一株具有促进石斛新根生长能力的瘤菌根菌菌株TP-13及其应用

一株具有促进石斛新根生长能力的瘤菌根菌菌株tp-13及其应用
技术领域
1.本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株具有促进石斛新根生长能力的瘤菌根菌菌株tp-13及其应用。


背景技术：

2.石斛属(dendrobium sw.)附生植物，石斛，又名万丈须。假鳞茎丛生，伸长呈茎状，多节；总状花序生茎上部节上，具花数朵或仅 1朵；花大而艳丽，花被片开展，侧萼片宽阔的基部着生在蕊柱足上，与唇瓣基部共同形成萼囊；唇瓣3裂。本属国产种类中具细茎而花小的类群，如细茎石斛、铁皮石斛、梳唇石斛、美花石斛、钩状石斛、霍山石斛等是中药“石斛”的原植物；茎粗而花大的种类均可作花卉供观赏。其中铁皮石斛(dendrobium officinale)被《道藏》誉为“中华九大仙草之首”，具有多种药理作用。然而石斛植物自然条件下繁殖率低，生长周期长，再加上生境破坏严重，导致野生资源极度匮乏，因此急需人工栽培石斛的方法。
3.铁皮石斛幼苗可通过非共生萌发培养和共生萌发培养两种方式获得，通过非共生萌发培养，虽具有较高幼苗率，但是方法获得的幼苗移植到自然环境，由于缺少与之建立共生关系的真菌伙伴，适应能力弱，抗病原微生物能力差，生长缓慢，且存活率低，导致后继生长严重受阻。而共生萌发培养技术是指在特定的基质(培养基)中同时播种植物种子和侵染促进种子萌发的共生真菌，该方法可以提高种子的萌发率、幼苗形成率。但由于兰科植物与其真菌伙伴组成复杂多样，幼苗建成后，幼苗矮小，抵御外界阻力能力弱，生长往往受阻停滞或者直接致死，故幼苗后期生长需要与更适合的真菌形成共生，刺激幼苗继续生长。因此，确定能与铁皮石斛幼苗形成共生关系并促进其生长的有效真菌是培育、保护铁皮石斛的关键环节。而菌根化的幼苗的获取是开展铁皮石斛保护、回归、重建种群实践以及发展铁皮石斛恢复友好栽培的基础。铁皮石斛在各生长阶段所需的真菌种类不一样，通过测定铁皮石斛原球茎和组培苗的生理指标发现，内生真菌主要通过产生内源激素来调节铁皮石斛的生长发育的。然而，现有技术报道了从铁皮石斛幼苗分离获得的真菌菌株，有些菌株能够对石斛种子和原球茎致死，有些菌株则能够促进铁皮石斛生长，主要体现在提高幼苗增长、叶绿素含量、促进营养元素的吸收等方面。新根生长是影响幼苗移栽成活率的重要影响因素，因此，提供一种石斛幼苗新根的内生菌株对于人工培育石斛幼苗会有较大的帮助。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明的目的在于提供一株瘤菌根菌菌株tp-13，具有促进铁皮石斛新根生长的能力，从而实现石斛的高效栽培。
5.本发明提供了一株具有促进石斛新根生长能力的瘤菌根菌 (epulorhiza sp.)菌株tp-13，保藏编号为cctcc no：m 20211285。
6.优选的，所述瘤菌根菌菌株tp-13的its序列如seq id no:1 所示。
7.本发明提供了一种用于石斛栽培的产品，包括所述瘤菌根菌菌株 tp-13和可接受的辅料。
8.优选的，所述产品包括微生物菌剂和石斛栽培用菌肥。
9.本发明提供了所述瘤菌根菌菌株tp-13或所述产品在石斛栽培中的应用。
10.优选的，所述石斛生长包括石斛新根生长、促进幼苗叶片、萌蘖的生长和提高幼苗干重。
11.优选的，所述石斛包括铁皮石斛。
12.本发明提供了一种提高石斛新根生长的方法，包括以下步骤：
13.将石斛幼苗和所述瘤菌根菌菌株tp-13进行共生培养。
14.优选的，所述共生培养用培养基为燕麦培养基。
15.优选的，所述共生培养的温度为23～27℃，所述共生培养的光暗周期l/d＝12/12，光照强度为2000～3000lx。
16.本发明提供的具有促进石斛新根生长能力的瘤菌根菌菌株 tp-13，保藏编号为cctcc no：m 20211285。所述菌株tp-13是从铁皮石斛幼苗迁地诱导获得的形成共生关系的幼苗菌根中分离筛选得到的。将菌株tp-13与石斛植物共生培养，菌株tp-13将石斛植物的菌根化，与其他同批分离的菌株相比，显著促进铁皮石斛幼苗新根的生长，为获得适应性强、成活率高的优质石斛种苗提供了有效途径，有望实现重建石斛种群和实现药用石斛的高效栽培。同时菌株tp-13 还能不同程度促进幼苗叶片、萌蘖的生长，提高幼苗的干重，从而促进石斛幼苗的生长。
