作为基于聚合物的抗肿瘤剂的肼基甲酸酯活化的聚乙烯醇(PVAC)的制作方法

作为基于聚合物的抗肿瘤剂的肼基甲酸酯活化的聚乙烯醇(pvac)
技术领域
1.本发明涉及癌症治疗的领域，并且提供了一种用于预防、减轻或治疗癌症的组合物。


背景技术：

2.癌症是世界范围内死亡的主要原因之一，每年估计有1000万人死于癌症。尽管开发了新药，导致若干种癌症类型的患者存活率提高，但是长期效果受到固有耐药性和获得性耐药性的影响。
3.在得到最终产品之前，药物开发总体上与许多困难相伴。最初，一种有希望的化合物在不同的体外模型中被鉴定和实验测试，然后最常由不同的小鼠模型启动临床前研究。由于毒性、严重的副作用或制造问题，许多有希望的化合物/药物无法上市。
4.聚合物是由高相对分子质量的大分子组成的物质，其结构实质上包含实际上或概念上来源于低相对分子质量的分子的多个重复单元。聚合物构成了可以以若干种方式进行修饰的一类化合物。聚合物的物理性质很大程度上取决于聚合物链的长度(或等效于分子量)。
5.近年来，聚合物技术已被用于增强抗肿瘤治疗。这些应用包括使用聚合物作为药物递送系统，以及整合至细胞抑制药物的主链以改变药代动力学属性(1，2)，并且最近还用作直接抗肿瘤剂(3-5)。
6.由于这些聚合物的相对带净电荷的膜，它们已被设计为与癌细胞膜相互作用(6)。聚合物的修饰还允许不同的尺寸，这导致增强的通透性和滞留效应(epr)(7，8)。这导致由于通过快速形成的恶性血管的可渗透的和有缺陷的内皮细胞壁的扩散引起的血管外聚合物积累增加(9-11)。
7.也可以对尺寸进行一些考虑。已知pva在口服和静脉内施用时均无毒，并且可以通过肾脏分泌(23)。尽管如此，随着聚合物尺寸增加，清除动力学(clearance kinetics)显著减慢，15kda尺寸的pva具有90分钟的t
1/2
，在分子量增加到43kda后其t
1/2
增加到23小时。然而，组织内的积累仍然很低(24)。当尺寸增加至高达125kda(远远超过白蛋白的尺寸(67kda)，白蛋白是通常保留在健康个体的循环中的化合物)时，仍然观察到进一步消除，这突出表明单独的分子质量并不能预测肾脏消除。
8.已经在小鼠中描述了肿瘤组织中聚乙烯醇(polyvinyl alcohol，pva)的尺寸依赖性积累(12)。pva被用作最初开发为药物偶联的分子中的主链，但初步研究表明，该聚合物具有直接的抗肿瘤活性。
9.肼基甲酸酯活化的聚乙烯醇(carbazate-activated polyvinyl alcohol，pvac)包括用肼基甲酸酯部分官能化的pva主链，肼基甲酸酯部分分子性靶向生物亲电体，如羰基，并且pvac能够结合多个羰基。肼基甲酸酯含有与胺具有相似性质的中性氮原子。与胺相比，肼基甲酸酯允许增加电子的稳定性，使其更具反应性并且形成的键更稳定。通常，此类
物质的过量通过还原剂(如谷胱甘肽)或酶(如醛脱氢酶)来处理(13)。
10.wo19016189a1公开了一种用于预防或治疗细菌诱导的感染和疾病的包含pvac的组合物，wo2018172422a1公开了一种用于稳定红细胞的包含pvac的组合物，并且wo2012105887公开了一种用于治疗或预防炎症相关病症的包含pvac的组合物。
11.鉴于上面讨论的问题，对具有新作用模式的替代治疗策略的需求持续未得到满足。


技术实现要素：

12.本发明提供了一种用于预防、减轻和/或治疗癌症的根据式i的化合物：
[0013][0014]
本发明还提供了一种用于预防、减轻和/或治疗癌症的包含根据式i的化合物的药物组合物。
[0015]
本发明还提供了一种通过向有需要的受试者施用如式i中定义的化合物用于预防、减轻和/或治疗癌症的方法。
[0016]
本发明公开了一种用于预防、减轻和/或治疗癌症的化合物，即一种聚合物，其包含根据式i的肼基甲酸酯修饰的聚乙烯醇(pvac)
[0017][0018]
未修饰的pva重复单元用n表示，而与重复单元偶联的肼基甲酸酯基用m表示。
[0019]
