用于固定细胞学用的稀有细胞的装置的制作方法

1.本发明总体涉及一种用于通过使用标准离心机离心而将细胞固定在基片上的机构，该标准离心机具有多个带有相应封盖的离心管。


背景技术：

2.细胞病理学(或细胞学)是在细胞水平上研究和诊断疾病的病理学分支，并且通常被用于游离细胞或组织片段的样本。细胞病理学通常被用于研究涉及宽范围身体部位的疾病，经常用于帮助诊断癌症，而且用于一些传染性疾病和其他炎症性疾病病症的诊断。
3.细胞病理学测试也称为涂片测试，因为样本通常被涂抹在玻璃显微镜载玻片上用于随后的染色和显微镜检查。细胞学样本还可以其他方式被制备，包括细胞离心。不同类型的涂片测试也可以被用于癌症诊断。在这个意义上，它被称为细胞学涂片。
4.细胞学允许通过观察单细胞来诊断疾病，并且小细胞簇越来越多地用于诊断一些类型的癌症。细胞学样本具有优于组织活检的优势，因为它们通常更容易获得，对患者造成较小的不适，不太可能导致患者的严重并发症，并且实施成本较低。
5.细胞学测试可以被用于诊断或用于筛查的目的。诊断测试被用于具有体征、症状、或一些其他原因而怀疑他们可能具有特定的疾病(例如癌症)的患者。诊断测试确定疾病是否存在，并且如果存在，则试图精确并准确地对疾病进行分类。筛查测试被用作早期检测手段，甚至在患者出现症状之前，就检测出特定疾病。如果筛查测试结果为阳性结果，这意味着在筛查测试中发现了什么，则通常启动诊断测试。
6.诸如pap涂片检测的一些细胞学检测用于筛查，而另一些细胞学检测可以准确鉴定疾病，例如癌症。当细胞学结果显示癌症时，经常在开始治疗之前还做活检以进行确认。
7.在细胞学检测中通常使用以下液体：尿液、痰(粘液)、脊髓液、胸膜液(来自肺周围的空间)、心包液(来自围绕心脏的囊)和腹水(来自腹部空间)。一旦收集，细胞学样本需要被沉积到盖玻片、载玻片或其他用于分析的基片上。通常通过诸如直接涂抹、触摸预处理或过滤技术的技术将样本转移到载玻片上。
8.可替代地，细胞离心机可以被用于将细胞均匀地沉积到载玻片上。这利用离心力在载玻片的限定区域中产生单层细胞沉积。利用细胞离心，一致地产生容易染色和评估的细胞的均匀制剂。由于离心机需要资金投入，细胞离心可能是昂贵的，并且在标准实验室中可能不是能广泛得到的。
9.制备样本的传统方法也不适合某些样本的制备。现有技术系统假设使用具有大量细胞(成千上万)的离心样本，并且可以在小体积(＜0.5ml)中浓缩。在一些应用中，例如使用循环肿瘤细胞(ctc)研究，在样本中可能仅存在少量细胞，例如仅一个或两个细胞，而这些细胞可以在大得多的体积中被发现。这意味着在没有细胞损伤的情况下最大化细胞回收是非常重要的。因此，包括细胞离心的现有系统不足以制备某些样本。此外，这些ctc可经受敏感分子测试、高分辨率成像技术或组织培养过程，其需要细胞样本来维持生理特征以确保稳健分析。
10.因此，在本领域中需要一种用于固定这些细胞以克服现有解决方案的上述缺陷的装置。
11.在整个说明书中，除非上下文另有要求，否则词语“包括(comprise)”、“包括(comprises)”和“包括(comprising)”将被理解为意指包括所陈述的步骤、或者元件、或者步骤或元件组，但不排除任何其他步骤、或者元件、或者步骤或元件组。
12.在此使用的术语“包含(including)”或“包含(includes)”或“包含(includes)”中的任一个也是开放式术语，其也意味着至少包含该术语后面的元件/特征，但不排除其他元件/特征。
13.在整个说明书中，对背景技术的任何讨论绝不应当被认为是承认此类背景技术是现有技术，也不应当被认为此类背景技术是在澳大利亚或全世界范围内广为人知、或形成本领域的公知常识的一部分。