17.本发明提供一种提高石斛新根生长的方法，该方法简单，操作容易，成本低，适于推广应用，在珍稀濒危兰科植物的回归保护、种群重建实践、药用兰科植物的生态栽培、解决铁皮石斛栽培产业的优质种苗来源瓶颈问题等方面都具有巨大的推广价值。
附图说明
18.图1为本发明提供的菌株tp-13与铁皮石斛幼苗共生培养后新根生长能力形态图。
19.生物材料保藏信息
20.瘤菌根菌属真菌(epulorhiza sp.)，于2021年10月15日保藏在中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路武汉大学，保藏编号为：cctcc no:m 20211285，菌株编号为tp-13。
具体实施方式
21.本发明提供了一株具有促进石斛新根生长能力的瘤菌根菌菌株tp-13，保藏编号为cctcc no：m 20211285。
22.在本发明中，所述菌株tp-13是从铁皮石斛幼苗迁地诱导获得的形成共生关系的幼苗菌根中分离筛选得到的。所述菌株tp-13的形态特征如下：在pda平板上培养10天，其菌落呈白色毯状，气生菌丝较发达，规则圆形发散生长，菌落表面粗糙、干燥。所述菌株tp-13 的菌丝特征如下：在25
±
2℃条件下培养箱内黑暗培养10天，光学显微镜下观察，菌丝粗3.51～4.65μm，分枝近直角，新菌丝着生于老菌丝，新菌丝具更明显隔膜，且隔膜数量更多，老菌丝细胞壁具有加厚现象，隔室较长。采用its基因片段进行分子鉴定，所述瘤菌根菌菌
株tp-13的its序列优选如seq id no:1所示,所述菌株tp-13与真菌epulorhiza sp.(登录号：kc154064.1)最为相似，最大相似度达到97.28％。综合形态学、生理生化和分子鉴定结果表明，菌株tp-13 属于瘤菌根菌(epulorhiza sp.)。
23.在本发明中，所述瘤菌根菌菌株tp-13的扩大培养方法，优选如下：
24.将瘤菌根菌菌株tp-13接种至pda培养基上，黑暗培养至菌丝长满培养皿。
25.本发明对所述瘤菌根菌菌株tp-13的接种量没有特殊限制，采用本领域所熟知的真菌接种量即可。所述黑暗培养的温度优选为 23～27℃，更优选为25℃。本发明对所述黑暗培养的时间没有特殊限制，培养至菌丝长满培养基即可。所述黑暗培养优选在人工气候箱中进行。
26.在本发明中，开展了菌株tp-13促进铁皮石斛幼苗新根生长有效性实验，同时以同批分离的其他瘤菌根菌菌株和非瘤菌根菌菌株为对照菌株，共生培养30d和90d，结果表明，共生培养30d时各菌株对幼苗的新根数有不同程度的提高，且与空白对照(pda组)相比差异显著，然而在共生培养90d时，菌株tp-13不仅相对于空白对照 (pda组)在幼苗的新根数方面具有显著优势，而且与其他菌株相比，也具有显著促进幼苗新根数的作用。因此，tp-13菌株对铁皮石斛幼苗新根生长有最明显的促进效果。
27.本发明提供了一种用于石斛栽培的产品，包括所述瘤菌根菌菌株 tp-13和可接受的辅料。
28.在本发明中，所述产品优选包括微生物菌剂和石斛栽培用菌肥。本发明对所述微生物菌剂的制备方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的真菌菌剂的制备方法即可。在本发明中，微生物菌剂的制备方法优选将上述扩大培养获得的菌株tp-13的菌丝接种至培养基上，待菌丝长满培养基后，混合，得到微生物菌剂。所述植物菌肥优选是将上述扩大培养获得的菌株tp-13的菌丝接种至培养基上，待菌丝长满培养基后，与营养成分混合，得到菌肥。所述培养基包括麦麸、米糠、 10％葡萄糖溶液等。所述麦麸、米糠、质量浓度10％葡萄糖溶液的体积比为2：3：3。每500ml培养基添加10片0.5cm3体积大小的菌块。所述培养的温度优选为23～27℃，更优选为25℃。所述培养优选为黑暗培养。所述培养的时间优选为14～16d，更优选为15天，直至辅料具有大量菌丝附着。所述营养成分还优选包括营养元素或有机肥等。
