已经描述了gbs cps与载体蛋白的缀合(参见，例如，wo2012035519)。
[0244]
gbs糖缀合物的标准人类剂量通常为5ug。在包含多种gbs血清型糖缀合物的多价疫苗中，每种血清型糖缀合物的标准人类剂量通常为5ug。对于以tt、dt或crm197作为载体蛋白的三价gbs结合疫苗，在与5ug每种糖的缀合中，考虑20-80ug的载体蛋白总剂量。
[0245]
hib
[0246]
流感嗜血杆菌是革兰氏阴性球杆菌。大多数引起侵袭性疾病的流感嗜血杆菌菌株为b型。b型流感嗜血杆菌可导致如败血症和脑膜炎的侵袭性疾病。针对聚核糖基-核糖醇-磷酸的抗体(抗prp)的特定水平已被证明与针对由b型流感嗜血杆菌导致的侵袭性疾病的保护相关。因此，hib prp糖是令人感兴趣的。
[0247]
与hib prp共同使用的特别感兴趣的载体是crm197、dt、tt和ompc，特别地tt。
[0248]
已经描述了hib与载体蛋白的缀合(参见，例如，wo 2007000343)。
[0249]
hib糖缀合物的标准人类剂量通常为10ug糖。考虑10-40ug的载体蛋白剂量。
[0250]
men a
[0251]
脑膜炎球菌血清型a荚膜糖可以通过如wo 03/007985、wo2007000343或wo 2018045286中描述的那些方法获得。用于缀合的mena荚膜糖可以是全长天然序列或可以是减小尺寸的。
[0252]
天然的糖可以部分水解以降低聚合度(dp)，例如至约10，如通过总有机磷和单酯磷酸之间的(w/w)比率确定的。(总有机磷)与(磷单酯)的dp比率与旋光强度(α)成反比，可使用这种关系比直接测定磷更方便地监测水解程度。
[0253]
尺寸调整可应用于去除低分子量和/或高分子量的糖。例如，水解产物可以通过诸如30kda的高截留膜过滤(例如，渗滤或超滤)，并弃去渗留物以去除高分子量糖。可以通过诸如q sepharose fast flow柱的这种柱色谱法去除低分子量糖如那些dp≤6的糖，以提供平均dp约15的寡糖。也可以通过低截留膜过滤(例如，渗滤或超滤)去除低分子量糖如那些dp≤6的糖，并弃去滤液。
[0254]
寡糖可以通过在还原末端引入伯氨基，例如通过使用氰基硼氢化钠，进行修饰以促进缀合。然后可以使用缀合化学诸如使用己二酸n-羟基琥珀酰亚胺二酯将衍生寡糖偶联至载体。
[0255]
与mena共同使用的特别感兴趣的载体是crm197、dt和tt，特别地crm197。
[0256]
已经描述了mena与载体蛋白的缀合(参见，例如，wo 03/007985和wo 2007000343)。
[0257]
mena糖缀合物的标准人类剂量通常为10ug糖。考虑载体蛋白剂量为5-40ug。
[0258]
menc
[0259]
脑膜炎球菌血清型c荚膜糖可以通过如constantino，1999；wo 2007000343或wo 2018045286中描述的那些方法获得。
[0260]
天然的糖可以部分水解以降低聚合度(dp)，例如至约10。在去-o-乙酰化和高碘酸盐处理后确定menc寡糖的avdp。avdp表示高碘酸盐处理产生的总唾液酸和甲醛之间的摩尔比。
[0261]
尺寸调整可应用于去除低分子量和/或高分子量的糖。例如，水解产物可以通过诸
如30kda的高截留膜过滤(例如，渗滤或超滤)，并弃去渗留物以去除高分子量糖。可以通过诸如q sepharose fast flow柱的这种柱色谱法去除如那些dp≤6的糖的低分子量糖，以提供平均dp约15的寡糖。也可以通过低截留膜过滤(例如，渗滤或超滤)去除如那些dp≤6的糖的低分子量糖，并弃去滤液。
[0262]
寡糖可以通过在还原末端引入伯氨基，例如通过使用氰基硼氢化钠，进行修饰以促进缀合。然后可以使用缀合化学诸如使用己二酸n-羟基琥珀酰亚胺二酯将衍生寡糖偶联至载体。
[0263]
用于menc的特别感兴趣的载体是crm197、dt和tt，特别地crm197。
[0264]
已经描述了menc与载体蛋白的缀合(参见，例如，wo 2007000343)。
[0265]
menc糖缀合物的标准人类剂量通常为5ug糖。考虑载体蛋白剂量为5-20ug。
[0266]
menw
[0267]
脑膜炎球菌血清型w荚膜糖可以通过如wo 03/007985或wo2018045286中描述的方法获得。
[0268]
天然的糖可以部分水解以降低聚合度(dp)，例如至约15至20，如由唾液酸(sa)与还原末端sa之间的比率确定的。(总sa)与(还原末端sa)的dp比率与通过hplc-sec测定的kd相关。可使用这种关系比直接测定sa更方便地监测水解程度。
[0269]
尺寸调整可应用于去除低分子量和/或高分子量的糖。例如，水解产物可以通过诸如30kda的高截留膜过滤(例如，渗滤或超滤)，并弃去渗留物以去除高分子量糖。可以通过诸如q sepharose fast flow柱的这种柱色谱法去除如那些dp≤3-4的糖的低分子量糖。也可以通过低截留膜过滤(例如，渗滤或超滤)去除如那些dp≤3-4的糖的低分子量糖，并弃去滤液。
[0270]
寡糖可以通过在还原末端引入伯氨基，例如通过使用氰基硼氢化钠，进行修饰以促进缀合。然后可以使用缀合化学诸如使用己二酸n-羟基琥珀酰亚胺二酯将衍生寡糖偶联至载体。
[0271]
与menw共同使用的特别感兴趣的载体是crm197、dt和tt，特别地crm197。
[0272]
已经描述了menw与载体蛋白的缀合(参见，例如，wo 03/007985和wo 2007000343)。
[0273]
menw糖缀合物的标准人类剂量通常为5ug糖。考虑载体蛋白剂量为5-20ug。
[0274]
meny
[0275]
脑膜炎球菌血清型y荚膜糖可以通过如wo 03/007985或wo2018045286中描述的方法获得。
[0276]
天然的糖可以部分水解以降低聚合度(dp)，例如至约15至20，如由唾液酸(sa)与还原末端sa之间的比率确定。(总sa)与(还原末端sa)的dp比率与通过hplc-sec测定的kd相关。使用这种关系监测水解程度可比直接测定sa更方便。
[0277]
尺寸调整可应用于去除低分子量和/或高分子量的糖。例如，水解产物可以通过诸如30kda的高截留膜过滤(例如，渗滤或超滤)，并弃去渗留物以去除高分子量糖。可以通过诸如q sepharose fast flow柱的这种柱色谱法去除如那些dp≤3-4的糖的低分子量糖。也可以通过低截留膜过滤(例如，渗滤或超滤)去除如那些dp≤3-4的糖的低分子量糖，并弃去滤液。
[0278]
寡糖可以通过在还原末端引入伯氨基，例如通过使用氰基硼氢化钠，进行修饰以促进缀合。然后可以使用缀合化学诸如使用己二酸n-羟基琥珀酰亚胺二酯将衍生寡糖偶联至载体。
[0279]
与meny共同使用的特别感兴趣的载体是crm197、dt和tt，特别地crm197。
[0280]
已经描述了meny缀合至载体蛋白(参见，例如，wo 03/007985和wo 2007000343)。
[0281]
meny糖缀合物的标准人类剂量通常为5ug糖。考虑载体蛋白剂量为5-20ug。
[0282]
menx
[0283]
menx荚膜多糖的结构是已知的，并且已经描述了menx糖缀合至载体(参见，例如，wo 2013174832)。
[0284]
与menx共同使用的特别感兴趣的载体是crm197、dt、蛋白d和tt，特别地crm197。
[0285]
已经描述了menx缀合至载体蛋白(参见，例如，wo 2013174832)。
[0286]
menx糖缀合物的标准人类剂量通常为5ug糖。考虑载体蛋白剂量为5-20ug。
[0287]
pcv
[0288]
肺炎球菌(肺炎链球菌)被赋予血清型特异性的化学连接多糖包裹。肺炎球菌有超过90种已知血清型，荚膜是肺炎球菌的主要毒力决定因素，因为荚膜不仅保护细菌的内表面免受补体的影响，而且其自身的免疫原性较差。抗多糖抗体水平已被认为可预测针对侵袭性肺炎球菌疾病的保护(jodar，2003)。在初次许可包含血清型4、6b、9v、14、18c、19f、23f的7价结合疫苗(pcv7)后，旨在扩大覆盖范围的两种肺炎球菌结合疫苗(pcv)已获得许可。10价肺炎球菌流感嗜血杆菌蛋白d结合疫苗(pcv10)包含缀合至不可分型流感嗜血杆菌蛋白d的血清型1、4、5、6b、7f、9v、14和23f，以及缀合至破伤风类毒素的血清型18c和缀合至白喉类毒素的血清型19f。13价肺炎球菌结合疫苗(pcv13)包含pcv7(4、6b、9v、14、18c、19f、23f)血清型以及缀合至交叉反应性物质crm197的血清型1、3、5、6a、7f和19a。
[0289]
肺炎球菌糖通常选自以下血清型1、2、3、4、5、6a、6b、7f、8、9n、9v、10a、11a、12f、14、15b、15c、17f、18c、19a、19f、20、22f、23f和33f，尽管可以理解，根据接种疫苗的接种者的年龄和疫苗施用的地理区域，可以替换一种或两种其它血清型。通常组合物将包含糖缀合物，其中所述多糖源自至少10种肺炎链球菌血清型。所述组合物可包含肺炎球菌糖缀合物，所述肺炎球菌糖缀合物包含其中所述多糖源自肺炎链球菌血清型1、4、5、6b、7f、9v、14、18c、19f和23f的糖缀合物(或基本上由其组成)。所述组合物可包含肺炎球菌糖缀合物，所述肺炎球菌糖缀合物包含糖缀合物(或基本上由其组成)，其中所述多糖源自肺炎链球菌血清型1、3、4、5、6a、6b、7f、9v、14、18c、19a、19f和23f。所述组合物可包含肺炎球菌糖缀合物，所述肺炎球菌糖缀合物包含糖缀合物(或基本上由其组成)，其中所述多糖源自肺炎链球菌血清型1、3、4、5、6b、7f、9v、14、18c、19a、19f、22f、23f和33f。所述组合物可包含肺炎球菌糖缀合物，所述肺炎球菌糖缀合物包含糖缀合物(或基本上由其组成)，其中所述多糖源自肺炎链球菌血清型1、3、4、5、6a、6b、7f、9v、14、18c、19a、19f、22f、23f和33f。所述组合物可包含肺炎球菌糖缀合物，所述肺炎球菌糖缀合物包含糖缀合物(或基本上由其组成)，其中所述多糖源自肺炎链球菌血清型1、3、4、5、6a、6b、7f、9v、12f、14、18c、19a、19f、22f、23f和33f。所述组合物可包含肺炎球菌糖缀合物，所述肺炎球菌糖缀合物包含糖缀合物(或基本上由其组成)，其中所述多糖源自肺炎链球菌血清型1、3、4、5、6a、6b、7f、8、9v、10a、11a、12f、14、15b、18c、19a、19f、22f、23f和33f。
[0290]
与肺炎球菌糖共同使用的特别感兴趣的载体是crm197、dt、蛋白d和tt。
[0291]
肺炎球菌糖缀合物的标准人类剂量对于血清型1、5、6b、7f、9v、14和23f为1ug糖和对于血清型4、18c和19f为3ug糖。
[0292]
伤寒沙门氏菌
[0293]
micoli，2012和rondini，2012已经描述了基于来自纯化的citrobacter freundii sensu lato的vi和crm
197
蛋白载体的伤寒沙门氏菌疫苗缀合物。在人体中测试时，vi-crm
197
结合疫苗在单次免疫后和较低剂量下，相比于非缀合的vi提供更高的抗vi抗体应答(van damme，2011；进一步的结果在8th international conference on typhoid fever and other invasive salmonelloses，孟加拉国，2013年3月给出)。然而，再次疫苗接种后的抗vi应答低于初次应答，且抗vi持续时间低于预期(bhutta，2014)。
[0294]
vi多糖的重复单元为：
[0295][0296]
其中r为h或乙酰基。
[0297]
已经描述了改进的缀合物，参见wo 2015068129，其利用具有平均分子量40-55kda的片段vi多糖。
[0298]
优选地多糖具有至少60％o-乙酰化。
[0299]
与沙门氏菌vi多糖共同使用的特别感兴趣的载体是crm197、dt和tt，特别地crm197。
[0300]
已经描述了v1糖缀合至载体蛋白(参见，例如，wo 2007000343、wo 2009150543、wo 2013038375和wo 2015068129)。
[0301]
vi糖缀合物的标准人类剂量通常为25ug糖。考虑载体蛋白总剂量为10-50ug。
[0302]
多价方法
[0303]
方便地，可以使用针对多种病原体和/或多种病原体亚型(例如，血清型等)的多价疫苗。在这种情况下，每个载体蛋白分子可以缀合至仅一种类型的糖。然而，载体蛋白可以缀合至多于一个分子的特定糖。仅将一种类型的糖缀合至载体简化了缀合过程，并由此提供了对缀合过程的更好控制。
[0304]
在疫苗组合物中使用多于一种载体蛋白是已知的，例如，以降低载体抑制的风险。因此，不同的载体蛋白可用于不同类型的糖。对于特定类型的糖，也可以使用多于一种载体蛋白，例如，糖的类型可以分为两组，一些缀合至crm197，另一些缀合至破伤风类毒素。
[0305]
特别感兴趣的多价方法包括糖缀合物的组合物：
[0306]-脑膜炎奈瑟氏球菌糖缀合物，例如包含mena、menc、menw和meny糖缀合物(或基本上由其组成)的组合，特别地与crm197、dt和/或tt载体；
[0307]-肺炎球菌糖缀合物，例如包含血清型1、4、5、6b、7f、9v、14、18c、19f和23f糖缀合物(或基本上由其组成)的组合，特别地与crm197、dt、蛋白d和/或tt载体；以及
[0308]-gbs糖缀合物，例如包含血清型ia、ib和iii糖缀合物，特别地血清型ia、ib、ii、
iii、iv和v糖缀合物(或基本上由其组成)的组合，特别地与crm197、dt和/或tt载体。
[0309]
当组合物包含多种糖缀合物时，每种糖缀合物的量是独立地处理的。
[0310]
在可能共同配制的情况下，多价方法方便地涉及施用包含多种糖缀合物组分的单一组合物。然而，应当理解，多价方法可以替代地涉及通过相同或不同途径基本上同时施用多种组合物。
[0311]
佐剂
[0312]“佐剂”是以非抗原特异性方式增强免疫应答产生的试剂。当与抗原结合使用时，佐剂可以使得能够更强诱导或以其他方式改善对抗原的免疫应答。
[0313]
在本发明的一些实施方案中，第一剂量为未加佐剂的。在本发明的其它实施方案中，第一剂量为加佐剂的。
[0314]
在本发明的一些实施方案中，第二剂量为未加佐剂的。在本发明的其它实施方案中，第二剂量为加佐剂的。
[0315]
当第一剂量和第二剂量加佐剂时，合适地佐剂是相同的。
[0316]
当存在时，佐剂的存在量通常足以增强接受者对糖缀合物的免疫应答(相比于无佐剂时获得的应答)。
[0317]
佐剂的实例包括但不限于无机佐剂(例如，诸如磷酸铝或氢氧化铝的无机金属盐)、有机佐剂(例如，诸如qs21的皂苷或角鲨烯)、油基佐剂(例如，弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂)、细胞因子(例如，il-1β、il-2、il-7、il-12、il-18、gm-cfs和inf-γ)、颗粒佐剂(例如，免疫刺激复合物(iscoms)、脂质体或可生物降解微球)、病毒体、细菌佐剂(例如，诸如3-脱-o-酰化单磷酰脂质a(3d-mpl)或胞壁酰肽的单磷酰脂质a)、合成佐剂(例如，非离子嵌段共聚物、胞壁酰肽类似物或合成脂质a)、合成多核苷酸佐剂(例如，聚精氨酸或聚赖氨酸)和包含未甲基化cpg二核苷酸(“cpg”)的免疫刺激性寡核苷酸。特别合适的佐剂选自皂苷、tlr4激动剂(例如，3d-mpl、gla或crx601)、tlr7激动剂、tlr8激动剂、tlr9激动剂中的一种或多种。