在一方面，根据本发明的式i使用的所述聚合物的聚合度(degree of polymerization，dp)在25≤dp≤3000的范围内。在另一方面，根据本发明的式i使用的所述聚合物的聚合度(dp)在100≤dp≤2000的范围内。在另一方面，根据本发明的式i使用的所述聚合物的聚合度(dp)在100≤dp≤1200的范围内。在又一方面，根据本发明的式i使用的所述聚合物的聚合度(dp)在100≤dp≤600的范围内。
[0020]
在一方面，根据本发明使用的所述聚合物(式i)具有1-50％范围内的卡巴肼(carbazide)的取代度(degree of substitution，ds)。在另一方面，根据本发明使用的所述聚合物具有1-20％范围内的卡巴肼的取代度(ds)。在另一方面，根据本发明使用的所述聚合物具有10％范围内的卡巴肼的取代度(ds)。在另一方面，根据本发明使用的所述聚合物具有0.5-50％范围内的卡巴肼的取代度(ds)。在另一方面，根据本发明使用的所述聚合物具有2.5-20％范围内的卡巴肼的取代度(ds)。在另一方面，根据本发明使用的所述聚合物具有10％范围内的卡巴肼的取代度(ds)。
[0021]
在一方面，根据本发明使用的并且如上描述的所述聚合物具有在0.5-10mmol/g聚乙烯醇肼基甲酸酯范围内的肼基甲酸酯含量。在另一方面，根据本发明使用的所述聚合物
具有在2-8mmol/g聚乙烯醇肼基甲酸酯范围内的肼基甲酸酯含量。在另一方面，根据本发明使用的所述聚合物具有在2-6mmol/g聚乙烯醇肼基甲酸酯范围内的肼基甲酸酯含量。
[0022]
在另一方面，根据本发明使用的并且如上描述的所述聚合物具有在0.1-10mmol/g聚乙烯醇肼基甲酸酯范围内的肼基甲酸酯含量。在另一方面，根据本发明使用的所述聚合物具有在0.5-4mmol/g聚乙烯醇肼基甲酸酯范围内的肼基甲酸酯含量。在另一方面，根据本发明使用的所述聚合物具有在2mmol/g聚乙烯醇肼基甲酸酯范围内的肼基甲酸酯含量。
[0023]
在又一方面，根据本发明使用的所述聚合物具有在约1000道尔顿(daltons)至约150000道尔顿的范围内的重均分子量。
[0024]
上述根据式i的所述聚合物的所有方面在不同的实施方案中是可组合的。
[0025]
本发明还提供了一种用于预防、减轻或治疗癌症的药物组合物，其包含上述根据式i的所述化合物或聚合物。
[0026]
所述药物组合物包含也在具体实施方式中描述的本发明的式i的聚合物，用于预防、减轻或治疗癌症。
[0027]
根据本发明使用的所述药物组合物还可以包含药学上可接受的赋形剂或载体。可接受的载体可以例如为水溶液。在一方面，所述水溶液为水。
[0028]
根据本发明使用的所述药物组合物可以以冻干物的形式存在。所述冻干物可以在向有需要的受试者施用之前在水溶液中复溶。
[0029]
所述癌症可以是实体瘤、液体瘤(liquid tumor)或血液瘤(heamatological tumor)。在一方面，所述癌症选自黑色素瘤、胃肠道癌、t细胞淋巴瘤、b细胞淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤(hodgin's lymphoma)。
[0030]
用于预防、减轻和/或治疗癌症的所述聚合物或所述药物组合物如上定义，其中，用途包括向需要这种治疗的受试者施用治疗有效量的根据式i的所述聚合物或所述药物组合物。
[0031]
另一个目的为提供一种预防、减轻和治疗癌症的方法，包括施用治疗有效量的根据式i的所述化合物或包含根据本发明的所述化合物的药物组合物。
[0032]
所述癌症可以选自黑色素瘤、胃肠道癌、t细胞淋巴瘤、b细胞淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤。
[0033]
在一方面，用于治疗受试者的癌症的方法包括向需要这种治疗的受试者施用药学有效剂量的根据本发明的所述聚合物或如上定义的所述药物组合物。
[0034]
施用的途径可以是肠胃外的、静脉内的、输注和/或口服的。在一方面，施用途径为肠胃外的。在另一方面，施用途径为静脉内的。在又一方面，施用途径为通过输注。在另一方面，施用途径为口服的。
[0035]
在又一方面，在治疗癌症的方法中，如上定义的本技术的所述聚合物或所述药物组合物可以与另一种抗癌治疗联合使用。
