在尿液样本中诊断结核的方法

在尿液样本中诊断结核的方法
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求南非临时专利申请号2019/06422的优先权，通过引用将其并入本文。
技术领域
3.本发明涉及用于在受试者中诊断活动性结核疾病(tb)的方法，所述方法包括检测来自受试者尿液样本中特定的生物标志物。


背景技术：

4.结核病(tb)是历史上人类最大的杀手，并且现在是南非最常见的死亡原因，因此迫切地需要结核病创新性的和准确的检测。据估计，tb影响该国家每年2至3％的gdp(每年约2000亿南非兰特)。
5.面临着对开发更好的tb诊断明显未满足的需求，是缺乏临床上有用的生物标志物，以及缺乏在床旁和社区中简单且负担得起的不依赖痰的tb检测平台。对于约50％的同时感染hiv的患者来说，这个问题尤其严重，这些患者不能产生痰或他们的痰含有非常少的细菌(《50个杆菌/ml)。目前在许多tb地方性流行国家使用的基于pcr的前线tb诊断检测(gene xpert ultra；cepheid)未能解决这个问题，并且现有的尿液脂阿拉伯甘露聚糖(lam)分析法(alere determine
tm
tb lam ag)不敏感，只能检测低于50％的tb-hiv同时感染的患者。混合缺乏有效的诊断，全世界几乎40％的tb病例为未诊断的或未报告的。在全球这一数量为每年超过4百万个tb案例；并且在南非(该国家具有最高的tb发病率)，这一数量为每年约150000至200000个新的tb案例(who 2017全球tb报告(global tb report))。


技术实现要素：

6.根据本发明的第一实施方式，提供了用于诊断结核疾病(tb)的方法，所述方法包括测试来自疑似患有tb的受试者的尿液样本的saa1以及retn和rbp4两者之一或retn和rbp4两者的存在的步骤。
7.特别地，可以测试尿液样本的saa1和retn；saa1和rbp4；或saa1、retn和rbp4的存在。
8.还可以测试尿液样本的一种或多种额外的生物标志物的存在，所述额外的生物标志物选自lilrb4、il18bp、serpina3、cd59、iglv3.21、igkv1.17、o53764_myctu(rv0567)、i6y0w5_myctu(fade19，rv2500c)、q79fp1_myctu(pe_pgrs28，rv1452c)、htpg_myctu(htpg，rv2299c)、rpob_myctu(rpob，rv0667)、eftu_myctu(tuf，rv0685)、acr_myctu(hspx，rv2031c)、ch602_myctu(groel2，rv0440)、clpp1_myctu(clpp1，rv2461c)和10kda伴侣蛋白(rv3418c)组成的组。
9.特别地，还可以测试尿液样本的il18bp、lilrb4、或il18bp和lilrb4两者的存在。
10.可以进一步测试尿液样本的一至五种额外的生物标志物的存在，所述额外的生物标志物选自serpina3、cd59、rbp4、iglv3.21和igkv1.17组成的组。特别地，还可以测试尿液
样本的serpina3、cd59、或serpina3和cd59两者的存在。
11.可以进一步测试尿液样本的一至四种额外的生物标志物的存在，所述额外的生物标志物选自htpg、pe_pgrs28、eftu_myctu和10kda伴侣蛋白组成的组。
12.还可以测试尿液样本的一种或多种(例如1至5种)其他生物标志物的存在，所述其他生物标志物选自saa2、crp、tsp4、a8mue1、axa81和retn组成的组。例如，可以测试尿液样本的至少saa1、rbp4和saa2的存在；至少saa1、rbp4、saa2和tsp4的存在；至少saa1、rbp4和crp的存在；或saa1、rbp4、saa2、crp、tsp4、a8mue1和retn的存在。
13.更特别地，可以进一步测试尿液样本的以下生物标志物的存在：
14.a)saa1、retn和lilrb4；
15.b)saa1、retn和il18bp；
16.c)saa1、retn、il18bp和lilrb4；
17.d)saa1、retn、il18bp和igkv1.17；
18.e)saa1、retn、il18bp、lilrb4和serpina3；
