用于确定水稻杂交亲和性的分子标记

1.本发明属于基因检测领域，具体涉及一种用于确定水稻杂交亲和性的分子标记及其应用。


背景技术：

2.籼粳杂交有强大的杂种优势，但籼粳杂交的f1代育性却很低(qiu et al.2005)。这 一现象主要受控于水稻第六号染色体的三个基因s5-orf3、s5-orf4和s5-orf5。
3.orf4与orf5仅相隔832bp，它们头对头排列，启动子是共用相同的序列，方向相反，因而两个基因的转录方向也相反。orf5扮演杀手的角色，它可以传递信号给orf4，引起内质网胁迫，导致细胞发生程序性细胞死亡与胚囊败育(chen et al.2008)。orf3 起到保护性作用，在籼粳杂种中，携带护卫基因orf3 的雌配子会阻止内质网发生胁迫反应，产生正常的配子，免于败育，而orf3-不具有这一功能(yang et al.2012；ji et al.2020)。 orf5分为三种基因型，粳稻型orf5-i、籼稻型orf5-j和orf5-n。基因orf5-n编码的蛋白在n端缺失包含信号肽的115个氨基酸，不能定位在细胞壁上，因而不能与orf4互作，所以杂交种f1代的育性不受影响(du et al.2011)。


技术实现要素：

4.为了探索影响籼粳杂交育种的因素，发明人研究了基因s5-orf3、s5-orf4和s5-orf5 等基因与育性稳定性、广亲和性的关系，利用三个基因不同组合，导致配子育性不同这一特性，设计了snp分子标记，可以利用这些分子标记快速地选育育性稳定的籼粳杂交后代。在该研究中，发现了s5-orf基因型与水稻杂交亲和性之间存在的规律事件。上述研究的成果构成了本发明的基础。具体而言，本发明包括如下技术方案。
5.一种用于确定水稻杂交亲和性的分子标记，其为水稻第六号染色体上基因s5-orf5的基因型，当s5-orf5的基因型为核苷酸序列seq id no:1所示的orf5-n时，提示水稻具有广亲和性。
6.agtaatgttgctccaattcttgcttaatcaacccatttcctttcctacgtttgact gcctgcctgcccctgagcaagcaagaaagaaagaaagaagggattaaatttgcttaa tccggcgccacagcagccgacgacgagttggagtgtccctcctccatcttcggtaag tagcaaagcacagtatgacattcacgaatgcatgtcatgatctatcactccc(seq idno:1)。
7.进一步地，当s5-orf5的基因型为orf5-n时，还提示杂交水稻、尤其是籼粳杂交品种的育性稳定。
8.在一种实施方式中，以水稻基因组dna为模板，进行pcr扩增所述分子标记时，使用的引物对分别为：
9.正向引物s5-orf5-indel1f：agtaatgttgctccaattcttgc(seq id no:2)；反向引物s5-orf5-indel1r：gggagtgatagatcatgacatgc(seq id no:3)。
10.上述分子标记中，s5-orf5的基因型还包括orf5-j和orf5-i，其中，orf5-j的核苷
酸序列为
11.aggaagaccagcagcttagctacacatatgaagaaatttgactctgtcgatcgg gacagccggagggagactggcaggcagatcaggggtgcagaggcaccatttaatcg atcggccattccttccgatatgctgctgctgctgctgcacgtcttgcttcttcattccc agcgagcggagggcggcaatatgatatgaccagcaccatcttcgatcgattctacggg tacgtaaatgcagatttgatcgatgcactact(seq id no:4)；
12.orf5-i的核苷酸序列为
13.aggaagaccagcagcttagctacacatatgaagaaatttgactctgtcgatcgg gacagccggagggagactggcaggcagatcaggggtgcagaggcaccatttaatcg atcggccattcctttcgatatgctgctgctgctgctgcacgtcttgcttcttcattccc agcgagcggagggcggcaatatgatatgaccagcaccatcttcgatcgattctacggg tacgtaaatgcagatttgatcgatgcactact(seq id no:5)。
14.在区分基因型orf5-j与orf5-i时，所用的引物为：
15.s5-orf5-snp1f：aggaagaccagcagcttagctac；
16.s5-orf5-snp1r：agtagtgcatcgatcaaatctgc。
17.本发明的第二个方面在于提供一种判断杂交水稻是否具有广亲和性的检测模型，其包括上述的分子标记和水稻是否具有广亲和性的标准。
18.上述的检测模型可以通过编程、数学软件包形式被输入计算机、基因检测装置、或者基因测序平台。
19.本发明的第三个方面在于提供一种用于检测水稻广亲和性的试剂盒，其包括上述pcr 扩增水稻基因组dna模板的引物。