附图说明
[0036]
图1示出了包含用多个肼基甲酸酯基团官能化的聚合物的pvac分子的合成。
[0037]
图2a-c示出了说明pvac(a)、ec(b)和pva(c)对细胞活力的效果的图。
[0038]
图3a-b示出了分别说明在24小时(a)和48小时(b)后以不同细胞密度接种的细胞
的细胞活力的图。
[0039]
图4a-c示出了不同细胞系和孵育时间(a)中细胞活力的流式细胞术评估、培养的细胞的形态学评估(b)以及塌陷的冲洗细胞和给药的细胞的图像(c)。
[0040]
图5a-b示出了在pvac处理24和48小时之前、pvac处理24和48小时之后的细胞周期的流式细胞术评估。
[0041]
图6a-d示出了c57bl/6j小鼠中b16的评估。
[0042]
图7a-d示出了无胸腺裸鼠中mda-mb-231的评估。
具体实施方式
[0043]
应当理解的是，本发明不限于本文公开的特定配置、工艺步骤与材料，因为此类配置、工艺步骤和材料可以有所不同。
[0044]
还应当理解的是，本文所采用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并未旨在限制，因为本发明的范围将仅受所附权利要求及其等同内容的限制。
[0045]
所引用的所有参考文献都以引用的方式全部并入本文并且用于所有目的，其程度如同每个单独的出版物或专利或专利申请被具体地并且单独地表明出于所有目的以引用的方式以其整体并入。
[0046]
通过参考本文提供的以下定义、附图和示例性公开内容可以最好地理解本发明。
[0047]
在本说明书中，除非另有说明，否则术语“药学上可接受的赋形剂”是指无毒、惰性的固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、包封材料或任何类型的制剂助剂。
[0048]
在本说明书中，除非另有说明，否则术语“药学上活性的化合物”包括当施用于包括人和动物的主体时将产生治疗上有益的药理反应的任何物质。
[0049]
在本说明书中，术语“施用(administering)”或“施用(administration)”是指以药理学有用的方式向受试者提供药物。
[0050]
在本说明书中，除非另有说明，否则术语“细胞毒性的化合物”是指具有抑制细胞的生长或杀死细胞的能力，即具有高的细胞毒性活性的化合物。
[0051]
在本说明书中，术语“癌症”意在指任何恶性肿瘤疾病，即由异常且不受控制的细胞分裂引起的任何恶性生长或肿瘤。术语“癌症”意在包括实体瘤、局部瘤和非实体癌症形式。例如，所述癌症形式可以选自由白血病(all、aml、cll、cml、cmml)、t细胞白血病、多发性骨髓瘤、卵巢癌、前列腺癌、宫颈腺癌、鳞状细胞癌、乳腺癌、结直肠癌、小肠癌、肛门癌、胃癌、肾癌、肾盂和输尿管的恶性黑色素瘤癌、尿道癌、膀胱癌、肝癌、阑尾癌、胰腺癌、肺癌、食道癌、唇/口腔癌、鼻癌、喉癌、脑/中枢神经系统癌、皮肤癌、甲状腺和胸腺癌、肉瘤、头颈癌、非霍奇金淋巴瘤(non-hodgkin iymphoma，nhl)、霍奇金淋巴瘤(hodgkin lymphoma)以及腹膜假黏液瘤组成的组。
[0052]
在本发明中，术语pvac是指肼基甲酸酯活化的聚乙烯醇、肼基甲酸酯修饰的聚乙烯醇、聚乙烯醇肼基甲酸酯，具有化学名称：聚[(1-羟基乙烯)-ran-(1-肼羧酸乙烯酯)](poly[(1-hydroxyethylene)-ran-(1-hydrazinecarboxylatoethylene)])。
[0053]
聚合物的取代度(ds)为每个基本单元(在缩聚物的情况下)或每个单体单元(在加聚物的情况下)连接的取代基的(平均)数量。
[0054]
聚合度(dp)为大分子或聚合物或低聚物分子中单体单元的数量。
[0055]
最初，pvac应当作为交联剂以形成相当惰性的水凝胶。然而，使用与该化合物相关的细胞系时的初步结果产生了有趣的形态学结果。这启发发明人进一步研究肿瘤系统中的物质pvac。
[0056]
在此，使用了不同细胞来源的肿瘤的实验模型，并且将其与具有不同免疫功能的小鼠模型结合。
[0057]