19.f)saa1、retn、il18bp、lilrb4、serpina3和cd59；
20.g)saa1、retn、lilrb4、il18bp、serpina3，以及cd59、rbp4、iglv3.21、cadm1和cfhr2中的任意两种；
21.h)saa1、rbp4、htpg和pe_pgrs28；或
22.i)saa1、rbp4、htpg、pe_pgrs28、eftu_myctu和10kda伴侣蛋白。
23.根据本发明的第二实施方式，提供了诊断和治疗患有结核疾病(tb)的受试者的方法，所述方法包含以下步骤：
24.执行以上所描述的方法；
25.基于样本中生物标志物的检测，确定受试者是否患有tb；以及
26.如果受试者需要tb治疗，则施用有效量的受试者tb治疗。
27.根据本发明的第三实施方式，提供了用于在受试者中诊断结核疾病(tb)的计算机实施方法，所述计算机执行的步骤包括：
28.接收输入的受试者数据，所述输入的受试者数据包括来自受试者尿液样本中saa1以及retn和rbp4两者之一或retn和rbp4两者的水平的值，
29.任选地接收输入的受试者数据，所述输入的受试者数据包括尿液样本中一种或多种其他生物标志物的水平的值，其中其他生物标志物选自lilrb4、il18bp、serpina3、cd59、rbp4、iglv3.21、igkv1.17、o53764_myctu(rv0567)i6y0w5_myctu(fade19，rv2500c)、q79fp1_myctu(pe_pgrs28，rv1452c)、htpg_myctu(htpg，rv2299c)、rpob_myctu(rpob，rv0667)、eftu_myctu(tuf，rv0685)、acr_myctu(hspx，rv2031c)、ch602_myctu(groel2，rv0440)、clpp1_myctu(clpp1，rv2461c)、saa2、crp、tsp4、a8mue1和ch10_myctu(10kda伴侣蛋白，rv3418c)组成的组；
30.将这些值与生物标志物的预先确定的值进行比较；
31.确定受试者是否患有tb；以及
32.显示关于受试者的诊断信息。
33.根据本发明的第四实施方式，提供了用于诊断受试者结核疾病(tb)的计算机实施方法，所述计算机执行的步骤包括：
34.接收输入的受试者数据，所述输入的受试者数据包括来自受试者尿液样本中saa1和rbp4的水平的值，
35.任选地接收输入的受试者数据，所述输入的受试者数据包括样本中一种或多种其他生物标志物的水平的值，其中所述其他生物标志物选自htpg、pe_pgrs28、eftu_myctu和10kda伴侣蛋白；
36.将这些值与生物标志物的预先确定的值进行比较；
37.确定受试者是否患有tb；以及
38.显示关于受试者的诊断信息。
39.根据本发明的第五实施方式，提供了用于根据以上所描述的方法诊断受试者血液样本中结核病的试剂盒，所述试剂盒包括：
40.从患者处接收样本的构件；
41.用于结合至少saa1以及retn和rbp4中两者之一或retn和rbp4两者的捕获剂；以及
42.至少一种指示剂，所述指示剂指示捕获剂何时与生物标志物结合。
43.所述试剂盒可以进一步包括：
44.尿液样本收集装置，
45.具有生物标志物的抗体的膜/测试条；
46.用于结合lilrb4、il18bp、serpina3、cd59、rbp4、iglv3.21、igkv1.17、o53764_myctu(rv0567)、i6y0w5_myctu(fade19，rv2500c)、q79fp1_myctu
47.(pe_pgrs28，rv1452c)、htpg_myctu(htpg，rv2299c)、rpob_myctu(rpob，rv0667)、eftu_myctu(tuf，rv0685)、acr_myctu(hspx，rv2031c)、ch602_myctu(groel2，rv0440)、clpp1_myctu(clpp1，rv2461c)或ch10_myctu
48.(10kda伴侣蛋白，rv3418c)、saa2、crp、tsp4、a8mue1或其任意组合的捕获剂；
49.用于实施诊断方法的指令；和/或
50.用于进行诊断的软件。
51.根据本发明的第六实施方式，提供了saa1以及retn和rbp4中两者之一或retn和rbp4两者的捕获剂在制造用于诊断tb的方法的试剂盒或检测试剂中的用途。
附图说明