20.本发明的另一个方面在于提供上述的分子标记、检测模型、试剂盒在水稻杂交育种、尤其是籼粳杂交育种中的用途。
21.本发明的判断杂交水稻是否具有广亲和性的分子标记和检测模型能够用于快速选育杂交水稻的后代品种，使家系快速稳定；也有助于根据基因型快速选育广亲和性的恢复系品系。
具体实施方式
22.籼粳杂交稻的育性稳定性和广亲和性是衡量杂交育种成功可能性的重要指标。水稻的广亲和性(wide compatibility)是指一些水稻中间型材料与籼粳品种杂交fi能正常结实。
23.利用判定育性稳定性和广亲和性的分子标记，可以在苗期通过基因检测来快速确定基因型，鉴定杂交稻的育性稳定性和广亲和性，帮助选择育种所需要的供体和受体品种，配制杂交种，从而加速育种进程，提高了水稻育种的效率，大大节约时间成本、人力成本和土地利用率，具有重要的经济意义。
24.本发明针对可能影响育性稳定性和/或广亲和性的基因s5-orf3、s5-orf4和 s5-orf5，设计了snp分子标记，期望可以利用这些分子标记来快速选育籼粳杂交后代，稳定育性，使家系快速稳定；并根据基因型快速选育广亲和性的恢复系品系。
25.经过系统的研究发现，基因s5-orf5的三个基因型orf5-i、orf5-j和orf5-n中， orf5-n基因型的水稻全部为广亲和性，而orf5-i和orf5-j基因型的水稻不具有广亲和性，因此确定s5-orf5的基因型是水稻广亲和性的分子标志物。对于orf5-i、orf5-j 的基因型，
可以根据orf5与orf4、orf3的不同组合的育性情况，选育所需要正常育性的后代。
26.在一种应用实施方式中，当本发明的分子标记以试剂盒形式提供时，该试剂盒除了各种引物外，还可分别包括下述物品中的至少之一：携带工具，其空间划分为可以收容一种或多种容器、96孔板或板条的限定空间，该容器例如是试剂盒、药瓶、试管、和类似物，每样容器都含有一个单独的用于本发明方法的组分；说明书，其可以写在瓶子、试管和类似物上，或者写在一张单独的纸上，或者在容器的外部或内部，例如是带有操作演示视频app下载窗口比如二维码的纸件，说明书也可以是多媒体的形式，比如cd、u盘、网盘等。
27.如下以验证实施例说明本发明的技术效果。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
28.实施例中涉及到的百分含量，除特别说明外(比如明示为体积百分比率或比例)，皆指质量百分含量。
29.实施例1：
30.主要仪器：pcr仪、abi 3730测序仪。
31.水稻基因供体品种：32个水稻品种由中国科学院上海植物生理生态研究所赠送。
32.分子标记筛选包括以下步骤：
33.1)提取待测水稻植株的基因组dna；
34.2)用分别针对各个基因s5-orf3、s5-orf4和s5-orf5的引物，对水稻基因组dna 进行pcr扩增；
35.pcr反应体系以20μl计为：10x pcr反应缓冲液2μ1，25mm mgso
4 0.8μl，2mm dntp 2μ1，5μm正向引物(-f)和反向引物(-r)各1.2μ1，基因组dna 20ng，kod-plus聚合酶 0.4μl，加ddh2o补足至20μ1。
36.pcr反应条件为：94℃预变性2分钟，94℃变性15秒，58℃退火30秒，68℃延伸1分钟，共35个循环；68℃保温5分钟。
37.3)对各个基因的单核苷酸多态性位点snp的pcr产物进行纯化，然后进行测序反应， 3730测序仪测序；
38.4)根据已经证实的水稻品种的育性稳定性和/或广亲和性，与各个测定的基因型进行归类统计，总结出对应于育性稳定性和/或广亲和性的基因型，即基因分子标记。
39.具体如下：
40.1.基因s5-orf3的基因型和snp位点检测
[0041][0042]
所选用的序列：orf3 /orf3-[0043]
tgtggaaccagaggatgccgtgcttcatggcgccgcgcttctttcccgtcctcta cctgttgcagagggaacagcagcagctcggtccatcgatttc (gatcactggttcc/-) gtgggaggcatctgatctctctcgtgtagcttatgctttggctacgacgatg(g/a) accaaggtgggtgcgcttcaggttggagcttacagtgagtgtgggtcattcttgcct tctggagtcgttttactag，
[0044]
其中，在ofr3 扩增239bp：
[0045]
tgtggaaccagaggatgccgtgcttcatggcgccgcgcttctttcccgtcctcta cctgttgcagagggaacagcagcagctcggtccatcgatttcgatcactggttccg tgggaggcatctgatctctctcgtgtagcttatgctttggctacgacgatggaccaag gtgggtgcgcttcaggttggagcttacagtgagtgtgggtcattcttgccttctgga gtcgttttactag；
