用于治疗HIV感染的长期存活的T细胞

用于治疗hiv感染的长期存活的t细胞
1.相关申请
2.本技术要求2019年7月17日提交的美国临时申请号62/875,217的优先权，其主题通过引用以其全文并入本文。


背景技术：

3.少量潜伏感染细胞的存在一直是阻止抗逆转录病毒治疗(art)和人类免疫缺陷病毒(hiv)根除的主要障碍。尽管art可以持久地抑制病毒复制，但hiv无限期地持续存在，需要感染个体终生接受复杂的抗逆转录病毒药物治疗。art重建免疫功能的能力具有高度可变性。即使经过多年有效art，一部分个体(高达45％)仍未能完全恢复cd4 t细胞计数。cd4 t细胞恢复受损与许多宿主相关因素和hiv相关因素有关，例如胸腺生成和体内平衡受损。由于接受art的个体中cd4 t细胞计数低与癌症和其他疾病的风险增加有关，因此需要新型治疗方法来增强这些个体的免疫功能。
4.对潜伏hiv库建模的研究已表明，在art开始4年后，总hiv dna和整合hiv dna的衰减最小，特别是在感染慢性期开始art的个体中。有几种机制导致hiv持续存在，包括由稳态增殖维持的长期存活的记忆cd4 t细胞的“潜伏”感染、功能失调的宿主清除机制以及可能残留的病毒复制。有意思的是，所有这些机制在无免疫应答者中均被加剧，并且与更高的hiv病毒库大小有关。因此，增强cd4 t细胞的恢复可能有助于art期间减少hiv病毒库。
5.ccr5是hiv进入的主要辅助受体之一。为hiv感染受试者提供ccr5缺陷免疫区室的治疗概念已在“柏林患者”中得到证实，该患者自接受来自纯合ccr5a32匹配供体的cd34

干细胞的同种异体骨髓移植后一直没有hiv。虽然这些结果令人鼓舞，但期望侵入性较小且适用范围更广的治疗策略。一种方法是通过自体t细胞的过继转移来重建免疫功能，这已成功扩展用于其他病毒感染，包括巨细胞病毒和epstein-barr病毒，但在hiv感染中很大程度上失败了，部分原因是cd4 t细胞仍易于受到hiv感染。最近的试验在一组hiv感染成年人中进行锌指核酸酶(zfn)介导的ccr5基因编辑的cd4t细胞(sb-728-t产品)的过继转移，已表明这种输注是安全的，耐受性良好并导致cd4 t细胞计数增加和hiv库减少。


技术实现要素：

6.本文描述的实施方案涉及长期存活的具有cd45ra
int
cd45ro
int
表型的cd4 t细胞和cd8 t细胞(cd4/cd8 t细胞)富集群、具有cd45ra
int
cd45ro
int
表型的基因修饰和/或改变的cd4/cd8 t细胞，以及它们在治疗hiv感染受试者中的用途，特别是治疗已经接受和/或继续接受抗逆转录病毒疗法的受试者的潜伏hiv感染。发现cd4/cd8 t细胞亚群具有长期存活的多能干细胞的表型和分子属性。如同其他已知的干细胞群，该亚群具有低代谢特征(脂肪酸代谢和氧化磷酸化上调，以及细胞周期途径下调)，保留自我更新的能力，并且可以分化为效应细胞。该亚群的主要特征在于中间共表达cd45ra和cd45ro(cd45ra
int
cd45ro
int
)。具有cd45ra
int
cd45ro
int
表型的cd4/cd8 t细胞还可以表达cd95(fas)cd127(il7r)和cd27。添加低剂量的细胞因子il-7和il-15可以导致形成具有cd45ra
int
cd45ro
int
表型的cd4/cd8细胞
富集群；而高剂量的细胞因子il-7和il-15可以导致细胞的效应分化。
7.可以对具有cd45ra
int
cd45ro
int
表型的cd4/cd8 t细胞进行基因修饰，使得它们缺乏功能性ccr5和/或cxcr4 hiv辅助受体。向hiv感染受试者施用具有cd45ra
int
cd45ro
int
表型的ccr5和/或cxcr4基因编辑的自体cd4/cd8 t细胞可以提供cd4 t细胞计数持续增加、恢复t细胞稳态和受试者体内hiv库的大小大幅度下降。
8.在一些实施方案中，产生具有cd45ra
int
cd45ro
int
表型的cd4/cd8 t细胞富集群的方法包括从受试者的生物样品中分离t细胞，该cd4/cd8 t细胞富集群可以经基因修饰使得该cd4/cd8 t细胞缺乏功能性ccr5和/或cxcr4 hiv辅助受体。生物样品可以包括待治疗的hiv受试者的含有样品的t细胞(例如外周血单核细胞)，即来自待治疗受试者的自体t细胞。分离的t细胞可以包括cd4 t细胞和/或cd8 t细胞
9.具有cd45ra
int
cd45ro
int
表型的cd4/cd8 t细胞群可以与分离的t细胞相分离。在一些实施方案中，在将具有cd45ra
int
cd45ro
int
表型的cd4/cd8 t细胞群与分离的t细胞相分离之前，该cd4/cd8 t细胞可以经基因修饰使得该cd4/cd8 t细胞缺乏功能性ccr5和/或cxcr4 hiv辅助受体。在其他实施方案中，在与分离的t细胞相分离之后，具有cd45ra
int
cd45ro
int
表型的cd4/cd8 t细胞群可经基因修饰使得具有cd45ra
int
cd45ro
int
表型的cd4/cd8 t细胞群缺乏功能性ccr5和/或cxcr4 hiv辅助受体。
10.在一些实施方案中，分离的cd4/cd8 t细胞通过转导、转染和/或电穿孔中的至少一种进行基因修饰，以使细胞中编码ccr5和/或cxcr4的基因失活。
11.在一些实施方案中，分离的cd4/cd8 t细胞可以表达cd95、cd127或cd27中的至少一种。在其他实施方案中，分离的cd4/cd8 t细胞可以中间表达4-1bb并且任选地表达ox40。
12.在其他实施方案中，分离的cd4/cd8 t细胞可以表达il17ra、cd5、il2rg、igf2r、slc38a1、il7r、slc44a2、slc2a3、cd96、cd44、cd6、ccr4、il4r或slc12a7中的至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种或更多种。
13.在一些实施方案中，分离的cd4/cd8 t细胞可以具有cd45ra
int
cd45ro
int
cd95 cd127 cd27 表型。在其他实施方案中，分离的t细胞可以具有cd45ra
int
cd45ro
int cd95 cd127 cd27 il7r cd44 scl38a1 il2rg cd6 cd5 表型。
14.在其他实施方案中，该方法可以包括在基因修饰和/或分离之前，用抗cd3抗体和/或抗cd28抗体活化分离的cd4/cd8 t细胞。活化的cd4/cd8 t细胞可以以有效促进具有cd45ra
int
cd45ro
int
表型的cd4/cd8 t细胞富集群扩增和/或形成的il7和il15的量培养。一旦分离，cd4/cd8 t细胞可以在包含tgfβ/il1β的培养基中培养以保持cd45ra
int
cd45ro
int
表型。
15.本文所述的其他实施方案涉及一种组合物，该组合物包括通过本文所述的方法产生的ccr5和/或cxcr4基因编辑的cd4/cd8 t细胞富集群。至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％的ccr5和/或cxcr4基因编辑的cd4/cd8 t细胞富集群可以具有cd45ra
int
cd45ro
int
表型。可以将该组合物或t细胞富集群施用于hiv感染受试者以治疗hiv感染。在一些实施方案中，将该组合物或t细胞富集群施用于hiv受试者能够促进绝对cd4细胞数量持续增加、恢复hiv特异性t细胞免疫和受试者体内hiv库明显衰减中的至少。在一些实施方案中，该受试者已经接受和/或继续接受抗逆转录病毒疗法。
附图说明
16.图1是示出了产生具有cd45ra
int
cd45ro
int
表型的cd4/cd8 t细胞富集群的方法的流程图。
17.图2(a-f)示出了显示sb-728-t输注后hiv库的衰减与ccr5基因编辑细胞的持久性相关的图。a，具有重叠抖动的箱线图，显示在基线(bl)、输注后第1年和第2年时每106个pbmc中携带总hiv dna的细胞的频率。方框显示中位值、第一和第三四分位数，并且晶须延伸到最大值和最小值。显示了所有9名参与者的个人数据点，颜色对应于不同队列(队列1、2和3分别以蓝色、绿色和红色显示)。受试者1-01和1-02的bl值按照材料和方法中的描述进行估算。*p《0.05；wilcoxon秩和检验。b，显示了在bl和第2-3年(长期随访)时每106个纯化的cd4 t细胞的整合hiv dna拷贝的频率。队列1、2和3的参与者分别以蓝色、绿色和红色符号显示。*p《0.05；wilcoxon秩和检验。c-d，长期时间点时携带总hiv dna的pbmc频率变化(第720天与第0天的log 10值之比)与输注后第21天(c)和第3-4年(d)五聚体复制标记细胞的倍数扩增之间的关联。来自稳健回归模型的散点图和预测与95％置信区间(阴影区域)一起显示。e，使用monolix(用于非线性混合效应模型中的参数估计的软件)对hiv dna(参与者3-01)进行双相衰减分析的代表性实例。蓝线代表每106个pbmc的hiv dna拷贝的双相指数拟合线(由红星表示)。这些线分别代表快速和慢速衰减以及在慢速衰减阶段结束后达到的平台期。插入突出代表缓慢相位衰减的开始和结束的两个交点。f，预期由于输注后稀释(参与者3-01)产生的估计的每106个pbmc的总hiv dna的代表性实例(红线)。还显示了输注后每106个pbmc的总hiv dna测量频率(蓝线)和每106个pbmc的总ccr5基因编辑细胞的估计频率(紫线；由五聚体重复标记的细胞的频率乘以4计算)。
18.图3(a-d)示出了新型记忆干细胞cd4 t细胞亚群(表达cd95的cd45ra
int
ro
int
细胞)的鉴定图表，该细胞亚群有助于ccr5基因编辑的t细胞和总cd4 t细胞的持续存在，但对cd4 t细胞库的影响极小。a，柱状图绘出了在bl(输注前7天至3个月；n＝9)、早期(第14-28天；n＝6)、中期(第4-7个月，n＝7)和输注后的长期时间点(第3-4年，n＝9)时cd4 t细胞中初始细胞、t
cm
、t
tm
、t
em
和cd45ra
int
ro
int
频率的平均分布。*p《0.05，**p《0.01；wilcoxon秩和检验。b，在输注后d14-m4(所有3个亚群的n＝7)、m6-8(分别为n＝7、7和6)、m11-12(分别为n＝7、7和6)和yr3-4(分别为n＝7、7和5)时在分选的t
cm
、t
tm
和t
em
记忆亚群中，以及在输注后m9-10(分别为n＝6和5)、m11-12(分别为n＝3和5)和yr3-4(分别为n＝7和8)在cd45ra

tscm和cd45ra
int
ro
int
中测量的每106个细胞的五聚体重复标记的中位频率。n/a＝未进行；冷冻保存的pbmc的局限性阻止了在早期时间点对t
scm
亚群进行定量。c，具有重叠抖动的箱线图，绘出了第3-4年样品中每个亚群对cd4 t细胞hiv库的贡献百分比(由于细胞可用性的限制，n＝8)。方框显示中位值、第一和第三四分位数，并且晶须延伸到最大值和最小值。显示了wilcoxon秩和检验的p值。d，3-d散点图，显示了输注后携带总hiv dna的pbmc频率的变化(第720天与第0天的log 10值之比)作为第3-4年cd45ra
int
ro
int t
scm
细胞计数的函数，第3-4年cd45ra
int
ro
int t
scm
中五聚体重复的频率，以及第3-4年cd45ra
int
ro
int t
scm
中五聚体重复频率与t
em
中五聚体重复频率的比率。建立稀疏线性多元模型以库衰减。预测最佳库衰减的多元回归模型包含三个特征：第3-4年cd45ra
int
ro
int t
scm
细胞计数(z轴)、第3-4年cd45ra
int
ro
int t
scm
中的log 10五聚体重复水平(x轴)和第3-4年五聚体重复cd45ra
int
ro
int t
scm
/t
em
比率(y轴)。散点图中的每个点对应参与者，其中点大小与hiv dna第720天/bl比率
成正比，衰减越大，点大小越小。
19.图4(a-g)示出了cd45ra
int
ro
int t
scm
与先前鉴定的cd45ra

t
scm
细胞不同的图表。a，与第3-4年样品中的t
em
和t
cm
相比，cd45ra
int
ro
int t
scm
中诱导或抑制的基因显著富集的选定途径的热图(n＝7)。与t
em
和t
cm
相比，颜色梯度绘出了cd45ra
int
ro
int t
scm
中诱导或抑制的基因富集的途径的gsea归一化富集评分(nes范围为-4至 5)(p《0.05)。选定的途径分为几个生物学功能；细胞周期、细胞代谢、细胞因子信号传导、notch信号传导和凋亡。b，zfn介导的ccr5突变的分布，通过dna测序确定，在第3-4年其独特存在于cd4 t细胞亚群的sb-728-t产品中cd45ra
int
cd45ro
int ccr7 cd27 中(n＝5)。方框显示中位值、第一和第三四分位数，并且晶须延伸到1.5*iqr的距离。异常值显示为点。c，饼图和柱状图，绘出了在输注后第3-4年响应于抗cd3/cd28刺激在cd4 t细胞亚群中产生的ifn-g、il-2和tnf-α细胞因子的频率。对每个细胞亚群(n＝6)的反应进行平均。饼图表示产生1、2或3种功能的细胞的比例。弧线识别对il-2、ifn-γ和tnf-α呈阳性的细胞群。柱状图绘出了细胞因子产生的不同组合的相对频率。d，直方图示出了在输注后第3-4年(n＝7)，转录因子t-bet、eomes、rorgt和gata-3在cd4 t细胞亚群中的表达。*p《0.05；wilcoxon秩和检验。e，使用euclidean距离突出显示cd45ra
int
ro
int t
scm
和cd45ra

t
scm
亚群之间的转录组差异的多维缩放(mds)图。第一维度解释了两个t
scm
亚群之间27％的转录组差异。cd45ra
int
ro
int t
scm
显示为红色，cd45ra

t
scm
显示为绿色(n＝7)。f，通过基因集富集分析(gsea)鉴定的途径的热图，与cd45ra

t
scm
相比，cd45ra
int
ro
int t
scm
中显著富集，重点关注wnt信号传导(reactome)。使用预定义途径前沿的聚合基因集揭示了这些基因在cd45ra
int
ro
int t
scm
亚群中显著富集。标度表示nes评分，红色和蓝色方块分别表示阳性富集和阴性富集。列代表cd45ra
int
ro
int t
scm
和cd45ra

t
scm
亚群。g，突出显示在cd45ra
int
ro
int t
scm
亚群中显著富集的顶级前沿基因的共表达网络。genemania算法用于推断网络连接和共表达。
20.图5(a-h)示出了显示在ati之前ccr5基因编辑的tscm与病毒载量控制相关的图。a，绘出了第22周(相当于ati 16周)的病毒载量(vl)值和从参与者图表获得的历史art前病毒设定点值(数据可用于研究1101队列1-5的15名参与者中的14名)。接受ati的参与者显示为红色。显示了wilcoxon秩和检验的p值。b-c，在第22周与历史art前病毒设定点之间的vl变化与峰扩增期间(输注后第1-3周)cd4 t细胞计数的变化之间的spearman秩相关性(b)以及在ati之前(第6周)，每106个pbmc的“五聚体复制”标记的频率(c)。接受延长ati的参与者显示为红色。虚线代表95％置信区间。小图d-h中显示的免疫学和病毒学测定针对队列3-5的参与者进行，这些参与者的冷冻保存细胞可用于分析，d-e，具有重叠抖动的箱线图显示在输注后6周(ati前)(d)和输注后22周(ati结束)(e)cd4 t细胞亚群(初始细胞、cd45ra t
scm
、cd45ra
int
ro
int t
scm
、t
cm
、t
tm
和t
em
)的ccr5基因编辑的等位基因的频率，由dna测序确定。方框显示中位值、第一和第三四分位数，并且晶须延伸到最大值和最小值。接受延长ati的参与者显示为红色。n＝7；*p《0.05；wilcoxon秩和检验。f-g，在第22周与历史art前病毒设定点之间的vl变化与在ati之前(第6周)(f)cd45ra
int
ro
int t
scm
和(g)cd45ra t
scm
细胞计数之间的spearman秩相关性。接受延长ati的参与者显示为红色。虚线代表95％置信区间，(n＝8；参与者01-060的历史art前vl设定点数据缺失，该参与者已延长ati，因此未纳入vl关联分析中)。h，3-d散点图，显示vl(w22-历史设定点)的变化作为cd45ra
int
ro
int t
scm
细胞计数和gag肽池刺激后产生il-2的cd8 t
tm
细胞频率的函数(使用每名参与者产生最大反应的
时间点；tmax)(n＝8)。使用w6的cd45ra
int
ro
int t
scm
计数和输注后gag肽池刺激后产生ifn-γ、tnf-α和il-2细胞因子的cd8 t细胞亚群的频率建立多变量线性回归模型。预测vl最佳变化的多变量模型包含在w6时的cd45ra
int
ro
int t
scm
计数(p＝0.05)和在tmax时产生il-2的hiv特异性cd8 t
tm
细胞(p＝0.02)。
21.图6(a-i)示出了显示在ati期间ccr5基因编辑的t
em
的水平与病毒载量的控制和t
em hiv库的较低再接种相关。a，箱线图显示在输注后第6周和第22周在cd4 t细胞亚群中检测到的sb-728-t产品中的cd45ra
int
cd45ro
int ccr7 cd27 (t
scm
表型)中独特存在的zfn诱导的ccr5突变百分比(n＝7)。方框显示中位值、第一和第三四分位数，并且晶须延伸到1.5*iqr的距离。异常值显示为点。b，显示ccr5基因编辑的cd4 t细胞动力学的示意图(有关完整模型的详细信息和假设，见材料和方法)。模型参数通过对延长ati周期的五名参与者的5个单独拟合结果的几何平均值获得。方框中列出的参数表示与使用100,000个箱在matlab中进行的灵敏度分析测试获得的细胞群大小具有显著相关性(≥
±
0.5)的参数。c-e，ati结束(第22周)时ccr5基因编辑的t
em
细胞计数与ati之前(第6周)ccr5基因编辑的cd45ra

t
scm
(c)、cd45ra
int
ro
int t
scm
(d)、t
cm
(e)细胞计数之间的spearman秩相关性。接受延长ati的参与者显示为红色。n＝7。f，具有重叠抖动的箱线图，表示在bl、输注后第6周和第22周时t
em
细胞内整合hiv dna的频率(n＝7)。方框显示中位值、第一和第三四分位数，并且晶须延伸到最大值和最小值。针对所有参与者显示点和线。接受延长ati的参与者显示为红色。显示了wilcoxon秩和检验的p值。g-h，病毒血症期间(第22周)t
em
中ccr5基因编辑的等位基因的频率与第22周(ati后16周)和历史上art前病毒设定点之间的病毒载量变化之间的spearman秩相关性(g)以及在第6周和第22周之间携带int.hiv dna的t
em
细胞的频率变化(h)。接受延长ati的参与者显示为红色。虚线代表95％置信区间。n＝6；参与者01-060的历史art前vl设定点数据缺失，该参与者已延长ati，因此未纳入vl关联分析中。i，第6周和第22周之间携带int.hiv dna的t
em
细胞的频率变化与第22周(ati后16周)的病毒载量水平之间的spearman秩相关性。接受延长ati的参与者显示为红色。虚线代表95％置信区间。n＝8。
22.图7示出了显示sb-728-0902研究参与者在基线时的hiv库的大小的图。在纯化的cd4 t细胞中测量的基线(bl)时cd4 t细胞计数与bl时整合hiv dna水平之间的相关性。使用spearman’s rho(p)检验。虚线代表95％置信区间。
23.图8(a-e)示出了单次sb-728-t输注导致总cd4 t细胞计数持续增加、cd4:cd8比改善和ccr5基因编辑细胞的长期持续存在。a，显示在基线(bl；输注前7天)时，第14天，第3、6和12个月，以及长期随访时间点(包括第2年和在第3-4年的末次随访)的cd4 t细胞计数。平均值以黑线显示。wilcoxon符号秩检验*p《0.05，**p《0.01。对于小图a-c，队列1(～1e10个输注细胞)的参与者以蓝色符号显示，队列2(～2e10个输注细胞)以绿色符号显示，以及队列3(～3e10个输注细胞)以红色符号显示。b，显示在bl，第14天，第3、6、12个月，第2年和第3-4年的cd4:cd8比。平均值以黑线显示。*p《0.05，**p《0.01；wilcoxon符号秩检验。c，如材料和方法中所述，在随访期间估计所有9名研究参与者的输注后五聚体复制标记的cd4 t细胞的倍数扩增。灰色区域表示倍数变化低于1的数据点。d，具有重叠抖动的箱线图，每106个来自输注后直肠活检的单核细胞的五聚体重复(基因编辑细胞的标记)。箱线图显示第75个百分位数(上边缘)、中位值(框中的实线)和第25个百分位数(下边缘)。晶须从最小值到最大值绘制。e，输注后3个个体的每106个pbmc(黑色圆圈)和来自淋巴结活检的单核细胞
(lnmc；正方形)的五聚体复制标记图，其中定量lnmc中的五聚体复制标记。
24.图9(a-c)示出了显示sb-728-t产品特征的图。a，来自生产前白细胞分离术样品(bl)和生产后(sb-728-t产品)的纯化cd4 t细胞中整合hiv dna水平。显示了wilcoxon符号秩检验p值。活cd3 cd4 细胞以cd45ra和cd45ro设门，然后以ccr7和cd27设门以识别初始细胞(cd45ra cd45ro-ccr7 cd27 )、cd45ra
int
cd45ro
int t
scm
样细胞、t
cm
(cd45ra-cd45ro ccr7 cd27 )、t
tm
(cd45ra-cd45ro ccr7-cd27 )、t
em
(cd45ra-cd45ro ccr7-cd27-)和cd45ra-cd45ro ccr7 cd27-亚群。b，在sb-728-t产品中观察到的cd4 t细胞亚群的频率。线代表平均值和标准差。c，通过对各种ccr5 zfn诱导的突变进行dna测序来测量sb-728-t产品中cd4 t细胞亚群中ccr5基因编辑的等位基因的频率。线代表平均值和标准差。*p《0.05，**p《0.01；wilcoxon符号秩检验。
25.图10(a-f)示出了显示cd45ra
int
cd45ro
int
和cd45ra