52.图1：使用原始log2转化的ibaq数据，在tb 和tb-个体(fdr≤0.05)之间显著差异表达的尿液中人源蛋白质的热图；
53.图2：tb阳性与tb阴性个体区分的按最有影响的蛋白质排序的活动性结核尿液中的人源蛋白质，基尼指数的平均值下降越大指示影响越大；
54.图3：使用原始log2转化的ibaq数据，在tb 和tb-个体(fdr≤0.05)之间显著差异表达的尿液中结核分枝杆菌来源的蛋白质的热图；
55.图4：tb阳性与tb阴性个体区分的按最有影响的蛋白质排序的活动性结核尿液中的结核分枝杆菌来源的蛋白质，基尼指数的平均值下降越大指示影响越大；
56.图5：显示了tb阳性与tb阴性个体区分的个体人类和分枝杆菌生物标志物的曲线下面积数据的直方图；
57.图6：显示了在tb阳性(n＝60)和tb阴性(n＝58)个体中(a)saa1和(b)rpb4相对丰
度水平的箱线图；
58.图7：使用ibaq数据，在tb 和tb-个体之间显著差异表达的尿液中人源蛋白质的热图；
59.图8：tb阳性与tb阴性个体区分的按最有影响的蛋白质排序的活动性结核尿液中的人源蛋白质，在去除该特征的时候下降值越大指示预测能力越强；
60.图9：显示生物标志物的分布和频率的箱线图。
具体实施方式
61.本文描述了用于在来自受试者的尿液样本中诊断(以及任选地也治疗)结核(tb)的方法和计算机实施方法。优选地，所述方法用于诊断活动性tb(tb的体征和症状和/或一致的影像学证据以及微生物学确认(培养物阳性和/或扩增dna的存在))，而不是用于诊断潜伏性结核分枝杆菌感染(ltbi)或初期tb。所述方法独立于hiv同时感染状态。
62.所述方法包括测试来自疑似患有tb的个体的尿液样本的至少两种人源生物标志物(其中一种是saa1，另一种是retn或rbp4)的存在。在一个实施方式中，所述方法包括测试尿液样本的至少saa1和retn。在另一种实施方式中，所述方法包括测试尿液样本的至少saa1和rbp4。在另一种实施方式中，所述方法包括测试尿液样本的至少saa1、retn和rbp4。所述方法进一步包括诊断所述个体患有或未患有tb。
63.任选地，还可以测试所述样本的其他人源生物标志物(例如lilrb4、il18bp、serpina3、cd59、iglv3.21、igkv1.17、saa2、crp、tsp4、axa81和a8mue1，或其任意组合)的存在或不存在。特别地，还可以测试尿液样本的il18bp、lilrb4、或il18bp和lilrb4两者的存在，和/或还可以测试serpina3、cd59、或serpina3和cd59两者的存在，和/或还可以测试saa2、tsp4、crp和/或a8mue1的存在。
64.还可以测试申请人已经在尿液中识别的所述样本的一种或多种分枝杆菌来源的生物标志物的存在，例如表1中列出的那些。
65.表1：在尿液中识别的结核分支杆菌蛋白质。
66.[0067][0068]
更特别地，可以测试所述样本的一种或多种下列结核分枝杆菌来源的蛋白质：o53764_myctu(rv0567)、i6y0w5_myctu(fade19，rv2500c)、q79fp1_myctu(pe_pgrs28，rv1452c)、htpg_myctu(htpg，rv2299c)、rpob_myctu(rpob，rv0667)、eftu_myctu(tuf，rv0685)、acr_myctu(hspx，rv2031c)、ch602_myctu(groel2，rv0440)、clpp1_myctu(clpp1，rv2461c)和/或ch10_myctu(10kda伴侣蛋白，rv3418c)。甚至更特别地，可以测试所述样本的htpg、pe_pgrs28、eftu_myctu和/或10kda伴侣蛋白的存在。例如，被测试的分枝杆菌来源的蛋白质可以是htpg和pe_pgrs28；htpg、pe_pgrs28和10kda伴侣蛋白；htpg、pe_pgrs28和eftu_myctu；pe_pgrs28，或eftu_myctu和10kda伴侣蛋白。
[0069]
以下生物标志物组已被识别为特别有效的生物标志物组：
[0070]
a)saa1和retn；
[0071]
b)saa1、retn和lilrb4；
[0072]
c)saa1、retn和il18bp；
[0073]
d)saa1、retn、il18bp和lilrb4；
[0074]