[0046]
在orf3-扩增226bp：
[0047]
tgtggaaccagaggatgccgtgcttcatggcgccgcgcttctttcccgtcctcta cctgttgcagagggaacagcagcagctcggtccatcgatttcgtgggaggcatctga tctctctcgtgtagcttatgctttggctacgacgatgaaccaaggtgggtgcgcttca ggttggagcttacagtgagtgtgggtcattcttgccttctggagtcgttttactag。
[0048]
2.基因s5-orf4的基因型和snp位点检测
[0049][0050]
所选用的序列：orf4 /orf4-[0051]
acagctactccagtcgtatttactttgctttaatttgctaggtgcacagctcggcc atgccctgccgatcgatggatcacatgcatttatcttgtgcactgagagatacgtacgt cctccgtcgcgttcaagttg(c/t) tacatatacactcctacgtgccgggaacagtataaaagctaaggtagggaaagggaa cggcttagctgtggtgatcagtgtgagctaggcgaggcaccatcactctgaccatga g
[0052]
其中，ofr4 为：
[0053]
acagctactccagtcgtatttactttgctttaatttgctaggtgcacagctcggcc atgccctgccgatcgatggatcacatgcatttatcttgtgcactgagagatacgtacgt cctccgtcgcgttcaagttgctacatatacactcctacgtgccgggaacagtataaaa gctaaggtagggaaagggaacggcttagctgtggtgatcagtgtgagctaggcgag gcaccatcactctgaccatgag；
[0054]
ofr4-为：
[0055]
acagctactccagtcgtatttactttgctttaatttgctaggtgcacagctcggcc atgccctgccgatcgatggatcacatgcatttatcttgtgcactgagagatacgtacgt cctccgtcgcgttcaagttgttacatatacactcctacgtgccgggaacagtataaaa gctaaggtagggaaagggaacggcttagctgtggtgatcagtgtgagctaggcgag gcaccatcactctgaccatgag。
[0056]
3.基因s5-orf5的基因型和snp位点检测
[0057]
3.1区分orf5-j与orf5-i的引物见下表。
[0058][0059]
所选用的序列：orf5-j/orf5-i
[0060]
aggaagaccagcagcttagctacacatatgaagaaatttgactctgtcgatcgg gacagccggagggagactggcaggcagatcaggggtgcagaggcaccatttaatcg atcggccattcctt(c/t) cgatatgctgctgctgctgctgcacgtcttgcttcttcattcccagcgagcggagggc ggcaatatgatatgaccagcaccatcttcgatcgattctacgggtacgtaaatgcagat ttgatcgatgcactact，
[0061]
其中，orf5-j为：
[0062]
aggaagaccagcagcttagctacacatatgaagaaatttgactctgtcgatcgg gacagccggagggagactggcaggcagatcaggggtgcagaggcaccatttaatcg atcggccattccttccgatatgctgctgctgctgctgcacgtcttgcttcttcattccc agcgagcggagggcggcaatatgatatgaccagcaccatcttcgatcgattctacggg tacgtaaatgcagatttgatcgatgcactact(seq id no:4)；
[0063]
orf5-i为：
[0064]
aggaagaccagcagcttagctacacatatgaagaaatttgactctgtcgatcgg gacagccggagggagactggcaggcagatcaggggtgcagaggcaccatttaatcg atcggccattcctttcgatatgctgctgctgctgctgcacgtcttgcttcttcattccc agcgagcggagggcggcaatatgatatgaccagcaccatcttcgatcgattctacggg tacgtaaatgcagatttgatcgatgcactact(seq id no:5)。
[0065]
3.2区分orf5-n与orf5-j、orf5-i的引物见下表，通过插入/缺失片段鉴定基因型。