将免疫活性的b16.f10黑色素瘤模型和无胸腺乳腺癌mb-mda-13模型用于研究肿瘤内pvac注射的抗肿瘤效果和安全性。
[0058]
实施例
[0059]
1.材料与方法
[0060]
1.1化合物
[0061]
pvac由特殊聚合物(specific polymers)(castries,法国)合成。pvac在-20℃冷冻干燥储存，并且在不同实验之前立即溶解于所需的介质中。使用肼基甲酸乙酯(ethyl carbazate，ec，一种低分子量的肼基甲酸酯化合物)和pva(与pvac合成中使用的pva的尺寸相同)作为对照。聚合度为295≤dp≤522，肼基甲酸酯含量为4
±
2mmol/g。该聚合物极易溶于水，几乎不溶于乙醇，并且取代基的分布是随机的。将ec和pva溶解于去离子水中，得到50mg/ml的储备浓度。两种化合物均购自sigma。
[0062]
1.1.1肼基甲酸酯修饰的聚乙烯醇(pvac)的合成
[0063]
向0.50g聚乙烯醇(pva，平均分子量16kda)中加入20ml二甲亚砜(dmso)。将混合物在80℃加热15分钟以完全溶解pva。冷却至室温后，添加1.00g的1,1
’‑
羰基二咪唑(cdi)并将混合物搅拌24h。将3.2ml(80％)水合肼添加至混合物中，再将该混合物搅拌又一个24小时。将反应混合物用水稀释并透析(6透析膜，截留分子量，mwco，3.5kda)三天，冷冻干燥后将产物分离为白色粉末。
[0064]
表征：通过在h2o中5％(w/v)的2,4,6-三硝基苯磺酸(sigma)的测定研究了肼基甲酸酯基团的取代度(ds)。将1ml样本溶解于20ml十水四硼酸钠(k99.5％，sigma)缓冲液(ph 9.3，0.1m)中。从制备的溶液中，将1ml与25p1 2,4,6-三硝基苯磺酸溶液混合。反应三小时后，通过紫外-可见光谱在505nm处分析了混合物，并且与基于肼基甲酸叔丁酯(tert-butyl carbazate，1.98.0％，sigma)的标准曲线进行了比较。取代度计算为7.5％(0.075)。
[0065]
1.2疏水性和亲水性测定(qcm-d)
[0066]
为了研究pva和pvac的疏水的和亲水的相互作用，使用了qcm-d。金传感器(biolin scientific，瑞典)在自组装单层中涂覆有1-十一硫醇(sigma)，以形成疏水表面，而未涂覆的金传感器用作亲水表面。然后，将它们在1型水中清洗并用n2气干燥。然后，将传感器放置在qsense pro(biolin scientific)中，实验开始时将pbs通过传感器5分钟，然后将含有2.5mg/ml pvac或pva的pbs通过传感器45分钟，最后pbs通过传感器10分钟。记录质量偏移(ng/cm2)与耗散。在两次实验中运行两个亲水的和疏水的传感器，得到每个表面4次观察结果。
[0067]
pbs的质量偏移(4.0
±
7.8ng/cm2)对于两个表面都可以忽略不计。在疏水的传感器上，对于pvac(31.8
±
4.5ng/cm2)和pva(13.8
±
13.6ng/cm2)的质量偏移都很低。在亲水的传感器上，在含有聚合物的溶液开始循环后1分钟记录的对于pvac(179.2
±
28.6ng/cm2)和pva(262.7
±
52.9ng/cm2)的质量偏移均快速且高。与pva(414.2
±
6.8ng/cm2)相比，冲洗10
分钟后的pvac的最终记录(198.8
±
22.6ng/cm2)显著降低。与pva(2.1
±
0.00)相比，pvac的耗散(1.2
±
0.02)也较低。综合而言，这表明随着更多分子堆积在表面上，pva能够形成更紧密的层，这种重新取向也是较慢的进展，因为传感器上的质量密度在含有pva的溶液初始占用后循环的时间内增加了60％。
[0068]
1.3细胞系
[0069]
gist-t1是人类胃肠道间质瘤(gist)细胞系，购自cosmo bio有限公司(tokyo，日本)。b16.f10(鼠类)和a375(人类)都是黑色素瘤细胞系。a375购自atcc(manassas，virginia，usa)，而b16.f10是来自adlego ab(stockholm，瑞典)的一类赠品，其也在小鼠模型中使用了md-mba-13细胞系。将细胞维持在补充有10％fbs、1％青霉素/链霉素的dmem培养基中。此外，gist-t1补充有1％谷氨酰胺(glutamax)。将细胞在37℃和5％co2的培养箱中培养。gist-t1用于活力实验和流式细胞术，而b16和a375仅用于流式细胞术实验。