e)saa1、retn、il18bp和igkv1.17；
[0075]
f)saa1、retn、il18bp、lilrb4和serpina3；
[0076]
g)saa1、retn、il18bp、lilrb4、serpina3和cd59；
[0077]
h)saa1、retn、lilrb4、il18bp、serpina3，以及cd59、rbp4、iglv3.21、cadm1和cfhr2中的任意两种；
[0078]
i)saa1和rbp4；
[0079]
j)saa1、rbp4和saa2；
[0080]
k)saa1、rbp4和crp；
[0081]
l)saa1、rbp4、saa2、tsp4；
[0082]
m)saa1、rbp4、saa2、tsp4，以及crp、a8mue1、retn中的一种或多种；
[0083]
n)saa1、rbp4、saa2、tsp4和crp；
[0084]
o)saa1、rbp4、saa2、tsp4和a8mue1；
[0085]
p)saa1、rbp4、saa2、tsp4和retn；
[0086]
q)saa1、rbp4、saa2、crp；
[0087]
r)saa1、rbp4、saa2、crp和axa81；
[0088]
s)saa1、rbp4、saa2、crp和tsp4；
[0089]
t)saa1、rbp4、saa2、crp、axa81和tsp4；
[0090]
u)saa1、rbp4、saa2、crp、axa81、tsp4和a8mue1；
[0091]
v)saa1、rbp4、htpg和pe_pgrs28；
[0092]
w)saa1、rbp4、htpg、pe_pgrs28和eftu_myctu；
[0093]
x)saa1、rbp4、htpg、pe_pgrs28和10kda伴侣蛋白；
[0094]
y)saa1、rbp4、htpg、pe_pgrs28、eftu_myctu和10kda伴侣蛋白。
[0095]
所述方法可用于诊断肺tb和肺外tb，例如结核性胸膜炎、结核性脑膜炎、泌尿生殖器结核、粟粒性结核以及骨和关节中的结核，等等。
[0096]
可以对被识别为患有活动性tb的受试者进行tb治疗。
[0097]
如本文所用，术语“包含(comprises)”、“包含(comprising)”、“包括(includes)”、“包括(including)”、“含有(contains)”、“含有(containing)”以其任何变体，旨在涵盖非排他性的包含，并且不排除不特定地提及的其他元素。
[0098]
可交换使用的术语“标志物”和“生物标志物”涉及目标分子，所述目标分子指示个体中的正常或异常过程或个体中的疾病或其他状况，或者所述目标分子是个体中的正常或异常过程或个体中的疾病或其他状况的标志。更具体地，“标志物”或“生物标志物”是存在特定生理状态或过程(无论正常的或不正常的)的解剖学的、生理学的、生物化学的或分子的参数。生物标志物可以包括小分子、肽、蛋白质和核酸。
[0099]
可交换使用的“生物标志物值”、“值”、“生物标志物水平”和“水平”涉及使用任何用于检测生物样品中的生物标志物的分析方法进行的度量，并且所述度量指示生物样本中生物标志物的存在、缺乏、绝对数量或浓度、相对数量或浓度、滴度、水平、表达水平、测量水平的比率，等等。“值”或“水平”的确切性质取决于用于检测生物标志物的特定分析方法的
特定设计和成分。
[0100]
与生物标志物的表达水平或值相比，生物标志物通常被描述为是过表达、低表达或差异表达的，所述生物标志物的表达水平或值指示个体中的正常过程或不存在疾病或其他状况，或者所述生物标志物的表达水平或值是个体中正常过程或不存在疾病或其他状况的标志。因此，也可以涉及生物标志物的“过表达”、“低表达”和“差异表达”，以作为来自所述生物标志物的“正常”或“对照”表达水平的变化。
[0101]
在一种实施方式中，对生物标志物子集或组有用的生物标志物的数目是基于生物标志物值的特定组合的灵敏度和特异性值。术语“灵敏度”和“特异性”在本文中被用于关于基于在个体的生物样本中检测到的生物标志物值的个体tb诊断进行正确分类能力的方面。“灵敏度”指示生物标志物在正确地分类具有阳性tb诊断(即疾病证据(evd))个体的表现。“特异性”指示生物标志物在正确地分类具有阴性tb诊断(ned)个体的表现。例如，用于测试对照样本和tb诊断样本的组的标志物平板的85％特异性和90％灵敏度指示85％的对照样本被该平板正确地分类为ned样本，而90％的阳性样本被该平板正确地分类为evd样本。