[0318]
合适的佐剂包括诸如铝盐或钙盐(或其混合物)的无机盐。可以使用称为氢氧化铝和磷酸铝的铝盐。这些名称是常规的，但仅仅是为了方便而使用，因为它们都不是对存在的实际化合物的精确描述。本发明可以使用通常用作佐剂的任何“氢氧化物”或“磷酸盐”佐剂。称为“氢氧化铝”(“明矾”)的佐剂通常是铝氢氧化物盐。称为“磷酸铝”的佐剂通常是铝羟基磷酸盐，通常还包含少量硫酸盐(即，羟基磷酸硫酸铝)。
[0319]
其它可能的佐剂包括皂苷。quil a及其衍生物。quil a是一种从南美乔木quillaja saponaria molina中分离的皂苷制剂，dalsgaard等人于1974年首次将其描述为具有佐剂活性(“saponin adjuvants”，archiv.f
ü
r die gesamte virusforschung，第44卷，springer verlag，berlin，第243-254页)。quil a的纯化级分通过hplc分离，其保留佐剂活性而不具有与quil a相关的毒性(参见，例如，ep 0362278)。通常感兴趣的级分包括qs7、qs17、qs18和qs21，例如qs7和qs21(也称为qa7和qa21)。qs21是一种特别感兴趣的皂苷。
[0320]
在本发明的某些实施方案中，皂苷是quillaja saponaria molina quil a的衍生物，合适地quil a的免疫活性级分，例如qs7、qs17、qs18或qs21，尤其是qs21。
[0321]
通常皂苷，例如quil a，尤其是qs21，是至少90％纯，例如至少95％纯，特别地至少
98％纯，尤其是99％纯。
[0322]
qs21组分的纯度可通过在214nm处的uv吸光度作为所用皂苷中qs21组分的比例(例如，至少95％，特别地至少98％，尤其是99％)测定。本发明的一个有益特征是皂苷可以存在于反应原性较低的组合物中，其中所述皂苷可被诸如胆固醇的外源甾醇淬灭。特别地，qs21可以使用胆固醇基脂质体作为递送平台来配制。使用胆固醇淬灭的qs21显示出与游离qs21相同的免疫刺激特性，但裂解性较低且更稳定。
[0323]
tlr4激动剂作为佐剂是特别感兴趣的。tlr4激动剂的合适的实例为脂多糖，合适地脂质a的无毒衍生物，特别地单磷酰脂质a，更特别地3-脱-o-酰化单磷酰脂质a(3d-mpl)。
[0324]
其他可以使用的tlr4激动剂为如wo 98/50399或美国专利号6,303,347中描述的那些氨基烷基氨基葡糖苷磷酸盐(agps)(还描述了agps的制备方法)。有些agps是tlr4激动剂，有些是tlr4拮抗剂。一种特别感兴趣的agp为crx601：
[0325][0326]
本发明可使用的其它tlr4激动剂包括如wo 2008/153541、wo2009/143457和9,241,988或文献coler(2011)和arias ma(2012)中描述的吡喃葡萄糖基脂质佐剂(gla)。为了定义可用于本发明的tlr4激动剂的目的，wo 2008/153541、wo 2009/143457和us9,241,988通过引用并入本文。
[0327]
通常，tlr4激动剂，例如脂多糖，尤其是3d-mpl为至少90％纯，例如至少95％纯，特别地至少98％纯，尤其是99％纯。
[0328]
本发明可使用tlr7和/或tlr8激动剂(参见，例如，dowling 2018)。特别感兴趣的tlr7和/或tlr8激动剂包括：
(5-氨基-2-(2-甲基-4-(2-(2-(2-膦酰乙氧基)乙氧基)乙氧基)苯乙基)苯并[f][1,7]萘啶-8-基)丙酸的组合；
[0343]-tlr4激动剂，例如脂多糖，尤其是3d-mpl、crx601或gla，特别地3d-mpl和tlr7和/或tlr8激动剂，例如4-氨基-1-[2-(1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3三乙二醇-磷酸)乙基]-2-正丁基-1h-咪唑并[4,5-c]喹啉或(3-(5-氨基-2-(2-甲基-4-(2-(2-(2-膦酰乙氧基)乙氧基)乙氧基)苯乙基)苯并[f][1,7]萘啶-8-基)丙酸的组合。
[0344]
受试者
[0345]
本文提供的方法和免疫原性组合物可用于在有需要的受试者，尤其是哺乳动物受试者中提高免疫应答。哺乳动物可以是家养动物，诸如狗或猫，或者可以是农场动物诸如牛、猪、绵羊或鸡。合适地，受试者为人类。
[0346]
人类可以是人类儿童。例如，在施用第一剂量时，人类受试者可以小于1岁。合适地，在施用第一剂量时，人类受试者至少4周龄。或者，人类受试者在施用第一剂量时可以是1至5岁，或在施用第一剂量时可以是5至18岁。
[0347]
人类可以是成人。例如，在施用第一剂量时，人类受试者可以是18至60岁，例如18至40岁。
[0348]
人类可以是老年人。例如，在施用第一剂量时，人类受试者可以大于60岁，例如大于65岁。
[0349]
在一些实施方案中，受试者之前未接种针对适用病原体(例如，通过本发明的方法诱导的免疫应答旨在针对其提供保护的病毒、真菌或细菌)的糖缀合物疫苗，例如受试者之前未针对适用病原体接种疫苗。在其它实施方案中，受试者之前已接种针对适用病原体的疫苗，例如接种糖缀合物疫苗。
[0350]
在一些实施方案中，受试者之前未接种针对所述细菌的疫苗。在其它实施方案中，受试者之前已接种针对所述细菌的疫苗。
[0351]
施用的时机
[0352]
第二剂量通常在第一剂量后1周至12个月向受试者施用，例如在第一剂量后2周至9个月，特别地在第一剂量后3周至6个月，尤其是在第一剂量后3周至3个月，并且期望地在第一剂量后3周至2个月。例如，第二剂量可以在第一剂量后2、3、4、5、6、7、8、9或10周向受试者施用。第二剂量可以在第一剂量后2、3、4、5或6个月向受试者施用。合适地第二剂量可以在第一剂量后3至5周施用。
[0353]
可以给予糖缀合物的另外的施用，例如第三次或第四次施用。
[0354]
第二剂量通常在第一剂量后3周至12个月，例如在第一剂量后3周至9个月，特别地在第一剂量后3周至6个月，尤其是在第一剂量后3周至3个月，并且期望地在第一剂量后3周至2个月向受试者施用。例如，第二剂量可以在第一剂量后3、4、5、6、7、8、9或10周向受试者施用。第二剂量可以在第一剂量后3、4、5或6个月向受试者施用。合适地第二剂量可以在第一剂量后3至5周施用。
[0355]
可以向人类受试者给予另外的糖缀合物施用，例如第三次或第四次施用。
[0356]
在一些实施方案中，其中所述人类受试者接受第一剂量、第二剂量和第三剂量，所述第三剂量是在第一剂量后至少10个月，例如在第一剂量后至少12个月，特别地至少24个月，并且尤其是至少36个月。在其他方案中，其中所述人类受试者接受第一剂量、第二剂量
和第三剂量，所述第三剂量是在第一剂量后36个月内，例如在第一剂量后24个月内，特别地在第一剂量后12个月内。
[0357]
施用途径
[0358]
本文所述的施用通过任何合适的途径进行，包括皮内、肌内、腹膜内或皮下，特别地肌内或皮下，尤其是肌内。
[0359]
注射可通过针(例如，皮下注射针)进行，但也可使用无针注射。
[0360]
每次剂量可以通过相同或不同的途径给予，通常是相同的途径，特别地肌内。
[0361]
剂量
[0362]
合适地第一剂量中的糖缀合物的量为第二剂量中的糖缀合物的量的1/5至1/500。例如，所述第一剂量为第二剂量中的糖缀合物的量的1/100至1/500。或者，所述第一剂量为第二剂量中的糖缀合物的量的1/25至1/100。所述第一剂量可以为第二剂量中的糖缀合物的量的1/5至1/25，例如1/8至1/25或1/10至1/25。特别感兴趣的实施方案中所述第一剂量中的糖缀合物的量为第二剂量中的糖缀合物的量的1/10或1/50。
[0363]
合适地所述第一剂量为第二剂量中的糖缀合物的量的1/20至1/5000。例如，所述第一剂量为第二剂量中的糖缀合物的量的1/1000至1/5000。或者，所述第一剂量为第二剂量中的糖缀合物的量的1/100至1/1000。所述第一剂量可以为第二剂量中的糖缀合物的量的1/20至1/100。
[0364]
合适地所述第一剂量包含0.005至2ug的糖缀合物。例如，所述第一剂量中的糖缀合物的量为0.005至0.05ug。或者，所述第一剂量中的糖缀合物的量为0.05至0.3ug。所述第一剂量中的糖缀合物的量可以为0.3至1ug。特别感兴趣的实施方案中所述第一剂量中的糖缀合物的量为0.1至2ug，特别地0.3至1.5ug，尤其是0.5至1ug。同样感兴趣的实施方案中所述第一剂量中的糖缀合物的量为0.01至0.5ug，特别地0.05至0.3ug，尤其是0.1至0.2ug的实施方案。特别感兴趣的实施方案中所述第一剂量中的糖缀合物的量为0.5ug、1ug、0.1ug或0.2ug。
[0365]
合适地所述第一剂量包含0.0005至0.5ug的糖缀合物。例如，所述第一剂量中的糖缀合物的量为0.0005至0.005ug。或者，所述第一剂量中的糖缀合物的量为0.005至0.05ug。所述第一剂量中的糖缀合物的量可以为0.05至0.5ug。
[0366]
在一些实施方案中，所述第二剂量合适地包含1至30ug的糖缀合物。例如，所述第二剂量中的糖缀合物的量为1至15ug。或者，所述第二剂量中的糖缀合物的量为15至30ug。所述第二剂量中的糖缀合物的量可以为5至25ug。
[0367]
当所述第二剂量中的糖缀合物的量为第一剂量中的糖缀合物的量的至少两倍时，合适地所述第二剂量中的糖缀合物的量为第一剂量中的糖缀合物的量的至少五倍，例如第一剂量中的糖缀合物的量的5至25倍(例如，10倍)或25至100倍(例如，50倍)。
[0368]
在一些实施方案中，合适地所述第一剂量中的糖缀合物的量为糖缀合物的标准剂量的1/5至1/500。例如，所述第一剂量为糖缀合物的标准剂量的1/100至1/500。或者，所述第一剂量为糖缀合物的标准剂量的1/25至1/100。所述第一剂量可以为糖缀合物的标准剂量的1/5至1/25，例如1/8至1/25，尤其是1/10至1/25。特别感兴趣的实施方案中所述第一剂量中的糖缀合物的量为糖缀合物的标准剂量的1/10或1/50。
[0369]
在其它实施方案中，合适地所述第一剂量中的糖缀合物的量为糖缀合物的标准剂
量的1/10至1/2000。例如，所述第一剂量为糖缀合物的标准剂量的1/500至1/2000。或者，所述第一剂量为糖缀合物的标准剂量的1/50至1/500。所述第一剂量可以为糖缀合物的标准剂量的1/10至1/50。
[0370]
合适地所述第二剂量中的糖缀合物的量为糖缀合物的标准剂量的1/2至2倍。例如，所述第二剂量中的糖缀合物的量为糖缀合物的标准剂量的1/2。或者，所述第二剂量中的糖缀合物的量为糖缀合物的标准剂量的2倍。所述第二剂量中的糖缀合物的量可以为糖缀合物的标准剂量的3/4至1.25倍。
[0371]
在其它实施方案中，合适地所述第二剂量包含0.005至2ug的糖缀合物。例如，所述第二剂量中的糖缀合物的量为0.005至0.05ug。或者，所述第二剂量中的糖缀合物的量为0.05至0.3ug。所述第二剂量中的糖缀合物的量可以为0.3至1ug。特别感兴趣的技术方案中所述第二剂量中的糖缀合物的量为0.1至2ug，特别地0.3至1.5ug，尤其是0.5至1ug。同样感兴趣的技术方案中所述第二剂量中的糖缀合物的量为0.01至0.5ug，特别地0.05至0.3ug，尤其是0.1至0.2ug。特别感兴趣的技术方案中所述第二剂量中的糖缀合物的量为0.5ug、1ug、0.1ug或0.2ug。
[0372]
在一些实施方案中，合适地所述第二剂量中的糖缀合物的量为糖缀合物的标准剂量的1/5至1/500。例如，所述第二剂量为糖缀合物的标准剂量的1/100至1/500。或者，所述第二剂量为糖缀合物的标准剂量的1/25至1/100。所述第二剂量可以为糖缀合物的标准剂量的1/5至1/25，例如1/8至1/25，特别地1/10至1/25。特别感兴趣的实施方案中所述第二剂量中的糖缀合物的量为糖缀合物的标准剂量的1/10或1/50。
[0373]
当第二剂量中的糖缀合物的量为第一剂量中的糖缀合物的量的1/2至5倍时，合适地所述第二剂量中的糖缀合物的量为第一剂量中的糖缀合物的量的1/2至2倍。所述第二剂量中的糖缀合物的量可以为第一剂量中的糖缀合物的量的3/4至1.25倍。
[0374]
按重量计，糖缀合物的量基于糖缀合物中的糖的量定义。例如，按重量比计，包含第二剂量的糖缀合物的1/20的第一剂量将包含第二剂量中存在的缀合糖的量的1/20。
[0375]
在一些实施方案中，第一剂量中的糖缀合物的量和第二剂量中的糖缀合物的量相同。在其它实施方案中，第一剂量中的糖缀合物的量小于第二剂量中的糖缀合物的量。
[0376]
第一剂量的糖缀合物和第二剂量的糖缀合物可以具有与感兴趣的病原体相关的不同的糖，但尽管具有相同的糖。
[0377]
第一剂量的糖缀合物和第二剂量的糖缀合物可以具有不同的载体。第一剂量的糖缀合物和第二剂量的糖缀合物可以具有相同的载体。
[0378]
方便地，第一剂量和第二剂量的糖缀合物是相同的。
[0379]
根据本文的教导，本领域技术人员可以根据糖缀合物和感兴趣的病原体来调整第一剂量和第二剂量(以及如果存在的后续剂量)中的糖缀合物的量，以实现剂量和免疫应答的适当平衡。
[0380]
制剂
[0381]
用于向人类施用的组合物，其包含糖缀合物，通常包含药学上可接受的稀释剂和/或赋形剂。药学上可接受的稀释剂和赋形剂是众所周知的，并且可以由本领域技术人员选择。稀释剂包括无菌注射用水、生理盐水、甘油等。此外，可以存在辅料，例如润湿剂或乳化剂、ph缓冲物质等。无菌无热原、磷酸盐缓冲生理盐水是典型的稀释剂。稀释剂或赋形剂还
可以包含至少一种增加溶解度和/或延长稳定性的组分。助溶剂/稳定剂的实例包括洗涤剂，例如月桂醇聚醚肌氨酸(laurel sarcosine)和/或聚山梨醇酯。本领域已知许多药学上可接受的稀释剂和/或药学上可接受的赋形剂，并且例如remington's pharmaceutical sciences，e.w.martin著，mack出版公司，easton，pa，第5版(975)中所述。合适的制剂可能根据预期的施用途径而不同，例如肌内(im)施用。
[0382]
本发明中使用的免疫原性组合物和/或疫苗可以是含水形式(例如，溶液或悬浮液)或干燥形式(例如，冻干)。如果使用干燥疫苗，其通常在注射前用液体介质重构。本领域已知疫苗的冻干。为了在冻干过程中稳定糖缀合物，可能优选地在组合物中包括稳定剂，例如糖醇(例如，甘露醇)和/或二糖或多元醇(例如，蔗糖或海藻糖)。合适地，使用化学上不同于糖缀合物的单糖亚单元的稳定剂，以便糖的量的定量不受稳定剂存在的影响。
[0383]
可以向组合物中加入缓冲剂。液体制剂的ph根据组合物的组分和向受试者施用的所需的适宜性进行调整。合适地，液体混合物的ph为至少4、至少5、至少5.5、至少5.8、至少6。液体混合物的ph可以小于9、小于8、小于7.5或小于7。在其它实施方案中，液体混合物的ph在4和9之间、在5和8之间，例如在5.5和8之间。因此，ph合适地在6和9之间，例如6.5-8.5。在特别优选的实施方案中，ph在5.8和6.4之间。
