辅助诊断HIV阴性马尔尼菲篮状菌病的生物标志物及其应用的制作方法

辅助诊断hiv阴性马尔尼菲篮状菌病的生物标志物及其应用
技术领域
1.本发明涉及生物医药技术领域，特别是涉及一种辅助诊断hiv阴性马尔尼菲篮状菌病的生物标志物及其应用。


背景技术：

2.马尔尼菲篮状菌病(talaromycosis,tsm)，是由马尔尼菲篮状菌(talaromyces marneffei，t.marneffei)，旧称马尔尼菲青霉菌(penicillium marneffei,p.marneffei)，感染引起的一种严重的侵袭性播散性真菌病。既往认为tsm常继发于hiv阳性宿主，主要流行于东南亚一带，我国高发并以广西、广东、香港等地区多见。但近年来研究发现：tsm在日本、美国、欧洲等地，以及我国的华中和华东地区均有报告。同时，易感人群也呈现出从hiv阳性向hiv阴性转变的大趋势，hiv阴性宿主tsm的发病率逐年显著增高，近年来更是发病率上升最快的肺部真菌病。hiv阴性tsm也初步呈现出全球流行的趋势，我国的广西和广东是hiv阴性tsm最主要的流行区域，占全国比例的73.47％，其中广西占51.79％，广东占21.68％。
3.虽然目前在流行病学上对hiv阴性tsm已有一定的认识，但临床对其易感、临床特征、发病机制等的认识仍严重不足，导致该病在临床上易误诊和漏诊，病情迁延不愈给患者带来极大的痛苦，也严重威胁患者的生命安全。已有研究表明，长时间的误诊误治是影响hiv阴性tsm患者预后的独立危险因素；另外，其播散程度、持续感染时间、复发率及病死率均明显高于hiv阳性宿主(病死率29.4％vs 20.7％)；临床观察到即使在积极抗真菌治疗的情况下，死亡率仍可高达34.74％。
4.导致hiv阴性tsm临床诊治难度大、死亡率高的一个重要原因是在于其易感因素和发病机制较hiv阳性宿主更为复杂，我们的认知尚浅。研究表明已知宿主存在原发性或继发性免疫缺陷，免疫微环境失衡引起的病原体识别及清除障碍，是造成播散和持续感染的关键因素。和hiv阳性宿主相比明确的cd4 t细胞绝对值的减少是其主要的发病机制不同，我们前期发现hiv阴性tsm患者的总t细胞、cd4 t细胞及cd4 /cd8 均正常。另外，更多的研究发现，血液恶性肿瘤、糖尿病、结核、系统性红斑狼疮、器官移植受者，有糖皮质激素、细胞毒性药物等免疫抑制剂使用史或抗ifn-γ自身抗体者升高，甚至是一些表观免疫正常者亦可患此病，这表明hiv阴性tsm存在更为复杂的细胞免疫和尚未清晰的发病机制，导致该病易发和难治。
5.综述所述，hiv阴性tsm的诊断及治疗具有巨大挑战，而患者难治、预后差等临床特征一直是困扰临床诊治的重大问题，严重影响患者生活质量并带来沉重经济负担，已然成为威胁公众健康的真菌病之一，是当前亟待解决的医学和社会问题。因此，深入研究hiv阴性tsm的发病机制、防御机制及马尔尼菲篮状菌感染的免疫逃逸机制迫在眉睫。然而关于hiv阴性tsm的易感和发病机制，以及宿主感染后马尔尼菲篮状菌通过何种细胞、何种主要细胞因子、何种信号通路影响其对机体的免疫微环境，免疫耐受等机制目前尚不明确，亟待我们深入研究探索，为提高临床对该病的救治率提供科学的依据。
6.了解马尔尼菲篮状菌病的发病机制是快速诊断和有效治疗该疾病的关键。近些年来，越来越多的潜在免疫缺陷被发现与马尔尼菲篮状菌的易感性相关，其中基因突变导致的免疫缺陷较为显著，包括stat1，card9，stat3等基因突变。全基因组测序为此类基因的发现提供了极大的助力，而此类基因的发现将为hiv阴性马尔尼菲篮状菌病的发病机制的研究提供可靠依据，未来可能作为该病的诊断和治疗靶点。