[0102]
如下文更详细的描述，采取无标记的蛋白质组学方法来调查120名个体的尿液蛋白质组学，这些个体临床上分层为tb /hiv-、tb /hiv 、tb-/hiv 和tb-/hiv-组。这些120个个体的共识泌尿蛋白质组学包含了1870个蛋白质，包括26个分枝杆菌来源的。正如所预料的那样，在尿液中这组蛋白质在个体之间似乎极大地改变。
[0103]
在患有活动性tb患者的尿液中，识别到差异表达的对结核分枝杆菌特异的蛋白质和人类蛋白质的集合，并且其适合用于诊断tb。这些集合包括表2的基因标识符、蛋白质和/或肽，以及在结核分枝杆菌或人类中他们的下游功能。值得注意的是，在hiv阴性和hiv阳性个体的尿液中，识别到这些生物标志物平板。据申请人所知，在疑似结核疾病患者的尿液中，该生物标志物平板还没有被报告。此外，从包含这些平板的单个蛋白质的知识出发或从tb患者的其他体液中发现的蛋白质的知识出发，还不可能得出结论，因为许多蛋白质在最终进入尿液之前已被严重降解。
[0104]
表2：在尿液样本中识别的人类和分枝杆菌生物标志物的最佳候选物。
[0105][0106][0107]
从表2的生物标志物的较大收集物可知，两种人源蛋白质的核心集合(saa1和retn；saa1和rbp4)被识别用于诊断tb。任选地，可以向这两种蛋白质中加入其它人源蛋白质(例如表2中所列的那些)，以产生生物标记的排列。
[0108]
还识别了具有高灵敏度和特异性的3种、4种、5种、6种和7种宿主来源的蛋白质的平板。
[0109]
在tb 个体的尿液中这些蛋白质被确切地检测到出现，但是在tb-个体的尿液中这
些蛋白质没有被检测到。考虑到个体尿液样本的高度可变性，特别是考虑到一些最易识别的生物标志物是急性期炎症反应蛋白质，在尿液中宿主来源的生物标志物标记似乎不可靠，但是在该队列中，tb /tb-的划定几乎完全可以通过尿液中这些蛋白质的存在或不存在来解释。综上所述，与其他炎性或非tb呼吸疾病相反，所提出的这组生物标志物的组合可能有助于它们对tb诊断的特异性。
[0110]
还可以加入表1中的一种或多种分枝杆菌蛋白质来产生组合的和多维的生物标记，所述组合的和多维的生物标记包括在尿液中特定发现的人类宿主特异性的生物标志物和结核分枝杆菌特异性的生物标志物。生物标志物的选择(所述生物标志物是结核分枝杆菌和人源的蛋白质和/或肽)使活动性结核的判定(阳性预测测试值(ppv)》0.8)和排除(阴性预测测试值(npv)》0.8)成为可能。
[0111]
在一种实施方式中，当检测到2种、3种、4种或更多种测试的生物标志物时，或当检测到的生物标志物的水平高于相同生物标志物在无tb的受试者中的通常水平时，将做出tb阳性诊断。
[0112]
基于在患有或未患有活动性tb的受试者中通常发现的生物标志物的水平，可以确定截止值或阈值，并且当确定受试者是否患有活动性tb时，可以将样本中检测到的生物标志物的测量水平与截止水平进行比较。换言之，相对于没有患有活动性tb的受试者，所述方法将检测所述组中的生物标志物是低表达还是高表达。
[0113]
在一种实施方式中，分析尿液样本检测目标生物标志物的存在，并确定每个生物标志物的生物标志物值(通常测量标志物rfu(相对荧光单位))。一旦检测到生物标志物并且分配了生物标志物值，则根据现有技术已知的各种方法对每个标志物进行评分或分类。然后结合标志物的评分提供总的评估分数，其反映了个体是否患有疾病的证据。
[0114]
具有用于比较、评分和/或分类生物标志物水平的软件的计算机可用于诊断受试者是否患有tb。
[0115]
在一些实施方式中，捕获剂用于特定地结合每个生物标志物，并且指示器将指示何时发生捕获剂和每个生物标志物的结合。捕获剂通常是抗体，但是其他可能的捕获剂的例子包括亲合体、锚蛋白重复蛋白、犰狳重复蛋白、核酸适体、肽、碳水化合物配体、合成配体和合成聚合物。
[0116]
术语“抗体”包括抗体及其抗体片段(来源于任何产生抗体的哺乳动物(例如小鼠、大鼠、兔和包括人在内的灵长类动物))，其特异性地结合目标多肽靶标。示例性抗体包括多克隆、单克隆和重组抗体；多特异性抗体(例如双特异性抗体)，人源化抗体，鼠抗体，嵌合的、鼠-人类、鼠-灵长类、灵长类-人类单克隆抗体，和抗个体基因型抗体，以及可以是其任意完整的分子或其片段。抗体片段是来源于全长抗体或与全长抗体相关的部分，优选包括其抗原结合区或可变区。