技术实现要素：

14.根据本发明的第一方面，提供了一种用于通过使用标准离心机的离心固定细胞的装置，该标准离心机具有多个离心管，这些离心管具有相应的封盖，该装置包括一个或更多个漏斗单元，一个或更多个漏斗单元中的每一个具有宽侧和窄侧，一个或更多个漏斗单元被适配成接收一个或更多个流体样本，一个或更多个中空圆筒具有在圆筒的侧表面上的多个外螺纹，一个或更多个中空圆筒被附接至相应的一个或更多个漏斗单元中的每一个的窄侧处，一个或更多个中空圆筒包封相应的一个或更多个漏斗单元的窄侧，一个或更多个被附接的垫圈环绕一个或更多个漏斗单元中的每一个的窄侧的圆周被安置窄侧上，一个或更多个盖玻片保持板被适配成保持相应的盖玻片或基片，一个或更多个盖玻片保持板被配置在邻近相应的一个或更多个漏斗单元的窄侧的圆周并且一个或更多个可移除盖帽具有多个内螺纹，一个或更多个可移除盖帽被适配成包封相应的一个或更多个盖玻片保持板以及相应的盖玻片，一个或更多个可移除盖帽被配置成紧固在相应的一个或更多个中空圆筒上。一个或更多个垫圈被适配成限制在漏斗单元内的一个或更多个流体样本的泄漏。在一些实施例中，漏斗是筒形的。在一些实施例中，基片可以是在其上细胞可以进一步被处理的任何适合的基片，包括培养板、具有细胞外基质的板、用于细胞挑选或非粘附培养的非粘附板。
15.优选地，一个或更多个漏斗单元中的每一个以及一个或更多个中空圆筒、一个或更多个垫圈、一个或更多个盖玻片保持板、相应的盖玻片以及一个或更多个可移除盖帽被置于标准离心机的相应的离心管中的每一个的内部，且封盖关闭。
16.优选地，标准离心机被配置成利用离心力将细胞样本推往盖玻片，将多个样本固定在一个或更多个漏斗单元内。
17.优选地，盖玻片被放置在一个或更多个漏斗单元内部的水平位置。
18.优选地，一个或更多个漏斗单元的窄侧具有第一组槽口，该第一组槽口被适配成保持一个或更多个可移除垫圈。
19.优选地，一个或更多个盖玻片保持板具有第二组槽口，该第二组槽口被适配成保持相应的一个或更多个可移除盖帽。
20.优选地，一个或更多个盖玻片保持板还具有第三组槽口，该第三组槽口被适配成
保持盖玻片。
21.优选地，样本中的分离的一个或更多个细胞被收集在盖玻片上。
22.优选地，一个或更多个漏斗单元中的每一个包括平坦的侧表面，该平坦的侧表面从宽侧朝向窄侧延伸至中部(halfway)。
23.优选地，平坦的侧表面还包含多个凹槽，这些凹槽被适配成固定在这些相应的离心管中的每一个内，以便在离心时硬化在这些相应的离心管中的每一个内的一个或更多个漏斗单元中的每一个。
24.优选地，一个或更多个流体样本选自包括血浆、血清、尿液、痰、脊髓液、胸膜液、心包液、以及腹水的组。
25.优选地，上述装置还可包含质量控制机构，该质量控制机构被配置成警告使用者一个或更多个流体样本的可能损失。
26.优选地，上述装置还涂覆有不粘材料。
27.优选地，样本基片板还可以被涂覆有不粘材料，并且流体边界机构被配置成防止流体样本在离心之后损失。这将浓缩细胞悬浮液并允许下游处理，如细胞挑选，其中细胞需要处于悬浮液中而不是被固定在玻璃上。
28.说明书附图
29.将参照附图描述本发明的至少一个示例，其中：
30.图1示出了根据本发明的实施例的用于流体分离的装置；
31.图2a示出了根据本发明的实施例的漏斗单元的侧视图；
32.图2b示出了根据本发明的实施例的漏斗单元的主视图；
33.图2c示出了根据本发明的实施例的漏斗单元的仰视图；
34.图2d示出了根据本发明的实施例的漏斗单元的俯视图；
35.图3示出了根据本发明的实施例的漏斗单元的截面图；
36.图4示出了根据本发明的实施例的装置的实现方案；
37.图5示出了根据本发明的实施例的针对低细胞计数样本的细胞回收率；