29.鉴于tp-13菌株对石斛幼苗新根生长有最明显的促进效果，同时还具有促进幼苗叶片、萌蘖的生长，提高幼苗干重的作用，因此本发明提供了所述瘤菌根菌菌株tp-13或所述产品在石斛栽培中的应用。
30.在本发明中，所述石斛生长优选包括石斛新根生长、促进幼苗叶片、萌蘖的生长和提高幼苗干重。本发明对栽培的石斛的种类没有特殊限制，采用本领域所熟知的石斛种类即可，例如细茎石斛、铁皮石斛、梳唇石斛、美花石斛、钩状石斛、霍山石斛。在本发明实施例中，以铁皮石斛为例加以说明菌株tp-13的共生作用。
31.本发明提供了一种提高石斛新根生长的方法，包括以下步骤：
32.将石斛幼苗和所述瘤菌根菌菌株tp-13进行共生培养。
33.在本发明中，所述共生培养用培养基优选为燕麦培养基。所述燕麦培养基优选为4g
·
l-1
燕麦和10g
·
l-1
琼脂，培养基ph为5.6～5.8。所述共生培养的温度优选为23～27℃，更优选为25℃。所述共生培养的时间优选为60～120d，更优选为90d。所述共生培养的光暗
周期l/d ＝12/12，光照强度优选为2000～3000lx，更优选为2500lx。本发明对石斛幼苗和所述瘤菌根菌菌株tp-13的接种顺序没有特殊限制，采用本领域所熟知的共生培养的接种顺序即可。在本发明实施例中，优先将石斛幼苗移栽至培养基中，再接种菌株tp-13。
34.下面结合实施例对本发明提供的一株具有促进石斛新根生长能力的瘤菌根菌菌株tp-13及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
35.实施例1
36.瘤菌根菌属真菌(epulorhiza sp.)tp-13菌株的分离、纯化及鉴定
37.(一)tp-13菌株的分离、纯化
38.1.迁地诱导铁皮石斛幼苗菌根
39.(1)2018年7月底至9月，团队实地调研多个地方，采访当地采药人，最终确认云南广南(23
°
58
′
n,105
°
11
′
e；1428m alt.)、湖南崀山喀斯特地貌(26
°
30
′
n,111
°
10
′
e；340m alt.)与丹霞地貌(26
°
20
′ꢀ
n,110
°
46
′
e；455m alt.)、重庆罗田(30
°
31
′
n,108
°
33
′
e；1200m alt.)，四川泸定(29
°
23
′
n,102
°
21
′
e；1382m alt.)和石棉(29
°
22
′
n,105
°
11
′ꢀ
e；3596m alt.)六个地方是铁皮石斛原生境，因为历史上采药人于此采集到过野生铁皮石斛。期间采集六个原生境基质带回实验室，将野外带回来的基质与无菌混合基质(树皮、泥炭土、火山石以2:1:1比例混合)等体积混合，然后用无菌水浇灌至饱和，后分装至塑料花盆 (半径5cm，高10cm)备用。
40.(2)选取长势良好的无菌铁皮石斛幼苗，五株为一丛，将其移植到装有诱导基质的塑料花盆，于25
±
2℃室温条件下光照培养(光周期为12/12h l/d)，保持花盆内基质的湿度，并每隔15天采集幼苗根组织，在显微镜下检查根组织是否被真菌定殖。
41.(3)移栽60天后，幼苗根组织上发现菌丝团，采集幼苗根样，用于后续真菌分离实验
42.2.瘤菌根菌属tp-13菌株的分离、纯化及保存
43.(1)根样的获得：铁皮石斛幼苗迁地诱导获得的形成共生关系的幼苗菌根
44.(2)根样内生真菌的诱导、分离、纯化及保存：在自来水下将用于真菌分离的根样冲洗干净。在超净工作台上，根样放入75％酒精消毒30s，再移入盛有2％次氯酸钠(naclo)溶液的无菌平板中，轻轻搅拌消毒3min，后用无菌尖镊取出，无菌水冲洗3～4次。用无菌手术刀将根样切成约0.1mm根片段，将其置于pda培养基中25℃培养箱黑暗培养。待根片段周围长出真菌菌丝，不断地切取菌丝尖端到新的pda培养基上作系列转移，转移3～5次后，可得纯菌落，共获得27株共生真菌。
45.(3)真菌保存：利用常规的试管斜面法对已纯化的真菌进行保存。将配制好的适量pda培养基倒入规格为18
×