cd45ro-亚群中cd58 cd95 细胞的频率在输注后增加并有助于ccr5基因编辑细胞的持久性的图。a-b，直方图显示在bl(n＝6)、中期(6-8个月，n＝5)、晚期(9-11个月；n＝5)和输注后的长期时间点(3-4年，n＝6)时，在cd45ra
int
cd45ro
int ccr7 cd27 cd127 cd28 (cd45ra
int
ro
int t
scm
；a)和cd45ra

cd45ro-ccr7 cd27 cd127 cd28 (cd45ra

t
scm
；b)亚群中表达cd58和cd95的细胞的平均频率。误差线代表标准差。*p《0.05，**p《0.01；mann-whitney检验。c-d，在第3-4年cd45ra

ro-和cd45ra
int
ro
int
亚群中cd58

cd95

细胞的频率与在长期时间点pbmc中ccr5基因编辑的cd4 t细胞的估计倍数扩增相关(在第3-4年ccr5基因编辑的等位基因的数量相对于输注的ccr5基因编辑的等位基因的数量(剂量))。e，在bl(输注前至多3个月)，以及在中期(第6个月)、晚期(第8-11个月)和输注后的长期时间点(第3-4年)，进行bl分析的6名受试者的cd45ra

ro-ccr7

cd27

cd127

cd28

cd58

cd95

(称为cd45ra

ro-t
scm
)和cd45ra

ro-ccr7

cd27

cd127

cd28

cd58-cd95-(称为初始细胞)细胞计数的纵向分析。f，在bl(输注前至多3个月)，以及在中期(第6个月)、晚期(第8-11个月)和输注后的长期时间点(至多第14个月)，进行bl分析的6名受试者的cd45ra
int
ro
int ccr7

cd27

cd127

cd28

cd58

cd95

(称为cd45ra
int
ro
int t
scm
)和cd45ra
int
ro
int ccr7

cd27

cd127

cd28

cd58-cd95-(称为cd45ra
int
ro
int cd95-)细胞计数的纵向分析。
26.图11示出了显示与其他记忆亚群相比，cd45ra
int
ro
int t
scm
细胞具有更高水平的ccr5基因编辑等位基因的图。在输注后第2-4年，通过对各种ccr5 zfn诱导突变的dna测序测量，在分选的cd4 t细胞亚群中ccr5基因编辑的等位基因的频率的具有重叠抖动的箱线图。线代表平均值和标准差。箱线图显示第75个百分位数(上边缘)、中位值(框中的实线)和第25个百分位数(下边缘)。晶须从最小值到最大值绘制。显示了wilcoxon符号秩检验p值。
27.图12(a-b)示出了显示ccr5基因编辑的t细胞有助于t细胞的多克隆无偏重建。a，柱状图显示在输注后7天(ccr5基因编辑的细胞扩增的峰值)(n＝3)和7-9个月(n＝4)，生产前样品(从bl白细胞分离样品纯化的cd4 t细胞，n＝4)、sb-728-t产品(n＝4)、纯化的cd4 t细胞的tcr多样性。香农熵指数用于测量tcr克隆的多样性。na＝样品在这个时间点不可用。b，使用香农熵指数，与输注后长期时间点(第3-4年)(n＝8)的亚群相比，来自sb-728-t产品的cd4 t细胞亚群中ccr5基因编辑的等位基因的多样性。线代表平均值和标准差。显示了wilcoxon符号秩检验p值。
28.图13(a-b)示出了显示cd45ra
int
ro
int t
scm
细胞是总hiv库的次要贡献者的图。直方
图绘出了sb-728-t产品(a)中分选的cd45ra-cd45ro

亚群(t
cm
，n＝9；t
tm
，n＝8；t
em
，n＝9；和ccr7 cd27-，n＝9)，和cd45ra
int
cd45ro
int
亚群(总cd45ra
int
cd45ro
int
，n＝9；和cd45ra
int
cd45ro
int ccr7 cd27 ，n＝9)中，以及在输注后3-4年(b)分选的cd45ra-cd45ro

亚群((t
cm
，n＝8；t
tm
，n＝7；和t
em
，n＝8)、cd45ra
int
cd45ro
int
亚群(cd95 ；cd45ra
int
ro
int t
scm
，n＝8；和cd95-，n＝8)和cd45ra

cd45ro-亚群(cd95 ；cd45ra

tscm)，n＝6；和cd95-；初始细胞，n＝7)中整合hiv dna(log 10拷贝/106个细胞)的平均水平。误差线代表标准差。*p《0.05**p《0.01；wilcoxon符号秩检验。
29.图14(a-b)示出了显示cd45ra
int
ro
int t
scm
细胞构成不同于先前描述的cd45ra

t
scm
亚群的不同细胞群的图。a，多维缩放(mds图)用于突出cd4 t细胞亚群在输注后3-4年的转录组变异。使用euclidean距离并且示出基于anova(方差分析，f检验，n＝3358转录本，p≤0.05)的顶级变异基因的降维。第一维度解释了cd4 t细胞亚群之间50％的差异。不同的亚群由不同的符号表示，每个细胞亚群有n＝7个样品。b，柱状图表示cd45ra
int
ro
int t
scm
和cd45ra