[0070]
1.4细胞活力测定
[0071]
将0.25
×
104–1×
104个gist-t1细胞接种到96孔板的每个孔中。将pvac、ec和pva添加至每个孔或溶媒(去离子水)中，随后孵育24小时或48小时。celltiter-glo测定(promega，mi，usa)是根据方案实施的基于atp的发光方法。简而言之，从培养箱中取出细胞以使其调整至室温，然后向每个孔中加入100μl的室温celltiter-glo。将板放在振荡器上5-10分钟。在envision 2103 multilabel reader(perkin elmer，ma，usa)上测量之前将细胞静置5-10分钟。
[0072]
通过添加稀释倍数为5的6种不同浓度的pvac(2.5mg/ml至0.8μg/ml)制备培养基。对于b16和gist-t1，细胞在培养物中保持48小时，对于a375，如果pvac的效果可以被冲洗掉，则在48小时后用含有与以前相同浓度的新pvac的培养基或不添加pvac的培养基更换培养基以进行研究。然后，将细胞再培养48小时。每天采集孔，然后通过流式细胞术分析它们的活力与细胞周期分析。
[0073]
1.5流式细胞术
[0074]
对于细胞凋亡流式细胞术，收集细胞并以pbs清洗两次，重悬于膜联蛋白结合缓冲液(annexin binding buffer)(pbs中的10mm hepes、150mm nacl、2.5mm cacl2)中，并且转移到玻璃流式细胞术管中，向其中添加5μl膜联蛋白v fitc(sigma，mi，usa)和10μl 7-aad(sigma，mi，usa)或pi(thermofisher，ma，usa)。在分析之前将样本孵育20分钟。将gist-t1细胞以3.75
×
105个细胞/孔接种于6孔板中，并且如上收集并染色。将a375和b16在24孔板中培养，每孔接种1
×
105个细胞，使细胞沉降24小时，然后改变培养基以含有pvac，如上所述对它们收集并染色。在accuri c6(b16)或facsverse流式细胞仪(bd，franklin lakes，nj，usa)上分析样本(a375和gist-t1)。所有样本都导出为fsc文件并在flowjo(flowjo lcc，ashland，or，usa)中处理。可以在每种技术的结果部分的代表性实施例中看到门控策略。对于细胞周期分析，flowjo中内置的工具与watson(pragmatic)单变量模型一起使用。与流式细胞术实验并行，每天还使用三星(samsung)a3蜂窝设备(seoul，south korea)拍摄培养物中细胞的图像。
[0075]
1.6黑色素瘤和乳腺癌的体内模型
[0076]
这部分研究由astrid fagreaus实验室的adlego ab分两部分实施。第一部分包括注射了b16.f10细胞的36只免疫活性的c57bl/6j小鼠。第二部分包括注射了mda-mb-231肿
瘤细胞的36只无胸腺裸鼠。在将b16.f10细胞注射到c57bl/6j小鼠中后，每周监测动物两次，记录体重、总体健康状况和肿瘤尺寸。当肿瘤尺寸达到至少50μl时，根据肿瘤尺寸将动物分成三组，每组12只小鼠。在研究期间，所有三组c57bl/6j小鼠经受每周3次肿瘤内/肿瘤周围注射，每次注射量为100μl。一组作为对照组并接受nacl(溶媒)注射，另外两组分别接受不同剂量的pvac(0.5mg/ml和10mg/ml)。这些剂量来源于体外实验，其中在0.5mg/ml以及10mg/ml的高剂量组中观察到效果。在治疗期间每周记录3次肿瘤尺寸和健康状况。当对照组的平均肿瘤尺寸达到2ml体积时，使动物安乐死。然后，切除肿瘤称重并分成两部分。一部分在干冰上的异戊烷中冷冻并在-80℃储存，第二部分放置于4％缓冲甲醛中，直到运送至micromorph ab(lund，瑞典)进行免疫组织化学分析。