[0117]
所述指示剂可以是测热的、电化学的、发色的、光学的、荧光的或放射性标记的指示剂等。
[0118]
在一种实施方式中，尿液样本可以与固相载体或承载体接触。“固体载体”在本文中指具有表面的任何基质，分子可以通过共价键或非共价键直接或间接地附着于所述表面。“固体载体”可以具有多种物理形式，其可以包括例如膜；芯片(例如蛋白质芯片)；载玻片(例如玻璃载玻片或盖玻片)；柱；空心的、实心的、半实心的、含有孔或空腔的颗粒，例如
珠粒；凝胶；纤维，包含光学纤维的材料；基质；和样本容器。示例性的样本容器包括样本槽、试管、毛细管、瓶和任何其他能够容纳样本的容器、凹槽或缺口。可以在多样本平台上含有样本容器，例如微量滴定板、载玻片、微流体装置等。载体可以由天然或合成材料、有机或无机材料组成。附着捕获试剂的固体载体的组成一般取决于附着方法(例如共价附着)。其他示例性容器包括微滴和微流体控制的或散装油/水乳液，在其中化验和相关操作可以发生。合适的固体载体包括例如塑料、树脂、多糖、硅胶或硅胶基质材料、功能化玻璃、改性硅、碳、金属、无机玻璃、膜、尼龙、天然纤维(例如丝、羊毛和棉)、聚合物等。包含固体载体的材料可以包括反应性基团，例如羧基、氨基或羟基组，用于捕获试剂的附着。聚合的固体载体可以包括例如聚苯乙烯、聚乙二醇四苯二甲酸酯、聚乙酸乙烯酯、聚氯乙烯、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯腈、聚甲基丙烯酸甲酯、聚四氟乙烯、丁基橡胶、丁苯橡胶、天然橡胶、聚乙烯、聚丙烯、(聚)四氟乙烯、(聚)偏二氟乙烯、聚碳酸酯和聚甲基戊烯。合适的固体载体颗粒可以使用包括例如编码的颗粒，例如型编码的颗粒、磁性颗粒和玻璃颗粒。
[0119]
生物标记可用于合适的免疫分析检测平台，所述免疫分析检测平台可包括光学的、sers、荧光的、电化学的、热的、比色的或其他检测平台。特别地，在elisa和/或横向流动形式中，可以产生用于多重定量的能够将所述生物标记的生物标志物捕获到表面上的抗体。可以用这些来开发针对tb疾病的即时诊断测试。
[0120]
还可以提供用于执行本发明的试剂盒。
[0121]
不同于其他商业上可获得的方法，本方法可以区分活动性和潜伏性结核，这对于确定受试者的治疗是重要的。活动性结核是在具有活动性结核疾病的临床的和放射学特征的受试者中，生物液体或组织的涂片显微镜检查-或结核分枝杆菌培养物呈阳性(或通过核酸扩增测试可检测到结核分枝杆菌)的疾病状态；经常出现全身症状。潜伏性结核感染是指在人体组织中存在潜在的活结核分枝杆菌，但个体是无症状的，并且没有活动性疾病的临床放射学特征。
[0122]
现在将通过以下非限制性实施例更加详细地描述本发明。
[0123]
实施例1：
[0124]
材料和方法
[0125]
队列招募和临床的分类
[0126]
患者在南非西开普(western cape)的tb诊所招募。根据胸部x光、培养物/涂片、genexpert和lam测试的结果，将患者分类到四个临床组：tb /hiv 、tb /hiv-、tb-/hiv-和tb-/hiv-。收集第一次排泄的尿液样本的中流，并储存在-20℃下直至处理。样本最初被设盲，并以12个随机批次进行处理。
[0127]
蛋白质沉淀
[0128]
将尿液样本在室温下解冻，并涡旋以均化任何沉积物质。将4ml的等分试样转移到玻璃瓶中，用比例为1∶0.75的甲醇和氯仿沉淀蛋白质。通过在4000rpm下离心2分钟，将沉淀物分离成相，并小心地除去顶部相。用1倍体积的甲醇洗涤剩余的蛋白质沉淀，并通过在4000rpm离心2分钟将其制成小球。除去上清液，并将小球在通风橱中干燥1小时。然后将所述小球在200μl变性缓冲液(10mm tris ph 8.0中的6m尿素、2m硫脲)中涡旋重悬，然后将样本转移到eppendorf管中，在-20℃下储存直至使用。
[0129]
溶液内胰蛋白酶消化
package for differential expression analysis of digital gene expression data.bioinformatics 26,139-140)。原始ibaq数据首先通过丰度进行过滤，去除样本中存在的丰度＜5％的蛋白质，其中认为fdr≤0.05和倍数变化≥1.5是显著的(benjamini-hochberg校正)。
[0139]