[0384]
合适的缓冲剂可以选自乙酸盐、柠檬酸盐、组氨酸、马来酸盐、磷酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐和tris。在一个实施方案中，缓冲剂为磷酸盐缓冲剂，例如na/na2po4、na/k2po4或k/k2po4。
[0385]
缓冲剂可以以至少6mm、至少10mm或至少40mm的量存在于液体混合物中。缓冲剂可以以小于100mm、小于60mm或小于40mm的量存在于液体混合物中。
[0386]
众所周知，对于肠胃外施用，溶液应具有药学上可接受的渗透压，以避免细胞变形或裂解。药学上可接受的渗透压通常是指溶液的渗透压近似等渗或轻度高渗。合适地，在重构时，本发明的组合物将具有在250至750mosm/kg范围内的渗透压，例如，渗透压可以在250至550mosm/kg范围内，例如在280至500mosm/kg范围内。在特别优选地实施方案中，渗透压可以在280至310mosm/kg范围内。
[0387]
渗透压可以根据本领域已知的技术进行测定，例如通过使用市售的渗透压计，例如购自advanced instruments inc.(usa)的advancedtm model 2020。
[0388]“等渗剂”是生理上可耐受的化合物，并且赋予制剂合适的张力以防止水跨越与制剂接触的细胞膜的净流动。在一些实施方案中，用于所述组合物的等渗剂为盐(或盐的混合物)，方便地盐为氯化钠，合适的浓度约150nm。然而，在其它实施方案中，所述组合物包含非离子等渗剂，并且所述组合物中氯化钠的浓度小于100mm，诸如小于80mm，例如，小于50mm，诸如小于40mm，小于30mm，并且特别地小于20mm。组合物中的离子强度可以小于100mm，诸如小于80mm，例如，小于50mm，诸如小于40mm或小于30mm。
[0389]
在特别的实施方案中，非离子等渗剂为多元醇，例如蔗糖和/或山梨醇。山梨醇的浓度可以例如为约3％至约15％(w/v)，例如约4％至约10％(w/v)。wo 2012080369中描述了包含免疫活性皂苷级分和tlr4激动剂的佐剂，其中所述等渗剂为盐或多元醇。
[0390]
合适地，人类剂量体积为0.05ml至1ml，例如0.1至0.5ml，尤其是剂量体积为约0.5ml或0.7ml。所用组合物的体积可以取决于递送途径和位置，通过皮内途径给予较小剂量。单位剂量容器可能包含过量以允许在单位剂量施用期间对材料进行适当操作。
[0391]
组合物旨在用于施用，并且因此将通常以无菌注射形式提供(例如，适合肌内注射的形式)。例如，在一些实施方案中，药物组合物以适于注射的液体(例如，水性)剂型提供。
[0392]
提供了包含第一剂量和第二剂量的糖缀合物的试剂盒。此类试剂盒通常在第一容器和第二容器中各自存在第一剂量和第二剂量的糖缀合物，特别地第一容器包含单一的第一剂量和第二容器包含单一的第二剂量。
[0393]
术语
[0394]
为了便于评述本公开的各个实施方案，提供了以下术语解释。可以在本公开的上下文中提供另外的术语和解释。尽管与本文描述的那些类似或等效的方法和材料可以用于实践或试验本公开，本文描述了合适的方法和材料。
[0395]
除非另有说明，否则本文所用的所有技术和科学术语都与本公开所属领域技术人员通常所理解的含义相同。疫苗学中常用术语的定义可见于例如，plotkin等人(编辑)，vaccines 6th edition，saunders出版，2012(isbn 9781455700905)。分子生物学中常用术语的定义可见于例如，benjamin lewin,genes v，oxford university press出版，1994(isbn0-19-854287-9)；kendrew等人(编辑)，the encyclopedia of molecular biology，blackwell science ltd.出版，1994(isbn0-632-02182-9)；和robert a.meyers(编辑)，molecular biology and biotechnology:a comprehensive desk reference，vch publishers,inc.出版，1995(isbn1-56081-569-8)。“vaccine design:the subunit and adjuvant approach”(powell&newman，编辑)(1995)plenum press new york))中总体描述了亚单位疫苗制备。
[0396]
除非上下文另外清楚地指出，单数术语“一个”、“一种”和“所述”包括复数指示物。类似地，除非上下文另外清楚地指出，词语“或”意图包括“和”。术语“多个”表示两个或更多个。进一步应当理解，为核酸或多肽给出的所有碱基大小或氨基酸大小和所有分子量或分子质量值是近似值，并且为了描述而提供。另外，关于物质(诸如抗原)的浓度或水平给出的数值限制意图为近似值。因此，在指明浓度是至少(例如)200pg的情况下，该浓度意图被理解为至少大约(或“约”或“～”)200pg。
[0397]
如本文所使用，术语“包含”是指“包括”。因而，除非上下文另有要求，否则本文术语“含(comprising)”、“含有(comprise)”和“包含(comprises)”，当应用于组合(例如，多种组分的组合物，多个步骤的方法)时，发明人意图将其解释为包括该组合的所有具体提及的特征以及任选地、另外的、未指定的特征，而术语“由
······
组成(consisting of)”和“由
······
构成(consists of)”仅包括指定的特征。因此，“包含”包括“由
······
组成”指定的作为限制性情况的组合。在一些实施方式中，术语“基本上由
······
组成(consisting essentially of)”用于通过非限制性实例的方式指代一种组合物，所述组合物中唯一的活性成分为指定的活性成分，然而，所述组合物可以包括用于稳定、保存该制剂等的其它化合物，但不直接涉及指定的活性成分的治疗效果。过渡性短语“基本上组成(consisting essentially)”的使用是指权利要求的范围应被解释为包括权利要求中所列举的具体材料或步骤，以及不实质影响本发明所要求保护的基本和新颖性特征的那些。参见，re herz，537f.2d 549，551-52，190uspq 461，463(ccpa 1976)(emphasis in the original)；另见mpep
§
2111.03。因此，当本发明的权利要求中使用术语“基本上由
······
组成(consisting essentially of)”时，不旨在解释为等同于“包
含”。
[0398]
缩写“例如”(e.g.)源自拉丁文exempli gratia(例如)，且在本文中用于指示非限制性实施例。因此，缩写“例如”(e.g.)与术语“例如”(for example)是同义的。
[0399]
术语“多肽”表示其中所述单体是通过酰胺键连接在一起的氨基酸残基的聚合物。本文中使用的术语“多肽”或“蛋白质”意图涵盖任何氨基酸序列，且包括经修饰的序列诸如糖蛋白。术语“多肽”具体地意图涵盖天然存在的蛋白，以及重组地或合成地生产的蛋白。术语“片段”在提到多肽时表示多肽的一部分(即其子序列)。术语“免疫原性片段”表示多肽的保留全长参照蛋白或多肽的至少一个优势免疫原性表位的所有片段。在多肽内的取向一般以n-末端至c-末端方向描述，其由各个氨基酸的氨基和羧基部分的取向限定。
[0400]“抗原”是可以在受试者中刺激抗体生成和/或t细胞应答的化合物、组合物或物质，包括注射、吸收或其它方式引入受试者中的组合物。术语“抗原”包括所有相关的抗原性表位。术语“表位”或“抗原决定簇”表示b和/或t细胞对其做出应答的抗原上的位点。“优势抗原性表位”或“优势表位”是针对其产生功能上显著的宿主免疫应答(例如抗体应答或t细胞应答)的那些表位。因而，针对病原体的保护性免疫应答，优势抗原性表位是当被宿主免疫系统识别时导致保护免于由该病原体造成的疾病的那些抗原性部分。术语“t-细胞表位”表示当与适当的mhc分子结合时被t细胞特异性地结合(经由t细胞受体)的表位。“b-细胞表位”是被抗体(或b细胞受体分子)特异性地结合的表位。
[0401]“免疫应答”是免疫系统的细胞(诸如b细胞、t细胞或单核细胞)对刺激(诸如病原体或抗原(例如，配制为免疫原性组合物或疫苗))的应答。免疫应答可以是b细胞应答，其导致特异性抗体(诸如抗原特异性的中和抗体、杀菌抗体、调理抗体等)的产生。免疫应答也可以是t细胞应答，诸如cd4 应答或cd8 应答。免疫应答也可以是“体液”免疫应答，其由抗体介导。在某些情况下，应答是对特定抗原特异性的(即“抗原特异性的应答”)。如果抗原源自病原体，则所述抗原特异性的应答是“病原体特异性的应答”。“保护性免疫应答”是抑制病原体的有害功能或活性、减轻病原体的感染、或减轻由病原体感染引起的症状(包括死亡)的免疫应答。例如，通过抑制病原体复制，或者通过在体内测定对病原体攻击的抗性，可以测定保护性免疫应答。受试者暴露于免疫原性刺激诸如病原体或抗原(例如，配制为免疫原性组合物或疫苗)会引发对刺激特异性的初始免疫应答，即，所述暴露“引发”免疫应答。随后暴露于刺激(例如，通过免疫接种)可以增加或“加强”特异性免疫应答的强度(或持续时间或两者)。因而，通过施用免疫原性组合物“加强”预先存在的免疫应答会增加抗原(或病原体)特异性应答的强度(例如，通过增加抗体滴度和/或亲和力，通过增加抗原特异性的b或t细胞的频率，通过诱导成熟效应子功能，或它们的任意组合)。
[0402]
本文使用的术语“初免-加强”或其变体是指其中首次施用(初次(prime)或激发(priming)剂量)包含至少一种抗原的免疫原性组合物之后施用(加强(boost)或强化(boosting)剂量)包含相同的至少一种抗原的免疫原性组合物的方法，其中与在未提供初始剂量的抗原的情况下获得的免疫应答相比，在随后施用时诱导了更高水平的针对抗原的免疫应答。
[0403]“免疫原性组合物”是适合于施用给人或动物受试者(例如，在实验或临床场合下)的物质的组合物，其能够引发特异性免疫应答，例如针对病原体。这样，免疫原性组合物包括一种或多种抗原或抗原性表位。免疫原性组合物还可以包括一种或多种额外组分，诸如
赋形剂、稀释剂和/或佐剂。在本公开的上下文中，术语免疫原性组合物(包括疫苗组合物或疫苗)将被理解为包括旨在向受试者或受试者群体施用以引发预防性或治疗性免疫应答的组合物。
[0404]
术语“疫苗组合物”和“疫苗”在本文中可互换使用。
[0405]“佐剂”是以非抗原特异性的方式增强免疫应答产生的试剂。
[0406]“药学上可接受的”所指物适合于向受试者(例如，人、非人灵长类动物或其它哺乳动物受试者)施用。remington:the science and practice of pharmacy，第22版，(2013)中描述了适合于药物递送的治疗性和/或预防性组合物(包括免疫原性组合物)的组合物和制剂(包括稀释剂)。
[0407]
如本文所使用，“月”是指30天的期限。对于本领域技术人员而言，以“30天”间隔进行的第二次免疫不限于恰好在之后30天施用，而是包括由于诸如临床和患者安排等问题引起的短期变化是显而易见的；此一容差类似地适用于其它间隔，例如45天、60天、90天、120天、150天、180天等。
[0408]
当指人时，术语“婴儿”是在0和两岁之间。术语“新生儿”是小于4周龄的婴儿。
[0409]
术语“减少”、“降低”和“增加”是相对术语。因此，与不同(参照)治疗(包括安慰剂或无治疗)相比，如果治疗后应答定量增加，则药剂或治疗增加应答。
[0410]
本文所使用的“治疗”包括疫苗施用；合适的参照治疗包括施用安慰剂或缺乏疫苗施用。
[0411]
术语“保护”不一定意指药剂或治疗完全地消除感染或疾病的风险，而是感染或疾病的至少一种特征被实质上或显著地减少或消除(与相关对照相比)。因而，预防或减少感染或疾病或其症状的风险的免疫原性组合物或治疗可能不会预防或消除所有治疗受试者中的感染或疾病。在已知相关治疗人群中疾病的发病率减少(与相关对照人群相比)的情况下，向个体施用所述治疗被认为减少了治疗个体的疾病风险。
[0412]
如本文所使用，ng指纳克，ug或μg指微克，mg指毫克，ml或ml指毫升，并且mm指毫摩尔。
[0413]
本文所使用的术语“糖”包括多糖和寡糖。
[0414]
关于指定数字的术语“约(around)”、“大约(about)”或“近似(approximately)”被定义为在指定的值的
±
10％内，特别地在指定的值的
±
5％内。
[0415]
本发明通过参照以下条款来说明：
[0416]
条款1.一种向受试者施用糖缀合物的方法，所述方法包括以下步骤：
[0417]
(i)施用第一剂量的糖缀合物；
[0418]
(ii)随后施用第二剂量的糖缀合物；
[0419]
其中所述第一剂量中糖缀合物的量为第二剂量中糖缀合物的量的1/20至1/5000。
[0420]
条款2.一种用于在包括以下步骤的方法中向受试者施用的糖缀合物：
[0421]
(i)施用第一剂量的糖缀合物；
[0422]
(ii)随后施用第二剂量的糖缀合物；
[0423]
其中所述第一剂量中糖缀合物的量为第二剂量中糖缀合物的量的1/20至1/5000。
[0424]
条款3.一种糖缀合物在制备用于在包括以下步骤的方法中向受试者施用的药物中的用途：
[0425]
(i)施用第一剂量的糖缀合物；
[0426]
(ii)随后施用第二剂量的糖缀合物；
[0427]
其中所述第一剂量中糖缀合物的量为第二剂量中糖缀合物的量的1/20至1/5000。
[0428]
条款4.一种试剂盒，其包含：
[0429]
(i)第一剂量的糖缀合物；
[0430]
(ii)第二剂量的糖缀合物；
[0431]
其中所述第一剂量中糖缀合物的量为第二剂量中糖缀合物的量的1/20至1/5000。
[0432]
条款5.一种向受试者施用糖缀合物的方法，所述方法包括以下步骤：
[0433]
(i)施用第一剂量的糖缀合物；
[0434]
(ii)随后施用第二剂量的糖缀合物；
[0435]
其中所述第一剂量中糖缀合物的量为第二剂量中糖缀合物的量的1/5至1/500。
[0436]
条款6.一种用于在包括以下步骤的方法中向受试者施用的糖缀合物：
[0437]
(i)施用第一剂量的糖缀合物；
[0438]
(ii)随后施用第二剂量的糖缀合物；
[0439]
其中所述第一剂量中糖缀合物的量为第二剂量中糖缀合物的量的1/5至1/500。
[0440]
条款7.一种糖缀合物在制备用于在包括以下步骤的方法中向受试者施用的药物中的用途：
[0441]
(i)施用第一剂量的糖缀合物；
[0442]
(ii)随后施用第二剂量的糖缀合物；
[0443]
其中所述第一剂量中糖缀合物的量为第二剂量中糖缀合物的量的1/5至1/500。
[0444]
条款8.一种试剂盒，其包含：
[0445]
(i)第一剂量的糖缀合物；
[0446]
(ii)第二剂量的糖缀合物；
[0447]
其中所述第一剂量中糖缀合物的量为第二剂量中糖缀合物的量的1/5至1/500。
[0448]
条款9.一种向受试者施用糖缀合物的方法，所述方法包括以下步骤：