t
scm
、t
cm
或t
em
之间差异表达基因的数量(deg；p《0.05)。
30.图15(a-b)示出了显示在1101研究中输注sb-728-t后接受分析治疗中断(ati)的受试者的病毒载量的图。a，1101临床试验总结。受试者在输注前2天接受递增剂量的环磷酰胺(ctx)预处理。受试者在输注后六周接受间隔16周的ati。b，显示在第22周之前恢复art的9名受试者和延长ati的6名受试者的病毒载量(vl)(对于这些受试者，vl保持低于10,000拷贝/ml，并且cd4 t细胞计数高于500细胞/μl)。红线绘出了art恢复。
31.图16(a-b)示出了显示1101研究中输注后(第6周)和治疗中断后(第22周)cd4 t细胞亚群分布和细胞计数的图。显示了在输注后6周(ati前)和输注后22周(ati结束)时cd4 t细胞亚群(初始细胞、cd45ra t
scm
、cd45ra
int
ro
int t
scm
、t
cm
、t
tm
和t
em
)的频率(a)和细胞计数(b)；n＝9。显示了wilcoxon符号秩检验p值。
32.图17示出了1101研究中ati后cd4 t细胞亚群中ccr5基因编辑细胞的频率。显示了已延长ati直至至少第12个月的参与者在输注后第6周(ati前)、第22周、第7/8个月和第12个月，cd4 t细胞亚群(cd45ra t
scm
、cd45ra
int
ro
int t
scm
、t
cm
和t
em
)的通过dna测序确定的ccr5基因编辑的等位基因的频率。
具体实施方式
33.除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
34.如本文所用，以下术语中的每一个在本节中具有与其相关联的含义。
35.冠词“a”和“an”在本文中用于指代冠词的一个或更多个(即，至少一个)的语法对象。例如，“an元素”是指一个元件或更多个元件。
36.如本文所用的“约”，当提及可测量值(例如量、时距等)时，意指涵盖较规定值
±
20％、
±
10％、
±
5％、
±
1％、或
±
0.1％的变化，因为这种变化适合于进行所公开的方法。
37.如本文所用，“活化”是指t细胞的状态，该状态已被充分刺激以诱导可检测的细胞增殖。活化还可以与诱导的细胞因子产生和可检测的效应功能有关。术语“活化的t细胞”尤其是指正在经历细胞分裂的t细胞。
38.如本文所用，术语“抗体”是指能够特异性结合抗原上的特定表位的免疫球蛋白分
子。抗体可以是源自天然来源或重组来源的完整免疫球蛋白，并且可以是完整免疫球蛋白的免疫活性部分。抗体通常是免疫球蛋白分子的四聚体。本发明中的抗体可以多种形式存在，包括，例如，多克隆抗体、单克隆抗体、fv、fab和f(ab)2，以及单链抗体和人源化抗体(harlow等人，1988；houston等人，1988；bird等人，1988)。
39.如本文所用，术语“抗原”或“ag”定义为引发免疫应答的分子。这种免疫应答可能涉及抗体的产生，或特定免疫活性细胞的活化，或两者。本领域技术人员将理解任何大分子，包括几乎所有的蛋白或肽，均可以用作抗原。此外，抗原可以源于重组或基因组dna。本领域技术人员将理解，包含编码引发免疫应答的蛋白的核苷酸序列或部分核苷酸序列的任何dna因此编码如本文所用的术语“抗原”。此外，本领域技术人员将理解抗原不需要仅由基因的全长核苷酸序列编码。显而易见的是，本发明包括但不限于使用多于一种基因的部分核苷酸序列并且这些核苷酸序列以各种组合排列以引发期望的免疫应答。此外，本领域技术人员将理解抗原根本不需要由“基因”编码。显而易见的是，抗原可以合成产生或源自生物样品。这样的生物样品可以包括但不限于组织样品、肿瘤样品、细胞或生物流体。
40.如本文所用，术语“自体的”意指源自同一个体随后将其重新引入该个体的任何材料。
[0041]“同种异体的”是指源自相同物种的不同动物的移植物。
[0042]“异种的”是指源自不同物种的动物的移植物。
[0043]
如本文所用，“有效量”意指提供治疗或预防获益的量。
[0044]
如本文所用，术语“表达”定义为由其启动子驱动的特定核苷酸序列的转录和/或翻译。
[0045]
如本文所用，术语“特异性结合”意指分子，例如抗体，其识别并结合样品中的另一个分子或特征，但基本上不识别或结合样品中的其他分子或特征。
[0046]
如本文所用，术语“抑制”意指将分子、反应、相互作用、基因、mrna和/或蛋白表达、稳定性、功能或活性降低可测量的量或降低至完全阻止。抑制剂是，例如，结合、部分或完全阻断刺激、降低、阻止、延迟活化、失活、脱敏或下调蛋白、基因和mrna稳定性、表达、功能和活性的化合物，例如，拮抗剂。
[0047]
术语“核酸”、“多核苷酸”和“寡核苷酸”可互换使用，并且是指直链或环状构象以及单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物。出于本公开的目的，这些术语不应被解释为限制聚合物的长度。这些术语可以涵盖天然核苷酸的已知类似物，以及在碱基、糖和/或磷酸盐部分(例如，硫代磷酸酯骨架)中经修饰的核苷酸。通常，特定核苷酸的类似物具有相同的碱基配对特异性。即，a的类似物将与t进行碱基配对。
[0048]
术语“多肽”、“肽”和“蛋白”可互换使用以指代氨基酸残基的聚合物。该术语还适用于氨基酸聚合物，其中一种或更多种氨基酸是相应天然氨基酸的化学类似物或修饰衍生物。
[0049]“结合”是指大分子之间(例如，蛋白和核酸之间或两种核酸之间)的序列特异性非共价相互作用。并非所有结合相互作用的组分均必须具有序列特异性(例如，与dna骨架中的磷酸残基接触)，只要整个相互作用是序列特异性的即可。这种相互作用通常以10-6
m-1
或更低的解离常数(kd)为特征。“亲和力”是指结合强度：增加的结合亲和力与较低的kd相关。
[0050]
术语“嵌合rna”、“嵌合向导rna”、“向导rna”、“单向导rna”和“合成向导rna”可互
换使用，并且是指包含向导序列、tracr序列和tracr配对序列的多核苷酸序列。术语“向导序列”是指向导rna内的约10-30(10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30)个碱基对序列，其特异于靶位点并且可以与术语“向导”或“间隔自”互换使用。术语“tracr配对序列”也可以与术语“直接重复”互换使用。
[0051]“互补性”是指核酸通过传统的watson-crick或其他非传统类型与另一个核酸序列形成氢键的能力。互补性百分比表示核酸分子中可以与第二核酸序列形成氢键(例如，watson-crick碱基配对)的残基的百分比(例如，10个中有5、6、7、8、9、10个为50％、60％、70％、80％、90％和100％互补)。“完全互补”是指核酸序列的所有连续残基将与第二核酸序列中相同数量的连续残基形成氢键。如本文所用，“基本上互补”是指在8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50或更多核苷酸的区域内至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％.97％、98％、99％或100％的互补程度，或是指在严格条件下杂交的两种核酸。
[0052]“结合蛋白”是能够与另一个分子结合的蛋白。结合蛋白可以结合例如dna分子(dna结合蛋白)、rna分子(rna结合蛋白)和/或蛋白分子(蛋白结合蛋白)。在蛋白结合蛋白的情况下，它可以与自身结合(以形成同二聚体、同三聚体等)和/或它可以与不同蛋白的一个或更多个分子结合。结合蛋白可以具有多于一种类型的结合活性。例如，锌指蛋白具有dna结合、rna结合和蛋白结合活性。
[0053]“锌指dna结合蛋白”(或结合结构域)是蛋白，或较大蛋白内的结构域，其通过一个或更多个锌指以序列特异性方式结合dna，它们是结合域内的氨基酸序列区域，其结构通过锌离子的配位而稳定。术语锌指dna结合蛋白通常缩写为锌指蛋白或zfp。
[0054]“tale dna结合结构域”或“tale”是包含一个或更多个tale重复结构域/单元的多肽。重复结构域参与tale与其同源靶dna序列的结合。单个“重复单元”(也称为“重复”)的长度通常为33-35个氨基酸，并且与天然存在的tale蛋白中的其他tale重复序列表现出至少一些序列同源性。
[0055]
锌指和tale结合域可以经“工程化”以结合预定的核苷酸序列，例如通过对天然存在的锌指或tale蛋白的识别螺旋区进行工程化(改变一个或更多个氨基酸)。因此，工程化dna结合蛋白(锌指或tale)是非天然存在的蛋白。工程化dna结合蛋白的方法的非限制性实例是设计和选择。设计的dna结合蛋白是自然界中不存在的蛋白，其设计/组成主要来自合理的标准。设计的合理标准包括应用替换规则和计算机化算法来处理数据库中的信息，该数据库存储现有zfp和/或tale设计和结合数据的信息。参见，例如，美国专利号8,586,526 6,140,081；6,453,242；和6,534,261；另见wo98/53058；wo 98/53059；wo 98/53060；wo 02/016536和wo 03/016496。
[0056]“选择的”锌指蛋白或tale是自然界中未发现的蛋白，其产生主要来自经验过程，例如噬菌体展示、相互作用陷阱或杂交选择。参见例如，美国专利号8,586,526；5,789,538；5,925,523；6,007,988；6,013,453；6,200,759；以及wo 95/19431；wo96/06166；wo 98/53057；wo 98/54311；wo 00/27878；wo 01/60970wo 01/88197；wo 02/099084。
[0057]“重组”是指在两个多核苷酸之间交换遗传信息的过程。为了本公开的目的，“同源重组(hr)”是指这种交换的特殊形式，例如，在通过同源定向修复机制修复细胞中的双链断裂期间发生。该过程需要核苷酸序列同源性，使用“供体”分子来模板修复“靶”分子(即经历
双链断裂的分子)，并且被称为“非交叉基因转换”或“短道基因转换”，因为它导致遗传信息从供体转移到靶标。不希望受任何特定理论的束缚，这种转移可以涉及对在断裂靶标和供体之间形成的异源双链dna的错配校正，和/或“合成依赖链退火”，其中供体用于重新合成将成为靶标和/或相关过程的一部分的遗传信息。这种专门的hr通常导致靶分子序列的改变，使得供体多核苷酸的部分或全部序列被掺入靶多核苷酸中。
[0058]
在本公开的方法中，如本文所述的一种或更多种靶向核酸酶(例如，crispr/cas)在预定位点处的靶序列(例如，细胞染色质)中产生双链断裂，可以将与断裂区域中的核苷酸序列具有同源性的“供体”多核苷酸引入细胞中。已显示双链断裂的存在有助于供体序列的整合。供体序列可以物理整合，可选地，供体多核苷酸用作模板，通过同源重组修复断裂，导致将供体中的全部或部分核苷酸序列引入细胞染色质中。因此，可以改变细胞染色质中的第一序列，并且在某些实施方案中，可以将其转化为存在于供体多核苷酸中的序列。因此，术语“替换(replace或replacement)”的使用可以理解为表示一个核苷酸序列被另一个替换，(即，信息意义上的序列替换)，并且不一定需要用另一种多核苷酸物理或化学替换一种多核苷酸。
[0059]
在本文所述的任何方法中，另外的crispr/cas核酸酶和/或另外的锌指或talen蛋白对可用于细胞内另外靶位点的另外双链切割。
[0060]
在用于靶向重组和/或替换和/或改变细胞染色质中目标区域中的序列的方法的某些实施方案中，染色体序列通过与外源“供体”核苷酸序列的同源重组而改变。如果存在与断裂区域同源的序列，则这种同源重组受到细胞染色质中双链断裂的刺激。
[0061]
在本文所述的任何方法中，外源核苷酸序列(“供体序列”或“转基因”)可以含有同源的序列，但与目标区域中的基因组序列不相同，从而刺激同源重组以在目标区域中插入不相同的序列。因此，在某些实施方案中，与目标区域中的序列同源的供体序列部分与被替换的基因组序列表现出约80％至99％(或它们之间的任何整数)的序列同一性。在其他实施方案中，供体和基因组序列之间的同源性高于99％，例如在超过100个连续碱基对中，如果供体和基因组序列之间仅有1个核苷酸不同。在某些情况下，供体序列的非同源部分可以含有不存在于目标区域中的序列，从而将新序列引入目标区域。在这些情况下，非同源序列的侧翼通常是50-1,000个碱基对(或它们之间的任何整数值)或任何数量大于1,000个的碱基对，其与目标区域中的序列同源或相同。在其他实施方案中，供体序列与第一序列非同源，并且通过非同源重组机制插入基因组中。
[0062]
本文所述的任何方法可用于通过靶向整合破坏目标基因表达的供体序列来使细胞中的一个或更多个靶序列部分或完全失活。还提供了具有部分或完全失活基因的细胞系。
[0063]
此外，如本文所述的靶向整合方法也可用于整合一种或更多种外源序列。外源核酸序列可以包含，例如，一种或更多种基因或cdna分子，或任何类型的编码或非编码序列，以及一种或更多种控制元件(例如，启动子)。此外，外源核酸序列可以产生一种或更多种rna分子(例如，小发夹rna(shrna)、抑制性rna(rnais)、微小rna(mirna)等)。
[0064]“切割”是指dna分子的共价骨架的断裂。切割可以通过多种方法启动，包括但不限于磷酸二酯键的酶水解或化学水解。单链切割和双链切割均是可能的，并且双链切割可以作为两个不同的单链切割事件的结果发生。dna切割可导致产生平末端或交错末端。在某些
实施方案中，融合多肽用于靶向双链dna切割。
[0065]“切割半结构域”是与第二多肽(相同或不同的)结合形成具有切割活性(优选双链切割活性)的复合体的多肽序列。术语“第一和第二切割半结构域”；“ 和-切割半结构域”和“左和右切割半结构域”可互换使用，指的是二聚化的切割半结构域对。
[0066]“工程化切割半结构域”是已经修饰以与另一个切割半结构域(例如，另一个工程化切割半结构域)形成专性异二聚体的切割半结构域。另见，美国专利公开号2005/0064474、2007/0218528、2008/0131962和2011/0201055，它们通过引用以其全文并入本文。
[0067]
术语“序列”是指任何长度的核苷酸序列，可以是dna或rna；可以是线性的、环状的或分支的，并且可以是单链的或双链的。术语“供体序列”是指插入基因组的核苷酸序列。供体序列可以是任何长度，例如长度为2至10,000个核苷酸(或它们之间或以上的任何整数值)，优选地长度为100至1,000个核苷酸(或它们之间的任何整数)，更优选地长度为约200至500个核苷酸。
[0068]“同源的不相同的序列”是指与第二序列具有一定程度的序列同一性的第一序列，但其序列与第二序列不相同。例如，包含突变基因的野生型序列的多核苷酸与突变基因的序列同源但不相同。在某些实施方案中，两个序列之间的同源性程度足以允许它们之间利用正常的细胞机制进行同源重组。两个同源的不同序列可以是任何长度，并且它们的非同源性程度可以小至单个核苷酸(例如，用于通过靶向同源重组校正基因组点突变)或大至10或更多千碱基(例如，用于在染色体的预定异位位点插入基因)。包含同源的不相同序列的两个多核苷酸不必具有相同的长度。例如，可以使用20至10,000个核苷酸或核苷酸对的外源多核苷酸(即供体多核苷酸)。
[0069]
用于确定核酸和氨基酸序列同一性的技术是本领域已知的。通常，此类技术包括确定基因的mrna的核苷酸序列和/或确定由其编码的氨基酸序列，并将这些序列与第二核苷酸或氨基酸序列进行比较。还可以以这种方式确定和比较基因组序列。通常，同一性是指两个多核苷酸或多肽序列分别精确的核苷酸-核苷酸或氨基酸-氨基酸对应。可以通过确定它们的同一性百分比来比较两个或更多个序列(多核苷酸或氨基酸)。两个序列(无论是核酸序列还是氨基酸序列)的同一性百分比是两个比对序列之间的精确匹配数除以较短序列的长度并乘以100。核酸序列的近似比对由smith和waterman，applied mathematics 2:482-489(1981)中的局部同源算法提供。该算法可以通过使用dayhoff,atlas of protein sequences and structure,m.o.dayhoff编辑，5suppl.3:353-358,national biomedical research foundation,washington,d.c.,usa开发的评分矩阵应用于氨基酸序列，并且通过gribskov,nucl.acids res.14(6):6745-6763(1986)归一化。确定序列同一性百分比的该算法的示例性实施由genetics computer group(madison,wis.)在“bestfit”实用应用程序中提供。用于计算序列之间同一性百分比或相似性百分比的合适程序通常是本领域已知的，例如，另一个比对程序是blast，使用默认参数。例如，可以使用以下默认参数来使用blastn和blastp：遗传密码＝标准；过滤＝无；链＝两者；截断值＝60；预期值＝10；矩阵＝blosum62；描述＝50个序列；排序方式＝高分；数据库＝非冗余，genbank embl ddbj pdb genbank cds翻译 swiss蛋白 spupdate pir。这些程序的详细信息可见于互联网。对于本文所述的序列，期望的序列同一性程度的范围是约80％至100％以及其间的任何整数值。通常，序列之间的同一性百分比为至少70-75％，优选80-82％，更优选85-90％，甚至更优选
92％，还更优选95％，以及最优选98％序列同一性。
[0070]
可选地，多核苷酸之间的序列相似程度可以通过多核苷酸在允许在同源区域之间形成稳定双链体的条件下杂交，然后用单链特异性核酸酶消化，并测定消化片段的大小来确定。当序列表现出在定义的分子长度上具有至少约70％-75％，优选80％-82％，更优选85％-90％，甚至更优选92％，还更优选95％，以及最优选98％序列同一性时(如使用上述方法所测定)，两个核酸或两个多肽序列彼此基本上同源。如本文所用，基本上同源还指与特定dna或多肽序列显示完全同一性的序列。基本上同源的dna序列可以在southern杂交实验中在例如针对该特定系统所定义的严格条件下进行鉴定。定义合适的杂交条件是本领域技术人员已知的。参见，例如，sambrook等人，同上；nucleic acid hybridization:a practical approach,编辑b.d.hames和s.j.higgins,(1985)oxford；washington,d.c.；irl press)。
[0071]
两个核酸片段的选择性杂交可以如下确定。两个核酸分子之间的序列同一性程度影响这些分子之间杂交事件的效率和强度。部分相同的核酸序列将至少部分抑制完全相同的序列与靶分子的杂交。可以使用本领域公知的杂交测定来评估完全相同序列的杂交的抑制(例如，southern(dna)印迹、northern(rna)印迹、溶液杂交等，参见sambrook等人，molecular cloning:a laboratory manual,第二版,(1989)cold spring harbor,n.y.)。可以使用不同程度的选择性进行此类测定，例如使用从低严格到高严格的条件。如果采用低严格条件，则可以使用甚至缺乏部分程度的序列同一性的二级探针来评估是否存在非特异性结合(例如，与靶分子具有小于约30％序列同一性的探针)，使得在不存在非特异性结合事件的情况下，第二探针将不与靶分子杂交。
[0072]“染色质”是包含细胞基因组的核蛋白结构。细胞染色质包含核酸(主要是dna)和蛋白，包括组蛋白和非组蛋白染色体蛋白。大多数真核细胞染色质以核小体的形式存在，其中核小体核心包含约150个碱基对的dna，其与包含组蛋白h2a、h2b、h3和h4中的每一个的八聚体缔合；和接头dna(长度取决于生物体)在核小体核心之间延伸。组蛋白h1分子通常与接头dna缔合。出于本公开的目的，术语“染色质”旨在涵盖所有类型的细胞核蛋白，包括原核和真核。细胞染色质包括染色体和游离染色质。
[0073]“染色体”是包含细胞基因组的全部或部分的染色质复合体。细胞的基因组通常以其核型为特征，核型是构成细胞基因组的所有染色体的集合。细胞的基因组可以包含一条或多条染色体。
[0074]“附加体”是包含不是细胞染色体核型的一部分的核酸的复制核酸、核蛋白复合体或其他结构。附加体的实例包括质粒和某些病毒基因组。
[0075]“可接近区域”是细胞染色质中的位点，其中核酸中存在的靶位点可以被识别靶位点的外源分子结合。不希望受任何特定理论的束缚，认为可接近区域是未包装进入核小体结构中的区域。可接近区域的独特结构通常可以通过其对化学和酶探针(例如核酸酶)的灵敏度来检测。
[0076]“靶位点”或“靶序列”是定义结合分子将结合的核酸部分的核酸序列，只要存在结合的充分条件。
[0077]“外源”分子是通常不存在于细胞中但可以通过一种或更多种基因、生化或其他方法引入细胞中的分子。“细胞中正常存在”是根据细胞的特定发育阶段和环境条件确定的。
因此，例如，仅在肌肉胚胎发育过程中存在的分子对于成体肌肉细胞而言是外源分子。类似地，热休克诱导的分子相对于非热休克细胞而言是外源分子。外源性分子可以包含，例如，功能失常的内源性分子的功能性形式或功能正常的内源性分子的功能性失常形式。
[0078]
外源分子尤其可以是小分子，例如通过组合化学过程产生的，或大分子，例如蛋白、核酸、碳水化合物、脂质、糖蛋白、脂蛋白、多糖，上述分子的任何修饰衍生物，或包含一种或更多种上述分子的任何复合体。核酸包括dna和rna，可以是单链或双链；可以是直链的、支链的或环状的；并且可以是任何长度。核酸包括那些能够形成双链体以及形成三链体的核酸。参见，例如，美国专利号5,176,996和5,422,251。蛋白包括但不限于dna结合蛋白、转录因子、染色质重塑因子、甲基化dna结合蛋白、聚合酶、甲基化酶、去甲基化酶、乙酰化酶、去乙酰化酶、激酶、磷酸酶、整合酶、重组酶、连接酶、拓扑异构酶、促旋酶和解旋酶。因此，该术语包括“转基因”或“目标基因”，它们是引入细胞中的外源序列。
[0079]
外源分子可以是与内源分子相同类型的分子，例如外源蛋白或核酸。例如，外源核酸可以包含感染病毒基因组、引入细胞中的质粒或附加体、或通常不存在于细胞中的染色体。用于将外源分子引入细胞的方法是本领域技术人员已知的并且包括但不限于，脂质(即脂质体，包括中性和阳离子脂质)介导的转移、电穿孔、直接注射、细胞融合、粒子轰击、磷酸钙共沉淀、deae-葡聚糖介导的转移和病毒载体介导的转移。外源分子还可以是与内源分子相同类型的分子，但来自与细胞来源不同的物种。例如，可以将人核酸序列引入最初源于小鼠或仓鼠的细胞系中。用于将外源分子引入植物细胞的方法是本领域技术人员已知的并且包括但不限于，原生质体转化、碳化硅(例如，whiskers.tm.)、农杆菌介导的转化、脂质(即脂质体，包括中性和阳离子脂质)介导的转移、电穿孔、直接注射、细胞融合、粒子轰击(例如，使用“基因枪”)、磷酸钙共沉淀、deae-葡聚糖介导的转移和病毒载体介导的转移。
[0080]
相比之下，“内源性”分子是在特定环境条件下在特定发育阶段通常存在于特定细胞中的分子。例如，内源性核酸可以包含染色体、线粒体、叶绿体或其他细胞器的基因组，或天然存在的游离核酸。另外的内源分子可以包括蛋白，例如转录因子和酶。
[0081]
如本文所用，术语“外源核酸产物”包括多核苷酸和多肽产物，例如，转录产物(多核苷酸，例如rna)和翻译产物(多肽)。
[0082]“融合”分子是其中两个或更多个亚基分子优选共价连接的分子。亚基分子可以是相同化学类型的分子，或者可以是不同化学类型的分子。第一类融合分子的实例包括但不限于融合蛋白(例如，zfp或tale dna结合域与一个或更多个活化结构域之间的融合)和融合核酸(例如，编码上述融合蛋白的核酸)。第二类融合分子的实例包括但不限于，形成三链体的核酸和多肽之间的融合，以及小沟结合物和核酸之间的融合。“融合多肽”是包含与异源多肽融合或结合的多肽或其部分(例如，一个或更多个结构域)的多肽。融合多肽的实例包括将部分cas蛋白与免疫球蛋白序列结合的免疫粘附素，以及表位标记的多肽，例如，其可以包含与“标签多肽”融合的cas蛋白或其部分。标签多肽具有足够的残基以提供可以制备抗体的表位，然而足够短，以至于它不干扰cas的核酸酶活性。合适的标签多肽通常具有至少六个氨基酸残基并且通常在约6-60个氨基酸残基之间。
[0083]
融合蛋白在细胞中的表达可以由将融合蛋白递送至细胞或通过将编码融合蛋白的多核苷酸递送至细胞而产生，其中多核苷酸被转录，并且转录物被翻译，以产生融合蛋白。反式剪接、多肽切割和多肽连接也可以参与蛋白在细胞中的表达。用于向细胞递送多核
苷酸和多肽的方法在本公开的别处呈现。
[0084]
为了本公开的目的，“基因”包括编码基因产物的dna区域(见下文)，以及所有调节基因产物产生的dna区域，此类调节序列是否与编码和/或转录序列相邻。因此，基因包括但不一定限于启动子序列、终止子、翻译调控序列(例如核糖体结合位点和内部核糖体进入位点)、增强子、沉默子、绝缘子、边界元件、复制起点、基质附着位点和基因座控制区域。“工程基因”是指以某种方式改变的基因，使得它与野生型基因不相同。改变可以是靶向缺失、插入和截短的形式。工程基因可以包含来自两个异源基因的编码序列或可以包含合成基因序列。工程基因还可以包含在蛋白序列中沉默的编码序列的变化(例如，密码子优化)。工程基因还可以包含具有改变的调节序列的基因。
[0085]“基因表达”是指将包含在基因中的信息转化为基因产物。基因产物可以是基因的直接转录产物(例如，mrna、trna、rrna、反义rna、核酶、结构rna或任何其他类型的rna)或通过mrna翻译产生的蛋白。基因产物还包括通过例如加帽、聚腺苷酸化、甲基化和编辑等过程修饰的rna，以及通过以下方法修饰的蛋白，例如，甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化、adp-核糖基化、肉豆蔻化和糖基化。
[0086]
基因表达的“调节”是指基因活性的改变。
[0087]
表达的调节可以包括但不限于基因活化和基因抑制。基因组编辑(例如，切割、改变、失活、随机突变)可用于调节表达。基因失活是指与不包括本文所述的crispr/cas系统的细胞相比基因表达的任何降低。因此，基因失活可以是部分的或完全的。
[0088]“目标区域”是细胞染色质的任何区域，例如，基因或基因内或邻近基因的非编码序列，其中需要结合外源分子。结合可以用于靶向dna切割和/或靶向重组。例如，目标区域可以存在于染色体、附加体、细胞器基因组(例如线粒体、叶绿体)或感染性病毒基因组中。目标区域可以在基因的编码区内，在转录的非编码区内，例如，前导序列、尾随序列或内含子，或在编码区上游或下游的非转录区内。目标区域可以小至单个核苷酸对或长达2,000个核苷酸对，或核苷酸对的任何整数值。
[0089]“真核”细胞包括但不限于真菌细胞(例如酵母)、植物细胞、动物细胞、哺乳动物细胞和人细胞(例如t细胞)。
[0090]
术语“操作连接”和“操作连接的”(或“可操作连接的”)可互换使用，是指两个或更多个组件(例如序列元素)的并置，其中组件被布置成使得两个组件均正常运行并且允许至少一个组件能够调解施加在至少一个其他组件上的功能的可能性。举例来说，如果转录调控序列响应于一种或更多种转录调控因子的存在或不存在而控制编码序列的转录水平，则转录调控序列(例如启动子)操作地连接至编码序列。转录调控序列通常与编码序列以顺式方式有效连接，但不必与它直接相邻。例如，增强子是操作连接至编码序列的转录调控序列，即使它们不连续。
[0091]
关于融合多肽，术语“操作连接的”可以指每个组件在与另一个组件连接时执行与如果它没有如此连接时相同的功能的事实。例如，对于其中cas dna结合结构域与活化结构域融合的融合多肽，如果cas dna结合结构域和活化结构域处于操作连接，在融合多肽中，cas dna结合结构域部分能够结合其靶位点和/或其结合位点，而活化结构域能够上调基因表达。当其中cas dna结合结构域与切割结构域融合的融合多肽时，如果在融合多肽中，cas dna结合结构域和切割结构域处于操作连接，cas dna结合域部分能够结合其靶位点和/或
其结合位点，而切割结构域能够切割靶位点附近的dna。
[0092]
蛋白、多肽或核酸的“功能片段”是其序列与全长蛋白不相同的蛋白、多肽或核酸，多肽或核酸，但仍保留与全长蛋白、多肽或核酸相同的功能。功能片段可以具有与相应的天然分子更多、更少或相同数量的残基，和/或可以包含一个或更多个氨基酸或核苷酸取代。用于确定核酸功能(例如，编码功能、与另一种核酸杂交的能力)的方法是本领域熟知的。类似地，确定蛋白功能的方法是熟知的。例如，多肽的dna结合功能可以通过例如滤膜结合、电泳迁移率变化或免疫沉淀测定来确定。dna切割可以通过凝胶电泳来测定。基因和生化上蛋白与另一种蛋白相互作用的能力可以通过例如共免疫沉淀、双杂交测定或互补来确定。参见，例如，fields等人(1989)nature 340:245-246；美国专利号5,585,245和pct wo 98/44350。
[0093]“载体”能够将基因序列转移至靶细胞。通常，“载体构建体”、“表达载体”和“基因转移载体”是指能够指导目标基因表达并且可以将基因序列转移至靶细胞的任何核酸构建体。因此，该术语包括克隆和表达载体，以及整合载体。
[0094]“报告基因”或“报告序列”是指产生易于测量的蛋白产物的任何序列，优选但不一定在常规测定中。合适的报告基因包括但不限于编码介导抗生素抗性(例如，氨苄青霉素抗性、新霉素抗性、g418抗性、嘌呤霉素抗性)的蛋白的序列，编码有色或荧光或发光蛋白(例如，绿色荧光蛋白、增强型绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、荧光素酶)的序列，以及介导增强细胞生长和/或基因扩增的蛋白(例如二氢叶酸还原酶)。表位标签包括例如flag、his、myc、tap、ha或任何可检测的氨基酸序列的一个或更多个拷贝。“表达标签”包括编码报告基因的序列，该报告基因可与所需基因序列有效连接，以监测目标基因的表达。
[0095]
术语“受试者”和“患者”可互换使用，是指哺乳动物，例如人患者和非人灵长类动物，以及实验动物，例如兔、犬、猫、大鼠、小鼠等动物。因此，如本文所用的术语“受试者”或“患者”是指可以向其施用本发明的干细胞的任何哺乳动物患者或受试者。本发明的受试者包括那些已经暴露于一种或更多种化学毒素(包括例如神经毒素)的受试者。
[0096]
如本文所用，术语“治疗的”意指治疗和/或预防。通过抑制、缓解或根除疾病状态来获得治疗效果。
[0097]
术语“治疗有效量”是指研究人员、兽医、医生或其他临床医生正在探索的将引发组织、系统或受试者的生物学或医学反应的主题化合物的量。术语“治疗有效量”包括当施用时，足以预防或在一定程度上减轻正在治疗的病症或疾病的一种或更多种体征或症状的化合物的量。治疗有效量将根据化合物、疾病及其严重程度以及待治疗受试者的年龄、体重等而变化。如本文所用的术语“治疗”疾病意指降低受试者出现的疾病或病症的至少一种体征或症状的频率或严重程度。
[0098]
如本文所用，术语“转染的”或“转化的”或“转导的”是指将外源核酸转移或引入宿主细胞的过程。“转染的”或“转化的”或“转导的”细胞是已经用外源核酸转染、转化或转导的细胞。该细胞包括受试者原代细胞及其子代。
[0099]“载体”是物质组合物，其包含分离的核酸并且可用于将分离的核酸递送至细胞内部。许多载体是本领域已知的，包括但不限于直链多核苷酸、与离子或两亲化合物相关的多核苷酸、质粒和病毒。因此，术语“载体”包括自主复制的质粒或病毒。该术语还应解释为包括促进核酸转移到细胞中的非质粒和非病毒化合物，例如，聚赖氨酸化合物、脂质体等。病
毒载体的实例包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体等。
[0100]
范围：在本公开全文中，本发明的各个方面可以以范围形式呈现。应当理解，范围形式的描述仅是为了方便和简洁，不应理解为对本发明范围的硬性限制。因此，范围的描述应该被认为已经具体公开了所有可能的子范围以及该范围内的各个数值。例如，对范围例如1至6的描述应被视为已明确公开了子范围，例如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等，以及该范围内的单个数值，例如1、2、2.7、3、4、5、5.3和6。无论范围的广度如何，这均适用。
[0101]
本文描述的实施方案涉及长期存活的具有cd45ra
int
cd45ro
int
表型的cd4 t细胞和cd8 t细胞(cd4/cd8 t细胞)富集群，经基因修饰和/或改变的具有cd45ra
int
cd45ro
int
表型的cd4/cd8 t细胞，以及它们在治疗hiv感染受试者中的用途，并且特别是已经接受和/或继续接受抗逆转录病毒疗法的受试者的潜伏hiv感染。发现亚群cd4/cd8 t细胞具有长期存活多能干细胞的表型和分子属性。如同其他已知的干细胞群，该亚群具有低代谢特征(脂肪酸代谢和氧化磷酸化上调，以及细胞周期途径下调)保留了自我更新的能力，并且可以分化为效应细胞。该亚群的主要特征在于中间共表达cd45ra和cd45ro(cd45ra