[0077]
在将mda-mb-231细胞注射到无胸腺裸鼠中后，每周监测动物两次，记录体重、总体健康状况和肿瘤尺寸。当平均肿瘤尺寸约为100μl时，根据肿瘤尺寸将动物分成三组，每组12只小鼠。所有三组经受每周两次为期28天的肿瘤内/肿瘤周围注射，每次注射量为100μl。一组作为对照组并接受nacl(溶媒)注射。其余两组接受如上所述不同剂量的pvac。在第29天使动物安乐死，并且切除肿瘤，称重，并分成两部分，如上所述进行处理。
[0078]
1.7免疫组织化学与组织学
[0079]
通过micromorph ab对肿瘤进行切片和染色。所有切片均在tissue-tek v.i.p.(miles scientific，newark，de，usa)中自动脱水、清理并用石蜡浸润。从肿瘤的外周和中心部分获得切片。所有肿瘤均用苏木精伊红(he)染色。b16的切片也用抗cd3和抗ki67染色(见表1)。用mayer的苏木精(bio-optica，milano，italy)进行he染色6分钟，然后在流水中清洗10分钟。然后，在伊红(bio-optica)中染色3分钟，接着在蒸馏水中清洗，最后将它们脱水并固定。
[0080]
表1.用于免疫组织化学的抗体
[0081][0082]
用于免疫组织化学的载玻片首先进行脱蜡，然后通过在硼酸(ph8.0) 0.2％triton-x 100中煮沸20分钟进行抗原修复。载玻片可以在室温下冷却20分钟，然后在pbs中清洗。将它们与一抗在具有5％山羊血清(jackson immunoresearch，cambridgeshire，uk)的pbs中孵育1小时(见表1)，接着在pbs中清洗3次。添加二抗(见表1)并将载玻片孵育30分钟，接着在tris缓冲液中清洗3次，并在3,3-二氨基联苯胺中孵育5分钟。最后，将它们在蒸馏水中漂洗并在苏木精中复染5秒，然后脱水并固定。
[0083]
一位高级病理学家使用leica dmrx显微镜以盲法对所有肿瘤载玻片进行了评分。在肿瘤形态、cd3 细胞数量和ki67表达方面对b16进行了评分。cd3 细胞和ki67表达的评分为：0(无阳性细胞)；极少量阳性细胞(0-1 )；少量阳性细胞(1 )；少量到中等数量的阳性细胞(1-2 )；中等数量的阳性细胞(2 )；中等到大量阳性细胞(2-3 )；大量阳性细胞(3 )；在肿瘤形态和白细胞浸润方面对mda-mb-231进行了评分。
[0084]
1.8细胞周期分析
[0085]
对于细胞周期流式细胞术，将样本在pbs中清洗2次，然后重悬于500μl的pbs中，然后将全部体积的pbs添加至4.5ml冰冷的70％etoh中，然后将样本在冰上或在4℃固定至少2小时(所有样本在48小时内进行分析)。然后将样本以500g
×
5分钟离心，并且丢弃上清液etoh，将细胞重悬于5ml pbs中并以500g
×
5分钟离心，并且丢弃上清液pbs。最后，将细胞重悬于含有10μg/ml pi(sigma)和100μg/ml核糖核酸酶(rnase，sigma)的1ml pi染色缓冲液中，并且转移到玻璃流式细胞术管中，将样本在分析前孵育30分钟，并且在60分钟内进行分析。
[0086]
在来自a375人类黑色素瘤细胞培养物的流式细胞术细胞周期分析测定中，来自不同传代的三种培养物，一式三份实验。
[0087]
1.9统计数据
[0088]
用平均值和作为标准偏差的误差条绘制图，在图中用*表示显著性差异(p值《0.05)。文本中的统计数据报告为p值、测试组之间的平均差、95％ci(如果可以计算)，格式为p＝0.05，z％(x
–
y)，其中z为组之间的平均差，而xy为95％ci的界限。对参数数据(例如肿瘤重量)使用一个参数单因素方差分析(one-way anova)，对非参数数据(例如淋巴细胞侵袭)使用kruskal-wallis进行多组分析。双因素方差分析(two-way anova)用于分析两个参数数据集(例如随时间变化的肿瘤尺寸)。进行方差分析(anova)后，在单因素方差分析的情况下使用tukey方法在实验组与对照组之间进行多重比较测试，且在双因素方差分析的情况下使用dunnett方法在实验组与对照组之间进行多重比较测试。在可能的情况下，在分析中测试了技术平行测定，如果不可能，则改为使用平行测定的平均值。