[0066][0067]
orf5-j和orf5-i序列：
[0068]
agtaatgttgctccaattcttgcttaatcaacccatttcctttcctacgtttgact gcctgcctgcccctgagcaagcaagaaagaaagaaagaagggattaaatttgctcg ctcctacgaatcctgcccctgagtaacaatgactgacttttaatttgtttgcagctag ggtggggatcgagatggtgatcttggagcagccacagctgctccttcttcttcttctt cttgtagcagctgcagctgcaaccggcgccacagcagccgacgacgagttggagtg tccctcctccatcttcggtaagtagcaaagcacagtatgacattcacgaatgcatgtc atgatctatcactccc；
[0069]
orf5-n的序列：
[0070]
agtaatgttgctccaattcttgcttaatcaacccatttcctttcctacgtttgact gcctgcctgcccctgagcaagcaagaaagaaagaaagaagggattaaatttgcttaa tccggcgccacagcagccgacgacgagttggagtgtccctcctccatcttcggtaag tagcaaagcacagtatgacattcacgaatgcatgtcatgatctatcactccc(seq idno:1)。
[0071]
实施例2：确定水稻杂交亲和性的分子标记
[0072]
测序了32个水稻材料的三个基因s5-orf3、s5-orf4和s5-orf5的基因型，符合通过传统育种实验已经确定的杂交亲和性鉴定事实，结果如表1所示。
[0073]
表1、水稻基因s5-orf3、s5-orf4和s5-orf5的基因型与广亲和性关系
[0074]
水稻品种orf3orf4orf5广亲和性hp486orf3 orf4-orf5-i无广亲和性hp274orf3 orf4-orf5-i无广亲和性hp119orf3 orf4-orf5-i无广亲和性
hp341orf3 orf4-orf5-i无广亲和性hp362orf3 orf4-orf5-i无广亲和性hp327orf3 orf4-orf5-i无广亲和性hp492orf3 orf4-orf5-i无广亲和性hp577orf3 orf4-orf5-i无广亲和性hp396orf3 orf4-orf5-i无广亲和性gp72orf3 orf4-orf5-i无广亲和性hp407orf3 orf4-orf5-i无广亲和性gp134orf3 orf4 orf5-i无广亲和性gp3orf3 orf4 orf5-i无广亲和性gp51orf3 orf4 orf5-i无广亲和性hp263orf3 orf4 orf5-i无广亲和性gp669orf3-orf4 orf5-j无广亲和性gp567orf3-orf4 orf5-j无广亲和性gp677orf3-orf4 orf5-j无广亲和性hp91orf3-orf4 orf5-j无广亲和性ur28orf3-orf4 orf5-j无广亲和性hp48orf3-orf4 orf5-j无广亲和性hp103orf3-orf4 orf5-j无广亲和性hp314orf3-orf4 orf5-j无广亲和性越光orf3-orf4 orf5-j无广亲和性gp551orf3-orf4 orf5-j无广亲和性hp11orf3-orf4 orf5-j无广亲和性hp390orf3-orf4 orf5-j无广亲和性空育131orf3-orf4 orf5-j无广亲和性gp688orf3 orf4-orf5-n广亲和性gp104orf3-orf4-orf5-n广亲和性gp124orf3-orf4-orf5-n广亲和性gp536orf3 orf4 orf5-n广亲和性
[0075]
如表1所示：经过测序，发现含有orf5-i基因型有15份，orf5-j基因型13份，orf5-n 基因型4份。
[0076]
根据该对比结果，可以确定定s5-orf5的基因型是水稻广亲和性的分子标志物，且当s5-orf5的基因型为orf5-n时，该水稻具有广亲和性；而orf5-i和orf5-j基因型的水稻不具有广亲和性。
[0077]
显然，通过s5-orf5基因型作为分子标记方法来筛选水稻植株，较传统育种实验结果稳定性高、可靠性好。该分子标记鉴定方法可在苗期取样，提取dna，通过pcr扩增和测序，找到相应的snp，鉴定出目标的单株，淘汰其它植株，提高个体的筛选效率，能够满足高通量分子标记辅助育种的需求，实现基因的产业化分子育种。
[0078]
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，
应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应该视为本发明的保护范围。
[0079]
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