20mm的玻璃试管中，培养基倒入量约为试管体积的1/3。硅胶塞后，放入高压灭菌锅内灭菌(121℃，20min)。灭菌后将试管置于超净工作台内摆成斜面待用。在超净工作台上，将纯化后的菌株用无菌接种针挑取边缘菌丝接种于pda斜面上，并注明菌种、编号、日期。将接种后的试管置于人工气候箱内25
±
2℃黑暗培养。待菌丝要长满pda斜面时，将试管取出存入4℃冰箱内保存。
46.(二)鉴定方法
47.1.分子鉴定
48.采用ctab法提取真菌总dna提取，用引物its1和its4进行 pcr扩增，pcr反应体系
和条件参照相应的产品说明书进行；扩增产物送上海生工生物工程有限公司测序；在美国国立生物技术信息中心数据库对所测序列进行比对分析，结合形态学特征确认其分类学地位。具体如下。采用ctab法提取真菌dna，pcr扩增所用引物为 its1(tccgtaggtgaacctgcgg，seq id no:2)和its4 (tcctccgcttattgatatgc，seq id no:3)；pcr反应体系(25μl) 包括：2.5μl 10
×
pcr缓冲液，0.4μl dntp，1.5μl mg
2
，1.5μl its1， 1.5μl its4，0.2μltaq酶，15.4μl ddh2o，2μl dna模板；扩增反应在pcr仪perkin elmer上进行，如下pcr循环：94℃预变性3min，循环1次；94℃变性1min，51℃退火1min，72℃延伸1min，30 次循环；最后72℃延伸10min；pcr扩增产物为上海生工生物工程有限公司进行测序；对所测序列提交美国国立生物技术信息中心数据库进行比对，初步确认其分类下地位。
49.本发明菌株鉴定结果表明，所述菌株tp-13与epulorhiza sp.(登录号：kc154064.1)真菌最为相似，最大相似度达到97.28％。
50.2.菌株tp-13形态特征如下：
51.所述菌株tp-13的形态特征如下：在pda平板上培养10天，其菌落呈白色毯状，气生菌丝较发达，规则圆形发散生长，菌落表面粗糙、干燥。
52.所述菌株tp-13的菌丝特征如下：在25
±
2℃条件下培养箱内黑暗培养10天，光学显微镜下观察，菌丝粗3.51～4.65μm，分枝近直角，新菌丝着生于老菌丝，新菌丝具更明显隔膜，且隔膜数量更多，老菌丝细胞壁具有加厚现象，隔室较长。
53.根据菌落、形态特征及分子生物学手段将本发明所涉及真菌鉴定为瘤菌根菌属真菌。
54.分离得到的菌株tp-13于2018年12月5日保藏在云南大学植物繁殖适应与进化生态学重点实验室兰科植物菌根真菌库，该菌株分类命名为瘤菌根菌属真菌(epulorhiza sp.)tp-13；并已于2021年10 月15日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路武汉大学，保藏编号为：cctcc no：m 20211285。
55.对比例1
56.实施例1分离的27株菌株中，分别对tp-1、tp-3、tp-6、tp-11、 tp-15、tp-23、tp-27菌株进行鉴定，鉴定方法同实施例1记载。
57.菌株tp-1(seq id no:4)、tp-3(seq id no:5)、tp-6(seq idno:6)被鉴定为胶膜属真菌(tulasnella sp.)，tp-11(seq id no:7) 被鉴定为瘤菌根菌属真菌(epulorhiza sp.)，菌株tp-15(seq id no:8) 被鉴定为sebacinales sp.，tp-23(seq id no:9)被鉴定为木霉菌 (trichoderma sp.)，菌株tp-27(seq id no:10)被鉴定为麝香霉菌 (muscodor sp.)。
58.实施例2
59.瘤菌根菌属真菌tp-13菌株促进铁皮石斛幼苗新根生长有效性实验
60.利用无菌铁皮石斛幼苗与真菌在培养基内的共生实验来验证该真菌是否对幼苗新根生长有促进效果以及比较不同真菌对新根生长促进效果的差异：
61.(1)配制共生培养基：共生萌发培养基为燕麦琼脂培养基，包括4g
·
l-1
燕麦和10g
·
l-1
琼脂，培养基ph为5.6～5.8；
62.(2)将用于验证促生长功能的26株共生真菌及本发明所诉瘤菌根菌属真菌epulorhiza sp.tp-13取出，接种在pda培养基上，置于人工气候箱内，在温度为25
