一株乳双歧杆菌及其在防治痤疮中的应用的制作方法

1.本发明属于益生菌筛选与应用技术领域，具体涉及一株具有治疗痤疮功效的乳双歧杆菌及其应用。


背景技术：

2.皮肤是人体最大的器官，构成了机体外界之间的强大屏障，主要由表皮、真皮、皮下组织和皮肤附属器组成。广义的皮肤屏障包括物理屏障、免疫屏障、色素屏障和神经屏障等，而狭义的皮肤屏障多指物理性或机械性的表皮屏障结构。表皮结构通过皮肤水分、温度、ph和皮肤微生物组稳态来阻止变应原或有毒有害物质进入机体。因此，当皮肤屏障的完整性被打破后容易出现皮肤炎症疾病，如痤疮。
3.痤疮是发生于毛囊皮脂腺单位的一种慢性炎症性皮肤病，主要好发于青少年。痤疮的发生主要与皮脂分泌过多、毛囊皮脂腺导管堵塞、细菌感染和炎症反应等因素密切相关。研究表明，毛囊中多种微生物尤其是痤疮丙酸杆菌可以激活先天性免疫反应，导致毛囊皮脂腺过度角化。现今临床上对痤疮的治疗多采用维a酸类药物、激素和抗生素等，但未收到满意的疗效。
4.益生菌是一种活性微生物，当施以足够数量时能够给宿主带来健康益处。常见的益生菌种包括乳杆菌、双歧杆菌、芽孢杆菌以及某些丁酸梭菌等。有关益生菌的研究表明，它可以定植于人体肠道内调节道菌群平衡，对人体的免疫系统、神经系统、消化系统、代谢系统和呼吸系统等产生影响，因而具有缓解或防治ibs、 ibd、糖尿病、抑郁和流感等疾病的功效。近年来，有关肠-皮肤轴的研究表明，益生菌有调节皮肤菌群构成、抑制体内炎症反应和增强皮肤屏障功能的功效。据报道，几乎一半的轻度痤疮患者肠道菌群发生了变化。
5.fabbrocini等发现，服用含鼠李糖乳杆菌sp1发酵液的患者与服用不含鼠李糖乳杆菌sp1发酵液的患者相比，前者恢复了与胰岛素信号相关基因的表达，并且痤疮外观得到改善。rahmayani等发现寻常痤疮患者口服益生菌混合物一个月后，血清中的抗炎细胞因子白介素il-10水平显著提高，表明口服益生菌可以通过调节炎症反应作为寻常痤疮的辅助治疗手段。此外，口服罗伊氏乳杆菌还可以限制毛囊周围的主要组织相容性细胞，影响早期炎症，预防痤疮的发生。
6.除口服益生菌外，近年来也有许多有关外用益生菌的报道，如在护肤产品中添加益生菌发酵液或其裂解液成分。这类后生元能够影响皮肤微生物的组成，如抑制金黄色葡萄球菌的定植，缓解过度炎症反应，最终起到改善皮肤健康的作用。以后生元为有效成分开发的护肤产品成为一种防治痤疮的新思路。
7.痤疮发病机制复杂，且益生菌的益生特性在株水平上具有差异，同种不同株的益生菌株其预防和缓解痤疮的效果及其作用机制存在差异。因此，筛选获得防治痤疮效果突出，作用机制明确的益生菌株仍是目前研究的难点和热点。


技术实现要素：

8.本发明的目的是提供一株新的乳双歧杆菌(bifidobacterium lactis)及其应用。该菌株分离自母乳喂养婴儿的新鲜粪便样本，具有免疫调节活性，能够减轻皮肤炎症、提高皮肤抵抗力，能有效预防和治疗痤疮。
9.本发明所提供的乳双歧杆菌，为乳双歧杆菌vhprobi o20(bifidobacteriumlactis vhprobi o20)，已于2021年5月24日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏号为cctcc no：m2021598。
10.所述乳双歧杆菌vhprobi o20株，其16s rdna序列seq id no:1。
11.所述乳双歧杆菌vhp robi o20株，其maldi-tof核糖体蛋白分子量图谱如图2所示；其riboprinter指纹图谱如图3所示；其rapd指纹图谱如图4所示； rep-pcr指纹图谱如图5所示。
12.本发明所提供的乳双歧杆菌可用于制备功能性食品、保健品、药品或化妆品。
13.本发明提供的乳双歧杆菌可用于制备具有抗氧化功能的制品；
14.本发明提供的乳双歧杆菌可用于制备预防或治疗痤疮的制品。
15.所述制品为功能性食品或化妆品。