[0449]
(i)施用第一剂量的0.0005至0.5ug的糖缀合物；
[0450]
(ii)随后施用第二剂量的1至30ug的糖缀合物。
[0451]
条款10.一种用于在包括以下步骤的方法中向受试者施用的糖缀合物：
[0452]
(i)施用第一剂量的0.0005至0.5ug的糖缀合物；
[0453]
(ii)随后施用第二剂量的1至30ug的糖缀合物。
[0454]
条款11.一种糖缀合物在制备用于在包括以下步骤的方法中向受试者施用的药物中的用途：
[0455]
(i)施用第一剂量的0.0005至0.5ug的糖缀合物；
[0456]
(ii)随后施用第二剂量的1至30ug的糖缀合物。
[0457]
条款12.一种试剂盒，其包含：
[0458]
(i)第一剂量的0.0005至0.5ug的糖缀合物；
[0459]
(ii)第二剂量的1至30ug的糖缀合物。
[0460]
条款13.一种向受试者施用糖缀合物的方法，所述方法包括以下步骤：
[0461]
(i)施用第一剂量的0.005至2ug的糖缀合物；
[0462]
(ii)随后施用第二剂量的1至30ug的糖缀合物；
[0463]
其中所述第二剂量中糖缀合物的量为第一剂量中糖缀合物的量的至少两倍。
[0464]
条款14.一种用于在包括以下步骤的方法中向受试者施用的糖缀合物：
[0465]
(i)施用第一剂量的0.005至2ug的糖缀合物；
[0466]
(ii)随后施用第二剂量的1至30ug的糖缀合物；
[0467]
其中所述第二剂量中糖缀合物的量为第一剂量中糖缀合物的量的至少两倍。
[0468]
条款15.一种糖缀合物在制备用于在包括以下步骤的方法中向受试者施用的药物中的用途：
[0469]
(i)施用第一剂量的0.005至2ug的糖缀合物；
[0470]
(ii)随后施用第二剂量的1至30ug的糖缀合物；
[0471]
其中所述第二剂量中糖缀合物的量为第一剂量中糖缀合物的量的至少两倍。
[0472]
条款16.一种试剂盒，其包含：
[0473]
(i)第一剂量的0.005至2ug的糖缀合物；
[0474]
(ii)第二剂量的1至30ug的糖缀合物；
[0475]
其中所述第二剂量中糖缀合物的量为第一剂量中糖缀合物的量的至少两倍。
[0476]
条款17.一种向受试者施用糖缀合物的方法，所述方法包括以下步骤：
[0477]
(i)施用第一剂量的1/10至1/2000标准剂量的糖缀合物；
[0478]
(ii)随后施用第二剂量的1/2至2倍标准剂量的糖缀合物。
[0479]
条款18.一种用于在包括以下步骤的方法中向受试者施用的糖缀合物：
[0480]
(i)施用第一剂量的1/10至1/2000标准剂量的糖缀合物；
[0481]
(ii)随后施用第二剂量的1/2至2倍标准剂量的糖缀合物。
[0482]
条款19.一种糖缀合物在制备用于在包括以下步骤的方法中向受试者施用的药物中的用途：
[0483]
(i)施用第一剂量的1/10至1/2000标准剂量的糖缀合物；
[0484]
(ii)随后施用第二剂量的1/2至2倍标准剂量的糖缀合物。
[0485]
条款20.一种试剂盒，其包含：
[0486]
(i)第一剂量的1/10至1/2000标准剂量的糖缀合物；
[0487]
(ii)第二剂量的1/2至2倍标准剂量的糖缀合物。
[0488]
条款21.一种向受试者施用糖缀合物的方法，所述方法包括以下步骤：
[0489]
(i)施用第一剂量的1/5至1/500标准剂量的糖缀合物；
[0490]
(ii)随后施用第二剂量的1/2至2倍标准剂量的糖缀合物。
[0491]
条款22.一种用于在包括以下步骤的方法中向受试者施用的糖缀合物：
[0492]
(i)施用第一剂量的1/5至1/500标准剂量的糖缀合物；
[0493]
(ii)随后施用第二剂量的1/2至2倍标准剂量的糖缀合物。
[0494]
条款23.一种糖缀合物在制备用于在包括以下步骤的方法中向受试者施用的药物中的用途：
[0495]
(i)施用第一剂量的1/5至1/500标准剂量的糖缀合物；
[0496]
(ii)随后施用第二剂量的1/2至2倍标准剂量的糖缀合物。
[0497]
条款24.一种试剂盒，其包含：
[0498]
(i)第一剂量的1/5至1/500标准剂量的糖缀合物；
[0499]
(ii)第二剂量的1/2至2倍标准剂量的糖缀合物。
[0500]
条款25.一种向受试者施用糖缀合物的方法，所述方法包括以下步骤：
[0501]
(i)施用第一剂量的0.005至2ug的糖缀合物；
[0502]
(ii)随后施用第二剂量的0.005至2ug的糖缀合物；
[0503]
其中所述第二剂量中糖缀合物的量为第一剂量中糖缀合物的量的1/2至5倍。
[0504]
条款26.一种用于在包括以下步骤的方法中向受试者施用的糖缀合物：
[0505]
(i)施用第一剂量的0.005至2ug的糖缀合物；
[0506]
(ii)随后施用第二剂量的0.005至2ug的糖缀合物；
[0507]
其中所述第二剂量中糖缀合物的量为第一剂量中糖缀合物的量的1/2至5倍。
[0508]
条款27.一种糖缀合物在制备用于在包括以下步骤的方法中向受试者施用的药物中的用途：
[0509]
(i)施用第一剂量的0.005至2ug的糖缀合物；
[0510]
(ii)随后施用第二剂量的0.005至2ug的糖缀合物；
[0511]
其中所述第二剂量中糖缀合物的量为第一剂量中糖缀合物的量的1/2至5倍。
[0512]
条款28.一种试剂盒，其包含：
[0513]
(i)第一剂量的0.005至2ug的糖缀合物；
[0514]
(ii)第二剂量的0.005至2ug的糖缀合物；
[0515]
其中所述第一剂量中糖缀合物的量为第二剂量中糖缀合物的量的1/2至5倍。
[0516]
条款29.一种向受试者施用糖缀合物的方法，所述方法包括以下步骤：
[0517]
(i)施用第一剂量的1/5至1/500标准剂量的糖缀合物；
[0518]
(ii)随后施用第二剂量的1/5至1/500标准剂量的糖缀合物；
[0519]
其中所述第二剂量中糖缀合物的量为第一剂量中糖缀合物的量的1/2至5倍。
[0520]
条款30.一种用于在包括以下步骤的方法中向受试者施用的糖缀合物：
[0521]
(i)施用第一剂量的1/5至1/500标准剂量的糖缀合物；
[0522]
(ii)随后施用第二剂量的1/5至1/500标准剂量的糖缀合物；
[0523]
其中所述第二剂量中糖缀合物的量为第一剂量中糖缀合物的量的1/2至5倍。
[0524]
条款31.一种糖缀合物在制备用于在包括以下步骤的方法中向受试者施用的药物中的用途：
[0525]
(i)施用第一剂量的1/5至1/500标准剂量的糖缀合物；
[0526]
(ii)随后施用第二剂量的1/5至1/500标准剂量的糖缀合物；
[0527]
其中所述第二剂量中糖缀合物的量为第一剂量中糖缀合物的量的1/2至5倍。
[0528]
条款32.一种试剂盒，其包含：
[0529]
(i)第一剂量的1/5至1/500标准剂量的糖缀合物；
[0530]
(ii)第二剂量的1/5至1/500标准剂量的糖缀合物；
[0531]
其中所述第一剂量中糖缀合物的量为第二剂量中糖缀合物的量的1/2至5倍。
[0532]
条款33.根据条款1至32中任一项所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述糖缀合物包括细菌糖，例如细菌荚膜糖。
[0533]
条款34.根据条款1至33中任一项所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述
第一剂量的糖缀合物和第二剂量的糖缀合物具有不同的糖。
[0534]
条款35.根据条款1至34中任一项所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述第一剂量的糖缀合物和第二剂量的糖缀合物具有相同的糖。
[0535]
条款36.根据条款1至35中任一项所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述第一剂的糖缀合物和第二剂的糖缀合物具有不同的载体。
[0536]
条款37.根据条款1至36中任一项所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述第一剂量的糖缀合物和第二剂量的糖缀合物具有相同的载体。
[0537]
条款38.根据条款1至37中任一项所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述第一剂量和第二剂量的糖缀合物是相同的。
[0538]
条款39.根据条款1至38中任一项所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述第一剂量的糖缀合物包含源自脑膜炎奈瑟氏球菌的糖，尤其为血清型a(mena)、c(menc)、w135(menw)、y(meny)或x(menx)。
[0539]
条款40.根据条款39所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述第一剂量的糖缀合物包含源自脑膜炎奈瑟氏球菌血清型a(mena)的糖。
[0540]
条款41.根据条款39所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述第一剂量的糖缀合物包含源自脑膜炎奈瑟氏球菌血清型c(menc)的糖。
[0541]
条款42.根据条款39所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述第一剂量的糖缀合物包含源自脑膜炎奈瑟氏球菌血清型w(menw)的糖。
[0542]
条款43.根据条款39所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述第一剂量的糖缀合物包含源自脑膜炎奈瑟氏球菌血清型y(meny)的糖。
[0543]
条款44.根据条款1至38中任一项所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述第一剂量的糖缀合物包含源自伤寒沙门氏菌vi糖的糖。
[0544]
条款45.根据条款1至38中任一项所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述第一剂量的糖缀合物包含源自b型流感嗜血杆菌的hib的糖。
[0545]
条款46.根据条款1至38中任一项所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述第一剂量的糖缀合物包含源自肺炎链球菌的糖，尤其为血清型1、2、3、4、5、6a、6b、7f、8、9n、9v、10a、11a、12f、14、15b、17f、18c、19a、19f、20、22f、23f或33f。
[0546]
条款47.根据条款1至38中任一项所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述第一剂量的糖缀合物包含源自b组链球菌的糖，尤其为ia、ib、ii、iii、iv、v、vi或vii组。
[0547]
条款48.根据条款1至47中任一项所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述第二剂量的糖缀合物包含源自脑膜炎奈瑟氏球菌的糖，尤其为血清型a(mena)、c(menc)、w135(menw)、y(meny)或x(menx)。
[0548]
条款49.根据条款48所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述第二剂量的糖缀合物包含源自脑膜炎奈瑟氏球菌血清型a(mena)的糖。
[0549]
条款50.根据条款48所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述第二剂量的糖缀合物包含源自脑膜炎奈瑟氏球菌血清型(menc)的糖。
[0550]
条款51.根据条款48所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述第二剂量的糖缀合物包含源自脑膜炎奈瑟氏球菌血清型w(menw)的糖。
[0551]
条款52.根据条款48所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述第二剂量的
糖缀合物包含源自脑膜炎奈瑟氏球菌血清型y(meny)的糖。
[0552]
条款53.根据条款1至47中任一项所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述第二剂量的糖缀合物包含源自伤寒沙门氏菌vi糖的糖。
[0553]
条款54.根据条款1至47中任一项所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述第二剂量的糖缀合物包含源自b型流感嗜血杆菌的hib的糖
[0554]
条款55.根据条款1至47中任一项所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述第二剂量的糖缀合物包含源自肺炎链球菌的糖，尤其为血清型1、2、3、4、5、6a、6b、7f、8、9n、9v、10a、11a、12f、14、15b、17f、18c、19a、19f、20、22f、23f或33f。
[0555]
条款56.根据条款1至47中任一项所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述第二剂量的糖缀合物包含源自b组链球菌的糖，尤其ia、ib、ii、iii、iv、v、vi或vii组。
[0556]
条款57.根据条款1至56中任一项所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述第一剂量的糖缀合物包含载体，所述载体为破伤风类毒素、其片段或其非毒性突变体。
[0557]
条款58.根据条款57所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述第一剂量的糖缀合物包含为破伤风类毒素的载体。
[0558]
条款59.根据条款1至56中任一项所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述第一剂量的糖缀合物包含载体，所述载体为白喉类毒素、其片段或其非毒性突变体。
[0559]
条款60.根据条款59所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述第一剂量的糖缀合物包含载体，所述载体为白喉类毒素。
[0560]
条款61.根据条款59所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述第一剂量的糖缀合物包含载体，所述载体为crm197。
[0561]
条款62.根据条款1至56中任一项所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述第一剂量的糖缀合物包含载体，所述载体为ompc。
[0562]