[0089]
2.伦理许可
[0090]
使用b16和mda-mb-231的体内研究由斯德哥尔摩北部(stockholm north)的区域动物实验伦理委员会在n37/15许可下进行。
[0091]
3.结果
[0092]
3.1 pvac、pva和ec对细胞活力的效果
[0093]
向细胞培养物中添加pvac导致孔中atp的减少，这反映了活细胞数量减少。该效果不遵循线性响应曲线；相反，在100μg/ml附近观察到峰值浓度。在浓度低于20μg/ml时，未观察到活细胞减少(图2a)。
[0094]
为了评估来自pvac的化学组分的潜在细胞毒性，在不同浓度下使用了与合成的pvac尺寸相同的主链pva(图2c)和肼基甲酸乙酯(ec，低分子量的肼基甲酸酯)(图2b)。这两种化合物在生物学相关浓度下没有降低细胞活力，这表明需要将肼基甲酸酯基团与大主链结合以观察pvac的效果。以摩尔质量计，肼基甲酸乙酯中的肼基甲酸酯含量约为pvac中的5倍；因此，2500μg/ml的pvac与500μg/ml的肼基甲酸乙酯中的肼基甲酸酯含量相同。
[0095]
图3a和3b示出了分别在24小时(a)和48小时(b)后以不同细胞密度接种的细胞的细胞活力。细胞密度的增加导致细胞活力的降低。48小时(b)后高接种密度下效果最明显，这表明pvac处理的细胞活力的降低取决于时间和接种密度。在两个时间间隔的高接种密度下观察到非线性剂量-反应关系，而中等密度(5
×
104)细胞/孔)则仅在24小时(a)观察到非线性剂量-反应关系。绝对发光的使用在24小时和48小时之间也显示出增加的值，表明有活力的和正在增殖的细胞。
[0096]
还测试了pvac对不同细胞系上细胞活力的效果，具有相似结果。测试的细胞系表示黑色素瘤、t细胞和b细胞淋巴瘤、胃肠道间质瘤以及霍奇金淋巴瘤(见表2)。
[0097]
表2.
[0098][0099][0100]
3.2使用膜联蛋白v/7-aad或pi的细胞活力的流式细胞术评估
[0101]
使用膜联蛋白v/7-aad或pi的流式细胞术评估用于评估细胞活力、细胞凋亡和坏死性细胞(见图4a)。a375人类黑色素瘤细胞用于扩展的方案，评估从pvac处理中拯救细胞的可能性。48小时后评估gist-t1细胞和b16.f10细胞。48小时之后，大多数细胞(a375、b16和gist-t1)在浓度范围为20-500μg/ml的pvac中显示晚期凋亡/坏死性细胞的统计学上显著的增加。对于其它浓度，效果不显著。
[0102]
为了评估通过施用新的pvac(右图)或清洗细胞并继续在细胞培养基中增长细胞(左图)来拯救细胞的可能性，在培养72和96小时后，较高浓度500μg/ml和2.5mg/ml显示死细胞数量的增加和活细胞的减少。在最高浓度(2.5mg/ml)以及较低浓度(4μg/ml)施用后，在培养72和96小时后，死细胞数量增加，并且活细胞减少。
[0103]
3.3暴露于pvac或溶媒的培养的细胞的形态学评估如图4b中所示。
[0104]
在培养过程中，对照细胞的汇合度迅速增加，其中细胞最初以单层生长，但后来也以多层生长。在暴露于pvac后的第一天期间观察到培养物的视觉方面的改变。在具有20μg/ml和100μg/ml的pvac的细胞中，汇合度和形态似乎受到影响。此外，暴露于500μg/ml的pvac的细胞在形态上也显示出细胞凋亡体。在培养48小时后，随着汇合度的增加，效果相似。冲洗之后暴露于2.5mg/ml的细胞塌陷形成难以辨认的坏死块，暴露于500μg/ml的细胞在冲洗后似乎也受到更大影响，而暴露于20μg/ml和100μg/ml的细胞则在汇合度和形态上缓慢恢复。施用2.5mg/ml后，细胞最初保持它们的总体形态，但在培养96小时后，细胞出现变形。随着时间变化，20-500μg/ml似乎受到越来越多的影响，出现大块细胞凋亡/坏死性碎片。
[0105]