16.本发明提供的乳双歧杆菌vhprobi o20对人工肠胃液具有很强的耐受性，在人工肠胃液中能进行萌发；该菌株对红霉素和氨苄西林等常见的抗生素敏感，不产生溶血素，不能够溶解血细胞，具有良好的生物安全性；
17.该菌株具有一定的抗氧化能力，菌体抗脂质过氧化抑制率为20.34％、上清液为73.10％；dpph清除率达到20.21％，hrs清除率达到23.03％。另外，该菌株细胞表面疏水性为64.7％。
18.乳双歧杆菌vhprobi o20及其裂解液，能够有效缓解兔耳痤疮部位的红肿程度，减轻兔耳皮肤粗糙程度和硬度，改善兔耳痤疮部位的皮损症状，兔耳皮肤有较完整地表皮层和真皮层。
19.乳双歧杆菌vhprobi o20还能够调节白兔体内炎症因子水平，调节其免疫反应，减缓痤疮炎症的发展进程。
20.本发明提供的乳双歧杆菌vhprobi o20，对机体无毒害作用，可以添加在食品或护肤品中，用于治疗痤疮，具有广阔的应用前景。
附图说明
21.图1为o20菌株菌落照片；
22.图2为o20菌株maldi-tof核糖体蛋白峰图；
23.图3为o20菌株riboprinter指纹图谱；
24.图4为o20菌株的rapd指纹图谱；
25.图5为o20菌株的rep-pcr指纹图谱；
26.图6为各组兔耳痤疮症状对比；
27.图7为各组细胞因子检测结果对比；
28.图8为各组兔耳病理切片结果。
具体实施方式
29.本发明提供的乳双歧杆菌vhprobi o20符合法规要求，经多相分类学鉴定，乳双歧杆菌vhprobi o20为一株新发现的菌株。本发明提供的乳双歧杆菌vhprobi o20能够有效治疗和缓解痤疮，单独使用该菌株且无需与益生元和/或其它益生菌复配即可对痤疮有缓解功效；具有重要的应用价值。
30.申请人于2021年5月24日将所述乳双歧杆菌vhprobi o20保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏号为cctcc no：m2021598。
31.本发明所述筛选方法并不局限于实施例所述，已知的能够达到筛选目的的方法均可以，实施例的筛选说明只是对本发明的说明，并不是对本发明保护范围的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
32.下面结合具体实施例对本发明做详细的描述。
33.实施例1乳双歧杆菌vhprobi o20的分离筛选
34.1、初筛
35.配制bms琼脂培养基调ph 6.2-6.5，121℃高压灭菌15min。
36.取1g母乳喂养婴儿的新鲜粪便样本(取样过程符合生物取样的伦理标准)，经无菌生理盐水稀释后放入无菌样品袋中，用匀浆仪拍打混匀；取100μl混匀液梯度稀释，涂布于bms琼脂培养基后于37℃厌氧培养48h，待平板长出单菌落镜检。根据镜检结果，申请人共筛选出25株潜在乳酸杆菌，分别命名为o01、 o02、
……
、o20、o21、o22、o23、o24、o25。
37.2、复筛
38.配制1l的bms液体培养基，121℃高压灭菌15min，待培养基冷却后加入 3.2g猪粘膜胃蛋白酶，摇匀溶解，置37℃水浴摇床中水浴1h，制成耐酸性培养基。
39.将筛选得到的25株乳酸杆菌o01、o02、
……
、o20、o21、o22、o23、o24、 o25按6％接种量分别接种于上述耐酸性培养基中，37℃条件下厌氧静置培养48h，取发酵液进行菌量计数。
40.结果显示，在所述25株乳酸杆菌发酵液中活菌量的对数值中，o20菌株经耐酸性培养基复筛后活菌量最多，对数值高达8.70log cfu/ml。从而说明o20 菌株耐酸能力最高。
41.实施例2菌株鉴定
42.1、菌落形态鉴定
43.将o20菌株接种于bms琼脂培养基上，37℃厌氧培养24h后，可见o20单菌落呈乳白色，菌落直径在1.5-2mm左右，表面光滑，显微镜下呈短杆状。菌落及光镜下照片如图1所示。
44.2、生理生化特性鉴定