条款63.根据条款1至56中任一项所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述第一剂量的糖缀合物包含载体，所述载体为流感嗜血杆菌蛋白d。
[0563]
条款64.根据条款1至63中任一项所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述第二剂量的糖缀合物包括载体，所述载体为破伤风类毒素、其片段或其非毒性突变体。
[0564]
条款65.根据条款64所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述第二剂量的糖缀合物包含载体，所述载体为破伤风类毒素。
[0565]
条款66.根据条款1至63中任一项所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述第二剂量的糖缀合物包括载体，所述载体为白喉类毒素、其片段或其非毒性突变体。
[0566]
条款67.根据条款66所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述第二剂量的糖缀合物包含载体，所述载体为白喉类毒素。
[0567]
条款68.根据条款66所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述第二剂量的糖缀合物包含载体，所述载体为crm197。
[0568]
条款69.根据条款1至63中任一项所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述第二剂量的糖缀合物包含载体，所述载体为ompc。
[0569]
条款70.根据条款1至63中任一项所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述第二剂量的糖缀合物包含载体，所述载体为流感嗜血杆菌蛋白d。
[0570]
条款71.根据条款1至70中任一项所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述
第一剂量的糖缀合物具有1：5至5：1的糖：蛋白比率(w/w)，尤其1：5至2：1的比率。
[0571]
条款72.根据条款1至70中任一项所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述第二剂量的糖缀合物具有1：5至5：1的糖：蛋白比率(w/w)，尤其1：5至2：1的比率。
[0572]
条款73.根据条款1至72中任一项所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述第一剂量的糖缀合物为未加佐剂的。
[0573]
条款74.根据条款1至72中任一项所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述第一剂量的糖缀合物为加佐剂的。
[0574]
条款75.根据条款74所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述第一剂量的糖缀合物以铝盐为佐剂，尤其为氢氧化铝或磷酸铝。
[0575]
条款76.根据条款74或75所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述第一剂量的糖缀合物以tlr4激动剂为佐剂，尤其为脂多糖，例如3d-mpl、crx601或gla、特别地3d-mpl。
[0576]
条款77.根据条款74至76中任一项所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述第一剂量的糖缀合物以皂苷为佐剂，尤其为quil a或其衍生物，特别地qs21。
[0577]
条款78.根据条款74至77中任一项所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述第一剂量的糖缀合物以tlr7和/或tlr8激动剂为佐剂，尤其为4-氨基-1-[2-(1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3三乙二醇-磷酸)乙基]-2-正丁基-1h-咪唑并[4,5-c]喹啉或(3-(5-氨基-2-(2-甲基-4-(2-(2-(2-膦酰乙氧基)乙氧基)乙氧基)苯乙基)苯并[f][1,7]萘啶-8-基)丙酸。
[0578]
条款79.根据条款74至78中任一项所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述第一剂量的糖缀合物以水包油乳液为佐剂，例如包含角鲨烯的亚微米水包油乳液。
[0579]
条款80.根据条款74至78中任一项所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述第一剂量的糖缀合物以脂质体制剂作为佐剂。
[0580]
条款81.根据条款1至80中任一项所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述第二剂量的糖缀合物为未加佐剂的。
[0581]
条款82.根据条款1至80中任一项所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述第二剂量的糖缀合物为加佐剂的。
[0582]
条款83.根据条款82所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述第二剂量的糖缀合物以铝盐为佐剂，尤其为氢氧化铝或磷酸铝。
[0583]
条款84.根据条款82或83所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述第二剂量的糖缀合物以tlr4激动剂为佐剂，尤其为脂多糖，例如3d-mpl、crx601或gla，特别地3d-mpl。
[0584]
条款85.根据条款82至84中任一项所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述第二剂量的糖缀合物以皂苷作为佐剂，尤其是quil a或其衍生物，特别地qs21。
[0585]
条款86.根据条款82至85中任一项所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述第二剂量的糖缀合物以tlr7和/或tlr8激动剂作为佐剂，尤其为4-氨基-1-[2-(1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3三乙二醇-磷酸)乙基]-2-正丁基-1h-咪唑并[4,5-c]喹啉或(3-(5-氨基-2-(2-甲基-4-(2-(2-(2-膦酰乙氧基)乙氧基)乙氧基)苯乙基)苯并[f][1,7]萘啶-8-基)丙酸。
[0586]
条款87.根据条款82至86中任一项所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述第一剂量的糖缀合物以水包油乳液为佐剂，例如包含角鲨烯的亚微米水包油乳液。
[0587]
条款88.根据条款82至86中任一项所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述第一剂量的糖缀合物以脂质体制剂作为佐剂。
[0588]
条款89.根据条款1至88中任一项所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述受试者为哺乳动物。
[0589]
条款90.根据条款89所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述受试者为人类。
[0590]
条款91.根据条款90所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述受试者为人类儿童，例如第一剂量小于1岁、1至5岁或在施用第一剂量时5至18岁。
[0591]
条款92.根据条款90所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述受试者为成人。
[0592]
条款93.根据条款92所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述成人为18至40岁。
[0593]
条款94.根据条款90所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述受试者为老年人，尤其为大于65岁。
[0594]
条款95.根据条款1至94中任一项所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述受试者之前未接种针对适用病原体的糖缀合物的疫苗，例如之前未接种针对诸如细菌的适用病原体的疫苗。
[0595]
条款96.根据条款95所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述受试者之前未接种针对诸如细菌的适用病原体的疫苗。
[0596]
条款97.根据条款1至94中任一项所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述受试者之前已接种针对诸如细菌的适用病原体的疫苗。
[0597]
条款98.根据条款97所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述受试者之前已接种针对诸如细菌的适用病原体的糖缀合物的疫苗。
[0598]
条款99.根据条款1至94中任一项所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述受试者之前未接种针对所述细菌的疫苗。
[0599]
条款100.根据条款1至94中任一项所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述受试者之前已接种针对所述细菌的疫苗。
[0600]
条款101.根据条款1至100中任一项所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述第一剂量皮内、肌内、腹膜内或皮下施用，尤其为肌内。
[0601]
条款102.根据条款1至100中任一项所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述第二剂量皮内、肌内、腹膜内或皮下，尤其为肌内。
[0602]
条款103.根据条款1至102中任一项所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述所有剂量经由相同途径施用。
[0603]
条款104.根据条款1至103中任一项所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，进一步包含第三剂量的糖缀合物。
[0604]
条款105.根据条款1至104中任一项所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述第二剂量在第一剂量后1周至12个月，例如在第一剂量后2周至9个月，特别地在第一剂量
后3周至6个月，尤其是在第一剂量后3周至3个月，并且理想地在第一剂量后3周至2个月，例如在第一剂量后3至5周施用。
[0605]
条款106.根据条款106所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述第二剂量在第一剂量后2、3、4、5、6、7、8、9或10周施用。
[0606]
条款107.根据条款107所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述第二剂量在第一剂量后2、3、4、5或6个月施用。
[0607]
条款108.根据条款1-104中任一项所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述第二剂量在第一剂量后3周至12个月，例如在第一剂量后3周至9个月，特别地在第一剂量后3周至6个月，尤其为在第一剂量后3周-3个月，并且理想地在第一剂量后3周至2个月施用。
[0608]
条款109.根据条款108所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述第二剂量在第一剂量后3、4、5、6、7、8、9或10周施用。
[0609]
条款110.根据条款108所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述第二剂量在第一剂量后3、4、5或6个月施用。
[0610]
条款111.根据条款1至110中任一项所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述第一剂量中糖缀合物的量为第二剂量中糖缀合物的量的1/20至1/5000。
[0611]
条款112.根据条款111所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述第一剂量中糖缀合物的量为第二剂量中糖缀合物的量的1/1000至1/5000。
[0612]
条款113.根据条款111所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述第一剂量中糖缀合物的量为第二剂量中糖缀合物的量的1/100至1/1000。
[0613]
条款114.根据条款111所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述第一剂量中糖缀合物的量为第二剂量中糖缀合物的量的1/20至1/100。
[0614]
条款115.根据条款1至110中任一项所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述第一剂量中糖缀合物的量为第二剂量中糖缀合物的量的1/5至1/500。
[0615]
条款116.根据条款115所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述第一剂量中糖缀合物的量为第二剂量中糖缀合物的量的1/100至1/500。
[0616]
条款117.根据条款115所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述第一剂量中糖缀合物的量为第二剂量中糖缀合物的量的1/25至1/100。
[0617]
条款118.根据条款115所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述第一剂量中糖缀合物的量为第二剂量中糖缀合物的量的1/5至1/25，例如1/8至1/25，尤其为1/10至1/25。
[0618]
条款119.根据条款118所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述第一剂量中糖缀合物的量为第二剂量中糖缀合物的量的1/10。
[0619]