38.图6示出了根据本发明的实施例的总样本损失；
39.图7示出了根据本发明的实施例的细胞的维持形态；以及
40.图8示出了根据本发明的实施例的细胞的细胞维持活性；以及
41.图9示出了根据本发明的实施例的另一种用于细胞固定的装置。
42.应当指出的是，在整个附图中，相同的标记表示相同的或相似的元件。
具体实施方式
43.本发明的目的是提供一种用于使用标准离心机固定或浓缩细胞的装置，该标准离心机具有多个带有相应的封盖的离心管(标准锥形离心管)。标准离心机是一种用于基于密度分离流体、气体或液体的实验室装置。通过以高速旋转包含材料的容器、从而导致离心力将较重的材料推至容器的外部，而实现分离。离心机在包括学术、临床和研究领域的大部分实验室是常见的，并被用于纯化或浓缩细胞、亚细胞器、病毒、蛋白质和核酸。存在多种类型的离心机，其通常通过预期用途或转子设计进行分类。本发明是允许使用标准离心机在盖玻片/载玻片/基片上制备样本的装置/适配器。它被设计为以最小的细胞损失离心大体积
的细胞悬浮液。特别地，它对于将稀有细胞固定在大体积的样本内或浓缩这种大体积的样本至没有细胞损失的较小体积中是有用的。该装置装配进标准的锥形离心管(“猎鹰管(falcon tubes)”)中。
44.在一些实施例中，漏斗是筒形的。
45.在一些实施例中，基片可以是在其上可以进一步处理细胞的任何合适的基片，包括玻璃板、培养板、具有细胞外基质的板、用于细胞挑选或非粘附培养的非粘附板、脱细胞基质片。
46.在此方面，为了清楚起见，下文已借助于附图讨论了本发明。然而，本领域技术人员应当理解，本发明不限于以下已经讨论的实现方案的具体类型，并且在不偏离本发明的保护范围的情况下可以同样适用于许多不同的实现方案。
47.图1示出了根据本发明的实施例的用于固定细胞的装置100(以下称为“装置100”)。用于通过离心固定细胞的装置100使用标准离心机(未示出)。标准离心机可以具有多个离心管(图中未示出)，这些离心管具有相应的封盖。装置100包括一个或更多个漏斗单元110、一个或更多个中空圆筒120、一个或更多个可移除垫圈130、一个或更多个盖玻片保持板140、一个或更多个可移除盖帽150、一个或更多个盖玻片(图中未示出)。装置100可以涂覆有不粘材料，例如但不限于pluronic f127、聚四氟乙烯(ptfe)、陶瓷。特别是在装置内，不粘材料有助于确保样本内的细胞不粘到漏斗的侧壁。
48.盖玻片保持板140可以涂覆有疏水层，该疏水层允许使用者在盖玻片上直接执行免疫细胞化学。这允许使用者在执行染色时，在盖玻片上放入抗体和其他溶液。通过保持板的疏水性，添加的溶液将在盖玻片上形成弯月面，并且被盖玻片的边缘限制。
49.此外，图2c示出了根据本发明的实施例的漏斗单元的仰视图。图2d示出了根据本发明的一个实施例的漏斗单元的俯视图。如图1和图2c-2d所示，一个或更多个漏斗单元110中的每一个具有宽侧1101和窄侧1102。一个或更多个漏斗单元110可以由但不限于非反应性的、非腐蚀性的并且抗粘附的材料(如塑料、pvc、不锈钢、铝、玻璃)制成。
50.此外，一个或更多个漏斗单元110可以具有平坦的侧表面1103。图2a示出了根据本发明的实施例的漏斗单元的侧视图。如图2a所示，平坦侧表面1103从宽侧1101朝向窄侧1102延伸至中部。平坦的侧表面1103进一步可以具有一个或更多个凹槽1104。一个或更多个凹槽1104可以是但不限于由橡胶、雕刻物、突起物制成的一个抓柄。一个或更多个凹槽1104可以被适配成固定在这些相应的离心管(在这个图中未示出)中的每一个内。另外，平坦的侧表面1103可以被适配成防止一个或更多个漏斗单元110被卡在离心管内。此外，平坦的侧表面可以充当用于使用某种类型的镊子移除的手柄。