45.本实施例中接种液的准备如下：在无菌条件下，取适量新鲜o20菌液， 5000rpm/min离心5min，用pbs缓冲液洗2次，再用同体积pbs缓冲液重悬菌体后稀释50倍，作为接种液。
46.2.1、过氧化氢酶实验
47.取新鲜菌液，滴一滴于干净的载玻片上，然后在其上滴加一滴3％过氧化氢溶液，观察到o20菌株不产生气泡，是阴性反应。
48.2.2、碳源代谢试验
49.本实施例中所用的基础培养基配方如下：
50.蛋白胨1.5g；酵母提取物0.6g；吐温80 0.1g；盐溶液0.5ml；酚红18mg；蒸馏水100ml；ph7.4
±
0.2。盐溶液成分：mgso4·
7h2o 11.5g，mnso4·
4h2o 2.8g，蒸馏水100ml。
51.配制10g/100ml的糖、醇和苷类碳水化合物溶液，并用0.22μm的无菌过滤器进行过滤。在无菌条件下，向96孔板中加入20μl除菌后的碳水化合物溶液，每种碳水化合物4个平行，然后加入170μl灭菌后含酚红的基础培养基，再加入10μl接种液，不接菌反应孔作为对照。每孔加入50μl液体石蜡以防止培养过程中水分蒸发。37℃厌氧培养，以酚红为指示剂，观察培养基颜色变化；具体结果见表1。
52.表1：o20菌株碳源代谢结果表
[0053][0054]
注：“ ”阳性反应；
“‑”
阴性反应。
[0055]
2.3maldi-tof-ms检测菌株核糖体蛋白表达
[0056]
按照0.1％的接种量在mrs液体培养基中接种新鲜菌液，37℃，150rpm培养 48h后，收集菌体，无菌水洗涤4次，晾干表面水分。然后取少量新鲜菌体以薄膜的形式均匀涂布于靶板上，加1μl裂解液覆盖样品，晾干后，再加1μl基质溶液覆盖样品，晾干后，将样品靶放入质谱仪进行鉴定。用激光照射样品与基质形成的共结晶薄膜，使样品中蛋白质电离，离子在10～20kv电场作用下加速飞过飞行管道，根据到达检测器的飞行时间不同检测蛋白质的分子量。利用autofms1000分析软件autof analyzer v1.0获取蛋白指纹图谱，o20菌株主要核糖体蛋白的离子峰为：m/z2658.901、2648.948、4002.334、4376.813、4561.980、5316.587、 5713.658、6871.363、9003.998。鉴定结果如图2所示。
[0057]
3、分子生物学鉴定
[0058]
3.1 16s rdna基因序列分析
[0059]
3.1.1、基因组dna提取
[0060]
参照天根细菌基因组dna提取试剂盒(目录号：dp302)操作。
[0061]
3.1.2、16s rdna基因扩增
[0062]
引物序列：
[0063]
27f：agagtttgatcctggctca；
[0064]
1492r：ggttaccttgttacgactt。
[0065]
通过测序获得o20菌株的16s rdna序列seq id no:1，并将该序列在ncbi 数据库中进行比对，初步确定o20菌株为乳双歧杆菌。
[0066]
3.2riboprinter指纹图谱
[0067]
用一根取菌棒从琼脂培养基平板上沾取已纯化好的单菌落，将其放入有缓冲液的样品管中，用手持搅拌器搅拌使其在缓冲液中悬浮，然后将样品架放入加热器中灭活后放入riboprinter系统中，样品经过dna制备、转膜、成像检测及数据处理后，得到细菌鉴定结果。鉴定结果显示，o20菌株为乳双歧杆菌，其 riboprinter指纹图谱结果见图3。
[0068]
3.3rapd和rep-pcr指纹图谱鉴定
[0069]
3.3.1、rapd指纹图谱鉴定
[0070]
1)引物序列：gagggtggcggttct。
[0071]
2)rapd反应体系
[0072]
表2 rapd反应体系
[0073][0074]
3)电泳
[0075]
制备1.5％的琼脂糖凝胶板，dl2000dna marker作为结果对照，稳压100v 电80min，最后利用凝胶成像系统检测电泳图。o20菌株的rapd指纹图谱如图 4所示。