条款120.根据条款118所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述第一剂量中糖缀合物的量为第二剂量中糖缀合物的量的1/50。
[0620]
条款121.根据条款1至120中任一项所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述第一剂量中糖缀合物的量为0.0005至0.5ug。
[0621]
条款122.根据条款121所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述第一剂量中糖缀合物的量为0.0005至0.005ug。
[0622]
条款123.根据条款121所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述第一剂量中糖缀合物的量为0.005至0.05ug。
[0623]
条款124.根据条款121所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述第一剂量中糖缀合物的量为0.05至0.5ug。
[0624]
条款125.根据条款1至120中任一项所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述第一剂量中糖缀合物的量为0.005至2ug。
[0625]
条款126.根据条款125所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述第一剂量中糖缀合物的量为0.005至0.05ug。
[0626]
条款127.根据条款125所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述第一剂量中糖缀合物的量为0.05至0.3ug。
[0627]
条款128.根据条款125所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述第一剂量中糖缀合物的量为0.3至1ug。
[0628]
条款129.根据条款125所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述第一剂量中糖缀合物的量为0.1至2ug，特别地0.3至1.5ug，尤其为0.5至1ug，例如0.5ug或1ug。
[0629]
条款130.根据条款125所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述第一剂量中糖缀合物的量为0.01至0.5ug，特别地0.05至0.3ug，尤其为0.1至0.2ug，例如0.1ug或0.2ug。
[0630]
条款131.根据条款1至130中任一项所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述第二剂量中糖缀合物的量为1至30ug。
[0631]
条款132.根据条款131所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述第二剂量中糖缀合物的量为1至15ug。
[0632]
条款133.根据条款131所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述第二剂量中糖缀合物的量为15至30ug。
[0633]
条款134.根据条款131所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述第二剂量中糖缀合物的量为5至25ug。
[0634]
条款135.根据条款1至134中任一项所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述第一剂量中糖缀合物的量为糖缀合物的标准剂量的1/10至1/2000。
[0635]
条款136.根据条款135所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述第一剂量中糖缀合物的量为糖缀合物的标准剂量的1/500至1/2000。
[0636]
条款137.根据条款135所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述第一剂量中糖缀合物的量为糖缀合物的标准剂量的1/50至1/500。
[0637]
条款138.根据条款135所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述第一剂量中糖缀合物的量为糖缀合物的标准剂量的1/10至1/50。
[0638]
条款139.根据条款1至134中任一项所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述第一剂量中糖缀合物的量为糖缀合物的标准剂量的1/5至1/500。
[0639]
条款140.根据条款139所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述第一剂量中糖缀合物的量为糖缀合物的标准剂量的1/100至1/500。
[0640]
条款141.根据条款139所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述第一剂量中糖缀合物的量为糖缀合物的标准剂量的1/25至1/100。
[0641]
条款142.根据条款139所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述第一剂量中糖缀合物的量为糖缀合物的标准剂量的1/5至1/25，例如1/8至1/25，尤其为1/10至1/25。
[0642]
条款143.根据条款139所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述第一剂量中糖缀合物的量为糖缀合物的标准剂量的1/10。
[0643]
条款144.根据条款139所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述第一剂量中糖缀合物的量为糖缀合物的标准剂量的1/50。
[0644]
条款145.根据条款1至144中任一项所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述第二剂量中糖缀合物的量为糖缀合物的标准剂量的1/2至2倍。
[0645]
条款146.根据条款145所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述第二剂量中糖缀合物的量为糖缀合物的标准剂量的1/2。
[0646]
条款147.根据条款145所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述第二剂量中糖缀合物的量为糖缀合物的标准剂量至标准剂量的2倍。
[0647]
条款148.根据条款145所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述第二剂量中糖缀合物的量为糖缀合物的标准剂量的3/4至1.25倍。
[0648]
条款145.根据条款1至148中任一项所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述第二剂量中糖缀合物的量为第一剂量中糖缀合物的量的至少两倍。
[0649]
条款146.根据条款145所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述第二剂量中糖缀合物的量为第一剂量中糖缀合物的量的至少五倍。
[0650]
条款147.根据条款146所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述第二剂量中糖缀合物的量为第一剂量中糖缀合物的量的5至25倍。
[0651]
条款148.根据条款146所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述第二剂量中糖缀合物的量为第一剂量中糖缀合物的量的25至100倍。
[0652]
条款149.根据条款146所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述第二剂量中糖缀合物的量为第一剂量中糖缀合物的量的10倍。
[0653]
条款150.根据条款146所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述第二剂量中糖缀合物的量为第一剂量中糖缀合物的量的50倍。
[0654]
条款151.根据条款1至150中任一项所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述第二剂量中糖缀合物的量为糖缀合物的标准剂量的1/5至1/500。
[0655]
条款152.根据条款151所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述第二剂量中糖缀合物的量为糖缀合物的标准剂量的1/100至1/500。
[0656]
条款153.根据条款151所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述第二剂量中糖缀合物的量为糖缀合物的标准剂量的1/25至1/100。
[0657]
条款154.根据条款151所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述第二剂量中糖缀合物的量为糖缀合物的标准剂量的1/5至1/25，例如1/8至1/25，尤其为1/10至1/25。
[0658]
条款155.根据条款151所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述第二剂量中糖缀合物的量为糖缀合物的标准剂量的1/10。
[0659]
条款156.根据条款151所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述第二剂量中糖缀合物的量为糖缀合物的标准剂量的1/50。
[0660]
条款157.根据条款1至156中任一项所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所
述第二剂量中糖缀合物的量为0.005至2ug。
[0661]
条款158.根据条款157所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述第二剂量中糖缀合物的量为0.005至0.05ug。
[0662]
条款159.根据条款157所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述第二剂量中糖缀合物的量为0.05至0.3ug。
[0663]
条款160.根据条款157所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述第二剂量中糖缀合物的量为0.3至1ug。
[0664]
条款161.根据条款157所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述第二剂量中糖缀合物的量为0.1至2ug，特别地0.3至1.5ug，尤其为0.5至1ug，例如0.5ug或1ug。
[0665]
条款162.根据条款157所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述第二剂量中糖缀合物的量为0.01至0.5ug，特别地0.05至0.3ug，尤其为0.1至0.2ug，例如0.1ug或0.2ug。
[0666]
条款163.根据条款1至162中任一项所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述第二剂量中糖缀合物的量为糖缀合物的标准剂量的1/5至1/500。
[0667]
条款164.根据条款163所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述第二剂量中糖缀合物的量为糖缀合物的标准剂量的1/100至1/500。
[0668]
条款165.根据条款163所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述第二剂量中糖缀合物的量为糖缀合物的标准剂量的1/25至1/100。
[0669]
条款166.根据条款163所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述第二剂量中糖缀合物的量为糖缀合物的标准剂量的1/5至1/25，例如1/8至1/25，尤其为1/10至1/25。
[0670]
条款167.根据条款163所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述第二剂量中糖缀合物的量为糖缀合物的标准剂量的1/10。
[0671]
条款168.根据条款163所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述第二剂量中糖缀合物的量为糖缀合物的标准剂量的1/50。
[0672]
条款169.根据条款1至162中任一项所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述第二剂量中糖缀合物的量为第一剂量中糖缀合物的量的1/2至5倍。
[0673]
条款170.根据条款169所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述第二剂量中糖缀合物的量为第一剂量中糖缀合物的量的1/2至2倍。
[0674]
条款171.根据条款170所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述第二剂量中糖缀合物的量为第一剂量中糖缀合物的量的3/4至1.25倍。
[0675]
条款172.根据条款1至171中任一项所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述糖缀合物的糖为2000至100000da。
[0676]
条款173.根据条款1至171中任一项所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述糖缀合物的糖为50000至1000000da。
[0677]
条款174.根据条款1至171中任一项所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述糖缀合物的糖为50000至1000000da。
[0678]
条款175.根据条款1至174中任一项所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述第一剂量包含糖缀合物的组合。
[0679]
条款176.根据条款175所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述第一剂量