51.一个或更多个凹槽1104可以在离心时硬化在这些相应的离心管中的每一个内的一个或更多个漏斗单元110中的每一个。一个或更多个漏斗单元110可以被适配成接收一个或更多个流体样本。一个或更多个流体样本选自包括血清、血浆、尿液、痰、脊髓液、胸膜液、心包液以及腹水的组。此外，一个或更多个漏斗单元110的窄侧1102可具有第一组槽口1106。此外，一个或更多个漏斗单元110可包含临近第一组槽口1106的圆周边缘1107。圆周边缘可以被适配成用于减少细胞被粘到垫圈130上的机会。图2b示出了根据本发明的实施例的漏斗单元110的主视图。如图1和图2b所示，进一步地，相应的一个或更多个漏斗单元110的窄侧1102被连接至一个或更多个中空圆筒120。
52.一个或更多个中空圆筒120可以在该圆筒的侧表面上具有多个外螺纹。一个或更多个中空圆筒120可以包围相应的一个或更多个漏斗单元110的窄侧1102。此外，一个或更多个漏斗单元110中的每一个可以具有一个或更多个可移除垫圈130，该一个或更多个可移除垫圈130环绕一个或更多个漏斗单元110中的每一个的窄侧1102的圆周被安置在窄侧1102上。一个或更多个可移除垫圈130可以由但不限于硅树脂、橡胶、塑料、pvc制成。
53.此外，相应的一个或更多个漏斗单元110的窄侧1102可以具有一个或更多个盖玻片保持板140，一个或更多个盖玻片保持板140被配置在相应的一个或更多个漏斗单元110的窄侧1102的圆周的近侧。一个或更多个盖玻片保持板140被适配成保持相应的盖玻片(图中未示出)。这些盖玻片被设想成包含具有可变厚度的方形盖玻片、矩形盖玻片、圆形盖玻片。盖玻片保持板140还可以被适配成保持具有短边缘的小的玻璃/塑料容器。然而，在优选实施例中，可以使用圆形盖玻片。这些盖玻片可以被放置在一个或更多个漏斗单元110内的一个水平位置中。一个或更多个盖玻片保持板140可以具有第二组槽口1401。第二组槽口可以被适配成将一个或更多个盖玻片保持板140保持在一个或更多个可移除盖帽150上。
54.相应的盖玻片可以借助于被安置在一个或更多个盖玻片保持板140的每一个上的第三组槽口(未示出)而被保持在适当位置。盖玻片搁置在盖玻片保持板140上，该盖玻片保持板进而通过被在相应的一个或更多个盖玻片保持板140的另一侧上的第二组槽口1401支撑的一个或更多个可移除盖帽150而被保持在适当位置。盖玻片由诸如可以是但不限于玻璃、塑料、石英、抗uv玻璃的材料制成。而且，一个或更多个盖玻片保持板140和盖玻片被包封在一个或更多个可移除盖帽150内。一个或更多个可移除盖150可以具有多个内螺纹或外螺纹。一个或更多个可移除盖帽150可以被适配成包封相应的一个或更多个盖玻片保持板140和相应的盖玻片。
55.图3示出了根据本发明实施例的漏斗单元的截面图。如图3所示，一个或更多个漏斗单元110中的每一个以及一个或更多个中空圆筒120，一个或更多个可移除垫圈130、一个或更多个盖玻片保持板140、相应的盖玻片(图中未示出)以及一个或更多个可移除盖帽150一起被组装，如图3所示，一个或更多个漏斗单元110可以包括一个空腔120l，该空腔形成在一个或更多个中空圆筒120的外壳与窄侧1102的环绕圆周之间。空腔1201可以被适配成配合具有边沿的不粘盖玻片/容器。不粘盖玻片/容器可以允许细胞悬浮液的浓度用于但不限于细胞挑选和贴壁或非贴壁细胞培养。