[0076]
3.3.2、rep-pcr指纹图谱
[0077]
1)引物序列：ctacggcaaggcgacgctgacg。
[0078]
2)rep-pcr的反应体系
[0079]
表3 rep-pcr的反应体系
[0080][0081]
3)电泳
[0082]
dl2000 dna marker作为结果对照。电压100v，电泳时间80min检测扩增结果。o20菌株的rep-pcr指纹图谱如图5所示。
[0083]
综上，将o20菌株的菌落形态以及生理生化特性结果上传至网站http://www.tgw1916.net/bacteria_logare_desktop.html，同时结合文献de clerck e，et al.systematic and applied microbiology,2004,27(1)50公布的结果，进行比对。综合分子生物学的鉴定结果，可以得出结论，o20菌株为一株新的乳双歧杆菌，将其命名为乳双歧杆菌vhprobi o20。
[0084]
实施例3乳双歧杆菌vhprobi o20对人工胃液和人工肠液的耐受性试验
[0085]
1、人工胃液的配制
[0086]
分别称取蛋白胨5g、酵母提取物2.5g、葡萄糖1g和nacl 2g，加入1000ml 蒸馏水，用稀盐酸调ph3.0，然后115℃灭菌20min。然后使用前加入3.2g猪粘膜胃蛋白酶，摇匀溶解，置37℃水浴摇床中温水浴1h，以模拟人体温度。
[0087]
2、人工肠液的配制
[0088]
分别称取蛋白胨5g、酵母提取物2.5g、葡萄糖1g、kh2po
4 6.8g和牛胆盐3.0g，加入77ml的0.2mol/l的naoh溶液，定容至1000ml，用稀盐酸或者氢氧化钠溶液调ph6.8
±
0.1，115℃灭菌20min。然后使用前加入1g胰酶，摇匀溶解，置 37℃水浴摇床中温水浴1h，以模拟人体温度。
[0089]
3、试验方法
[0090]
取2ml新鲜菌液，5000rpm/min离心5min收集菌体，菌体用生理盐水洗涤 3次，再用2ml生理盐水重悬，作为接种液。取1ml接种液，加入到24ml人工肠液中，置于37℃水浴摇床(200rpm/min)3h，取样1ml，检测活菌量。
[0091]
活菌计数方法按照国标《gb4789.35-2016-食品微生物检验乳酸菌检验》测定菌量，该菌株经过人工肠液消化后的活菌量(log cfu/ml)见表4。
[0092]
表4人工胃肠液消化后的活菌量
[0093][0094]
从表4可知，本发明筛选到的乳双歧杆菌vhprobi o20经人工胃液消化后活菌量基本没有变化，经过人工肠液消化后活菌量仅下降0.63个log值。说明该菌株对人工胃肠液具有很强的耐受性。
[0095]
实施例4乳双歧杆菌vhprobi o20的抗生素耐受性实验
[0096]
1、抗生素配制：氨苄青霉素、克林霉素、红霉素、庆大霉素、链霉素、四环素、万古霉素均配制成2048μg/ml的贮存液，-20℃保存备用。使用时将贮存液用bms液体培养基进行2倍系列梯度稀释成使用液，梯度稀释浓度为 1～1024μg/ml共11个梯度。
[0097]
2、接种液制备：接种液的准备：取适量新鲜菌液(24～48h，40℃培养)，5000rpm 离心5min，用无菌生理盐水洗一次，再用同体积生理盐水重悬菌体后稀释50 倍，作为接种液。
[0098]
3、微量肉汤稀释法测定抗生素对乳双歧杆菌vhprobi o20的最小抑菌浓度 mic。
[0099]
a.96孔板第1列次加入不含抗生素的bms液体培养基，作为阴性对照，向第2～12列依次加入190μl含不同浓度抗生素的bms液体培养基，然后分别接种10μl上述接种液，做3个平行孔，并以1个孔不加菌液作为空白。
[0100]
b.加入50μl石蜡油覆盖防止水分蒸发。
[0101]
c.将96孔板于40℃振荡培养48h后取出，测定od600值，用48h的结果统计抗生素对菌株的mic值，具体结果见表5。