包含脑膜炎奈瑟氏球菌糖缀合物的组合，例如mena、menc、menw和meny糖缀合物的组合。
[0680]
条款177.根据条款175所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述第一剂量包含肺炎球菌糖缀合物的组合，例如包含血清型1、4、5、6b、7f、9v、14、18c、19f和23f糖缀合物的组合。
[0681]
条款178.根据条款175所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述第一剂量包含gbs糖缀合物的组合，例如包含血清型ia、ib和iii糖缀合物的组合，特别地血清型ia、ib、ii、iii、iv和v糖缀合物。
[0682]
条款179.根据条款1至178中任一项所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述第二剂量包含糖缀合物的组合。
[0683]
条款180.根据条款179所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述第二剂量包含脑膜炎奈瑟氏球菌糖缀合物的组合，例如mena、menc、menw和meny糖缀合物的组合。
[0684]
条款181.根据条款1至180中任一项所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述第一剂量包含缀合至crm197载体的1ug mena糖，并且所述第二剂量包含缀合至crm197载体的1ug mena糖，所述第二剂量合适地在所述第一剂量后一个月施用。
[0685]
条款182.根据条款1至181中任一项所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述第一剂量包含缀合至crm197载体的0.5ug mena糖，并且第二剂量包含缀合至crm197载体的0.5ug menc糖，第二剂量合适地在第一剂量后一个月施用。
[0686]
条款183.根据条款1至182中任一项所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述第一剂量包含缀合至crm197载体的0.5ug mena糖，第二剂量包含缀合至crm197载体的0.5ug menw糖，第二剂量合适地在第一剂量后一个月施用。
[0687]
条款184.根据条款1至183中任一项所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述第一剂量包含缀合至crm197载体的0.5ug mena糖，和第二剂量包含缀合至crm197载体的0.5ug meny糖，第二剂量合适地在第一剂量后一个月施用。
[0688]
条款185.根据条款1至180中任一项所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述第一剂量包含缀合至crm197载体的1ug mena糖，和第二剂量包含缀合至crm197载体的10ug mena糖，第二剂量合适地在第一剂量后一个月施用。
[0689]
条款186.根据条款1至180或185中任一项所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述第一剂量包含缀合至crm197载体的0.5ug mena糖，并且第二剂量包含缀合至crm197载体的5ug menc糖，第二剂量合适地在第一剂量后一个月施用。
[0690]
条款187.根据条款1至180、185或186中任一项所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述第一剂量包含缀合至crm197载体的0.5ug mena糖，和第二剂量包含缀合至crm197载体的5ug menw糖，第二剂量合适地在第一剂量后一个月施用。
[0691]
条款188.根据条款1至180或185至187中任一项所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述第一剂量包含缀合至crm197载体的0.5ug mena糖，和第二剂量包含缀合至crm197载体的5ug meny糖，第二剂量合适地在第一剂量后一个月施用。
[0692]
条款189.根据条款1至180中任一项所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述第一剂量包含缀合至crm197载体的0.2ug mena糖，和第二剂量包含缀合至crm197载体的0.2ug mena糖，第二剂量合适地在第一剂量后一个月施用。
[0693]
条款190.根据条款1至180或189中任一项所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，
其中所述第一剂量包含缀合至crm197载体的0.1ug mena糖，和第二剂量包含缀合至crm197载体的0.1ug menc糖，第二剂量合适地在第一剂量后一个月施用。
[0694]
条款191.根据条款1至180，189或190中任一项所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述第一剂量包含缀合至crm197载体的0.1ug mena糖，和第二剂量包含缀合至crm197载体的0.1ug menw糖，第二剂量合适地在第一剂量后一个月施用。
[0695]
条款192.根据条款1至180或189至191中任一项所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述第一剂量包含缀合至crm197载体的0.1ug mena糖，和第二剂量包含缀合至crm197载体的0.1ug meny糖，第二剂量合适地在第一剂量后一个月施用。
[0696]
条款193.根据条款1至180中任一项所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述第一剂量包含缀合至crm197载体的0.2ug mena糖，和第二剂量包含缀合至crm197载体的10ug mena糖，第二剂量合适地在第一剂量后一个月施用。
[0697]
条款194.根据条款1至180或193中任一项所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述第一剂量包含缀合至crm197载体的0.1ug mena糖，和第二剂量包含缀合至crm197载体的5ug menc糖，第二剂量合适地在第一剂量后一个月施用。
[0698]
条款195.根据条款1至180，193或194中任一项所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述第一剂量包含缀合至crm197载体的0.1ug mena糖，和第二剂量包含缀合至crm197载体的5ug menw糖，第二剂量合适地在第一剂量后一个月施用。
[0699]
条款196.根据条款1至180或193至195中任一项所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述第一剂量包含缀合至crm197载体的0.1ug mena糖，和第二剂量包含缀合至crm197载体的5ug meny糖，第二剂量合适地在第一剂量后一个月施用。
[0700]
条款197.根据条款179所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述第二剂量包含肺炎球菌糖缀合物的组合，例如包含血清型1、4、5、6b、7f、9v、14、18c、19f和23f糖缀合物的组合。
[0701]
条款198.根据条款179所述的方法、糖缀合物、用途或试剂盒，其中所述第二剂量包含gbs糖缀合物的组合，例如包含血清型ia、ib和iii糖缀合物的组合，特别地血清型ia、ib、ii、iii、iv和v糖缀合物。
[0702]
实施例
[0703]
以下实施例描述了制备和实践本文所述免疫原性组合物的一些示例性方式。应当理解，这些实施例仅用于说明目的，并不意图限制本文所述的组合物和方法的范围。
[0704]
实施例1：用gbs糖缀合物免疫小鼠
[0705]
方法
[0706]
5周龄雌性balb/c小鼠组在一定剂量范围内施用gbs 1a-crm197糖缀合物(参见pinto，2014)。在第1天和第21天腹膜内以200μl施用组合物。
[0707][0708]
每组包含10只小鼠。
[0709]
在第0天(免疫前)和第35天取样，并针对gbs 1a型菌株进行elisa和调理吞噬滴度测定。
[0710]
elisa
[0711]
使用与生物素化ia型天然多糖偶联的链霉亲和素衍生磁性微球(radix biosolutions，usa)通过luminex分析法测定血清样品中的血清抗体滴度(buffi等人，msphere 2019，第4卷，第4期，e00273-19)。在rt下平衡后，将125万个微球转移到lobind管(eppendorf)中，并在黑暗中置于磁性分离器中2分钟。微球用包含0.05％tween 20(calbiochem)的pbs洗涤，并将生物素-psia在pbs、0.05％tween 20、0.5％bsa(sigma-aldrich)中以1ug/ml终浓度加入至微球中。将生物素-psia微球在室温下避光孵育60分钟，并用pbs、0.05％tween 20洗涤两次。将偶联的微球悬浮于500μl pbs、0.05％tween 20、0.5％bsa中并在4℃下储存。
[0712]
在pbs、ph 7.2、0.05％tween 20、0.5％bsa中制备标准超免疫血清和测试样品的8个3倍系列稀释液。将每个血清稀释液(50μl)与等体积的偶联微球(3,000微球/区域/孔)在96-孔greiner板(millipore公司)中混合，并在黑暗中于室温下孵育60分钟。孵育后，微球用200μl pbs洗涤三次。每孔加入于pbs、ph 7.2、0.05％tween 20、0.5％bsa中的50μl的2.5ug/ml抗小鼠igg二抗(jackson immunoresearch)，连续振荡下孵育60分钟。洗涤后，将微球悬浮于100μl pbs中，并在使用luminex 200仪器进行分析之前振摇。通过bioplex manager tm软件(biorad)实时采集数据。
[0713]
调理吞噬杀灭测定(opka)
[0714]
hl60细胞在含10％胎牛血清的rpmi1640中生长，在37℃、5％co2下孵育。hl60细胞用0.78％二甲基甲酰胺(dmf)分化为嗜中性粒细胞，且4-5天后用作吞噬细胞来源。
[0715]
在96孔微量滴定板中进行测定，总体积为125μl/孔。每个反应包含热灭活测试血清(12.5ul)、gbs ia菌株515 1a(6
×
104集落形成单位[cfu])、分化的hl60细胞(2
×
106细胞)和hank平衡盐溶液红(gibco)中的10％幼兔补体(cederlane)。对于每个血清样品，测试6个系列稀释。阴性对照组缺乏效应细胞，或包含阴性血清或热灭活补体。在反应组装后，将板在37℃下振摇下孵育1小时。在孵育前(t0)和孵育后(t
60
)，将混合物在无菌水中稀释，并在含5％山羊血的胰蛋白胨大豆琼脂板上铺板(becton dickinson)。然后将每个板在37℃
下用5％co2孵育过夜，第二天计数cfu。opka滴度表示为导致50％细菌杀灭的倒数血清稀释度并且杀灭％计算如下
[0716][0717]
其中对于每个血清稀液的两次重复，t0是在t0时计数的cfu的平均值，t
60
是在t
60
时计数的cfu的平均值。
[0718]
结果
[0719]
第35天的cps 1a igg滴度如图1所示，并总结在下表中。
[0720][0721]
第3组观察到的gmt(0.1ug/0.1ug)高于第1组(1ug/1ug；p＝0.0015)或第2组(0.1ug/1ug；p＝0.023)观察到的gmt。第5组观察到的gmt(0.01ug/0.01ug)高于第1组(1ug/1ug；p＝0.0007)或第4组(0.01ug/1ug；p＝0.0113)观察到的gmt。第3组和第5组的调理吞噬滴度最高。
[0722]
数据显示，用减少的第一剂量的gbs ia糖缀合物进行疫苗接种可以增加gbs 1a gmt。尤其是，用减少的第一剂量和减少的第二剂量的糖缀合物进行疫苗接种可以显著增加gbs 1a gmt和opka滴度。
[0723]
实施例2：用menacwy糖缀合物免疫小鼠
[0724]
方法
[0725]
小鼠组施用在一定剂量范围的menacwy-crm197糖缀合物。在第1天和第14天以200ul皮下施用组合物。
[0726][0727]
在第0天(免疫前)和第28和42天取样，并针对荚膜ps和对参照菌株的血清杀菌活性进行elisa。
[0728]
elisa
[0729]
基于内部开发的2步快速间接elisa(casini d，2015中描述了类似的方法)，将感兴趣的抗原包被在板上，并与血清样品中存在的特异性抗体反应。通过与血清稀释缓冲液中包含的alp酶偶联的第二抗物种特异性抗体显示结合。由该酶催化的底物反应产生的信号与样品中的抗体浓度成比例，在405nm处具有吸收峰。
[0730]
简而言之，孔单独用在pbs中每种多糖的5μg/ml溶液(每种多糖的ph值为8.2)包被，在2至8℃下孵育过夜。然后用350μl洗涤缓冲液(pbs ph 7.4；tween 20 0.05％)洗涤细胞3次。
[0731]
通过分配200μl smart block(candor bioscience)对孔进行后涂覆，并在室温下孵育2小时，然后用350μl洗涤缓冲液洗涤3次，然后通过分配200μl liquid plate sealer(candor bioscience)密封并在室温下孵育2小时。
[0732]
将样品稀释(pbs与tween 20 0.05％；1％bsa；抗小鼠igg alp-缀合二级抗体)至1：500的最小起始稀释度，然后依据适当的标准进行2倍系列稀释。
[0733]
将板在37℃下孵育(mena：25'、menc：20'、menw：35'和meny：30')。板用洗涤缓冲液洗涤4次，向各孔中加入100μl/孔的底物溶液(dea缓冲液中3mg/ml p-npp(粉末))。然后将板在37℃下孵育mena：20'、menc：25'、menw：20'、meny：20'，然后在405nm处读数。
[0734]
使用市售幼兔补体(ht-rsba)的高通量杀菌测定
[0735]
实验前一天，在巧克力琼脂板上从冷冻的等分原液中分离所研究的细菌菌株。将板在37℃和5％co2下孵育过夜。实验当天，将分离的菌落接种在具有8ml mhb(mueller hinton broth) 0.25％葡萄糖的无菌耐热玻璃管中。如果在620nm处的光密度在0.065-0.085范围内，则将培养物在37℃和5％co2下孵育直至od620达到0.400-0.450(通常在90-120分钟)。
[0736]
样品用稀释缓冲液(dpbs 1％bsa 0.1％葡萄糖)适当地预稀释，然后在384孔透明
板中进行分配和以1：2稀释步骤系列稀释。
[0737]