int
cd45ro
int
)。具有cd45ra
int
cd45ro
int
表型的cd4/cd8 t细胞还可以表达cd95(fas)cd127(il7r)和cd27。添加低剂量的细胞因子il-7和il-15可导致形成具有cd45ra
int
cd45ro
int
表型的cd4/cd8细胞富集群；而高剂量的细胞因子il-7和il-15可导致细胞的效应分化。
[0102]
在一些实施方案中，具有cd45ra
int
cd45ro
int
表型的cd4/cd8 t细胞可以经基因修饰，使得它们缺乏功能性ccr5和/或cxcr4 hiv辅助受体。将具有cd45ra
int
cd45ro
int
表型的ccr5和/或cxcr4基因编辑的自体cd4/cd8 t细胞施用于hiv感染受试者可以提供cd4 t细胞计数持续增加，恢复t细胞稳态，并且受试者体内hiv病毒库的大小明显下降。
[0103]
具有cd45ra
int
cd45ro
int
表型的ccr5和/或cxcr4基因编辑的cd4/cd8 t细胞富集群在移植或施用于受试者后具有在受试者中长期存在或存活的能力。持久性可能与治疗性t细胞移植在治疗疾病(例如hiv感染)中的有效性相关。治疗性t细胞的持久性越强，治疗方案越有可能是有效的。因此，具有cd45ra
int
cd45ro
int
表型的长期存活的、自我更新和多能ccr5和/或cxcr4基因编辑的cd4/cd8 t细胞可以降低生产成本，促进效应分化，并提高治疗受试者潜伏性hiv感染的效率。此外，目前可用的hiv治疗产品中这些细胞的频率可以用作生物标志物并预测成功的干预。
[0104]
在一些实施方案中，与不具有cd45ra
int
cd45ro
int
表型的t细胞相比，具有cd45ra
int
cd45ro
int
表型的ccr5和/或cxcr4基因编辑的cd4/cd8 t细胞富集群在施用于受试者后可以在体内持续至少1、2、3、4、5、6、12、24、36、48或72个月更长的时间。具有cd45ra
int
cd45ro
int
表型的ccr5和/或cxcr4基因编辑的cd4/cd8 t细胞富集群在施用后还可以具有增强的受试者移植的能力。特别是，具有cd45ra
int
cd45ro
int
表型的ccr5和/或cxcr4基因编辑的cd4/cd8 t细胞富集群可以具有增强的非条件受体移植中的能力。
[0105]
术语“植入”是指移植细胞在移植后立即填充受体并存活的能力。因此，移植后短期内评估植入。例如，植入可以指在实验的首次体内评价、临床试验或治疗方案中，例如，在受者体内可检测到移植细胞或其子代的最早时间点，检测到的移植细胞的子代细胞数量。在一个实施方案中，在移植后0-12、0-24、0-48或0-72小时评估植入。在另一个实施方案中，在移植后约1、2、3、4、5、6、12、24、36、48、60或72小时评估植入。在优选的实施方案中，在移植后约12小时评估植入。
[0106]
图1示出了产生具有cd45ra
int
cd45ro
int
表型的cd4/cd8 t细胞富集群的方法的流程图，可以对其进行基因修饰使得其缺乏功能性ccr5和/或cxcr4 hiv辅助受体。在该方法中，在步骤10中，从受试者的生物样品中分离出初始t细胞群。生物样品可以包括来自受试者的任何含有t细胞的样品。受试者的实例包括人、犬、猫、小鼠、大鼠及其转基因物种。优选地，受试者是人。
[0107]
t细胞可以从许多来源获得，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脾组织和肿瘤。在一些实施方案中，t细胞可以从患有待治疗的hiv的受试者获得，即来自待治疗的受试者的自体t细胞。在某些实施方案中，t细胞可以使用本领域技术人员已知的任何数量的技术(例如聚蔗糖分离)从受试者采集的单位血液中获得。在一些实施方案中，来自个体循环血液的细胞通过单采术或白细胞单采术获得。单采产品通常含有淋巴细胞，包括t细胞、单核细胞、粒细胞、b细胞、其他有核白细胞、红细胞和血小板。可以洗涤通过单采术采集的细胞以去除血浆级分并将细胞置于适当的缓冲液或培养基中用于后续处理步骤。在一个实施方案中，可以用磷酸盐缓冲盐水(pbs)洗涤细胞。在可选的实施方案中，洗涤溶液不含钙并且可能不含镁或可能不含许多或所有二价阳离子。洗涤后，可将细胞重悬于多种生物相容性缓冲液中，例如不含ca、不含mg的pbs。可选地，可以去除单采样品中非期望的组分，并将细胞直接重悬于培养基中。
[0108]
在另一个实施方案中，可以通过裂解红细胞和耗竭单核细胞(例如，通过percoll梯度离心)从外周血中分离t细胞。可选地，可以从脐带中分离t细胞。在任何情况下，可以通过阳性或阴性选择技术进一步分离特定的t细胞亚群。
[0109]
在一些实施方案中，分离的t细胞可以包括cd4 t细胞和/或cd8 t细胞。cd4t细胞和/或cd8 t细胞(cd4/cd8 t细胞)可以通过阳性或阴性选择从生物样品中分离。可以使用针对阴性选择细胞特有的表面标志物的抗体组合来完成阴性选择。一种方法是通过负磁免疫粘附或流式细胞术进行细胞分选和/或选择，其使用针对存在于负选择的细胞上的细胞表面标志物的单克隆抗体混合物。例如，为了通过负选择富集cd4 细胞，单克隆抗体混合物通常包括针对cd14、cd20、cd11b、cd16、hla-dr和cd8的抗体。
[0110]
为了通过正选择或负选择分离期望的细胞群，可以改变细胞和表面(例如，颗粒，例如珠粒)的浓度。在某些实施方案中，可能需要显著降低珠粒和细胞混合在一起的体积(即增加细胞浓度)，以确保细胞和珠粒最大接触。例如，在一个实施方案中，使用20亿个细胞/ml的浓度。在一个实施方案中，使用10亿个细胞/ml的浓度。在进一步的实施方案中，使用大于1亿个细胞/ml。在进一步的实施方案中，使用10、15、20、25、30、35、40、45或5000万个细胞/ml的细胞浓度。在又一个实施方案中，使用75、80、85、90、95或1亿个细胞/ml的细胞浓度。在进一步的实施方案中，可以使用125或1.5亿个细胞/ml的浓度。使用高浓度可提高细胞产量、细胞活化和细胞扩增。
[0111]
在从生物样品中分离t细胞之后，在步骤20，可以通过本领域已知的任何合适的方法来活化和/或扩增分离的cd4/cd8 t细胞。在本发明的实施方案中，在存在一种或更多种非特异性t细胞刺激物(例如，抗cd3和抗cd28)和/或一种或更多种细胞因子(例如，il-1b、il-2、il-4、il-6、il-7、il-9、il-10、il-12、il-15、il-17、il-21、il-22、il-23、il-35、tgf-β、ifnα、ifnγ、tnfα)重组蛋白、共刺激分子、凝集素、离子载体、合成分子、抗原呈递细胞(apc)、人工apc或饲养层的情况下，活化t细胞或扩增t细胞的数量。在一些实施方案中，可
以通过使t细胞与一种或更多种非特异性t细胞刺激物和/或一种或更多种细胞因子物理接触来活化cd4/cd8 t细胞并且扩增t细胞的数量。任何一种或更多种非特异性t细胞刺激均可用于本发明的方法。非特异性t细胞刺激的实例包括抗cd3抗体和抗cd28抗体。在一些实施方案中，非特异性t细胞刺激物可以是与珠粒缀合的抗cd3抗体和抗cd28抗体。任何一种或更多种细胞因子均可以用于本发明的方法。示例性细胞因子包括白细胞介素(il)-2、il-7、il-21和il-15。
[0112]
在分离的cd4/cd8 t细胞活化和/或扩增后，在步骤30，cd4/cd8 t细胞可以使用例如流式细胞仪分离或分选成以中间共表达cd45ra和cd45ro(cd45ra
int
cd45ro
int
)为特征的cd4/cd8 t细胞富集群。该方法可以包括以任何合适的方式分选细胞。在一些实施方案中，分选使用流式细胞术进行。可以使用本领域已知的任何合适的方法进行流式细胞术。流式细胞术可以使用任何合适的抗体和染色剂。在一些实施方案中，流式细胞术是多色流式细胞术。
[0113]
通过本文所述的方法产生的具有cd45ra
int
cd45ro
int
表型的cd4/c8 t细胞富集群可以包括具有cd45ra
int
cd45ro
int
作为主要细胞类型的cd4/c8 t细胞。在一些实施方案中，本文所述的方法产生的细胞培养物和/或细胞群包含至少约99％、至少约98％、至少约97％、至少约96％、至少约95％、至少约94％、至少约93％、至少约92％、至少约91％、至少约90％、至少约89％、至少约88％、至少约87％、至少约86％、至少约85％、至少约84％、至少约83％、至少约82％、至少约81％、至少约80％、至少约79％、至少约78％、至少约77％、至少约76％、至少约75％、至少约74％、至少约73％、至少约72％、至少约71％、至少约70％、至少约69％、至少约68％％，至少约67％，至少约66％、至少约65％、至少约64％、至少约63％、至少约62％、至少约61％、至少约60％、至少约59％、至少约58％、至少约57％、至少约56％、至少约55％、至少约54％、至少约53％、至少约52％、至少约51％、或至少约50％的具有cd45ra
int
cd45ro
int
的cd4/c8 t细胞。在优选的实施方案中，细胞培养物或细胞群的细胞包括人细胞。
[0114]
长期存活的具有cd45ra
int
cd45ro
int
表型的cd4/cd8 t细胞还可以通过其他细胞表面标志物的表达进行表征。例如，具有cd45ra
int
cd45ro
int
表型的分离的cd4/cd8 t细胞可以表达cd95、cd127或cd27中的至少一种。在其他实施方案中，具有cd45ra
int
cd45ro
int
表型的cd4/cd8 t细胞可以进一步中间表达4-1bb并且任选地表达ox40。
[0115]
在其他实施方案中，具有cd45ra
int
cd45ro
int
表型的分离的cd4/cd8 t细胞可以进一步表达il17ra、cd5、il2rg、igf2r、slc38a1、il7r、slc44a2、slc2a3、cd96、cd44、cd6、ccr4、il4r或slc12a7中的至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种或更多种。
[0116]
在一些实施方案中，分离的cd4/cd8 t细胞可以具有cd45ra
int
cd45ro
int cd95 cd127 cd27 表型。在其他实施方案中，分离的t细胞可以具有cd45ra
int cd45ro
int
cd95 cd127 cd27 il7r cd44 scl38a1 il2rg cd6 cd5 表型。
[0117]
在一些实施方案中，在分离或分选具有cd45ra
int
cd45ro
int
表型的cd4/c8 t细胞之前和/或之后，可以通过在包含少量il-7和/或il-15的培养基中培养分离的cd4/cd8t细胞来富集具有cd45ra
int
cd45ro
int
表型的分离的cd4-cd8 t细胞。发现与在高il-7/il-15条件下(例如，il-7/il-15浓度大于10ng/ml)培养的活化cd4/cd8 t细胞相比，在低il-7/il-15条件下(例如，il7/il15浓度低于10ng/ml)培养的活化cd4/cd8t细胞可以促进或形成具有
cd45ra
int
cd45ro
int
表型的cd4/c8 t细胞富集群。。
[0118]
在一些实施方案中，培养基可以包括il-7和/或il-15，其浓度为，例如，小于约100ng/ml、小于约95ng/ml、小于约90ng/ml、小于约85ng/ml、小于约80ng/ml、小于约75ng/ml、小于约70ng/ml、小于约65ng/ml、小于约60ng/ml、小于约55ng/ml、小于约50ng/ml、小于约45ng/ml、小于约40ng/ml、小于约35ng/ml、小于约30ng/ml、小于约25ng/ml、小于约20ng/ml、小于约15ng/ml、小于约10ng/ml、小于约5ng/ml、小于约4ng/ml、小于约3ng/ml、小于约2ng/ml、或小于约1ng/ml。
[0119]
使用本文所述的低il-7/il-15浓度培养基，细胞群或细胞培养物可富集具有cd45ra
int
cd45ro
int
表型的cd4/c8 t细胞，与未处理的细胞群或细胞培养物相比，其含量至少约2至约1000倍。在一些实施方案中，与未处理的细胞群或细胞培养物相比，具有cd45ra
int
cd45ro
int
表型的cd4/c8 t细胞可以富集至少约5至约500倍。在其他实施方案中，与未处理的细胞群或细胞培养物相比，具有cd45ra
int
cd45ro
int
表型的cd4/c8 t细胞可以富集至少约10至约200倍。在还其他实施方案中，与未处理的细胞群或细胞培养物相比，具有cd45ra
int
cd45ro
int
表型的cd4/c8 t细胞可以富集至少约20至约100倍。在又其他实施方案中，与未处理的细胞群或细胞培养物相比，具有cd45ra
int
cd45ro
int
表型的cd4/c8 t细胞可以富集至少约40至约80倍。在某些实施方案中，与未处理的细胞群或细胞培养物相比，具有cd45ra
int
cd45ro
int
表型的cd4/c8 t细胞可以富集至少约2至约20倍。
[0120]
在一些实施方案中，一旦分离或分选，cd4/cd8 t细胞可以在包含tgfβ/il1β的培养基中培养以保持cd45ra
int
cd45ro
int
表型。向具有cd45ra
int
cd45ro
int
表型的cd4/cd8细胞添加tgfβ和/或il1β可导致在施用于受试者之前保持cd45ra
int
cd45ro
int
表型。
[0121]
在一些实施方案中，该方法可以进一步包括在活化和/或分离之前或之后对cd4/cd8 t细胞进行基因修饰，使得它们缺乏功能性ccr5和/或cxcr4 hiv辅助受体。当hiv感染人t细胞时，它依赖于与t细胞受体cd4和两种辅助受体中的一种，即趋化因子受体ccr5或cxcr4的结合，才能进入细胞。人群体中的天然ccr5变体(“ccr5-a32”)被鉴定出似乎对hiv感染具有抗性，尤其是在纯合状态下。因此，为了防止hiv感染t细胞并最终导致hiv感染患者的t细胞死亡和免疫功能下降，可以破坏一种或两种辅助受体以使细胞对病毒产生抗性(见美国专利号7,951,925)。目前正在进行临床试验，其中在离体，hiv患者的t细胞ccr5基因座处被编辑以敲除ccr5基因。然后将这些细胞重新引入患者体内以治疗hiv。
[0122]
在一些实施方案中，cd4/cd8 t细胞可以经基因修饰，使得该cd4/cd8 t细胞在将具有cd45ra
int
cd45ro
int
表型的cd4/cd8t细胞群与分离的t细胞分离之前缺乏功能性ccr5和/或cxcr4 hiv辅助受体。在其他实施方案中，具有cd45ra
int
cd45ro
int
表型的cd4/cd8 t细胞群可以在与分离的t细胞相分离后进行基因修饰，使得具有cd45ra
int
cd45ro
int
表型的cd4/cd8 t细胞群缺乏功能性ccr5和/或cxcr4 hiv辅助受体。
[0123]
在一些实施方案中，cd4/cd8 t细胞的基因修饰或基因组编辑可以通过转导、转染或电穿孔进行。可以使用慢病毒、γ-、α-逆转录病毒或腺病毒进行转导，或者通过核酸(dna、mrna、mirna、antagomirs、odn)、蛋白、位点特异性核酸酶(锌指核酸酶、talen、crisp/r)、自我复制的rna病毒(例如，马脑病病毒)或整合缺陷型慢病毒载体进行电穿孔或转染。
[0124]
在一些实施方案中，cd4/cd8 t细胞和/或具有cd45ra
int
cd45ro
int
表型的cd4/cd8 t细胞可以通过基因组编辑用工程化核酸酶进行基因修饰。基因组编辑是使用序列特异性
核酸酶插入、缺失或修饰基因组序列的过程。目前存在几种基因组编辑方法，包括大范围核酸酶、锌指核酸酶(zfn)、基于转录活化因子样效应子的核酸酶(talen)和crispr-cas系统。这些核酸酶诱导双链dna断裂，随后可以通过非同源末端连接(nhej)或同源依赖修复(hdr)进行修复，它实现使用与双链断裂周围的dna同源的模板插入或修饰基因。传统上，基因组编辑通过用rna或dna转染或转导细胞进行，然后产生蛋白，并且在crispr-cas系统情况下，基因组编辑需要向导rna。
[0125]
例如，双链断裂(dsb)可以由位点特异性核酸酶例如锌指核酸酶(zfn)或tal效应域核酸酶(talen)产生。参见，例如，umov等人(2010)nature 435(7042):646-51；美国专利号8,586,526；6,534,261；6,599,692；6,503,717；6,689,558；7,067,317；7,262,054，其公开内容通过引用以其全文并入用于所有目的。
[0126]
另一种核酸酶系统涉及使用在细菌和古细菌中发现的所谓的获得性免疫系统，称为crispr/cas系统。crispr/cas系统存在于40％的细菌和90％的古细菌中，并且其系统的复杂性不同。参见，例如，美国专利号8,697,359。crispr基因座(成簇的规则间隔的短回文重复序列)是生物体基因组内的区域，其中外源dna的短片段整合在短重复回文序列之间。这些基因座被转录并且rna转录物(“crrna前体(pre-crrna)”)被加工成短crispr rna(crrna)。共有三种类型的crispr/cas系统，它们均包含这些rna和称为“cas”蛋白(crispr相关)的蛋白。i型和iii型均具有加工pre-crrna的cas内切酶，即，当完全加工成crrna时，组装多cas蛋白复合体，该复合体能够切割与crrna互补的核酸。
[0127]
在ii型系统中，crrna使用不同的机制产生，其中反式活化rna(tracrrna)与crrna前体中的重复序列互补，在cas9蛋白存在的情况下，触发双链特异性rnase iii的加工。然后cas9能够切割与成熟crrna互补的靶dna，但是cas 9的切割取决于crrna和靶dna之间的碱基配对，并且在crrna中存在称为pam序列(原型间隔区相邻基序)的短基序。此外，tracrrna也必须存在，因为它与crrna在其3’端碱基配对，并且这种缔合触发cas9活性。
[0128]
cas9蛋白具有至少两个核酸酶结构域：一个核酸酶结构域类似于hnh核酸内切酶，而另一个类似于ruv核酸内切酶结构域。hnh型结构域似乎负责切割与crrna互补的dna链，而ruv结构域切割非互补链。
[0129]
可以通过使用包含通常由crrna和tracrrna退火形成的发夹的工程化“单向导rna”(sgrna)来避免对crrna-tracrrna复合体的需求(参见jinek等人(2012)science337:816和cong等人(2013)sciencexpress/10.1126/science.1231143)。在化脓链球菌中，当cas相关rna和靶dna之间形成双链rna:dna异二聚体时，工程化的tracrrna:crrna融合或sgrna引导cas9切割靶dna。该系统包含cas9蛋白和包含pam序列的工程化sgrna，已用于rna引导的基因组编辑(参见ramalingam同上)，并已用于体内斑马鱼胚胎基因组编辑(参见hwang等人(2013)nature biotechnology31(3):227)，其编辑效率与zfn和talen相似。
[0130]
还可以设计特异性核酸酶以将肽融合抑制剂插入到hiv受体上，以防止hiv感染t细胞(参见共有的美国专利公开号20120093787)，其中这种肽融合抑制剂的实例是c34或fuzeon。类似地，可以通过使用工程核酸酶将抗hiv转基因插入细胞内的安全港基因座以对抗病毒来治疗hiv。这种抗hiv基因的实例可以选自由以下项组成的组：编码抑制hiv多蛋白的锌指转录因子的序列、编码抑制hiv受体表达的锌指转录因子的序列、ccr5核酶、靶向hiv多蛋白的sirna序列、编码trim5α限制因子的序列、编码apobec3g限制因子的序列、编码
revmio蛋白的序列、编码c46的序列、其他抗hiv基因、自杀盒及其组合。因此，本发明的方法和组合物可用于用crispr/cas系统治疗或预防hiv，其中单向导rna包含靶向ccr5或cxcr4基因的序列以整合合适的抗hiv转基因。
[0131]
在一些实施方案中，基因组编辑可以包括用位点特异性核酸酶切割以靶向插入到选定的基因组基因座中(参见，例如，共有的美国专利号7,888,121)。可以使用对靶基因特异的核酸酶，使得转基因构建体通过同源定向修复(hdr)或在非同源末端连接(nhej)驱动的过程中通过末端捕获插入。靶向基因座包括“安全港”基因座，例如人细胞中的aavs1、hprt和ccr5基因，以及鼠细胞中的rosa26(参见，例如，美国专利号7,888,121；7,972,854；7,914,796；7,951,925；8,110,379；8,409,861；8,586,526；美国专利公开20030232410；20050208489；20050026157；20060063231；20080159996；201000218264；20120017290；20110265198；20130137104；20130122591；20130177983和20130177960)。与依赖于转基因随机整合的经典整合方法相比，核酸酶介导的整合提供了改善转基因表达、提高安全性和表达持久性的前景，因为它允许精确的转基因定位，从而将基因沉默或附近癌基因活化的风险降至最低。
[0132]
除了上述插入方法之外，基因组编辑还可以包括基因敲除。在没有供体核酸的情况下，具有切割基因组的细胞将求助于容易出错的nhej途径来修复断裂。该过程通常在修复过程中添加或缺失核苷酸(“插入缺失”)，这可能导致在靶位点引入错义或无义突变。
[0133]
例如，ccr5特异性锌指核酸酶正在i/ii期试验中用于在t细胞中产生非功能性ccr5受体，从而预防hiv感染(参见美国专利号7,951,925)。然后将这些细胞重新引入患者体内以治疗hiv。因此，本发明的方法和组合物可用于用crispr/cas系统破坏ccr5等位基因，其中单向导rna包含靶向人ccr5基因的序列(chr3:46411633-46417697)，尤其是在外显子区域或附近(chr3:46414394-46415452)。
[0134]
用于靶向ccr5基因以进行敲除的一个特别优选的区域是delta-32突变区附近的区域(在chr3:46414923-46415020处或附近)。另一个特别优选的区域chr3:46414522-46414643周围，它编码ccr5蛋白的第二个细胞外环的一部分。atg蛋白翻译起始位点处或附近的区域(在chr3:46414347-46414466处或附近)对于基因组修饰也是特别优选的，例如通过靶向整合将c34肽融合到ccr5的n端用于抗hiv治疗。
[0135]
类似的研究正在cxcr4依赖性hiv的动物模型中进行，其中cxcr4被选择性破坏，或与ccr5串联破坏以防hiv感染t细胞(参见美国专利公开号20100291048)。因此，本文所述的方法和组合物可用于用crispr/cas系统破坏cxcr4等位基因，其中单向导rna包含靶向人cxcr4基因的序列(chr2:136871919-136875725)，特别是在外显子2区域(chr2:136872439-136873482)和小外显子周围区域(chr2:136875616-136875630)或附近。一个优选的靶向cxcr4基因敲除的区域是位于或接近chr2:136872863-136872982的区域，其是ccr5基因中的delta-32突变区域的类似物。特别优选在外显子atg蛋白翻译起始位点附近的chr2:136875540-136875687处或附近的区域，并且在外显子2剪接位点附近的chr2:136873389-136873558处或附近的区域特别优选用于基因修饰，例如通过靶向整合将c34肽融合至cxcr4的n末端用于抗hiv治疗。因此，可以设计sgrna以结合ccr5或cxcr4基因座中任何位置的序列，包括但不限于这些优选靶向区域中的一个或更多个中的序列。
[0136]
核酸酶、编码这些核酸酶的多核苷酸、供体多核苷酸和包含本文所述的蛋白和/或
多核苷酸的组合物可以通过任何合适的方式离体递送至cd4/cd8 t细胞和/或具有cd45ra
int
cd45ro
int
表型的cd4/cd8 t细胞。
[0137]
如本文所述的递送核酸酶的方法描述于，例如，美国专利号6,453,242；6,503,717；6,534,261；6,599,692；6,607,882；6,689,558；6,824,978；6,933,113；6,979,539；7,013,219；和7,163,824，所有这些的公开内容通过引用以其全文并入本文。
[0138]
如本文所述的核酸酶和/或供体构建体还可以使用包含编码一种或更多种crispr/cas系统的序列的载体进行递送。可以使用任何载体系统，包括但不限于质粒载体、dna小环、逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、痘病毒载体；疱疹病毒载体和腺相关病毒载体等，以及它们的组合。另见，美国专利号6,534,261；6,607,882；6,824,978；6,933,113；6,979,539；7,013,219；和7,163,824，以及美国公开号20140335063，其通过引用以其全文并入本文。此外，显而易见的是这些载体中的任何一种均可以包含一种或更多种治疗所需的序列。因此，当将一种或更多种核酸酶和供体构建体引入细胞中时，核酸酶和/或供体多核苷酸可以携带在相同载体或不同载体上。当使用多个载体时，每个载体可以包含编码一种或更多种核酸酶和/或供体构建体的序列。
[0139]
常规的基于病毒和非病毒的基因转移方法可用于将编码核酸酶的核酸和供体构建体引入细胞(例如，哺乳动物细胞)和靶组织中。非病毒载体递送系统包括dna质粒、dna微环、裸核酸和与递送载体如脂质体或泊洛沙姆复合的核酸。病毒载体传递系统包括dna和rna病毒，它们在递送至细胞后具有附加的或整合的基因组。有关基因治疗程序的综述，参见anderson,science 256:808-813(1992)；nabel和feigner,tibtech 11:211-217(1993)；mitani和caskey,tibtech 11:162-166(1993)；dillon,tibtech 11:167-175(1993)；miller,nature 357:455-460(1992)；van brunt,biotechnology6(10):1149-1154(1988)；vigne,restorative neurology and neuroscience 8:35-36(1995)；kremer和perricaudet,british medical bulletin 51(1):31-44(1995)；haddada等人，见微生物学和免疫学的当前主题doerfler和bohm(编辑)(1995)；以及yu等人，gene therapy 1:13-26(1994)。
[0140]
核酸的非病毒递送方法包括电穿孔、脂质转染、显微注射、基因枪、病毒体、脂质体、免疫脂质体、聚阳离子或脂质：核酸缀合物、裸dna、裸rna、加帽rna、人工病毒粒子和药物增强的dna摄取。使用例如sonitron 2000系统(rich-mar)的声穿孔也可用于核酸的递送。
[0141]
其他示例性核酸递送系统包括由amaxa biosystems(cologne,germany)、maxcyte,inc.(rockville,md.)、btx molecular delivery systems(holliston,ma)和copernicus therapeutics inc.提供的那些(参见例如美国专利号6,008,336)。脂质转染描述于例如美国专利号5,049,386；4,946,787；和4,897,355)和市售脂转染试剂(例如，transfectam.tm和lipofectin.tm.)。适用于多核苷酸的有效受体识别脂转染的阳离子和中性脂质包括feigner、wo 91/17424、wo 91/16024的那些。
[0142]
脂质：核酸复合体(包括靶向脂质体，例如免疫脂质复合体)的制备是本领域技术人员所熟知的(参见，例如，crystal,science 270:404-410(1995)；blaese等人，cancer gene ther.2:291-297(1995)；behr等人，bioconjugate chem.5:382-389(1994)；remy等人，bioconjugate chem.5:647-654(1994)；gao等人，gene therapy 2:710-722(1995)；
ahmad等人，cancer res.52:4817-4820(1992)；美国专利号4,186,183、4,217,344、4,235,871、4,261,975、4,485,054、4,501,728、4,774,085、4,837,028、和4,946,787)。
[0143]
另外的递送方法包括使用包装将核酸递送至engeneic递送载体(edv)中。这些edv使用双特异性抗体特异性递送至靶组织，其中抗体的一个臂对靶组织具有特异性，而另一臂对edv具有特异性。抗体将edv带至靶细胞表面，然后通过内吞作用将edv带入细胞。一旦进入细胞，内容物被释放(参见macdiarmid等人(2009)nature biotechnology 27(7):643)。
[0144]
使用基于rna或dna病毒的系统用于递送编码工程化crispr/cas系统的核酸利用了高度进化的过程，用于将病毒靶向机体中的特定细胞并将病毒有效载荷运输至细胞核。病毒载体可以直接施用于受试者(体内)，或者它们可以用于在体外治疗细胞并将修饰的细胞施用于受试者(离体)。用于递送crispr/cas系统的传统基于病毒的系统包括但不限于，用于基因转移的逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒、牛痘和单纯疱疹病毒载体。使用逆转录病毒、慢病毒和腺相关病毒基因转移方法可以整合到宿主基因组中，通常导致插入的转基因的长期表达。此外，已在许多不同的细胞类型和靶组织中观察到高转导效率。
[0145]
可以通过掺入外源包膜蛋白改变逆转录病毒的趋向性，扩增靶细胞的潜在靶细胞群。慢病毒载体是能够转导或感染非分裂细胞并且通常产生高病毒滴度的逆转录病毒载体。逆转录病毒基因转移系统的选择取决于靶组织。逆转录病毒载体由具有至多6-10kb的外源序列包装能力的顺式作用长末端重复序列组成。极少顺式ltr以复制和包装载体，然后将其用于将治疗基因整合至靶细胞中以提供永久的转基因表达。广泛使用的逆转录病毒载体包括基于鼠白血病病毒(mulv)、长臂猿白血病病毒(galv)、猿免疫缺陷病毒(siv)、人类免疫缺陷病毒(hiv)及其组合(参见，例如，buchscher等人，j.virol.66:2731-2739(1992)；johann等人，j.virol.66:1635-1640(1992)；sommerfelt等人，virol.176:58-59(1990)；wilson等人，j.virol.63:2374-2378(1989)；miller等人， j.virol.65:2220-2224(1991)；pct/us94/05700)。
[0146]
在优选瞬时表达的应用中，可以使用基于腺病毒的系统。基于腺病毒的载体能够在许多细胞类型中实现非常高的转导效率，并且不需要细胞分裂。使用这种载体，已经获得高滴度和高水平的表达。这种载体可以在相对简单的系统中大量生产。腺相关病毒(“aav”)载体也用于用靶核酸转导细胞，例如，在核酸和肽的体外生产中，以及用于体内和离体基因治疗程序(参见，例如，west等人，virology 160:38-47(1987)；美国专利号4,797,368；wo 93/24641；kotin,human gene therapy 5:793-801(1994)；muzyczka,j.clin.invest.94:1351(1994))。许多出版物中描述了重组aav载体的构建，包括美国专利号5,173,414；tratschin等人，mol.cell.biol.5:3251-3260(1985)；tratschin等人，mol.cell.biol.4:2072-2081(1984)；hermonat和muzyczka，pnas 81:6466-6470(1984)；和samulski等人，j.virol.63:03822-3828(1989)。
[0147]
目前至少有六种病毒载体方法可用于临床试验中的基因转移，其利用涉及通过插入辅助细胞系的基因来互补缺陷载体以产生转导剂的方法。
[0148]
plasn和mfg-s是已用于临床试验的逆转录病毒载体的实例(dunbar等人，blood 85:3048-305(1995)；kohn等人，nat.med.1:1017-102(1995)；malech等人，pnas 94:2212133-12138(1997))。pa317/plasn是用于基因治疗试验的第一个治疗载体。(blaese等