[0102]
表5罗伊氏乳杆菌vhprobi o20的抗生素mic值
[0103][0104]
mic单位μg/ml
[0105]
从表5的结果可以看出，本发明提供的乳双歧杆菌vhprobi o20对红霉素和氨苄西林等常见抗生素敏感，生物安全性良好。
[0106]
实施例5乳双歧杆菌vhprobi o20抗氧化功能测定
[0107]
1、菌株清除dpph(1，1-二苯基-2-三硝基苯肼)和羟基自由基(hrs)能力测定
[0108]
菌株清除dpph自由基能力的测定
[0109]
取1ml待测菌株的pbs菌悬液，加入1ml 0.4mm的现配的dpph自由基溶液，混合均匀后然后置于室温温度下遮光反应30min，然后测定样品在波长 517nm处的吸光度a样本，测3次平行。对照组样品以等体积pbs溶液和dpph
·
乙醇混合液，并以等体积pbs菌悬液和乙醇混合液空白调零。清除率按下列公式计算：清除率％＝[1-(a
样品-a
空白
)/a
对照
]
×
100％。结果见表6。
[0110]
表6 dpph自由基清除率表
[0111][0112]
3)菌株清除hrs能力的测定
[0113]
将100μl 5mm的水杨酸钠-乙醇溶液，100μl 5mm的硫酸亚铁，500μl去离子水和200μl乳酸菌pbs菌悬液混匀后加入100μl过氧化氢溶液(3mm)，37℃水浴15min后在510nm波长处测量样品吸光度。羟自由基清除率按照下列公式进行计算。
[0114]
清除率％＝(a
样品-a
控制
)/(a
空白-a
控制
)
×
100％，其中a
控制
为去离子水替代样品，a
空白
为去离子水替代样品和h2o2，结果见表7。
[0115]
表7 hrs自由基清除率表
[0116][0117]
2、菌株抗脂质过氧化实验鉴定
[0118]
亚油酸乳化液的制备：0.1ml亚油酸，0.2ml tween 20，19.7ml去离子水。 0.5ml的pbs溶液(ph 7.4)中加入1ml亚油酸的乳化液，1mlfeso4(1％)，再加入0.5ml样品，37℃水浴1.5h，混合液加入0.2ml tca(4％)，2ml tba (0.8％)，100℃水浴30min，迅速冷却，4000rpm/min离心15min，收集上清液在532nm下测吸光度即为a；对照组以0.5ml蒸馏水代替样品即为a0。抑制率/％＝(a0－a)/a0×
100％
[0119]
注：a为样品组吸光度；a0为对照组吸光度，结果见表8。
[0120]
表8抗脂质过氧化抑制率表
[0121][0122]
实施例6乳双歧杆菌vhprobi o20的黄曲霉毒素b1吸附能力
[0123]
1、配制浓度为1μg/ml的afb1-pbs溶液。
[0124]
2、接种吸附：取1ml新鲜菌液(24h，37℃)，8000rpm离心5min，弃上清，用同体积pbs缓冲液清洗菌体2次，8000rpm离心5min，弃上清，然后将菌体重悬于1ml上述afb1-pbs溶液，置于37℃恒温培养箱，1h后取出，8000rpm 离心10min，取上清待测。
[0125]
3、按照黄曲霉毒素b1检测试剂盒说明书测定上清液中黄曲霉毒素b1浓度。
[0126]
测定前，将上清液用甲醇稀释100倍。
[0127]
结果显示：本发明提供的乳双歧杆菌vhprobi o20的黄曲霉毒素b1吸附能力为15.90％，标准差为0.01％。
[0128]
实施例7乳双歧杆菌vhprobi o20的疏水性细胞表面测试
[0129]
1、待测菌液制备：挑取纯化好的乳双歧杆菌vhprobi o20菌落接种于新配制的mrs液体培养基中，于37℃培养24～48h。再按1％(v/v)的接种量接至mrs 液体培养基中于37℃继续培养24～48h后6000
×
g离心10min，收集菌体后用无菌生理盐水冲洗2次，再用灭菌0.1m kno
3 1ml溶液重悬菌体，作为待测菌液。