±
2℃黑
暗培养活化至真菌菌丝长满培养皿得到共生菌株材料；
63.(3)将长势大约一致(叶：4-5片，根：2条，株高：1.7-2.5cm，茎粗：1.2-1.5mm)的无菌铁皮石斛幼苗移栽到装有燕麦琼脂培养基的组培瓶中，每组处理230株苗，46个重复；
64.(4)将用于共生菌株接种至栽有无菌幼苗的组培瓶中，再置于组培室，在温度为25
±
2℃条件下恒温培养，光照周期l/d＝12/12，光照强度为2500lx；
65.(5)真菌对铁皮石斛幼苗新根促进效果和数据统计分析：统计两个时期(共生30天和90天)，每次统计幼苗根数量，按照公式i 计算出新根数(r)；
66.r＝maen(rt-r0)
±
se
ꢀꢀꢀꢀ
公式i
67.其中rt为各时期幼苗的根数量，r0为幼苗最初的根数量，se为标准误。
68.共生培养90天截止实验时，利用广义线性模型(glms)比较不同真菌接种处理对新根数的影响，并用最小显著性差异(lsd)比较各处理平均值，p《0.05；任意接种处理对铁皮石斛幼苗新根生长均有不同程度的促进效果(表1)。
69.表1不同真菌对铁皮石斛幼苗新根生长的影响(30天、90天统计)
[0070][0071]
注意：小写字母表示不同真菌处理间的显著性。
[0072]
由表1可知，铁皮石斛幼苗与共生真菌共生培养30天后，不同真菌处理包括不接菌处理的pda对照均有新根的生长，尤其接种tp-27、tp-1和tp-13菌株处理，新根数平均值均显著高于其他真菌接种处理，分别高达2.227
±
0.192、1.724
±
0.112、1.62
±
0.189。共生培养90天截止实验时候虽所有真菌处理组的新根数都显著高于对照，但接种tp-13的处理组其平均新根数最高，高达2.688
±
0.298，于30 天的基础上增长29.78％，其促进新根生长的效果最佳，因此，tp-13 真菌对铁皮石斛幼苗新根生长有最明显的促进效果。
[0073]
真菌对铁皮石斛幼苗新根生长促进效应不同，大部分真菌处理对幼苗新根生长有持续的正面影响，但是tp-27菌株很特别，前期其对幼苗新根效果最佳，但是到90天统计时，发现其新根数量反倒不如前期，培养过程中发现该处理的幼苗根系有变黄变枯、根系断裂，遗留在共生培养基内，因此其不具有应用价值；而tp-1前期效果虽与 tp-13效果相当，但是
后期其促进效果没有tp-13效果好。而接种 tp-13菌株处理的幼苗其促进新根生长效果最佳，并且效果能够一直持续，同时其幼苗新叶数、萌蘖数、及干重相比不接菌处理的对照组也有显著的促进效果。铁皮石斛幼苗与本发明菌株tp-13表现出有益的共生关系，利用tp-13菌株和铁皮石斛幼苗共生，实现铁皮石斛幼苗菌根化，可作为铁皮石斛栽培的生物菌剂原料。
[0074]
实施例3
[0075]
为了进一步研究tp-13菌株和铁皮石斛幼苗共生时对铁皮石斛幼苗生长的影响，分别测定幼苗新叶数、萌蘖数以及干重指标数据，其中，萌蘖：90天统计，新萌芽的小芽；新叶数：90天时，统计叶片数，减去幼苗最初的叶片数，即得到新叶数；干重：90天统计时，将幼苗放入80度烘箱，烘烤干，期间称重检查干重数字是否变化，直至幼苗的干重数值不变，称量所有幼苗干重。
[0076]
结果见表2。
[0077]
表2不同真菌对铁皮石斛幼苗生长的影响(90天统计)
[0078][0079][0080]
注意：小写字母表示不同真菌处理间的显著性。
[0081]
与空白对照相比，tp-13菌株对铁皮石斛幼苗新叶树、萌孽数以及幼苗干重方面均有显著促进生长作用。而与其他物种菌株(tp-1、 tp-3、tp-23、tp-6、tp-27、tp-15)相比，tp-13菌剂具有相当的促生长作用。而对于同种的菌株(tp-11)相比，tp-13菌株在促进幼苗新叶树方面显著低于tp-11，萌蘖数方面，tp-13菌株与tp-11 的促生作用相当，而幼苗干重方面，tp-13菌株显著优于tp-11菌株。因此，tp-13菌株还具有促进铁皮石斛幼苗新叶树、萌孽数以及提高幼苗干重的作用。
[0082]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。