图4c显示了与先前在2.5mg/ml pvac中观察到的相同现象的图像，其中冲洗细胞塌陷，而给药的细胞保持完整的形态。左图描绘了细胞残留物交联成大片，这可能是pvac的直接影响。交联效应在100μg/ml和500μg/ml最为明显，但在较低或较高浓度下均未发生。当结合更多的肼基甲酸酯时，pvac的溶解度受到影响，另一种可能的解释为观察到pvac的沉淀(图4c)。
[0106]
如图5a-b所示，在培养过程中，对照细胞和pvac处理的细胞在细胞周期上没有差异。
[0107]
门控策略的代表示例为使用ssc w/h和fsc w/h门鉴定单细胞，然后使用flowjo细胞周期分析工具进行分析。条形表示不同处理，并且图表示时间点。细胞周期的阶段的分布用不同的颜色表示。根据对照和2.5mg/ml中的目测判断培养物中随时间变化的汇合度。在活力测定、形态学和细胞凋亡流式细胞术(数据未示出)中，非线性剂量反应都很明显。这种效果似乎不是细胞系特异性的。选择在体外显示峰值效应的pvac的浓度(100μg/ml)用于评估体内效果。还选择了10mg/ml以确保它是仍然显示出强效的饱和剂量。
[0108]
3.4体内b16和mda-mb-231在图6a-d中示出。
[0109]
将c57bl/6j小鼠接种b16肿瘤并用pvac(高或低剂量)或溶媒注射到该肿瘤中。
[0110]
(a)左上图显示随时间变化在每个刻度(tick)处进行新注射的注射量，以及随时间变化的肿瘤尺寸。
[0111]
(b)右上图显示在小鼠已被安乐死并切除肿瘤之后研究结束时的肿瘤重量。
[0112]
(c)该图显示肿瘤的组织学特征，这些特征包括淋巴细胞侵袭(通过cd3染色确定)与外周(左下)和肿瘤中心(左上)的坏死程度、坏死程度(右上)以及肿瘤的ki67状态(右下)。
[0113]
(d)底部的图显示在对照组(a)、低剂量组(b)和高剂量组(c)中用cd3染色的肿瘤的组织学。箭头表示cd3染色阳性的细胞。与对照组相比，注射开始后五天，高剂量组中的肿瘤尺寸较小(p＝0.044平均0.34cm3，ci 95％0.01
–
0.69)。在最后一次注射的时间点，低剂量组和高剂量组中的肿瘤尺寸均较小(分别为p＝0.0017平均0.6cm
3 ci95％0.27
–
0.95和p＝0.0006平均0.57cm
3 ci95％0.22
–
0.92)。在已切除肿瘤后测量的肿瘤尺寸没有差异。与对照组相比，高剂量组中肿瘤中心(p＝0.017平均1.42秩差ci 95％1.09
–
1.74对2.42 ci 95％1.78
–
3.05)和外周(p＝0.003平均1.83秩差ci 95％1.59
–
2.08对2.47 ci 95％2.47
–
3.2)中的cd3 细胞的数量均较高。
[0114]
在mda-mb231无胸腺裸鼠(图7)中，三只小鼠没有发展成已确定的肿瘤，并且在治疗期之前被排除在外。由于肿瘤体积超过2ml，因此三只动物(每组一只)被安乐死。总共五只动物由于感染而被安乐死，其中四只来自pvac高剂量组。低剂量的pvac导致肿瘤尺寸随时间增加(a)，切除肿瘤后没有观察到重量差异(b)。组间的组织学参数(基质的含量(中)、坏死程度(右)以及白细胞侵袭(下))没有发现差异(c)。盲法病理学评估表明，高pvac剂量组显示出治疗效果的组织学特征，描述为增加的白细胞计数和更多的基质组织。
[0115]
4.讨论
[0116]
除了与常规化疗试剂一起使用外，聚合物已被证明具有直接的抗肿瘤效果，特异性靶向肿瘤细胞且对正常细胞无毒作用的研究结果令人鼓舞。此外，它的抗肿瘤效果已经在化疗耐受细胞[5]以及休眠癌细胞[6]中显示出来，这两者都代表癌症治疗中的主要临床问题。受此启发，发明人试图确定由肼基甲酸酯基团官能化的常用的聚合物pva的效果。结果表明，pvac有效诱导细胞活力降低并导致晚期细胞凋亡/坏死性细胞群体(gist-t1、a375、b16)，并且pvac的任何组分都没有发挥抗肿瘤效果。在b16.f10(黑色素瘤)小鼠模型中观察到体内肿瘤生长的统计上显著的下降，其特征还在于cd3 浸润增加。这在无胸腺(免疫无能)小鼠模型(mda-mb-13)中并未观察到。在本研究中观察到的非线性剂量关系很有
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