使用statistica 13.3版本执行额外的统计分析。
[0140]
结果
[0141]
确定总共有1870个蛋白质组被识别出来(fdr《1％)，其中26个分枝杆菌源，其余为人类源。每个样本中个体分枝杆菌肽的频率很低，大多数个体分枝杆菌肽在不到10％的样本中被识别。然而，人类和分枝杆菌蛋白通常由多个独特的肽识别，1672个蛋白质由2个或更多独特的肽识别。
[0142]
对ibaq值执行差异丰度测试来识别tb 和tb-个体之间显著差异丰富的蛋白质(图1和图3)。fdr≤5％，倍数变化≥1.5时，有102个差异丰富的蛋白质。使用string db对这些蛋白质进行功能富集分析，以识别富集的go术语和路径。
[0143]
tb状态的最佳预测因子的重要性排序由准确性的平均值下降来确定，去除该特征后下降越大，表示预测能力越强(图2和图4)。前七个人类生物标志物是saa1、rbp4、saa2、a8mue1、tsp4、crp和retn。在训练集合(分别为41个tb-样本和38个tb 样本)上，这7个生物标志物的随机森林分析(用10倍交叉验证)导致了准确性为94％(灵敏度＝89％，特异性＝99％，阳性预测值(ppv)＝97％，阴性预测值(npv)＝91％)(表3)。
[0144]
表3：使用训练和测试队列(n＝118)，在判定和排除活动性tb中，由7种蛋白质和/或肽组成的蛋白质生物标记的性能参数。
[0145][0146]
与生物标志物逐步减少相关联的交叉验证误差率揭露了四种生物标志物足以预测tb疾病状态(误差率约为9％)。使用随机选择的验证集合(分别为19和20个tb 和tb-样本)重新测试了这前四种生物标志物，即saa1、rpb4、saa2和tsp4，结果准确性为92％，ppv为100％，npv为87％，灵敏度为84％，特异性为100％(表4)。
[0147]
表4：包含saa1、rpb4、saa2和tsp4的蛋白质生物信号在判定和排除活动性tb(n＝39)中的表现参数。
[0148][0149][0150]
组合的和多维的生物标记包含两种人类宿主特定的生物标志物(saa1和rbp4)，并且还评估saa1、rbp4和2至4种结核分枝杆菌生物标志物，以判定和排除tb，并将这些生物标志物与只是saa1的生物标记进行比较(图5和6)。该生物标记是：
[0151]
saa1、rbp4、htpg、pe_pgrs28、10kda伴侣蛋白、eftu_myctu；
[0152]
saa1、rbp4、htpg、pe_pgrs28；以及
[0153]
saa1、rbp4。
[0154]
这些生物标记的随机森林分析结果如表5所示。
[0155]
表5：在判定和排除活动性tb中，包含多达6种蛋白质和/或肽的人类和结核分枝杆菌来源的组合的和多维的生物标记的表现。
[0156][0157]
bm，生物标志物；ubm，尿液生物标志物；auc，曲线下面积；ber，平衡误差率；
[0158]
sens.，敏感度；spec.，特异性；ppv，阳性预测值；npv，阴性预测值；
[0159]
saa-1，血清淀粉样蛋白a；rbp-4，视黄醇结合蛋白4。
[0160]
实施例2：
[0161]
材料和方法
[0162]
临床分类
[0163]
上述队列(n＝118)根据tb疾病状况分为两大组：tb (n＝57)和tb-(n＝61)。
[0164]
数据处理
[0165]
使用maxquant 1.6.14.0版本分析如上面生成的lc-ms数据，在运行、ibaq与lfq之间匹配。用于原始数据分析的数据库是2019年11月从蛋白质分析数据库(uniprot)下载的，数据库该是结合了智人和结核分枝杆菌h37rv的数据库，含有74053个人类序列和3999个结核分枝杆菌序列。使用r中的内部qc管道对maxquant的输出文件夹“.txt”进行分析，以评估运行质量。从数据中去除杂质和反向碰撞。
[0166]
统计分析
[0167]
使用上述随机森林分析和差异丰度分析，对单个生物标志物的ibaq值进行统计测试，重点关注图2中确定的以下24个候选人类生物标志物：
[0168]
表6：选择用于进一步测试的前24个候选人类生物标志物。