56.图4示出了根据本发明的实施例的装置的实施方式。如图4所示，一个或更多个流体样本被放入一个或更多个漏斗单元110内。一起被组装的的具有一个或更多个流体样本的一个或更多个漏斗单元110中的每一个以及一个或更多个中空圆筒120、一个或更多个可移除垫圈130、一个或更多个盖玻片保持板140、相应的盖玻片210和一个或更多个可移除盖帽150被置于标准离心机的相应的离心管220中的每一个内，且封盖关闭(附图示出了从离心管220的开口观察的视图，离心管220没有盖)。
57.一个或更多个漏斗单元110上的凹槽1104为离心管内的一个或更多个漏斗单元110提供抓柄。凹槽1104可以防止一个或更多个漏斗单元110在离心管220内摆动。标准离心机可以利用离心力来将流体样本内的细胞推向盖玻片210。固定的细胞样本在盖玻片210上被收集。在盖玻片210上收集细胞样本之后，可以通过旋开可移除盖帽150并移除盖玻片保持板140来取回盖玻片210。
58.装置100可以包含过滤器(未示出)。过滤器可以被安置在一个或更多个漏斗单元110的宽侧1101与相应的盖玻片之间。在一个实施例中，过滤器可以被放置在一个或更多个漏斗单元110中的每一个的中间部分中。过滤器可适配成允许在离心过程期间在过滤器上截获细胞，未被过滤的细胞被固定在盖玻片上。
59.此外，装置100可以包含质量控制机构(未示出)。该质量控制机构可以内置于一个或更多个漏斗单元110中的每一个内。质量控制机构可被配置成警告使用者一个或更多个流体样本的可能损失。在一个实施方式中，密封机构(具有垫圈130)的失效将导致流体泄漏到锥形离心管(220)的底部，因此警告使用者在流体样本内可能损失一些细胞。
60.此外，装置100可包含流体边界机构。流体边界机构可以被配置在样本收集容器上，以防止一个或更多个流体样本在离心期间的损失。这可以浓缩细胞悬浮液并允许下游处理，如细胞挑选，其中细胞需要处于悬浮液中而不是被固定在玻璃上。
61.图9示出了本发明的另一实施例。该实施例提供了用于固定漏斗的不同机构，特别是通过使用具有四分之一转扭锁的盖帽来固定具有盖玻片保持器的基座。具有不同数量的锁定部分的其他类型的卡锁或棘爪锁定装置也是适用的。在该实施例中，盖玻片保持器被纹理化以允许容易地抓握和转动该部分。固定机构使用四分之一转扭锁。这种扭锁确保垫圈的最佳压缩以形成紧密的密封(不会在盖玻片上施加太多的压力，该压力可能破裂盖玻片)。它还向使用者提供已经达到最佳密封的反馈。
62.垫圈由硅胶制成并且在盖玻片上形成密封。漏斗的下侧具有凸缘，该凸缘突出到垫圈的附接件之外，以减小细胞被向内凸出的垫圈卡住的可能性。漏斗的平坦部分允许漏斗在离心之后容易从锥形离心管被移除。
63.除了垫圈130之外，还可以使用其它装置来密封保持板140，包含使用可压缩基片代替盖玻片作为目标基片使用来密封漏斗单元110的窄侧1102。
64.为了改善细胞的分布，一些实施例包含在漏斗单元内的多个翅片，以允许细胞的更均匀的分布，特别是对于较高的细胞计数的样本。翅片优选地与漏斗壁同心地设置，以便引导细胞朝向漏斗的中心，以防止细胞在盖玻片圆周处的局部聚集。
65.图5示出了低细胞计数的样本的细胞回收结果(样本内低≤10个细胞；高≥10个细胞但小于200个细胞)。该图示示出了掺入的培养细胞的比例，掺入的培养细胞是在使用根据本发明优选实施例的装置进行细胞离心之后被回收的。“低”被定义为掺入悬浮液中的10个或更少的细胞；“高”被定义为多于10个但少于200个细胞。细胞悬浮液包括来自在磷酸盐缓冲溶液中的癌细胞系的细胞。该图示证明了在小细胞数目和高细胞数目两者中使用本发明后的高的细胞回收效率。