[0130]
2、表面疏水性测定：吸取50μl上述菌悬液加入2450μl的0.1m kno3并记录od600为a0,取1.5ml菌悬液与500μl二甲苯混匀后在室温下静置10min(此时形成两相体系)。将两相体系涡旋振荡2min后再静置20min，重新形成水相和有机相。小心吸取水相(不要吸到有机相)在600nm处测量吸光度a1。细胞疏水性按公式hydrophobicity％＝(a
0-a1)/a1×
％计算，测三次实验取平均值。
[0131]
结果显示：本发明提供的乳双歧杆菌vhprobi o20细胞表面疏水性为69.50％，标准差为5.57％。
[0132]
实施例8乳双歧杆菌vhprobi o20及其裂解液在缓解兔耳痤疮中的应用
[0133]
1实验动物处理及模型构建
[0134]
1.1实验耗材
[0135]
表9实验耗材
[0136][0137][0138]
1.2新鲜菌液及裂解液制备
[0139]
将乳双歧杆菌vhprobi o20接种至新鲜培养的mrs培养基中，37℃厌氧培养12h后用作灌胃使用。取新鲜培养的菌液采用高压均质机进行破碎处理，压力为100mpa，重复均质
3次后置于70℃水浴锅彻底灭活处理，制备成裂解液。
[0140]
1.3实验动物处理
[0141]
选用清洁级新西兰大白兔，雄性，20只，随机分为4组，每组5只，由青龙山动物繁殖中心提供。实验兔专用颗粒饲料饲喂，饲养于清洁级动物房，温度18-20℃，相对湿度40％，分笼饲养，每笼随机放入1只，自由摄食饮水。
[0142]
大白兔适应性饲养完成后分别为空白组、建模组、阳性组、益生菌组。其中，空白组不做任何处理，全程灌胃和涂抹生理盐水；建模组、阳性组和益生菌组采用痤疮丙酸杆菌和油酸构建痤疮模型，建模组和阳性组在建模后分别采用生理盐水和甲硝唑凝胶治疗，益生菌组采用乳双歧杆菌vhprobi o20及其裂解液治疗。整个实验期间严格依照动物伦理法照看并处理动物。
[0143]
具体的处理方法如下：
[0144]
分别于兔耳左右外耳道上，用0.25ml涂布器均匀涂布50％油酸0.2ml,隔天 1次，连续涂布28天。将培养后的痤疮丙酸杆菌计数，调整浓度为107个/ml备用。在涂布油酸第12天，皮内注射痤疮杆菌30ul/耳，并在注射处做标记总计注射一次。
[0145]
(1)空白组：适应性结束后每天灌胃10ml生理盐水，外耳道涂抹生理盐水1ml,早中晚各一次至第38天试验结束；
[0146]
(2)建模组：每天灌胃10ml生理盐水，外耳道涂抹生理盐水1ml覆盖外耳道痤疮处,早晚各一次至第38天试验结束；
[0147]
(3)阳性组：每天灌胃10ml生理盐水，涂抹甲硝唑凝胶1g覆盖外耳道痤疮处,早晚各一次至第38天试验结束；
[0148]
(4)益生菌组：每天灌胃1
×
109cfu/ml乳双歧杆菌vhprobi o20菌液10ml，涂抹乳双歧杆菌vhprobi o20裂解液1ml覆盖外耳道痤疮处，早晚各一次至第 38天试验结束；
[0149]
2指标检测
[0150]
第38天试验结束后用便携式测厚仪测定各兔儿厚度，观察兔儿肿胀情况。采用痤疮皮损计数法来评估益生菌涂抹治疗效果，从兔儿硬度、厚薄、粗糙等方面观察兔儿皮肤情况。
[0151]
表10痤疮模型观察评分标准
[0152][0153]
抽取静脉血elisa法检测白兔血清il-10、tnf-α和ifn-γ3种细胞因子的含量。
[0154]
兔耳组织取材，制成5μm厚的石蜡切片进行he染色。依据实验性痤疮组织病理学判
定分级标准，根据模型动物的表皮增厚情况、毛囊口扩张程度以及所产生的角化物量，判断标本组织的病理学变化。
[0155]
3数据分析
[0156]
使用spss 22.0统计软件进行数据分析，结果以平均值
±
标准误的方式表示。两组间比较采用独立样本t检验，多组间差异比较采用单因素方差分析，方差齐时再进一步用最小显著差数法进行两两比较，方差不齐时采用秩和检验。p《0.05 表示差异具有显著性，p《0.01表示差异具有极显著性。使用graphpad prism 8.0 进行作图。