人，science 270:475-480(1995))。对于mfg-s包装的载体，已观察到50％或更高的转导效率。(ellem等人，immunol immunother.44(1):10-20(1997)；dranoff等人，hum.gene ther.1:111-2(1997))。
[0149]
重组腺相关病毒载体(raav)是基于缺陷和非致病性细小病毒腺相关2型病毒的有前景的替代基因递送系统。所有载体均源自仅保留转基因表达盒两侧的aav 145碱基对(bp)反向末端重复序列的质粒。由于整合到转导细胞的基因组中，有效的基因转移和稳定的转基因递送是该载体系统的关键特征。(wagner等人，lancet 351:9117 1702-3(1998)，keams等人，gene ther.9:748-55(1996))。根据本发明，还可以使用其他aav血清型，包括aav1、aav3、aav4、aav5、aav6、aav8、aav9和aavrhl0，以及它们的所有变体。
[0150]
复制缺陷型重组腺病毒载体(ad)可以以高滴度生产并且容易感染许多不同的细胞类型。大多数腺病毒载体经工程化，使得转基因替换ad ela、elb和/或e3基因；随后，复制缺陷载体在人293细胞中繁殖，该细胞提供反式缺失基因功能。ad载体可以在体内转导多种类型的组织，包括非分裂的、分化的细胞，例如在肝脏、肾脏和肌肉中发现的那些。传统的ad载体具有较大的携带能力。在临床试验中使用ad载体的实例涉及通过肌肉注射进行抗肿瘤免疫的多核苷酸治疗(sterman等人，hum.gene ther.7:1083-9(1998))。在临床试验中使用腺病毒载体进行基因转移的其他实例包括rosenecker等人，infection 24:1 5-10(1996)；sterman等人，hum.gene ther.9:7 1083-1089(1998)；welsh等人，hum.gene ther.2:205-18(1995)；alvarez等人，hum.gene ther.5:597-613(1997)；topf等人，gene ther.5:507-513(1998)；sterman等人，hum.gene ther.7:1083-1089(1998)。
[0151]
包装细胞用于形成能够感染宿主细胞的病毒颗粒。这种细胞包括包装腺病毒的293细胞和包装逆转录病毒的.psi.2细胞或pa317细胞。用于基因治疗的病毒载体通常由将核酸载体包装到病毒颗粒中的生产细胞系产生。载体通常包含包装和随后整合到宿主(如适用)所需的最小病毒序列，其他病毒序列被编码要表达的蛋白的表达盒替换。缺失的病毒功能由包装细胞系以反式形式提供。例如，用于基因治疗的aav载体通常仅具有来自aav基因组的反向末端重复(itr)序列，这些序列是包装和整合到宿主基因组中所必需的。病毒dna被包装在细胞系中，该细胞系含有辅助质粒，该质粒编码其他aav基因，即rep和cap，但缺乏itr序列。细胞系也被腺病毒作为辅助感染。辅助病毒促进aav载体的复制和辅助质粒中aav基因的表达。由于缺乏itr序列，辅助质粒未被大量包装。可以通过例如对腺病毒比对aav更灵敏的热处理来减少腺病毒的污染。
[0152]
基因编辑载体可以离体递送至cd4/cd8 t细胞和/或具有cd45ra
int
cd45ro
int
表型的cd4/cd8 t细胞，然后将细胞重新植入患者体内，通常在选择包含该载体的细胞后。包括用于离体施用的基因编辑载体的制剂可以包括在液体或乳化液体中的混悬剂。活性成分通常与药学上可接受且与活性成分相容的辅料混合。合适的辅料包括例如水、盐水、右旋糖、甘油、乙醇等，以及它们的组合。此外，该制剂可含有少量辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、ph缓冲剂、稳定剂或增强药物组合物有效性的其他试剂。
[0153]
通过本文所述的方法产生的具有cd45ra
int
cd45ro
int
表型的经选择的、富集的ccr5和/或cxcr4基因编辑的cd4/cd8 t细胞群可以包含在组合物中，例如药物组合物，用于治疗受试者的hiv感染。该组合物还可以包括药学上可接受的载体。关于药物组合物，载体可以是任何常规用于施用细胞的那些。这种药学上可接受的载体是本领域技术人员熟知的并且
公众容易获得。优选药学上可接受的载体是在使用条件下没有有害副作用或毒性的载体。
[0154]
可以将组合物制备成单位剂型以施用于受试者。施用的量和时间由治疗的临床医生决定，以达到期望结局。组合物可以被配制用于全身(例如静脉内)或局部(例如肿瘤内)施用。在一个实例中，将ccr5和/或cxcr4基因编辑的具有cd45ra
int
cd45ro
int
表型的cd4/cd8 t细胞富集群配制用于肠胃外给药，例如静脉内施用。包括ccr5和/或cxcr4基因编辑的cd4/cd8 t细胞富集群的组合物具有如本文所公开的cd45ra
int
cd45ro
int
表型，例如可以用于治疗受试者的hiv。
[0155]
用于施用的组合物可以包括在药学上可接受的载体(例如水性载体)中提供的具有cd45ra
int
cd45ro
int
表型的ccr5和/或cxcr4基因编辑的cd4/cd8 t细胞富集群的溶液。可以使用多种水性载体，例如缓冲盐水等。这些溶液是无菌的并且通常不含非期望物质。这些组合物可以通过常规的熟知灭菌技术进行灭菌。该组合物可以含有药学上可接受的辅助物质，以接近生理条件，例如ph调节缓冲剂、毒性调节剂、助剂等，例如乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠等。在这些制剂中，具有cd45ra
int
cd45ro
int
表型的ccr5和/或cxcr4基因编辑的cd4/cd8 t细胞的细胞数量或浓度变化范围广泛，并且将根据所选择的和受试者需要的特定施用方式，主要基于液体体积、粘度、体重等。制备用于基因疗法、免疫疗法和/或细胞疗法的此类剂型的实际方法对于本领域技术人员而言是已知的或将是显而易见的。
[0156]
在一个实例中，可将具有cd45ra
int
cd45ro
int
表型的ccr5和/或cxcr4基因编辑的cd4/cd8 t细胞富集群添加到含有0.9％氯化钠(usp)的输液袋中，并且在一些情况下以一定剂量以0.5至15mg/kg体重施用。具有cd45ra
int
cd45ro
int
型的ccr5和/或cxcr4基因编辑的cd4/cd8 t细胞富集群可以通过缓慢输注施用，而不是静脉推注或推注方式施用。在一个实例中，施用较高负荷剂量，随后以较低水平施用维持剂量。
[0157]
施用的具有cd45ra
int
cd45ro
int
表型的ccr5和/或cxcr4基因编辑的cd4/cd8 t细胞的剂量，例如数量，应足以在受试者或动物中在合理的时间范围内产生例如治疗或预防反应。例如，具有cd45ra
int
cd45ro
int
表型的ccr5和/或cxcr4基因编辑的cd4/cd8 t细胞的数量应足以在距施用时间约6个月、1年、2年、3年、4年或更长的时间段内治疗hiv。在某些实施方案中，时间段可以更长。具有cd45ra
int
cd45ro
int
表型的ccr5和/或cxcr4基因编辑的cd4/cd8 t细胞的数量将通过以下确定，例如，具有cd45ra
int
cd45ro
int
表型的ccr5和/或cxcr4基因编辑的cd4/cd8 t细胞的有效性和动物(例如，人)的状况，以及待治疗的动物(例如，人)的体重。
[0158]
具有cd45ra
int
cd45ro
int
表型的ccr5和/或cxcr4基因编辑的cd4/cd8 t细胞的数量还将通过可能伴随具有cd45ra
int
cd45ro
int
表型的ccr5和/或cxcr4基因编辑的cd4/cd8 t细胞富集群的任何不良副作用的存在、性质和程度来确定。通常，主治医师将决定用于治疗每个个体患者的具有cd45ra
int
cd45ro
int
表型的本发明ccr5和/或cxcr4基因编辑的cd4/cd8 t细胞的数量，考虑各种因素，例如年龄、体重、一般健康状况、饮食、性别、施用途径和所治疗疾病的严重程度。举例来说并且不旨在限制本发明，具有cd45ra
int
cd45ro
int
表型的ccr5和/或cxcr4基因编辑的cd4/cd8 t细胞的数量可以是每次输注约10
×
104至约10
×
10
11
个细胞，每次输注约10
×
105个细胞至约10
×
109个细胞，或每次输注10
×
107至约10
×
109个细胞。
[0159]
设想具有cd45ra
int
cd45ro
int
表型的ccr5和/或cxcr4基因编辑的cd4/cd8 t细胞可用于治疗或预防有需要的受试者的hiv感染的方法。在这方面，治疗或预防受试者的hiv感
染的方法可以包括以可有效治疗或预防受试者的hiv的量向受试者施用可以具有本文所述的cd45ra
int
cd45ro
int
表型的ccr5和/或cxcr4基因编辑的cd4/cd8 t细胞富集群。
[0160]
在一些实施方案中，向hiv受试者施用组合物或t细胞富集群能够促进绝对cd4细胞数持续增加、恢复hiv特异性t细胞免疫以及受试者体内hiv库明显衰减中的至少一种。在一些实施方案中，受试者已经接受和/或继续接受抗逆转录病毒治疗
[0161]
施用的具有cd45ra
int
cd45ro
int
表型的ccr5和/或cxcr4基因编辑的cd4/cd8 t细胞可以是宿主或受试者同种异体或自体的细胞。优选地，细胞对于受试者是自体的。
[0162]
在一些实施方案中，具有cd45ra
int
cd45ro
int
表型的ccr5和/或cxcr4基因编辑的cd4/cd8 t细胞可以与潜伏hiv表达的活化剂联合施用。几种潜伏hiv表达的活化剂可用于本文所述的组合物和方法中。例如，潜伏hiv表达的活化剂可以包括但不限于组蛋白脱乙酰酶(hdac)抑制剂和蛋白激酶c激动剂。
[0163]
已经证明hdac抑制剂诱导hiv-1启动子的转录活化。hdac抑制剂可以是影响组蛋白脱乙酰酶活性降低的任何分子。这包括蛋白、肽、dna分子(包括反义分子)、rna分子(包括irna试剂和反义分子)和小分子。在一些实施方案中，hdac抑制剂是小干扰rna(sirna)，例如针对hdac1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11的si/shrna。此类hdac抑制剂的限制性实例如下所述。应当理解，hdac抑制剂包括本文所述的hdac抑制剂的任何盐、晶体结构、无定形结构、水合物、衍生物、代谢物、立体异构体、结构异构体和前药。
[0164]
在一些实施方案中，hdac抑制剂可以包括短链脂肪酸(例如，丁酸钠、异戊酸、戊酸、4-苯丁酸(4-pba)、苯丁酸(pb)、丙酸、丁酰胺、异丁酰胺、苯乙酸酯、3-溴丙酸、三丁酸甘油酯、丙戊酸(vpa)、丙戊酸、丙戊酸半钠和新戊酰氧基甲基丁酸(pivanex)。
[0165]
在其他实施方案中，hdac抑制剂可以包括异羟肟酸衍生物(例如，辛二酰苯胺异羟肟酸(saha，伏立诺他)、曲古抑素类似物(例如曲古抑素a(tsa)和曲古抑素c)、间羧基肉桂酸双羟肟酸(cbha)、pyroxamide、水杨基双异羟肟酸、辛二酰双异羟肟酸(sbha)、壬二酸双异羟肟酸(abha)壬二-1-异羟肟酸-9-胺苯(aaha)、6-(3-氯苯基脲基)己二酸(3c1-ucha)、oxamflatin[(2e)-5-[3-[(苯磺酰基)氨基]苯基]-戊基-2-酮-4-异羟肟酸]、a-161906scriptaid、pxd-101(prolifix)、laq-824、chap、mw2796、mw2996；或美国专利号5,369,108、5,932,616、5,700,811、6,087,367和6,511,990中公开的任何异羟肟酸。在某些实施方案中，hdac抑制剂是saha。
[0166]
在其他实施方案中，hdac抑制剂可以包括苯甲酰胺衍生物(例如，ci-994；ms-275[n-(2-氨基苯基)-4-[n-(吡啶-3-基甲氧羰基)氨基甲基]苯甲酰胺]和ms-275的3
’‑
氨基衍生物)。
[0167]
在其他实施方案中，hdac抑制剂可以包括环肽(例如，trapoxin a(tpx)-环四肽(环-(l-苯丙氨酰-l-苯丙氨酰-d-哌可林-l-2-氨基-8-氧代-9,10-环氧癸酰基))、fr901228(fk 228，缩酚酸肽)、fr225497环状四肽、apicidin环状四肽[环(n-o-甲基-l-色氨酸-l-异亮氨酸-d-哌啶基-l-2-氨基-8-氧代癸酰基)]、apicidin ia、apicidin ib、apicidin ic、apicidin iia和apicidin iib、chap、hc-毒素环状四肽、wf27082环状四肽和chlamydocin。
[0168]
其他hdac抑制剂可以包括天然产物，例如psamaplin和depudecin，亲电子酮衍生物(例如三氟甲基酮)、α-酮酰胺(例如n-甲基-α-酮酰胺)、lsd1多肽、tnf-α(tnfα)、诱导型
转录因子nf-at(活化t细胞的核因子)和抗iκbα或iκbε剂。
[0169]
可以将具有cd45ra
int
cd45ro
int
表型的ccr5和/或cxcr4基因编辑的cd4/cd8 t细胞单独或与本文所述的潜伏hiv表达的活化剂联合施用于潜伏hiv感染受试者，例如，潜伏感染hiv的人。受试者可以包括尽管接受抗逆转录病毒疗法(例如，ha art)治疗但仍具有持久性hiv库的受试者。因此，在一些实施方案中，治疗有效量是具有cd45ra
int
cd45ro
int
表型的ccr5和/或cxcr4基因编辑的cd4/cd8 t细胞用于显著减少潜伏性hiv感染受试者中的潜伏性hiv库的量。
[0170]
在其他实施方案中，治疗有效量的具有cd45ra
int
cd45ro
int
表型的ccr5和/或cxcr4基因编辑的cd4/cd8 t细胞，以及任选地潜伏hiv表达的活化剂，可以与用于治疗hiv感染的另一种治疗剂组(例如用于haart或免疫毒素的组分)联合施用于受试者。
[0171]
如上所述，本文所述的具有cd45ra
int
cd45ro
int
表型的ccr5和/或cxcr4基因编辑的cd4/cd8 t细胞可以与一种或更多种用于治疗hiv感染的另外治疗剂组合。应当理解，具有cd45ra
int
cd45ro
int
表型的ccr5和/或cxcr4基因编辑的cd4/cd8 t细胞与hiv/aids抗病毒剂、免疫调节剂、抗感染剂或疫苗的组合范围不限于以下列表，并且原则上包括与可用于治疗aids的任何药物组合物的任何组合。hiv/aids抗病毒剂和其他药剂通常以本领域报道的常规剂量范围和方案用于这些组合中。
[0172]
抗病毒剂的实例包括(但不限于)抗病毒剂生产商(商品名和/或药物名称位置)适应症(活性)：阿巴卡韦glaxosmithkline hiv感染，aids，arc gw 1592(ziagen)(nrti)；1592u89阿巴卡韦 glaxosmithkline hiv感染，aids，arc(nnrti)；拉米夫定 (trizivir)齐多夫定乙酰甘露聚糖carrington labs arc(irving,tex.)ach 126443achillion pharm.hiv感染，aids，arc(核苷逆转录酶抑制剂)；阿昔洛韦burroughs wellcome hiv感染，aids，arc，联合azt ad-439tanox biosystems hiv感染，aids，arc ad-519tanox biosystems hiv感染，aids，arc阿德福韦酯gilead hiv感染，aids，arc gs 840(rti)；al-721ethigen arc，pgl，hiv阳性，(加利福尼亚州洛杉矶)，aidsα干扰素glaxosmithkline卡波西肉瘤，hiv，联合w/retrovir amd3100 anormed hiv感染、aids、arc(cxcr4拮抗剂)；安普那韦glaxosmithkline hiv感染，aids，141w94(agenerase)arc(pi)；gw 141vx478(vertex)安沙霉素adria laboratories arc lm 427(dublin,ohio)erbamont(stamford,conn.)中和抗体；advanced biotherapy aids，arc ph不稳定α异常概念(rockville,interferon md.)ar177 aronex pharm hiv感染，aids，arc阿扎那韦(bms 232632)bristol-myers-squibb hiv感染，aids，arc(zrivada)(pi)；β-氟-ddanatl cancer institute aids相关疾病bms-232623bristol-myers squibb/hiv感染，aids，(cgp-73547)novartis arc(pi)；bms-234475bristol-myers squibb/hiv感染，aids，(cgp-61755)novartis arc(pi)；卡普韦林pfizer hiv感染，aids，(ag-1549，s-1153)arc(nnrti)；ci-1012wamer-lambert hiv-1感染西多福韦gilead science cmv视网膜炎、疱疹、乳头瘤病毒硫酸凝胶多糖aji pharma usa hiv感染巨细胞病毒免疫medlmmune cmv视网膜炎珠蛋白更昔洛韦syntex视力威胁cmv更昔洛韦外周cmv视网膜炎地拉韦啶pharmacia-upjohn hiv感染、aids、(rescriptor)arc(nnrti)；葡聚糖硫酸盐ueno fine chem.ind.aids，arc，hiv ltd.(osaka，japan)阳性无症状ddc hoffman-la roche hiv感染，aids，arc(扎西他滨，(hivid)(nrti)；双脱氧胞苷ddl bristol-myers squibb hiv感染，aids，arc；双脱氧肌苷
(videx)联合azt/d4t(nrti)dpc 681&dpc 684dupont hiv感染，aids，arc(pi)dpc 961&dpc 083dupont hiv感染aids，arc(nnrtri)；emvirine triangle pharmaceuticals hiv感染、aids、arc(coactinon)(非核苷类逆转录酶抑制剂)；elio elan corp，plc hiv感染(gainesville,ga.)依非韦伦dupont hiv感染，aids,(dmp 266)(sustiva)arc(nnrti)；merck(stocrin)泛昔洛韦smith kline带状疱疹，单纯疱疹恩曲他滨triangle pharmaceuticals hiv感染，aids，arc ftc(coviracil)(nrti)；emory university emvirine triangle pharmaceuticals hiv感染，aids，arc(coactinon)(非核苷类逆转录酶抑制剂)；hby097 hoechst marion roussel hiv感染，aids，arc(nnrti)；金丝桃素vimrx pharm.hiv感染，aids，arc重组人；triton biosciences aids，卡波西肉瘤，干扰素β(almeda，ca)；arc干扰素α-n3 interferon sciences arc，aids茚地那韦；merck(crixivan)hiv感染，aids，arc，无症状hiv阳性，还联用azt/ddl/ddc(pi)；isis 2922isis pharmaceuticals cmv视网膜炎je2147/ag1776；agouron hiv感染，aids，arc(pi)；kni-272natl cancer institute hiv-assoc.疾病拉米夫定；3tc glaxo wellcome hiv感染，aids，(epivir)arc；还联用azt(nrti)；洛布卡韦bristol-myers squibb cmv感染；洛匹那韦(abt-378)abbott hiv感染，aids，arc(pi)；洛匹那韦 利托那韦abbott(kaletra)hiv感染，aids，arc(abt-378/r)(pi)；莫泽那韦avid(camden，n.j.)hiv感染，aids，arc(dmp-450)(pi)；奈非那韦agouron hiv感染，aids，(viracept)arc(pi)；奈韦拉平boeheringer hiv感染，aids，ingleheim arc(nnrti)；(viramune)novapren novaferon labs,inc.hiv抑制剂(akron，ohio)；pentafusaide trimeris hiv感染，aids，arc t-20(融合抑制剂)；肽t peninsula labs aids八肽(belmont，ca)序列pro 542progenies hiv感染，aids，arc(附着抑制剂)；pro 140progenies hiv感染，aids，arc(ccr5辅助受体抑制剂)；三钠astra pharm.产品，cmv视网膜炎，hiv感染，膦甲酸酯inc其他cmv感染；pnu-140690pharmacia upjohn hiv感染、aids、arc(pi)；普罗布考vyrex hiv感染，aids；rbc-cd4sheffield med.tech hiv hiv感染，aids，(houston tex.)arc；利托那韦abbott hiv感染，aids，(abt-538)(ritonavir)arc(pi)；沙奎那韦hoffmann-laroche hiv感染，aids，(fortovase)arc(pi)；司他夫定d4tbristol-myers squibb hiv感染，aids，arc双脱氢脱氧-(zerit.)(nrti)；胸苷t-1249trimeris hiv感染，aids，arc(融合抑制剂)；tak-779takeda hiv感染，aids，arc(可注射ccr5受体拮抗剂)；替诺福韦gilead(viread)hiv感染，aids，arc(nrti)；替拉那韦(pnu-140690)boehringer ingelheim hiv感染，aids，arc(pi)；tmc-120&tmc-125tibotec hiv感染，aids，arc(nnrti)；tmc-126tibotec hiv感染，aids，arc(pi)；伐昔洛韦glaxosmithkline生殖器hsv和cmv感染病毒唑viratek/icn(costa无症状hiv阳性，利巴韦林mesa，calif.)las，arc；齐多夫定；azt glaxosmithkline hiv感染，aids，arc，(retrovir)卡波西肉瘤联合其他疗法(nrti)；[pi＝蛋白酶抑制剂nnrti＝非核苷逆转录酶抑制剂nrti＝核苷逆转录酶抑制剂]。
[0173]
另外的治疗剂可以单独使用、序贯使用或与具有cd45ra
int
cd45ro
int
表型的ccr5和/或cxcr4基因编辑的cd4/cd8 t细胞联合使用。可以通过相同或不同的使用途径或在相同的药物制剂中一起施用于受试者。
[0174]
根据该实施方案，具有cd45ra
int
cd45ro
int
表型的ccr5和/或cxcr4基因编辑的cd4/cd8 t细胞和潜伏hiv表达的活化剂可以与任何haart方案或其组分共同施用。目前使用
haart的护理标准通常是至少三种核苷类逆转录酶抑制剂的联合用药，并且经常包括蛋白酶抑制剂，或者可选地非核苷类逆转录酶抑制剂。cd4 细胞计数低或血浆rna水平高的受试者可能需要更积极的haart。对于具有相对正常的cd4 细胞计数和长期血浆hiv rna水平低至不可测量的受试者(即，缓慢或非进展者)可能需要较少积极的haart。对于接受抗逆转录病毒方案治疗的抗逆转录病毒初治受试者，可以使用抗逆转录病毒药物的不同联合用药(或鸡尾酒混合物(cocktail))。
[0175]
因此，在一些实施方案中，可以将具有cd45ra
int
cd45ro
int
表型的ccr5和/或cxcr4基因编辑的cd4/cd8 t细胞和任选地潜伏hiv表达的活化剂与核苷反向转录酶抑制剂、非核苷类hiv逆转录酶抑制剂和蛋白酶抑制剂“鸡尾酒混合物”共同施用于受试者。例如，具有cd45ra
int
cd45ro
int
表型的ccr5和/或cxcr4基因编辑的cd4/cd8 t细胞和hdac抑制剂可以与两种核苷逆转录酶抑制剂(例如齐多夫定(azt)和拉米夫定(3tc))和一种蛋白酶抑制剂(例如，indinavir(mk-639))的鸡尾酒混合物共同施用。具有cd45ra
int
cd45ro
int
表型的ccr5和/或cxcr4基因编辑的cd4/cd8 t细胞和任选的潜伏hiv表达活化剂，例如hdac抑制剂，还可以与一种核苷逆转录酶抑制剂(例如，司他夫定(d4t))、一种非核苷类逆转录酶抑制剂(例如奈韦拉平(bi-rg-587))和一种蛋白酶抑制剂(例如奈非那韦(ag-1343))的鸡尾酒混合物共同施用于受试者。可选地，可将具有cd45ra
int
cd45ro
int
表型的ccr5和/或cxcr4基因编辑的cd4/cd8 t细胞和任选的hdac抑制剂与一种核苷逆转录酶抑制剂(例如齐多夫定(azt))和两种蛋白酶抑制剂(例如，奈非那韦(ag-1343)和saqinavir(ro-31-8959))的鸡尾酒混合物共同施用于受试者。
[0176]
本发明背景中的共同施用被定义为指在协调治疗过程中施用多于一种治疗剂以实现改善的临床结局。这种共同施用也可以是同时进行的，即在重叠的时间段内发生。
[0177]
在另外的实施方案中，可以将免疫毒素与具有cd45ra
int
cd45ro
int
表型的具有ccr5和/或cxcr4基因编辑的cd4/cd8 t细胞共同施用于受试者。免疫毒素的实例是靶向在细胞外部表达的hiv蛋白的免疫毒素，例如病毒包膜糖蛋白或其一部分。术语“免疫毒素”是指毒素与抗体(例如抗hiv包膜糖蛋白抗体)的共价或非共价连接。毒素可以直接与抗体连接，或通过例如接头分子间接连接。毒素可以选自由蓖麻毒素-a和相思豆毒蛋白-a组成的组。
[0178]
潜伏hiv表达的活化(也称为潜伏hiv表达的再活化)导致潜伏感染细胞转化为生产性感染细胞。这种转变可以通过活跃病毒感染的任何特征来衡量，例如，感染性颗粒的产生、逆转录酶活性、分泌抗原、细胞表面抗原、可溶性抗原、hiv rna和hiv dna等。本文所述的方法可任选地包括确定或检测潜伏hiv表达活化的步骤。在一个实施方案中，这种方法包括确定或检测mrna，例如hiv mrna。其他mrna，例如tat mrna、nf-κb mrna、nf-at mrna和其他编码多肽的mrna也可以使用熟知的方法来确定，包括但不限于基于杂交和扩增的测定。
[0179]
在另一个实施方案中，使用基于扩增的测定来测量hiv基因的表达水平。在一个实施方案中，可以通过确定hiv多肽的表达水平来检测潜在hiv表达的活化。hiv多肽的表达水平可以通过几种方法确定，包括但不限于，如本文进一步描述的或本领域技术人员已知的，亲和捕获、质谱、针对hiv蛋白(例如gp120和逆转录酶)的传统免疫测定、page、western印迹或hplc。
[0180]
为此目的可以采用的检测范例包括光学方法、电化学方法(伏安法和安培法技术)、原子力显微镜和射频方法，例如多极共振光谱。除了共聚焦和非共聚焦显微镜外，光学
方法的示例还包括荧光、发光、化学发光、吸光度、反射率、透射率和双折射或折射率(例如，表面等离子体共振、椭圆偏光法、共振镜法、光栅耦合器波导法或干涉法)。
[0181]
在一些实施方案中，可以对本文所述的基于hiv的载体构建体和pcr产物进行全局测序和454焦磷酸测序以确认自体病毒群体的产生和纯度。454是一种简单、高效且具有成本效益的方法，可用于获取样品中的近似遗传多样性。在示例性实施方案中，dna载体和血浆rna将用条形码引物扩增，然后使用454jr测序以获得每个扩增子/样品平均约2000个读数。
[0182]
通过参考以下实验实施例对本发明作进一步详细描述。提供这些实施例仅用于说明目的，并不旨在限制，除非另有说明。因此，本发明决不应被解释为限于以下实施例，而是应该被解释为包括由于本文提供的教导而变得明显的任何和所有变化。
[0183]
实施例
[0184]
在本实施例中，我们显示了来自两个独立的临床试验的免疫重建和病毒学结局，其中hiv感染的成年人接受ccr5基因编辑的cd4 t细胞的单次输注。在第一项研究(sb-728-0902临床试验)中，我们发现这种干预导致cd4 t细胞数量增加，并在一组先前尽管接受长期有效的art，但未能使他们的cd4 t细胞计数正常化的个体中恢复整体t细胞稳态。重要的是，我们观察到大多数参与者的总hiv病毒库的大小长期显著下降，9名个体中有4名个体的hiv dna减少了每百万个细胞中超过1个logio拷贝dna。尽管这些结果是使用不包括hiv复制能力库的hiv dna测量产生的，但观察到的hiv库高度显著减少与长期art期间报告的非常稳定的水平以及最近使用潜伏期逆转剂形成鲜明对比。这些结局似乎是由于未感染的cd45ra
int
ro
int t
scm
衍生细胞不断替换短期存活的hiv感染细胞。在第二项研究(sb-728-1101临床试验)中，我们证实这些ccr5基因编辑细胞的单次输注导致这种新型cd45ra
int
ro
int t
scm
亚群的产生，并且此类细胞的更高频率与改善对art中断后的hiv复制。这些观察结果支持一种模型，在该模型中记忆cd4 干细胞的ccr5基因编辑允许这些细胞在病毒存在的情况下扩增并分化成其他记忆亚群，并为其子代提供免受感染的保护。
[0185]
材料和方法
[0186]
sb-728-0902临床试验是一项针对接受art治疗的慢性hiv感染个体的开放标签、非对照、非随机i期研究(clinicaltrials.gov#nct01044654)。该项研究由sangamo therapeutics申办，于2009年12月至2014年4月在美国的两个中心开展。该项研究的主要目的是评估由zfn(sb-728-t细胞)在ccr5基因处编辑的自体cd4 富集t细胞的递增剂量的安全性和耐受性。次要目的包括评估cd4 t细胞计数的增加、ccr5基因编辑细胞的长期持久性、归巢至肠道黏膜，以及对hiv病毒持久性(hiv rna和前病毒dna)的影响。共有9名参与者入组三个递增剂量队列，每个队列中有3名参与者。在最初的4周内每周对所有参与者进行随访，然后在之后的一年内每月随访一次，之后他们参与一项为期三年的安全性研究。参与者1-01在第12个月和第31个月之间经历治疗中断。
[0187]
sb-728-1101临床试验是一项针对接受art治疗的慢性hiv感染个体的开放标签、非对照、非随机1期研究(clinicaltrials.gov#nct01543152)。该项研究由sangamo therapeutics申办，于2012年3月至2017年1月在美国的12个中心开展。该项研究的主要目的是评价单剂量sb-728-t细胞施用后递增剂量的环磷酰胺(ctx)预处理以促进cd4 t细胞扩增的安全性和耐受性。在输注sb-728-t细胞前一天，参与者接受剂量为0.1(队列1，n＝
3)、0.5(队列2，n＝6)、1.0(队列3，n＝3)、1.5(队列5，n＝3)和2.0g/m2(队列4，n＝3)的ctx。参与者随后接受～10至400亿个sb-728-t细胞。所有参与者在最初的4周内每周进行一次随访，每两个月一次直至第14周，每月一次直至第22周，然后每2个月一次直至第12个月。输注sb-728-t后6周停止art，持续16周(图17a)。次要目的包括评价sb-728-t细胞在art中断后对血浆hiv-1rna水平的影响。在治疗中断期间，在连续三个每周测量中，对cd4 t细胞计数降至《500个细胞/μl和/或hiv-rna增加到》100,000个拷贝/ml的参与者重新实施art。所有参与者均已完成为期1年的研究并参与一项为期3年的长期安全性研究，但一名参与者退出研究。一名参与者(03-003)未中断art。
[0188]
最终的临床方案、修正案和知情文件由nih重组dna咨询委员会，以及每个研究中心的机构审查委员会和机构生物安全委员会(根据需要)审查和批准。所有参与者均提供了书面知情同意书。
[0189]
入组标准
[0190]
sb-728-0902试验
[0191]
具有资格的参与者为18岁或以上，并且感染hiv，如elisa所记录的。参与者未患病毒血症(未检出hiv rna)，接受稳定的art并且cd4 t细胞计数为200至500个细胞/μl，具有足够的静脉途径并且没有白细胞分离术的禁忌症。关键排除标准包括ccr5锌指核酸酶靶区的snp、当前或先前的aids诊断、接受马拉韦罗或免疫抑制剂治疗以及乙型肝炎或丙型肝炎合并感染。