66.图6示出了与cytocspin cytocentifuge(目前的细胞离心黄金标准)相比的总样本损失。n＝4。这个视图示出了对比优选实施例的装置和黄金标准工具cytospin(thermofisher)的在具有非常低的细胞计数(＜10个细胞)的样本的细胞离心过程中损失的掺入的培养细胞的比例。浅灰色区域代表回收的细胞样本的比例；黑色区域代表损失的细胞样本的比例。该图示证明了与黄金标准cytospin(thermofisher)相比，使用该装置进行细胞离心后，遭受总样本细胞损失的样本比例显著降低。
67.图7证明了维持的形态。该图示出了典型的荧光共聚焦显微图像，其描绘了使用优选实施例的装置进行细胞离心后的循环肿瘤细胞的图像。这些图像描绘了四个人乳腺癌细
胞(mcf-7)，它们被掺入健康供体全血中以模拟ctc，并且它们随后被辐射(8gy剂量)。使用优选实施例的装置进行细胞离心的培养的乳腺癌细胞的生物标记染色。图像中的每个块布表示使用不同的标记物进行的染色：细胞表面标记物(上皮细胞粘附分子[epcam])是绿色的，细胞核染色或dna染色是蓝色的，γ-h2ax焦点(响应双链dna断裂的标记物)是红色的。最终的块表示合并的图像。比例尺是10μm。这些显微镜图像块证明了在使用根据本发明优选实施例的装置进行细胞离心后的细胞形态得以保持，细胞形态如由这些细胞生物标记的确定的和预期的染色模式所指示的。
[0068]
图8是培养的ctc的免疫细胞化学图像(绿色＝泛细胞角蛋白；蓝色＝核染色)，并且该图像证明了使用本发明优选实施例固定后的细胞活性。在该实验中，来自胰腺癌的原位小鼠模型的血液富含循环肿瘤细胞(ctc)。富集的样本部分被转移至该装置以允许通过离心将细胞固定在盖玻片上。这些细胞的成功培养证实了细胞离心后的细胞活性。此外，使用相同的胰腺癌的原位小鼠模型，已经证明了该装置可用于ctc离体培养，该ctc离体培养具有42％(5/12)的高成功率。
[0069]
本发明提供了许多优势。首先，它为现有问题提供了节省成本且易于实施的解决方案。本发明的优势是本发明允许大体积的离心。本发明使一个或更多个细胞样本的损失最小化。本发明有助于减少流体样本内的细胞上的剪切应力，从而维持细胞活性，并减少细胞形态的变形。本发明可用于任何实验室而无需额外的资金支出。大多数生物医学实验室具有使用与本发明兼容的锥形离心管(“falcon”管)的离心机。
[0070]
本发明易于使用。它具有内置的“质量控制”，在“质量控制”中可以看到泄漏并且警告用户可能的细胞丢失。适配器的内壁不允许这些细胞样本粘到这些漏斗单元的壁上。因此，细胞样本的浪费较少。对原型的测试表明60％-100％的细胞回收率。回收的细胞具有正常的形态，并且在许多情况下，维持它们的活性，如通过用组织培养技术繁殖它们的能力所证明的。本发明使盖玻片上的细胞回收的产量最大化。与标准离心机和离心机内的标准管一起使用的本发明的灵活性显著增加了本发明的成本效益。因此，本发明可用于这样的医疗机构，该医疗机构中缺乏用于细胞离心的特殊设备。此外，本发明的防泄漏设计确保在盖玻片上的流体样本细胞的最大沉积。此外，除了最小细胞损失之外，本发明的实施例还提供了对样本内的细胞的最小破坏。
[0071]
在此使用的术语和描述仅通过说明的方式阐述并且不意味着限制。本文所公开的示例和限制旨在不以任何方式进行限制，并且可以在不脱离本公开的精神的情况下进行修改。本领域的技术人员将认识到，在本公开的及其等同物的精神和范围内，许多变化是可能的，其中除非另外指明，否则所有术语都应以其最广泛的可能意义来理解。
[0072]
对这些实施例的各种修改对于本领域技术人员来说从描述中是显而易见的。与在此描述的各个实施例相关联的原理可以应用于其他实施例。因此，该描述不旨在限制这些实施例，而是提供与在此所披露和/或所建议的原理和新颖的和创造性的特征相一致的最广的范围。因此，预期本发明将保留落入本发明范围内的所有其他此类替代方案、修改和变化。