[0157]
4.实验结果
[0158]
4.1终末期各组白兔一般状态观察
[0159]
第38天给药结束后空白组兔耳外观柔软，可见清晰的毛细血管，兔耳开口处的毛囊口排列整齐；建模组兔耳可见明显红肿，有隆起的脓包；阳性组兔耳出现角化，毛囊变粗，兔耳变厚。益生菌组兔耳透光度改善，红肿程度减轻，没有丘疹和脓包出现，黑头现象减轻，兔耳变薄，硬度和粗糙程度缓解。各组别典型兔耳观察结果见图6，各组别兔耳外观观察评分结果见表11。
[0160]
表11兔耳外观评分量表
[0161][0162]
4.2终末期各组别白兔血清elisa检测结果
[0163]
il-10是一种在免疫调节和炎症中具有多效性的细胞因子。它下调巨噬细胞 th1细胞因子、mhc
‑ⅱ
类抗原和共刺激分子的表达，同时还可增强b细胞的生存、增殖和产生抗体的能力。tnf-α是一种涉及系统性炎症的细胞因子，同时也是属于引起急性反应的众多细
胞因子中的一员。inf-γ是水溶性二聚体的细胞因子，是ⅱ型干扰素的唯一成员，被称为巨噬细胞活化因子。实验结束后，血清中三种细胞因子水平变化如图7所示。
[0164]
从图7的结果可知，与空白组相比，建模组白兔血清中tnf-α和inf-γ细胞因子水平升高，差异具有极显著性(p《0.001)，il-10细胞因子水平降低，差异具有显著性(p《0.05)；与建模组相比，阳性组白兔血清tnf-α和inf-γ细胞因子水平降低，差异具有极显著性(p《0.001)，il-10细胞因子水平略高，差异不具有显著性；与建模组相比，益生菌组白兔血清tnf-α细胞因子水平降低，差异具有极显著性(p《0.001)，iinf-γ细胞因子水平低于建模组，l-10细胞因子水平略高于建模组，差异均不具有显著性；
[0165]
4.3各组别兔耳病理观察
[0166]
光学显微镜下观察各组兔耳he切片染色结果，如图8所示。
[0167]
空白组兔耳表皮层较薄，毛囊以及真皮和表皮交界处清晰，真皮内可见稀疏单核细胞浸润，真皮内稀疏单一结构；建模组光镜下可见真皮过度角化，毛囊口与漏斗部有角化物质堆积，毛囊上皮的颗粒层、棘层增生明显，真皮内可见大量的炎性细胞浸润，表皮层及真皮层不完整；阳性组兔耳表皮层较薄，真皮和表皮交界处以及毛囊清晰，真皮内可见单核细胞浸润，真皮内稀疏单一结构，少部分毛囊口可见扩张，有疏松的角化物质充填。光镜下，益生菌组兔耳表皮层较薄，毛囊以及真皮和表皮交界处清晰，真皮内有大量单核细胞浸润，真皮层可见角化物堆积。
[0168]
上述动物实验结果表明，同时灌胃乳双歧杆菌vhprobi o20及在痤疮部位涂抹其裂解液，能够有效缓解痤疮部位的红肿程度，减轻兔耳皮肤粗糙程度和硬度，兔耳痤疮部位的皮损症状得以改善，有清晰的表皮层和真皮层。此外，乳双歧杆菌vhprobi o20能够调节白兔体内炎症因子水平，调节其免疫反应水平，减缓炎症进程。
[0169]
综上所述，本发明提供的乳双歧杆菌vhprobi o20对于模拟人工肠胃液具有很强的耐受能力，有较强的细胞表面疏水性，这对于益生菌顺利经过胃肠道并在结肠处定植及发挥益生功能奠定了基础。同时，溶血性实验证实乳双歧杆菌 vhprobi o20不产溶血素，对常见抗生素敏感，生物安全性良好。乳双歧杆菌 vhprobi o20能够清除dpph和hrs等自由基，具有一定的抗氧化功效。此外，乳双歧杆菌vhprobi o20能吸附黄曲霉毒素b1以及较强的抗脂质过氧化能力。经兔耳痤疮实验证实，灌胃乳双歧杆菌vhprobi o20及同期涂抹其裂解液能够缓解痤疮严重程度，调节其免疫反应水平。乳双歧杆菌是人体正常的肠道菌群，其益生功效表明可以开发成后生元产品，应用于食品和护肤品当中。另外，根据最新的分类学规则，在《可用于食品的菌种名单》征求稿中，乳双歧杆菌 (bifidobacterium lactis)更名为动物双歧杆菌乳亚种。