[0192]
sb-728-1101试验
[0193]
具有资格的参与者为18岁或以上，并且感染hiv，如elisa所记录的。参与者在稳定的art中未患病毒血症并且cd4 t细胞计数》500/μl，患有r5嗜性hiv，并且自愿在治疗中断期间停止当前的art。关键的排除标准包括腺病毒中和抗体》40、ccr5锌指核酸酶靶区的snp、当前或先前的aids诊断、接受马拉韦罗或免疫抑制剂治疗以及乙型肝炎或丙型肝炎合并感染。
[0194]
细胞生产
[0195]
简而言之，参与者经历10l白细胞分离术以采集、富集、修饰和扩增自体cd4 t细胞。sb-728-t是指已用sb-728(复制缺陷型重组ad5/35病毒载体，编码ccr5特异性zfn(sbs8196z和sbs8267))离体转导的自体cd4 富集t细胞，并且包括基因编辑和未编辑的细胞的混合物。ccr5特异性zfn的表达诱导细胞dna中的双链断裂，该双链断裂由细胞机器修复，导致约25％的转导细胞中随机序列插入或缺失(插入缺失)。这些插入缺失破坏ccr5编码序列，导致移码突变和蛋白表达终止。
[0196]
冷冻保存的外周血单核细胞(pbmc)样品
[0197]
sb-728-0902
[0198]
不同时间点冷冻保存样品的可用性因参与者而异；因此，时间点分为早期(14-28天)、中期(4-7个月或9-10个月)、晚期(11-12个月)和长期(2-3或3-4年)输注后时间点。基线样品包括来自初始白细胞分离术(输注前2-3个月)以及输注前1-2周的少量血液抽取的冷冻保存的pbmc。参与者1-01、1-02和1-03的pbmc直至输注后6个月或8个月才进行冷冻保存。大多数参与者同意在长期随访期间进行大量抽血(n＝9，第2-3年)和/或白细胞分离术(n＝7，第3-4年)，以进行需要大量细胞，例如ccr5测序和在分选的cd4 t细胞亚群中整合
hiv dna定量。对于某些检测，包括ics检测和cd95流式细胞仪染色，仅有6名参与者的基线样品仍可用。所有参与者的生产样品(sb-728-t产品)也可用。
[0199]
sb-728-1101
[0200]
在每个时间点进行临床测量(cd4、cd8计数、病毒载量(vl)和五聚体重复标记)。队列1和2参与者无法获得基线和ati前冷冻保存的pbmc；因此，免疫学(t细胞表型分析、zfn介导的ccr5 dna测序在分选的cd4 亚群中的突变)和病毒学(整合的hiv dna)测量仅在来自队列3-5的参与者中进行。基线样品包括来自初始白细胞分离术(输注前2-3个月)以及输注前1-2周抽取的少量血液中冷冻保存的pbmc。队列3-5的参与者的生产样品(sb-728-t产品)也可用。
[0201]
直肠和淋巴结活检
[0202]
sb-928-0902试验的参与者在基线、第14天、第3、6和12个月进行直肠活检(每个时间点n在3名和9名参与者之间变化)。通过组合胶原酶消化和用18g针挑取，从通过内窥镜检查获得的乙状结肠活检中分离出粘膜单核细胞。在某个时间点(在sb-728-t输注后9至18个月)对3名志愿者的腹股沟淋巴结进行活检。如anton等人
47
所述，将组织处理成单个细胞，并分离基因组dna以评估ccr5基因修饰。
[0203]
通过聚合酶链反应定量ccr5基因编辑的cd4 t细胞
[0204]
zfn介导的基因修饰可以产生广泛的移码突变以破坏ccr5基因座。开发基于pcr的测定，以测量在约25％的基因编辑等位基因的zfn切割位点处获得独特的5-核苷酸(五聚体)dna序列ctgat重复。使用市售试剂盒(masterpure dna纯化试剂盒，epicenter,madison,wi)从pbmc中提取基因组dna(gdna)。使用5μg gdna进行标准pcr，以扩增包含ccr5基因修饰的1.1kb区域。随后通过两个独立的qpcr评价该1.1kb的扩增子，一个对五聚体复制-ccr5基因编辑的等位基因特异(通过使用包含五聚体复制的引物)，并且第二个用于扩增所有ccr5等位基因。五聚体重复特异性模板与ccr5等位基因总数的比率产生每100万个pbmc的五聚体重复。该测定的灵敏度为每105个总ccr5等位基因有一个ccr5基因编辑的等位基因。通过将五聚体复制基因编辑细胞的频率乘以4来估计pbmc中ccr5基因编辑细胞的频率。
[0205]
使用cel-i定量sb-728-t产品中的ccr5基因修饰
[0206]
cel-i核酸酶在由双螺旋dna结构中的凸起或错配产生的扭曲位点特异性切割dna双链体。我们已经调整了使用这种酶来定量通常由zfn介导的基因修饰引起的次要插入缺失的方案。简而言之，对目标基因组区域(ccr5)进行pcr扩增，使pcr产物变性，然后实现重新退火以允许野生型和非同源末端连接编辑的等位基因重新退火在一起并产生异源双链体。然后用cel-i核酸酶消化重新退火的pcr产物，以在错配位点切割pcr扩增的dna。随后，zfn介导的基因修饰水平可以通过确定未切割的亲本片段与两个较低迁移切割产物的比率来定量。
[0207]
通过二代测序/miseq定量ccr5基因修饰
[0208]
从基因组dna pcr扩增目标基因座(ccr5中的zfn结合位点)，并通过在illumina miseq测序仪上的配对末端深度测序确定每个基因座的修饰水平。配对序列通过seqprep(john st.john，https://github.com/jstjohn/seqprep，未公开)合并。在目标扩增子基因组区和获得的illumina序列之间进行needleman-wunsch比对以映射插入缺失。在sb-728-t
产品(n＝9)和第3-4年样品(n＝8)中来自sb-728-0902参与者以及sb-728-t产品(n＝7)及第6周和第22周样品(n＝7)中来自sb-728-1101队列3-5的参与者的分选cd4 t细胞亚群进行ccr5测序。ccr5基因编辑的记忆亚群细胞计数通过将每个记忆亚群细胞计数乘以ccr5基因编辑的等位基因在每个记忆亚群中的频率进行估计，如通过ccr5测序确定。
[0209]
sb-728-t输注后ccr5基因编辑的cd45ra
int
rc
in
t t
scm
的细胞追踪
[0210]
分选的cd4 t细胞亚群中ccr5 zfn介导的突变的测序用于追踪输注后cd45ra
int
rc
in
t t
scm
细胞的分化。首先，野生型ccr5扩增子)和仅在1个测序样品中检测到的序列从进一步分析排除(-80％的独特ccr5序列)。然后，对于每个供体，我们鉴定了仅在sb-728-t产品中的cd45ra
int
rc
in
t t
scm
细胞中表达的序列，然后分析第3-4年样品(sb-728-0902)或第6和22周样品在cd4 t细胞记忆亚群中的分布(sb-728-1101)。
[0211]
sb-728-t输注后的扩增估计
[0212]
在参与者中持续存在的ccr5基因编辑的等位基因的水平相对于输注的ccr5基因编辑的细胞的量可以使用通过五聚体重复标记和cd4 细胞计数的ccr5修饰的测量值和假设进行估计；1)血液体积为4.7升，2)约2.5％的cd4 t细胞位于外周
49
和3)sb-728-t产品分布与内源性cd4 t细胞相似(来自乙状结肠和腹股沟淋巴结的cd4 t细胞中的ccr5修饰水平与外周类似，图8e)。
[0213][0214]
sb-728-t产品、基线和sb-728-t输注后样品中的细胞表型分析
[0215]
在用2％fa(sigma aldrich)在22℃下固定15 min之前，使用用t
scm panel或负调节panel在4℃下染色30分钟的100万个解冻的pbmc表面进行cd4 和cd8 亚群上的共抑制受体的分析和评价。两个panel均包括cd3 alexa 700(克隆ucht1)(bd biosciences)、cd4 qdot 605(克隆s3.5)(invitrogen)、cd27 apce780(克隆0323)(ebioscience)、cd8 percp(克隆ski)、cd45rabv650(克隆hi100))、cd45ro percpe710(克隆uchl1)(biolegend)和水性荧光活性染料(死细胞标志物)(invitrogen)。t
scm panel包括cd95 pe-cy7(克隆dx2)、cd58 pe(克隆1c3)、cd127 bv421(克隆hil-7r-m21)、cd28 apc(克隆cd28.2)、cd14 v500(克隆m5e2)(bd biosciences)、cd19 bv510(克隆h1b19)(biolegend)和ccr7 fitc(克隆150503)(研发)。负调节panel包括ccr7 pe-cf594(克隆150503)、ctla-4 apc(克隆bni3)、cd31 pe(克隆wm59)(bd biosciences)、tim-3 bv421(克隆f38-2e2)、pd-1 pe-cy7(克隆eh12.2h7)(biolegend)和lag-3 fitc(克隆17b4)(novus biologicals)。使用bd lsr-ii在24小时内采集至少100,000个活细胞，并使用flow jo版本9进行分析。
[0216]
细胞分选
[0217]
为了定量五聚体复制标记和cd4 t细胞亚群内整合dna的水平，首先通过负磁选(stemcell)从pbmc中分离cd4 t细胞，然后用以下进行表面染色：cd3 alexa 700(克隆ucht1)、cd95 pe-cy7(克隆dx2)、cd58 pe(克隆1c3)、cd127 bv421(克隆hil-7r-m21)、cd28 apc(克隆cd28.2)、cd14 v500(克隆m5e2)(all bd biosciences)、cd4 qdot 605(克隆s3.5)(invitrogen)、cd27 apce780(克隆0323)(ebioscience)、cd8 percp(克隆ski)、
cd45rabv 650(克隆hi100)、cd45ro percpe710(克隆uchl1)、cd19 bv 510(克隆h1b19)(biolegend)、ccr7 fitc(克隆150503)(r&d)和水性荧光活性染料(invitrogen)。然后用facs aria(becton dickinson)分选至多200,000个总cd4 t细胞以及cd4 t细胞亚群，并在-80℃下以干燥沉淀物储存，直至分析。对于免疫亚群的基因阵列分析，将10,000个分选细胞直接采集到不含rnase的1.5ml eppendorf管中，该管含有500μl的含1％β-巯基乙醇的rlt缓冲液，并储存在-80℃下直至分析。
[0218]
pbmc中的hiv dna、总cd4 t细胞亚群和分选的cd4 t细胞亚群
[0219]
通过液滴数字聚合酶链式反应测量pbmc中的总hiv dna。简而言之，使用市售试剂盒(masterpure dna纯化试剂盒,epicenter,madison,wi)从pbmc中提取基因组dna(gdna)。2μg的gdna用限制性内切酶ddei在37℃下消化1小时。根据生产商的建议制备pcr液滴。简而言之，通过将250或500ng消化的gdna与ddpcr
tm
2x master mix和两个taqman引物/探针集混合来制备20μl多重pcr混合物。使用qx-100液滴发生器在dg8
tm
试剂盒中产生pcr液滴，其中每份20μl pcr混合物被分成约15,000纳升量的液滴。pcr液滴被转移到96孔pcr板中并用箔密封。使用bio-rad cl000热循环仪(95℃(60秒)，40个循环的94℃(30秒)/60℃(60秒)，98℃(600秒)进行标准pcr。使用qx-100液滴梳子pcr系统(bio-rad,hercules,ca)评价hiv dna拷贝数。测定hiv gag和rpp30的pcr阳性和pcr阴性液滴，并通过泊松分析计算模板浓度。通过将hiv gag浓度归一化为rpp30浓度来确定hiv拷贝数。如前所述，在来自基线sb-728-0902参与者的纯化cd4 t细胞中、在sb-728-t产品第2-3年样品(n＝9)中以及在sb-728-t产品中分选的cd4 t细胞亚群中和第3-4年样品(n＝8)中测量整合dna728-t产品。还在基线、第2-6周和第14-22周样品(n＝8)中的sb-728-1101队列3-5参与者中测量纯化的cd4 t细胞以及分选的cd4 t细胞亚群中的整合dna。
[0220]
hiv趋向性测定
[0221]
使用商业dna测定法(monogram biosciences/labcorp,south san francisco,ca)评价hiv趋向性。从pbmc中提取病毒包膜dna序列。使用基于细胞的转导测定确定hiv趋向性，其中从pbmc样品中扩增hiv env蛋白序列，亚克隆为文库，包装到慢病毒载体中，并使用辅助受体限制细胞系进行评价。
[0222]
细胞内细胞因子染色
[0223]
解冻的pbmc静置12小时，然后分别用布雷非德菌素a(5μg/ml)(sigma aldrich)和gag肽(1μg/肽/ml；nih aids试剂程序)、葡萄球菌肠毒素b(seb；1μg/ml)或完全培养基(空白对照)6小时刺激200万个细胞。然后用以下对细胞进行表面染色：cd3 alexa 700(克隆ucht1)、cd8 pacific blue(克隆rpa-t8)、ccr7 pe-cf594(克隆150503)、cd14 v500(克隆m5e2)(bd biosciences)、cd4 qdot 605(克隆s3.5)、cd27 apce780(克隆0323)(invitrogen)、cd45ra bv 650(克隆hi100)、cd19 bv 510(克隆h1b19)(biolegend)和水性荧光活性染料(invitrogen)，用0.05％皂苷透化并用il-2percp-cy5.5(克隆mq1-17h12)、ifnγapc(克隆b27)和tnfαalexa fluor 488(克隆mab11)(bd biosciences)进行细胞内染色，然后用2％甲醛固定。使用bd lsr-ii在24小时内获取细胞。至少获取500,000个活事件。使用flowjo版本9分析细胞，并使用boolean门控函数确定多功能cd8 t亚群的分布。
[0224]
t细胞受体(tcr)库
[0225]
使用immunoseq测定(adaptive biotechnologies，seattle，wa)进行tcr库分析。
immunoseq方法通过多重pcr扩增重排的tcr cdr3序列，以从分离的基因组dna中探索所有vβ和jβ组合，并使用高通量测序技术对tcr cdr3链进行测序，以确定每个样品中各种t细胞克隆的组成。tcr多样性使用香农熵指数进行评估，该指数说明了每个样品中存在的tcr vβcdr3序列的唯一克隆数(丰富度)和克隆分布(均匀度)。较大的香农熵指数反映了tcr vβcdr3序列的更多样化分布。
[0226]
基因微阵列和分析
[0227]
选择的cd4 或cd8 亚群被分选到如上所述的rlt缓冲液中。具体地，在基线和第12个月对cd4 t
cm
、cd4 t
tm
、cd4 t
em
和cd8 总记忆细胞进行分选。此外，cd4 记忆亚群还在第3-4年进行分选，包括cd45ra
int
ro
int t
scm
、t
cm
和t
em
细胞。根据生产商的说明(qiagen，valencia，ca)裂解分选的细胞以提取rna。进行t7 oligo(dt)引发的逆转录反应，然后进行体外转录。这些产物经过第二轮扩增(life technologies的messageamp ii arna扩增试剂盒)产生生物素标记的arna，根据生产商的说明与illumina human ht-12版本4表达beadchip杂交并使用illumina iscan系统进行定量。
[0228]
使用来自bioconductor的r统计语言和微阵列数据线性模型(limma)统计软件包进行基因阵列输出数据的分析。简而言之，检查扫描的阵列图像是否有伪影和芯片内的异常信号分布，并从分析中删除具有低整体强度或可变性的阵列。诊断图，例如密度图、箱线图和阵列间距离的热图，用于评估芯片间的杂交质量。在使用分位数归一化方法进行归一化之前，对强度进行log2转换。未映射至带注释的refseq基因的探针和对照探针被移除。与基线相比，在第12个月对cd4 t
cm
(n＝6)、cd4 t
tm
(n＝9)、cd4 t
em
(n＝7)和cd8 总记忆细胞(n＝9)进行差异表达基因分析，并且与第3-4年的cd4 t
cm
和t
em
亚群(n＝7)相比，对cd4 cd45ra
int
ro
int t
scm
进行差异表达基因分析。通过进行纵向供体配对分析来确定不同时间点或亚群之间基因表达水平的差异。在limma包中实施的缓和t检验用于评估基线和月数之间基因差异表达的统计显著性(p《0.05)。所有微阵列数据均以登录号gse66214保存在geo。
[0229]
我们使用基因集富集分析(gsea)来鉴定输注后在t记忆细胞中调节的富集生物途径(图4)。gsea是用于确定特定基因集的成员是否优先出现在秩排序的基因列表的顶部或底部的统计方法，其中基因根据它们与目标结局的关联强度进行排序。更具体地，gsea计算富集评分(nes)，它反映了一组基因在不同表达的基因中过度代表的程度。观察到的nes的显著性通过排列测试获得：利用基因列表来确定观察到的nes偶然发生的频率。执行前沿分析以检查基因组中对富集贡献最大的特定基因。我们使用gsea的预排序基因列表选项并测试msigdb(http://software.broadinstitute.org/gsea/msigdb/)策划基因集以及自定义基因集的富集，以测试treg和我们数据中的stat3途径。我们弃去错误发现率(fdr)》25％和标示p值》0.05的基因组。
[0230]
我们使用如上所述的gsea和fisher组合检验方法来识别在cd4 cd45ra
int
ro
int t
scm
相比于cd4 t
cm
以及cd4 cd45ra
int
ro
int t
scm
相比于cd4 t
em
比较中富集的途径。与t
em
和t
cm
相比，cd45ra
int
ro
int t
scm
中诱导或抑制的基因显著富集的选定途径被分为几个生物学功能；细胞周期、细胞代谢、细胞因子信号传导、notch信号传导和凋亡(图4a)。
[0231]
我们使用圆形图表示与cd4 t
cm
、t
em
和t
tm
以及cd8 总记忆亚群的基线相比在第12个月时增加或减少的顶部富集途径(图4b，c)。为了评估输注后12个月cd4 记忆t细胞亚群的基因表达谱是否与免疫应答者(ir)的谱相似，我们对一个独立队列的hiv感染ir(n＝20；
cd4 计数》500个细胞/μl)和免疫无应答者(inr；n＝21；cd4 计数《350个细胞/μl)参与者进行了gsea分析(克利夫兰免疫失败-clif-队列)。与inr相比，在sb-728-t产品输注后第12个月在cd4 记忆t细胞中上调的所有途径(5/5)在ir中富集(图4e，f)；这些途径与活跃代谢(myc、ox/phos)和增殖(dna修复)有关。
[0232]
为了研究与基线相比，sb-728-t产品在第12个月时对cd4 t
cm
和cd8 总记忆细胞中炎症和免疫活化的影响，我们首先使用上述limma方法进行纵向供体配对分析。如果概率p低于0.05，则认为基因在基线和第12个月之间存在差异表达。使用干扰素数据库(http://interferome.its.monash.edu.au/interferome/home.jspx)识别由i型干扰素(ifn i)诱导的差异表达基因。从每个比较中选择选定的基因(与基线相比在第12个月上调或下调)并提交至genemania网络服务器(//www.genemania.org/)以使用共表达相互作用类别生成基因相互作用网络。
[0233]
我们使用线性回归分析来识别第3-4年样品中由cd45ra
int
ro
int t
scm
表达的基因，这些基因与第2-4年每106个pbmc的总hiv dna拷贝频率和第3-4年cd45ra
int
ro
int t
scm
计数相关。我们在cd45ra
int
ro
int t
scm
中的基因表达和这些结果的水平之间拟合线性模型(使用r语言)作为连续变量，并使用gsea将途径与两个读数正或负相关联。我们表示了以类似方式调节的途径以及在图4g中以不同方向调节的通路。我们强调了与hiv库大小呈正相关的主要途径，如第2-4年的总hiv dna测量，以及通过绘制它们的归一化富集评分与第3-4年的cd45ra
int
ro
int t
scm
计数呈负相关(图4h，i)。该分析在7名参与者中的6名中进行；参与者1-02，在输注后cd45ra
int
ro
int t
scm
细胞的植入量较低，由于在我们的探索性分析中被确定为异常值，因此从分析中删除。
[0234]
统计分析
[0235]
hiv库分析
[0236]
使用具有随机截距的混合效应线性回归模型对输注后hiv库的总体衰减(测量为每106个pbmc的总hiv dna)随时间(以天计)建模在r包lme4中的函数lmer中实现。与模型相关的p值使用r的multicomp包中实现的cftest函数估计。
[0237]
为了分析每个个体的hiv库的衰减，针对每个个体拟合每106个pbmc的总hiv dna频率随时间的变化，使用graphpad prism v7.0软件进行线性回归模型。计算p值和回归系数(图2a)。参与者1-01和1-02的缺失基线值通过模型拟合截距计算。
[0238]
临床数据、ccr5修饰和流式细胞术
[0239]
配对wilcoxon秩和双尾检验用于与基线相比，对cd4 总t细胞和亚群计数的输注后变化、cd4:cd8比率、t细胞功能、免疫检查点阻滞剂和整合hiv dna进行非参数供体配对双侧分析。wilcoxon秩和双尾检验还用于比较亚群之间ccr5基因编辑等位基因的水平，并比较sb-738-t产品和长期时间点之间tcr库和ccr5基因编辑等位基因的多样性。mann-whitney双尾检验用于在匹配参与者的数量随时间点变化并且在给定时间点包含少于6个匹配对的情况下执行非配对非参数双侧比较，例如输注后cd95 细胞与基线相比的频率，以及sb-728-0902研究(五聚体复制和ccr5 dna测序)中不同cd4 记忆亚群之间的ccr5基因编辑等位基因水平。spearman’s rho(p)检验用于在各种测量和临床结局之间进行非参数相关分析，包括delta cd4 t细胞计数(sb-728-0902)、使用末个测量值(第2-4年时间点)与基线(sb-728-0902)之比计算的库大小变化和对照病毒复制(sb-728-1101)。我们通过使用
benjamini和hochberg的原始fdr方法计算fdr值来控制多重比较检验。p值《0.05和q值《0.25被认为具有显著性。这些统计分析使用graphpad prism v7.0进行。
[0240]
在sb-728-0902中输注sb-728-t产品后总hiv dna衰减的统计分析
[0241]
为了描述在六名参与者中观察到的输注后hiv dna衰减，使用monolix版本2016r1(http://lixoft.com/products/monolix/)(由marc lavielle开发并在matlab中实现的统计软件包，它使用非线性混合效应模型方法估计参数)进行统计分析。使用个体方法和群体方法(将所有六名患者汇总在一起)使用以下等式估计双相指数衰减，y＝a bl*exp(-rl*timr) b2*exp(-r2*time)(等式1)。monolix使用monte carlo markov链(mcmc)迭代算法实现期望最大化算法的随机近似。mcmc迭代方法使用metropolis-hastings方法。为了进行拟合，我们考虑了每个双相衰减模型方程的不同分布。两个衰减率r1和r2按照对数正态分布估计，取值在(0,1)之间。使用对数正态分布估计慢速和快速截距参数bl和b2以及平台参数a，仅取正值。为了确保模型收敛，在模拟步骤中使用2000monte carlo迭代。对于相同的双相衰减函数，还使用非线性最小二乘估计方法(r中的nlslm包)确认monolix个体拟合的形状。
[0242]
为了估计hiv dna的快相和慢相各自开始占主导地位的时间，我们使用以下等式绘制了与每个快相和慢相相关的斜率：
[0243]
斜率_快＝(a bl b2)*exp(-r*时间)
ꢀꢀ
(等式2)
[0244]
斜率_慢＝(a b2)*exp(-r2*时间)
ꢀꢀ
(等式3)
[0245]
两个斜率之间的交点(等式2和3)是慢相开始支配快衰减相的时间。类似地，慢相(等式3)和平台线之间的交点表明了慢衰期结束和hiv dna达到平台估计的新频率水平的时间。使用matlab.2016对六名患者中的每一名进行计算。
[0246]
类似地，为了估计快相和慢相对总hiv dna衰减的百分比贡献，我们使用了以下等式：
[0247]
百分比_快:y0＝a bl b2(t＝0天时的hiv dna拷贝)
[0248]
百分比_慢:
[0249]
模型选择和诊断
[0250]
与群体方法结果相比，个体方法产生更好的拟合。为了评价每个r和monolix拟合之间的差异，以及个体与群体拟合结果，使用akiake信息准则(aic)和贝叶斯信息准则(bic)。具有较小的aic和bic表示最简约的模型，使用monolix中的个体方法可以更好地实现。
[0251]
cd4 t细胞动力学的数学模型
[0252]
为了研究ccr5基因编辑的记忆cd4 t细胞的持久性，我们开发了描述记忆cd4 t细胞群的动态的数学模型。我们将记忆cd4 t细胞分为两个群，ccr5基因编辑和非编辑记忆cd4 t细胞。该模型考虑了初始细胞(n)、干细胞记忆cd45ra
int
ro
int
(tscm2,tscm2
ge
)、干细胞记忆cd45ra (tscm1,tscm1
ge
)、中枢记忆(cm,cm
ge
)、过渡记忆(tm,tm
ge
)和效应记忆(em,em
ge
)，其中ge下标是指ccr5基因编辑的cd4 t细胞。描述该系统的微分等式是：
[0253]
[0254][0255][0256][0257][0258][0259][0260][0261][0262][0263][0264]
使用monolix r2018中的个体拟合方法，我们将进行延长ati中断期(第6周-第12个月)的5名患者的ccr5基因编辑和非基因编辑的cd4 t细胞记忆亚群数据计数拟合至ode模型。鉴于样品量小，我们采用个体拟合程序来参数化模型参数，如上一节所述(sb-728-0902中输注sb-728-t产品后总hiv dna衰减的统计分析)。对于所有模型参数，我们假设对数正态分布，仅取正值。
[0265]
全局灵敏度分析
[0266]
为了确定最能影响细胞群大小的参数，我们使用latin hypercube抽样(lhs)和偏秩相关系数(prcc)测量模型参数和模型输出之间的线性关联进行灵敏度分析测试。该测试允许同时研究多个参数和模型输出之间的灵敏度。鉴于参数分布的不确定性，我们使用均匀分布来改变模型参数，其中最大值和最小值取自针对每名受试者获得的5个单独拟合。确认模型参数和输出之间的单调性关系。为了确保准确度，prcc值在matlab中使用100,000个bin获得。
[0267]
估计sb-728-0902中输注的细胞稀释导致hiv dna衰减
[0268]
sb-728-0902研究的参与者在输注后由于被输注的细胞量稀释而导致的hiv dna衰减可以使用五聚体复制标记的ccr5基因修饰和使用cel-i核酸酶的sb-728-t产品中ccr5基因修饰的测量值进行估计，假设；1)一个基因编辑的等位基因代表一个基因编辑的细胞，2)来自sb-728-t产品的cd4 t细胞不含带有hiv dna的细胞，以及3)未编辑的细胞在输注后与ccr5基因编辑的细胞类似地持续存在(参与者仍接受art)。
[0269]
pbmc中ccr5基因编辑细胞的估计频率＝每个时间点每106个pbmc的五聚体重复频率*4/1000
[0270]
估计的pbmc中输注细胞的频率＝每个时间点pbmc中ccr5基因编辑细胞的频率*
(100/sb-728-t产品中ccr5基因编辑细胞的频率，由cel-1核酸酶确定)
[0271]
估计的由于输注细胞导致的hiv dna衰减＝具有hiv dna的细胞的基线频率*每个时间点的pbmc中输注细胞的频率/100
[0272]
估计的由输注细胞引起的hiv dna频率＝具有hiv dna的细胞的基线频率-每个时间点由于输注细胞引起的hiv dna估计衰减
[0273]
异常值
[0274]
参与者1-02具有升高的抗腺病毒滴度，这可能阻碍ccr5基因编辑细胞的植入水平和cd45ra
int
ro
int t
scm
细胞(基因编辑细胞中高度富集的群体)的持久性(sb-728-t产品来源于用编码ccr5靶向zfn的重组ad5/f35腺病毒载体转导)，因此被从选择性分析排除，该分析侧重于将ccr5基因编辑细胞和cd45ra
int
ro
int
t
scm
亚群的扩增与hiv库衰减相关联(例如在图1c-d、图2d-e和图3g-i中)。
[0275]
结果
[0276]
单次sb-728-t输注导致hiv库大小持续减少，这与ccr5基因编辑细胞的扩增和持久性相关
[0277]
临床研究sb-728-0902评价了9名接受长期art的hiv感染成人，他们未能使cd4 t细胞计数增加至高于500个细胞/μl的水平。在基线时，参与者已接受7至22年的有效art，平均cd4 t细胞计数为363细胞/μl。cd4 t细胞计数与基线访视时整合hiv dna(此处称为hiv库)水平呈负相关(p＝0.017)。所有参与者均接受单次zfn介导的ccr5基因编辑的cd4 t细胞的输注。
[0278]
如预期，在输注后7天内，外周cd4 t细胞计数(和cd4:cd8比率)增加(见在线讨论；图10a、10b)。值得注意的是，这种增加是持续的，在纵向观察期间，cd4 t细胞计数保持显著高于基线3-4年(p＝0.024)(图10a)。ccr5基因编辑细胞的扩增在输注后7-21天达到峰值(在21天扩增中位值为2.4倍；图10c)，并且与cd4 t细胞计数增加有关。在pbmc中检测到ccr5基因编辑的cd4 t细胞长达4年(平均为0.8％标记的pbmc，平均为2.7％标记的cd4 t细胞)，在直肠活检和淋巴结中检测到长达12个月(最后测量的时间点(图10d、10e)。
[0279]
我们接下来确定在sb-728-t输注后cd4 t细胞计数的恢复是否导致含有hiv dna的循环细胞的频率降低。我们观察到输注后两年总hiv dna水平与基线相比显著下降(p＝0.0195；平均衰减为-0.91log10，95％置信区间(ci)-1.71至-0.11)(图2a)。此外，在输注后还观察到具有整合dna的cd4 t细胞频率显著衰减(图2b)。早期(21天)和长期时间点(～3-4年)较高水平的ccr5基因编辑细胞扩增与hiv dna水平的持续降低相关(分别为r2＝0.62,p＝0.0014和r2＝0.91,0.0003)(图2c和2d)。这些结果强烈表明，输注的cd4 t细胞的持续存在对hiv库大小的衰减有影响。
[0280]
有意思的是，来自sb-728-t产品的cd4 t细胞显示出比基线的cd4 t细胞显著更低的潜伏感染细胞频率(p＝0.004，图16a)。使用两相衰减模型来确定具有低水平整合hiv dna的输注细胞的持续存在是否仅通过在输注细胞的峰值增殖期间通过稀释导致hiv库衰减。hiv dna衰减的斜率在输注的前1-15天内最大，在此期间观察到平均30.47％(95％ci，9.664-51.28)的下降。之后，hiv dna水平继续以较慢的速度下降，半衰期为211天(95％ci；56-365)。这种较慢的衰减阶段占hiv dna减少的大部分(平均下降的69.5％)(图2e)。随后计算每个时间点由于稀释而具有hiv dna的细胞的估计频率(图2f)。我们发现，约100天后，
观察到的具有hiv dna的细胞频率低于单独稀释估计的频率，这表明单独稀释不能解释hiv感染细胞频率的长期下降。我们的分析表明，输注细胞的持久性通过可能包括恢复t细胞稳态和/或未感染细胞补充cd4 t细胞池的机制导致hiv衰减。
[0281]
新型记忆干细胞样cd4 t细胞亚群有助于恢复t细胞稳态并与库衰减相关
[0282]
为了研究导致cd4 t细胞重构的机制，进行输注后cd4 t细胞亚群分布的纵向分析。我们的研究显示了表达中间水平cd45ra和cd45ro(称为“cd45ra
int
ro
int”)的t细胞的特异性增加(图3a)。cd45ra
int
ro
int
细胞存在于sb-728-t产品中，在ccr5基因编辑的等位基因中高度富集，并且在输注后分析的每个时间点绝对数量显著增加。重要的是，输注后cd45ra
int
ro
int
细胞计数的变化，而不是其他记忆亚群的变化，与cd4 t细胞计数的长期增加显著相关(表1)。cd95 cd58 细胞的频率(在cd45ra
int
ro
int
和cd45ra