[0169] 生物标志物id基因名称1saa1saa12q5vy30rbp43saa2saa24a8mue1lilrb45tsp4thbs46crpcrp7retnretn8lv321iglv3-219fabplfabp110kv117igkv1-1711e5rgn3atox112aactserpina313e9pnw4cd59糖蛋白14a0a0c4dh68igkv2-2415i18bpil18bp16a0a0a0mt36igkv6d-2117kvd39igkv1d-3918axa81anxa8l119hv307ighv3-3020a0a087x0t8cadm121cspg2vcan22adipoadipoq23fhr2cfhr224a0a0c4dgy8enoph1
[0170]
结果
[0171]
对ibaq值执行差异丰度测试，以识别tb 和tb-个体之间显著差异丰度的24个候选生物标志物集合中的蛋白质(图7)。
[0172]
在24个候选生物标志物的集合中，通过准确性的平均值下降来确定tb状态的最佳预测因子的重要性排序，去除特征后下降值越大指示预测能力越强(图8)。前2个人类生物标志物是saa1和retn；前3个人类生物标志物是saa1和retn，结合lilrb4或il18bp；前4个人类生物标志物是saa1、retn、lilrb4和il18bp。
[0173]
训练集合的分析
[0174]
在训练集合(分别为38和41个tb 和tb-样本)上，这2个生物标志物平台saa1和retn的随机森林分析(用10倍交叉验证)得到的灵敏度＝89％，特异性＝91％，阳性预测值(ppv)＝90％，阴性预测值(npv)＝90％。
[0175]
在训练集合(分别为38tb 样本和41个tb-样本)上，这3个生物标志物平台saa1、retn和lilrb4的随机森林分析(用10倍交叉验证)得到的灵敏度＝92％，特异性＝93％，阳性预测值(ppv)＝92％，阴性预测值(npv)＝93％。
[0176]
在训练集合(分别为38tb 样本和41个tb-样本)上，这3个生物标志物平台saa1、retn和il18bp的随机森林分析(用10倍交叉验证)得到的灵敏度＝97％，特异性＝95％，阳性预测值(ppv)＝95％，阴性预测值(npv)＝97％。
[0177]
在训练集合(分别为38和41个tb 和tb-样本)上，这4个生物标志物平台saa1、retn、lilrb4和il18bp的随机森林分析(用10倍交叉验证)得到的灵敏度＝97％，特异性＝95％，阳性预测值(ppv)＝95％，阴性预测值(npv)＝97％。
[0178]
在训练集合(分别为38和41个tb 和tb-样本)上，这7个生物标志物平台saa1、retn、lilrb4、il18bp、serpina3、cd59和cadm1的随机森林分析(用10倍交叉验证)得到的灵敏度＝89％，特异性＝98％，阳性预测值(ppv)＝96％，阴性预测值(npv)＝93％。
[0179]
在训练集合(分别为38和41个tb 和tb-样本)上，这7个生物标志物平台saa1、retn、lilrb4、il18bp、serpina3、cd59和cfhr2的随机森林分析(用10倍交叉验证)得到的灵敏度＝95％，特异性＝95％，阳性预测值(ppv)＝95％，阴性预测值(npv)＝95％。
[0180]
在训练集合(分别为38和41个tb 和tb-样本)上，这7个生物标志物平台saa1、retn、lilrb4、il18bp、serpina3、iglv3.21和rbp4的随机森林分析(用10倍交叉验证)得到的灵敏度＝92％，特异性＝98％，阳性预测值(ppv)＝97％，阴性预测值(npv)＝93％。
[0181]
测试集合的统计验证
[0182]
然后使用随机选择的验证集合(分别为19个tb 样本和20个tb-样本)重新测试这些最佳生物标志物平台，得到的准确性(auc)、灵敏度、特异性、ppv和npv的值在表7中显示。
[0183]
使用箱线图(图9)进一步分析该集合中每个生物标志物的分布和频率，以获得关于已识别生物标志物组的效用的额外了解。
[0184]
在临床上有用的诊断平台中，理想的生物标志物应在高百分比的病例和/或对照中表达，并且应提供病例和对照之间的明确区别。基于这些数据和基本原理，结合上述随机森林分析(表7)和差异丰度测试(图7)，用于诊断tb疾病的人类尿液生物标志物的优选集合选自包含saa1、retn、lilrb4(a8mue1)、il18bp、serpina3(aact)、cd59(e9pnw4)、rbp4(q5vy30)、iglv3.21(lv321)和igkv1.17(kv117)的列表。
[0185]