热灭活补体(hic)和活性补体(ac)分别在黑色384孔板中分配。
[0738]
直至细菌培养物达到最终od，用稀释缓冲液稀释并分配至透明板中，然后将反应混合物转移至包含hic和ac以及各种对照的黑色板中。黑色板在37℃ 5％co2下孵育1小时。
[0739]
然后加入alamar blue缓冲液(mhb中的15％alamar blue 0.25％葡萄糖)。然后将板密封返回孵育箱中。每30分钟读取荧光信号(fi)，共16次。然后数据使用excel宏分析用于杀菌滴度计算，应用4pl回归模型。滴度是通过对倒数血清稀释度进行插值来确定的，得到fi的50％降低(ic
50
)。
[0740]
使用人血浆作为补体来源(hsba)的人体杀菌试验
[0741]
测定在无菌96孔板中进行，最终体积为每孔50μl。杀菌试验包含两种内部对照：1)一种对照是在不存在抗体的情况下通过单独补体进行的杀灭，补体依赖性对照(cdc)。第二种对照是在存在热灭活补体的情况下通过单独血清的杀灭，非补体依赖性对照(cic)。这些对照用于计算0时(t0)的菌落平均值。该值的50％是考虑用于定义杀菌血清稀释度的菌落数。
[0742]
实验前一天，在巧克力琼脂板上从冷冻等分原液中分离所研究的细菌菌株。将板在37℃和5％co2下孵育18小时。实验当天，将分离的菌落接种至具有8ml mhb(mueller hinton broth) 0.25％葡萄糖的14ml聚丙烯桶中。如果600nm处的光密度为0.05-0.06，则将培养物在37℃和5％co2下以150rpm振摇孵育直至od600达到0.24-0.26，相当于约109cfu/ml(通常90-120分钟)。
[0743]
用稀释缓冲液(dpbs 1％bsa 0.1％葡萄糖)将样品预稀释至最终稀释度105cfu/ml(1：10000)。向3ml细菌悬浮液中加入30μl肝素储备溶液(500u/ml)和30μl盐储备溶液(mgcl
2 1m，cacl
2 0.15m)，得到浓度5u/ml肝素、10mm mgcl2和1.5mm cacl2。
[0744]
实验当天，将12.5μl/孔的细菌工作稀释液(105cfu/ml)与12.5μl/孔的活性血浆在96孔板中混合，然后在t0时将5μl铺板在巧克力琼脂板上。琼脂板在37℃和5％co2下孵育。覆盖96孔板并在37℃、5％co2下孵育60分钟。
[0745]
在t
60
分钟时，将每孔10μl点样在具有mh琼脂的方形培养皿上。t
60
的对照在巧克力琼脂板上用5μl铺板。板在37℃、5％co2下孵育过夜。
[0746]
第二天，计数每个板上每个点的菌落数(菌落形成单位，cfu)。所有孔均一式两份铺板并记录重复计数。
[0747]
通常，滴度是参照t0计算。当热灭活补体对照和活性补体对照中的存活率至少为t0的80％时，该实验被认为有效。在t0无效(例如，培养基有问题)的情况下，可以使用两次计数的平均值在t
60
时计算滴度(在所有t
60
对照都正确的情况下)。
[0748]
对于每个测试样品和内部对照，计算重复的平均值。杀菌滴度定义为与t0时对照反应中cfu的平均数相比，在反应混合物中60分钟孵育后cfu降低50％的倒数血清稀释度。测试样品的重复的平均值必须小于或等于t0对照平均值的50％才能被认为具有杀菌作用。
[0749]
结果
[0750]
图2至图5分别显示了第28天和第42天的mena、menc、menw和meny igg滴度。图6至9分别显示了第28天和第42天的mena、menc、menw和meny的杀菌测定结果：使用人血浆作为补体来源(hsba)的人体杀菌测定-上图；幼兔补体(ht-rsba)-下图。
[0751]
从结果可以看出，即使在复杂的多价疫苗的情况下，减少糖缀合物的剂量也可导致相对较高的gmt和杀菌滴度。尤其是，低剂量初免之后标准剂量加强可以提供的抗体滴度与使用更高初免剂量获得的那些相似或更高(结合和功能)。使用0.2ug剂量的mena和0.1ug menc初免的sba滴度分别与使用2ug或1ug剂量初免相当。对于meny和menw，0.1ug和甚至0.01ug剂量均可以有效地提供初免，就sba滴度而言，与标准1ug剂量类似。
[0752]
实施例3-人体试验
[0753]
向18至40岁的成人组施用一定剂量范围的menacwy-crm197糖缀合物。在第1天和第1个月(第1组和第3组至第6组)或第1天和第1年(第2组)以500ul体积肌内施用组合物。疫苗是基于menveo(分别为10ug：5ug：5ug：5ug menacwy)，但相应稀释。
[0754][0755]
在第一剂量之前、第一剂量之后1个月(第二剂量之前)、第一剂量之后2个月、第一剂量之后1年(对于第2组第二剂量之前)和第二剂量之后1个月采集血样。对血样针对荚膜ps和对参照菌株的血清杀菌活性进行elisa。
[0756]
在整个说明书和随后的权利要求书中，除非上下文另有要求，否则术语“包含(comprise)”及其变体“含有(comprises)”和“含(comprising)”将被理解为显暗示包含所述整体、步骤、整体的集合或步骤的集合，但不排除任何其它整体、步骤、整体的集合或步骤的集合。
[0757]
本技术(本说明书和权利要求书构成其一部分)可以用作关于任何后续申请的优先权的基础。此类后续申请的权利要求可涉及本文所述的任何特征或特征的组合。实施方案被设想为在适当的环境下独立地、完全地彼此组合以形成本发明的进一步实施方案。它们可以采取产品、组合物、方法或用途权利要求的形式，并且可以通过举例而非限制的方式包括以下权利要求。
[0758]
本说明书中引用的所有出版物(包括但不限于专利和专利申请)均以引用的方式并入本文中，如同各单个出版物被具体地和独自地指明以引用的方式并入本文中，如同已完全阐述一样。
immunized with recombinant hepatitis b surface antigen.j.immunol,1998,160:870-876
[0773]
donnelly jj,deck rr,liu ma immunogenicity of a haemophilus influenzae polysaccharide-neisseria meningitidis outer membrane protein complex conjugate vaccine.j immunol.1990nov 1；145(9):3071-9.)；
[0774]
dowling,dj recent advances in the discovery and delivery of tlr7/8agonists as vaccine adjuvants.immunohorizons.2018jul 2；2(6):185-197
[0775]
edmond,等人.,group b streptococcal disease in infants aged younger than 3months:systematic review and meta-analysis.the lancet,379(9815):547
–
546(2012).
[0776]
falugi等人rationally designed strings of promiscuous cd4( )t cell epitopes provide help to haemophilus influenzae type b oligosaccharide:a model for new conjugate vaccines.(2001)eur j immunol 31
[0777]
geno,k.a.；gilbert,g.l.；song,j.y.；skovsted,i.c.；klugman,k.p.；jones,c.；konradsen,h.b.；nahm,m.h.,pneumococcal capsules and their types:past,present,and future.clin microbiol rev 2015,28(3),871-99
[0778]
greenberg,r.等人.sequential administration of 13-valent pneumococcal conjugate vaccine and 23-valent pneumococcal polysaccharide vaccine in pneumococcal vaccine
–
adults 60-64years of age vaccine 32(2014)2364
–
2374
[0779]
guttormsen等人.,rational chemical design of the carbohydrate in a glycoconjugate vaccine enhances igm-to-igg switching.proc natl acad sci usa,105(15):5903-8.epub 2008mar 31(2008).
[0780]
hoare和koshland.a method for the quantitative modification and estimation of carboxylic acid groups in proteins.1967 jbc 242:2447-2453
[0781]
jackson,l.等人.influence of initial vaccination with 13-valent pneumococcal conjugate vaccine or 23-valent pneumococcal polysaccharide vaccine on anti-pneumococcal responses following subsequent pneumococcal vaccination in adults 50years and older vaccine 31(2013)3594-3602
[0782]
jodar等人.serological criteria for evaluation and licensure of new pneumococcal conjugate vaccine formulations for use in infants.vaccine,(21)2003,p.3265-3272
[0783]
jonker,e.f.f.；van ravenhorst,m.b.；berbers,g.a.m.；visser,l.g.,safety and immunogenicity of fractional dose intradermal injection of two quadrivalent conjugated meningococcal vaccines.vaccine 2018,36(26):3727-3732
[0784]
klugman k.p.,g.i.t.,koornhof h.j.,robbins j.b.,schneerson r.,schultz d.,cadoz m.,armand j.,protective activity of vi capsular polysaccharide vaccine against typhoid fever.lancet 1987,2(8569),1165-1169
[0785]
krieg,cpg motifs in bacterial dna trigger direct b-cell activation.nature374:546(1995)).
of vi for a vi-crm(197)glycoconjugate vaccine against salmonella typhi.j.infect.dev ctries,2012
[0802]
pichichero protein carriers of conjugate vaccines:characteristics,development,and clinical trials.hum vaccin immunother.2013dec 1；9(12):2505
–
2523.
[0803]
nicholls和youle,in genetically engineered toxins,ed:frankel,maecel dekker inc,1992.
[0804]
pinto,v和berti,f exploring the group b streptococcus capsular polysaccharides:the structural diversity provides the basis for development of nmr-based identity assays journal of pharmaceutical and biomedical analysis 98(2014)9
–
15
[0805]
ramsay,m.e.；andrews,n.j.；trotter,c.l.；kaczmarski,e.b.；miller,e.,herd immunity from meningococcal serogroup c conjugate vaccination in england:database analysis.bmj 2003,326,365-366
[0806]
schneerson,r.；barrera,o.；sutton,a.；robbins,j.b.,preparation,characterization,and immunogenicity of haemophilus influenzae type b polysaccharide-protein conjugates.j.exp.med.1980,152,361-376
[0807]
szu等人.ultrasonic irradiation of bacterial polysaccharides.
[0808]
characterization of the depolymerized products and some applications of the process.carbohydrate research第152卷第7-20页(1986)
[0809]
tacket c.o.,l.m.m.,robbins j.b.,persistence of antibody titres three years after vaccination with vi polysaccharide vaccine against typhoid fever.vaccine 1988,6(4),307-308
[0810]
uchida等人.,diphtheria toxins and related proteins.j.biol.chem.218；3838-3844,(1973).
[0811]
van damme等人.,safety,immunogenicity and dose ranging of a new vi-crm197 conjugate vaccine against typhoid fever:randomized clinical testing in healthy adults plosone 2011。