ro-亚群内在t
scm
中表达的标记物与ccr5基因编辑的细胞的扩增呈正相关)。五聚体重复标记(ccr5基因编辑细胞的序列标签)的水平在cd45ra
int
ro
int cd95 细胞(称为cd45ra
int
ro
int t
scm
)和cd45ra

ro-cd95 细胞(称为cd45ra

t
scm
)中特异性富集，在第3-4年时，与种属记忆(t
cm
)或过渡记忆(t
tm
)细胞相比，cd45ra
int
ro
int t
scm
中水平分别高约14倍和21倍(图3b)。基因编辑驱动的ccr5 dna突变的测序证实了ccr5基因编辑的等位基因在cd45ra
int
ro
int t
scm
中的长期富集(范围为14.4％至37.7％，相比于t
cm
中为2.5％至16.7％，t
tm
中为1％至16.7％，以及t
em
中为0.7％至2.59％)。值得注意的是，这些突变的多样性在sb-728-t产品和第3-4年时间点样品之间的cd45ra
int
ro
int t
scm
中没有变化，这表明这些细胞很可能代表了有助于长期多克隆的长期存活的记忆亚群ccr5基因编辑细胞的持久性。此外，在第3-4年时间点，cd45ra
int
ro
int t
scm
的持久性而非cd45ra
int
ro
int cd95或cd45ra

t
scm
细胞的持久性与总cd4 t细胞计数的增加显著相关(表1)。总之，这些结果表明sb-728-t的输注导致新型t
scm
样亚群，该亚群与ccr5基因突变的长期持续性和cd4 t细胞的重建有关。
[0283]
表1-早期(第14天)、中期(第4-7个月)、晚期(第11-12个月)和长期时间点(第3-4年)循环cd4 t细胞亚群(delta细胞计数)的增加与在相同时间点免疫重建(delta cd4 计数)相关。
[0284][0285]
t
cm
细胞定义为cd45ra-、cd45ro 、ccr97 和cd27
[0286]
t
tm
细胞定义为cd45ra-、cd45ro 、ccr79-和cd27
[0287]
cd45raintroint t
scm
定义为cd45raint、cd495roint、ccr7 、cd27 、cd127 、cd28 、cd58 和cd95结果仅显示具有p《0.05和错误发现率(fdr)《0.25的显著相关性
[0288]
在输注后3-4年，短期存活的记忆细胞(例如t
em
)中存在ccr5基因突变(图3b)表明长期存在的记忆细胞(例如t
scm
和t
cm
)内的ccr5基因编辑的细胞正在分化为tem导致在输注后长达3-4年保持一小部分ccr5基因编辑的t
em
细胞。为了研究cd45ra
int
ro
int t
scm
对hiv宿主衰减的作用，我们首先定量sb-728-t产品和cd4 t细胞亚群中第3-4年样品中整合hiv dna的水平，发现与其他记忆亚群相比，cd45ra
int
ro
int t
scm
细胞的整合hiv dna水平显著降低(在第3-4年cd45ra
int
ro
int t
scm
中1.99log10,95％ci:1.64-2.34vs.t
cm
中2.8log10,95％ci；2.48-3.13p＝0.016,t
tm
中2.79log10 95％ci:2.31-3.28p＝0.016,t
em
中2.87log10 95％ci:2.28-3.45p＝0.023)。此外，在第3-4年的样品中，仅5.3％的cd45ra
int
ro
int t
scm
细胞对cd4 t细胞hiv库有贡献，(图3c)而其他记忆亚群对具有hiv总dna的细胞池贡献显著更高频率的细胞[t
cm
为45.5％(p＝0.0078)，t
tm
为16.5％(p＝0.0156)，t
em
为29.6％(p＝0.0156)]。
[0289]
将具有低水平整合的hiv dna的cd45ra
int
ro
int t
scm
细胞分化为其他记忆亚群可以提供hiv库在总cd4 t细胞中衰减的基础的机制。为了研究这一点，建立稀疏线性多变量模型来预测输注后含有总hiv dna的pbmc频率的变化，其中包括cd45ra
int
ro
int t
scm
细胞计数，cd45ra
int
ro
int t
scm
细胞中五聚体重复的频率以及cd45ra
int
ro
int t
scm
和t
em
之间共享突变的数量作为可能的独立变量。我们的分析表明，在第3-4年较高的cd45ra
int
ro
int t
scm
细胞计数(p＝0.0018)、在第3-4年较高的cd45ra
int
ro
int t
scm
中的五聚体重复频率(p＝0.005)和第3-4年cd45ra
int
ro
int t
scm
中五聚体重复频率与t
em
中五聚体重复频率的比率较低(p＝0.0014)最佳预测输注后hiv库中更大的衰减(校正r2＝0.99，f检验：p＝0.0008；图3d)。这些结果表明，cd45ra
int
ro
int t
scm
细胞计数的长期持续性和t
em
群体中ccr5基因编辑细胞亚群的保持对于减少hiv库很重要，并表明cd45ra
int
ro
int t
scm
细胞可以分化成并补充具有可检测比例的细胞携带ccr5基因编辑的等位基因的更多分化的记忆细胞池，其可以抵抗感染。
[0290]
cd45ra
int
ro
int t
scm
表达与静止和自我更新相关的基因并且可以分化成其他记忆亚群
[0291]
我们的结果表明cd45ra
int
ro
int t
scm
的持久性及其对长期cd4 t细胞重建的影响表明这些细胞表达赋予长期持久性的基因和途径。对输注后3-4年的样品进行分选的cd4 t细胞亚群的转录分析。基因表达方差的多维尺度显示，cd45ra
int
ro
int t
scm
与t
cm
和t
em
之间的差异比cd45ra t
scm
更大。此外，在将cd45ra t
scm
与t
em
进行比较时，发现比t
cm
和cd45ra t
scm
更多的差异表达基因(deg)(5022vs.2943，vs.2136)。基因集富集分析(gsea)表明cd45ra
int
ro
int t
scm
细胞富含与静止相关的基因(例如notch信号传导途径、wnt介导的未分化hsc保持所必需的)和有助于细胞持久性的代谢途径，例如脂肪酸氧化、氧化磷酸化和丙酮酸代谢。与细胞凋亡相关的基因，与t
cm
和t
em
相比，效应子功能、细胞周期和jak-stat信号传导均被下调(图4a)，这表明cd45ra
int
ro
int t
scm
细胞比其他记忆亚群更静止。
[0292]
为了评估cd45ra
int
ro
int t
scm
分化成其他记忆亚群的能力，我们对分选的cd4 t细胞亚群中的ccr5 zfn介导的突变进行测序，并识别sb-728-t产品中cd45ra
int
ro
int t
scm
细胞特有的序列(n＝3,881)。输注后3-4年在各种cd4 t细胞记忆亚群中对这些序列的分布分析(图4b)表明，在所有记忆t细胞亚群(包括短期存活的t
em
)中检测到cd45ra
int
ro
int t
scm
独特突变(0.49％(95％ci：0％-1.36％)。这些结果表明cd45ra
int
ro
int t
scm
细胞可以分化成并补
充更多分化的记忆细胞池。为了进一步表征cd45ra
int
ro
int t
scm
与其他记忆亚群相比的分化状态，我们通过流式细胞术研究了它们在用抗cd3/28包被的珠粒(图4c)、seb或pma/离子霉素刺激后的多功能反应。我们的分析表明，cd4 cd45ra
int
ro
int t
scm
细胞的分化程度低于t
cm
、t
tm
和t
em
。通过分析与th1(t-bet和eomes)、th2(gata-3)和thl7(rorgt)谱系定型相关的转录因子的表达水平，证实了cd45ra
int
ro
int t
scm
细胞的未分化状态。与初始细胞和cd45ra t
scm
相似，cd45ra
int
ro
int t
scm
细胞不表达th特异性转录因子(图3d)。对免疫检查点标志物的进一步分析表明，cd45ra
int
ro
int cd95 细胞的pd-1、tigit和slam水平显著低于t
tm
和t
em
，这表明cd45ra
int
ro
int cd95 细胞比其他记忆亚群更少耗竭(图28b)。总之，这些结果表明cd45ra
int
ro
int t
scm
表现出干细胞特性，包括长期存活和多能性，并且是比t
cm
、t
em
和t
em
记忆细胞分化程度更高的前体。
[0293]
我们接下来比较了cd45ra
int
ro
int t
scm
和cd45ra t
scm
细胞的转录组，以研究基因表达的差异，特别是参与自我更新的途径的差异，包括wnt信号传导级联(图4f)-参与保持t细胞的“干细胞样”表型的途径。基因表达方差的多维尺度显示，先前表征的cd45ra

cd95

t记忆干细胞(t
scm
)在转录上与本研究中描述的cd45ra
int
ro
int t
scm
群不同(图4e)。仔细观察这些基因组的组合前沿基因揭示了几个基因表达的上调，这些基因对保持严格度至关重要。这些包括wnt因子及其受体(卷曲蛋白-fzd)-如上所述，已知它们启动干细胞保持级联反应(图4g)。这与下游信号传导级联相结合，其中包括dvl、β-连环蛋白和tcf7-已知可防止效应t细胞分化的基因。还观察到由sox基因上调定义的进一步严格下游机制(图4g)。有意思的是，与cd45ra

t
scm
对应物相比，cd45ra
int
ro
int t
scm
富含促炎(mapk、jun、nfat)和凋亡(pss)基因组(图4g)。该亚群中促炎特征的增强可能表明它们分化成更多“效应子”样细胞的能力增加。有意思的是，与wnt信号传导级联相关的组合前沿基因与cd4 t细胞计数的长期增加呈正相关，与输注后hiv库的减少呈负相关。
[0294]
总之，这些结果证实了cd45ra
int
ro
int t
scm
表型的细胞构成了具有长期存活和未分化记忆细胞特征的新型独特的t
scm
亚群。
[0295]
ccr5基因编辑的cd45ra
int
ro
int t
scm
的频率与在sb-728-t输注后6周接受治疗中断的参与者的病毒载量控制相关
[0296]
我们接下来评估了在停止art治疗后输注ccr5基因编辑的cd4 t细胞(包括cd45ra
int
ro
int t
scm
)对控制病毒血症的影响。我们分析了来自独立临床试验(sb-728-1101研究；n＝15；5个队列；见材料和方法)的样品，其中参与者在sb-728-t输注后六周接受分析治疗中断(ati)产品。病毒载量水平分析显示，ati期间(第22周)的病毒载量显著低于其历史上的art前病毒载量设定点(p＝0.0067)(图5a)，表明输注sb-728-t产品可能导致大多数参与者暂时但不完全控制病毒血症。ati在第22周时显示病毒载量测量值低于10,000拷贝/ml和cd4 t细胞计数高于500个细胞/μl的6名个体中进行扩展，然后他们进行ati持续0.5-2年。5名参与者在第12个月时的病毒载量范围为130至16,000拷贝/ml。其中一名个体(01-060)具有保护性人类白细胞抗原(hla)等位基因；hla-b57。
[0297]
巧合的是，与历史上的art前病毒载量设定点相比，第22周病毒载量的更大减少与峰值细胞扩增时cd4 t细胞计数的更大变化(图5b)和在ati(第6周)之前更高频率的ccr5基因编辑的等位基因显著相关(图5c)。这些结果强调了在sb-728-t输注后ccr5基因编辑细胞的扩增与病毒载量控制之间的关联，表明t
scm
亚群的作用，显示在1101试验中也富含ccr5基
因突变(图5d，e)，在ati后减少病毒载量。病毒载量控制与cd4 t细胞亚群计数之间的相关性分析表明，在ati(第6周)之前，仅较高的cd45ra
int
ro
int t
scm
和cd45ra

ro-t
scm
细胞计数(特别是ccr5基因编辑的t
scm
细胞计数)与第22周的病毒载量与历史病毒载量设定点相比更大的减少相关(图5f，g)。
[0298]
我们接下来研究了hiv特异性cd8 t细胞的功能反应，之前显示其对ati后控制病毒复制(refs)发挥关键作用，并建立多元回归模型，使用ati后hiv特异性cd8 t细胞亚群产生的细胞因子(ifn-γ、tnf-α、il-2)的峰值频率以及ati前(第6周)的cd45ra
int
ro
int t
scm
计数，预测第22周病毒载量与历史art前病毒载量设定点相比的变化。我们的分析表明，ati前较高的cd45ra
int
ro
int t
scm
细胞计数以及产生il-2的cd8 t
tm
细胞的峰值频率可以最佳预测第22周相对于历史art前设定点的病毒载量减少，解释了95％的病毒载量的变化(图5h)。这些结果表明，hiv库中的衰减与cd45ra
int
ro
int t
scm
细胞(p＝0.05)和产生il-2(p＝0.02)的cd8 t
tm
细胞的扩增呈显著负相关。
[0299]
ccr5基因编辑的t
em
的频率与在sb-728-t输注后6周接受治疗中断的参与者的病毒载量控制相关
[0300]
为了检验ccr5基因编辑的cd45ra
int
ro
int t
scm
细胞在ati期间通过分化成其他记忆亚群有助于控制病毒载量的假设，我们首先确定了cd45ra
int
ro
int t
scm
产品特有的ccr5突变，并追踪它们在输注后和ati后在其他记忆细胞中的持久性。我们的结果表明，在第6周和第22周，在所有cd4 记忆亚群中检测到cd45ra
int
ro
int t
scm
产物特有的ccr5突变(添加频率，数量，图6a)，突出了ccr5基因编辑的cd45ra
int
ro
int t
scm
细胞分化的潜力。
[0301]
为了研究长期病毒复制对ccr5基因编辑的cd4 t细胞记忆亚群的持久性和分化能力的影响，接下来，我们使用常微分方程模型模拟了5名个体在病毒血症期间(第6周至第12个月)的ccr5基因编辑和未编辑的cd4 t细胞亚群的稳态，其中ati延长至第12个月或更长时间。在monolix中使用单独的拟合程序，获得每个ccr5基因编辑和未编辑的cd4 t细胞亚群的死亡(γ)、增殖(ρ)和转换率(细胞/天)。我们观察到ccr5基因编辑的cd45ra

t
scm
、cd45ra
int
ro
int t
scm
和t
cm
记忆cd4 t细胞的死亡率与未经编辑的对应物的死亡率相比平均低3个数量级(图6b)。此外，ccr5基因编辑的cd45ra

t
scm
、cd45ra
int
ro
int t
scm
和t
cm
记忆cd4 t细胞的死亡率低于其转化率(图6b)。此外，使用matlab中的灵敏度分析测试来确定参数与细胞计数之间的关系，我们观察到转换的模型参数与ati后ccr5基因编辑的cd45ra

t
scm
、cd45ra
int
ro
int t
scm
和t
cm
细胞计数呈显著负相关(图6b)。总之，这些结果表明ccr5突变的存在对cd4 早期记忆亚群具有保护作用，并且这些细胞的超时损失更可能是由于这些细胞的分化而不是细胞死亡。此外，灵敏度分析还表明，ccr5基因编辑的cd45ra
int
ro
int t
scm
的增殖率与所有ccr5基因编辑细胞的细胞(包括t
em
)计数呈显著正相关，这对于其他亚群的增殖率未观察到(图6b)。这表明ccr5基因编辑的cd45ra
int
ro
int t
scm
的自我更新对于补充和保持其他记忆亚群中的ccr5突变很重要。
[0302]
为了支持这些发现，在art中断之前(第6周)更高的ccr5基因编辑的cd45ra

ro-t
scm
、cd45ra
int
ro
int t
scm
和t
cm
细胞计数与在ati后(第22周)更高数量的ccr5基因编辑的t
em
细胞相关，证实病毒血症可以触发t
scm
逐渐分化为t
em
细胞(图6c-e)。
[0303]
由于与其他记忆细胞相比，t
em
细胞已显示表达最高水平的ccr5，因此在病毒复制期间保持t
em
亚群中的ccr5基因编辑细胞亚群可导致保护免受从头感染。为了研究这一点，
我们在基线和输注后第6周和第22周测量了分选的cd4 t细胞亚群中hiv库的大小(通过整合hiv dna水平估计)。我们的结果表明，在ati期间，携带整合hiv dna的t
em
的频率没有显著变化(图6f)。密切检查显示，50％的参与者在第6周至第22周期间t
em
细胞中库的大小增加，而另一半显示整合hiv dna的频率没有变化或减少。重要的是，ati期间t
em
细胞内含有整合hiv dna的细胞频率的变化与t
em
群体中ccr5基因编辑的等位基因的频率呈负相关(图6g)。我们进一步发现，与历史art前病毒载量设定点相比，t
em
亚群中第22周ccr5基因编辑的等位基因频率较高(而非在其他亚群中)与第22周病毒载量的较大下降相关(图6h-i)。总之，这些结果表明，由于从其前体分化，ccr5基因编辑的t
em
细胞的持续补充限制了病毒血症期间t
em
中库的大小，并且对tem亚群从头感染的更大保护对控制ati期间病毒活跃复制产生影响。
[0304]
该研究的观察结果进一步证实了我们从sb-728-0902队列产生的发现，证明新型cd45ra
int
ro
int t
scm
亚群具有最高水平的ccr5基因编辑的等位基因并且能够分化成其他记忆亚群。分化的记忆t细胞，包括表达ccr5突变的短期存活的t
em
受到保护免受病毒感染；这导致了病毒血症的控制和hiv病毒库的逐渐衰减，正如在这两项研究中所观察到的那样。
[0305]
cd45ra t
scm
亚群先前被描述为具有常规记忆t细胞的特征、增强的自我更新和分化成其他记忆亚群的能力。cd45ra cd45ro ccr7 cd27 cd95 t
scm
样表型先前已报道在体外扩增纯化的cd4 和cd8 初始t细胞后，在细胞因子(例如il-2、il-7、il-15或il-21)的存在下共刺激；然而，尚未研究这些细胞在体内持续存在的潜力以及这些细胞中的一部分是否可以恢复为cd45ra cd45ro-表型。此外，在art开始联合il-2治疗后，在体内出现表达低水平cd45ra和cd45ro的cd4 亚群，这与cd4 t细胞增加相关，这表明响应于稳态增殖，cd45ra
int
ro
int
细胞也可以在体内产生。我们在本研究中确定的响应于稳态增殖亚群也证明通过wnt信号传导级联的基因集富集观察到的自我更新能力。我们进一步观察到其他严格机制(sox基因)的上调以及促炎和凋亡特征的增强，这些特征是响应于稳态增殖亚群独有的，与cd45ra t
scm
亚群不同，进一步突出了这些t
scm
群体之间的区别。
[0306]
t
scm
先前已被证明允许hiv感染。限制早期记忆细胞中的hiv感染对于保持cd4 t细胞稳态的重要性已在非人灵长类动物以及病毒血症非进展者hiv感染个体中得到证实。次级淋巴组织中存在t
scm
细胞(富含ccr5基因编辑的等位基因(在第3-4年时在外周高达～40％)-其中hiv复制将被部分抑制，如果不是完全抑制-可能导致它们长期存活。这反过来将导致适应性免疫功能的全身改善，增加cd4 t细胞数量并控制hiv和其他病原体，从而减少库的大小，正如我们在当前研究中所显示的那样。事实上，我们在sb-728-t产品中在第3-4年在短期存活的细胞(例如t
tm
和t
em
)中检测到t
scm
亚群特有的ccr5基因编辑细胞，证实了t
scm
分化为t
em
的潜力。此外，这些观察结果支持ccr5基因编辑的cd4 t细胞记忆亚群的稳态建模，我们观察到死亡率降低。此外，hiv dna的双相衰减分析排除了稀释是hiv衰减原因的可能性。然而，我们的多变量模型表明，ccr5基因编辑的cd45ra
int
ro
int t
scm
的长期持续存在确实导致输注后hiv库的衰减。
[0307]
中心假设是，为一小部分t细胞提供免受hiv感染的保护将提供全身获益并实现控制病毒复制。为支持这一点，sb-728-0902和sb-728-1101研究的结果证实了sb-728-t输注在恢复t细胞稳态和同源帮助hiv特异性cd8 t细胞中的作用，可导致t
scm
分化为t
em
免受hiv感染。所提供的同源帮助通过观察到的hiv库中的衰减进一步突出，这与cd45ra
int
ro
int t
scm
细胞和gag特异性cd8 t
tm il-2产生细胞的扩增呈负相关。hiv特异性cd8 t细胞产生il-2对病毒复制的作用已被证实。
[0308]
我们认识到，我们的结果可能是由于输注产品中ccr5基因编辑和基因未修饰的t
scm
细胞的离体扩增，并且此类细胞将在体内受到art的保护。为了支持这一假设，我们观察到输注后ccr5修饰和未修饰细胞明显扩增。有意思的是，我们的模型显示cd45ra
int
ro
int t
scm
的增殖率与所有ccr5基因编辑细胞的细胞计数呈正相关。然而，应该注意的是，先前关于过继转移的抗cd3/cd28共刺激ccr5未修饰细胞的研究未能导致hiv 参与者的cd4 t细胞计数持续增加。我们现在正在进行一项随机临床试验，在该项试验中我们可以输注ccr5修饰细胞和未修饰细胞，以更明确地解决这个问题。
[0309]
此处描述的结果表明，单次输注ccr5基因编辑的细胞是安全的、耐受性良好的，并且可以导致hiv dna水平显著降低(并且可能导致具有复制能力的hiv库)。此外，基因编辑的记忆干细胞的长期存在导致功能失调/受感染的旧记忆细胞被新细胞取代，这些新细胞受到保护，免受感染，从而重新补充免疫系统。与造血干细胞移植相比，这种疗法的非侵入性和自体性使其更容易获得且繁琐性更低。通过电穿孔递送锌指核酸酶mrna的进展可以允许多剂量方案，这有望大大提高cd4 t细胞计数。与此一致，每8周多次输注未经修饰的抗cd3/cd28共同刺激的未经修饰的cd4 t细胞先前已导致输注一年后细胞计数显著增加。此外，随着每次输注后cd4 t细胞计数增加，随后产生的产物也有望产生更大的植入和持久性，结果表明，与cd4 t细胞计数低的产品相比，cd4 t细胞计数较高的hiv 受试者的产品在体外扩增得更好。此外，对hiv dna的统计分析结果显示，在输注6周后，库部分减少，这表明如果在与衰减的第二阶段一致的延长时间后中断治疗，则可能实现病毒载量控制的最佳实现。.
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总之，我们的结果表明，ccr5基因编辑细胞的输注提供了独特的治疗干预，可改善t细胞稳态并减少总hiv库。从理论上讲，将这种方法与其他干预措施联合使用可能进一步改善结局。
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虽然本发明已经参照其优选实施方案进行了具体展示和描述，但本领域的技术人员将理解，在不背离所附权利要求所涵盖的本发明的范围的情况下，可以对其形式和详情进行各种改变。前述说明书中引用的所有专利、出版物和参考文献均通过引用以其全文并入本文。