技术实现要素：

7.基于此，有必要针对上述问题，本发明提供一种辅助诊断hiv阴性马尔尼菲篮状菌病的生物标志物，该生物标志物能够对hiv阴性马尔尼菲篮状菌病进行辅助诊断，为hiv阴性马尔尼菲篮状菌病的发病机制的研究提供可靠依据。
8.一种辅助诊断hiv阴性马尔尼菲篮状菌病的生物标志物，所述生物标志物为chr17:21703362和/或chr17:21703501。
9.本发明的生物标志物可用于辅助诊断hiv阴性马尔尼菲篮状菌病。
10.在其中一个实施例中，所述生物标志物为kcnj18基因的c.g576c和/或c.g715a。
11.本发明还提供一种本发明所述的生物标志物在制备用于辅助诊断hiv阴性马尔尼菲篮状菌病的试剂或设备中应用。
12.本发明还提供一种用于辅助诊断hiv阴性马尔尼菲篮状菌病的试剂盒，包括用于检测本发明所述的生物标志物的试剂。
13.在其中一个实施例中，所述试剂盒中包括用于检测所述生物标志物的特异性扩增引物，所述特异性扩增引物的序列为：
14.上游引物：gccttcctcttctccatcga(seq id no.1)，
15.下游引物：gctggcctcgtcaatttcat(seq id no.2)。
16.在其中一个实施例中，包括用于检测所述生物标志物的测序引物，所述测序引物的序列为：
17.测序引物：gctggcctcgtcaatttcat(seq id no.3)。
18.本发明还提供一种用于辅助诊断hiv阴性马尔尼菲篮状菌病的系统，其特征在于，包括：
19.测序模块，用于检测生物样本中如本发明所述的生物标志物；
20.分析模块，用于获取上述检测结果，根据预定规则判断诊断结果。
21.在其中一个实施例中，所述预定规则为：当检测到chr17:21703362位点为g＞c突变，则判断为hiv阴性马尔尼菲篮状菌病高风险；或，当检测到chr17:21703501位点为g＞a突变，则判断为hiv阴性马尔尼菲篮状菌病高风险。
22.本发明还提供一种用于科学研究目的的hiv阴性马尔尼菲篮状菌病检测方法，包括检测本发明所述的生物标志物的步骤。
23.本发明还提供一种kir通道作为药物靶点在制备用于治疗hiv阴性马尔尼菲篮状菌病中的应用。
24.发明人发现kcnj18基因c.g576c和/或c.g715a位点突变导致kir通道功能障碍，表明kir通道可作为治疗hiv阴性马尔尼菲篮状菌病的药物靶点。
附图说明
25.图1为hiv阴性tm感染患者全外显子基因测序流程及基因分析流程图。
26.图2为实施例中的琼脂糖凝胶电泳图。
27.图3为kcnj18基因突变蛋白结构及功能预测图。
28.图4为3例hiv阴性tsm患者kcnj18基因突变一代测序验证结果。
具体实施方式
29.为了便于理解本发明，以下将给出较佳实施例对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
30.除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
31.需要说明的是，本发明所涉及的研究是根据赫尔辛基宣言的原则进行的。本研究经广州医科大学第一附属医院伦理委员会批准(参考编号2019026)，并获得参与者的书面知情同意。
32.实施例1
33.严格按照纳入和排除标准，纳入53例hiv阴性马尔尼菲篮状菌感染患者，对所有患者外周血进行全外显子基因检测，并利用一代测序对突变基因进行验证。hiv阴性tm感染患者全外显子基因测序流程及基因分析流程如图1所示，具体地过程如下。
34.一、hiv阴性马尔尼菲篮状菌感染患者的纳入和排除
35.在2018年1月至2021年1月期间，根据以下纳入标准，借助一项前瞻性多中心队列研究从全国7个分中心纳入58例hiv阴性马尔尼菲篮状菌感染患者，根据排除标准最终入组53例患者。
36.纳入标准：1)实验室检查明确hiv阴性；2)有马尔尼菲篮状菌感染的临床或影像学表现；3)在以下标本中分离出马尔尼菲蓝状菌或有相应的病理变化，标本：痰，气道分泌物，肺泡灌洗液，肺，胸膜渗出，骨髓涂片，皮肤，淋巴结等，病理变化：
①
pas或wright’s染色后可见圆形或椭圆形，有明显横隔；
②
从培养物中分离病原体；
③
病理检查示tm感染伴化脓性肉芽肿、中央坏死和大量单核巨噬细胞浸润；或
④
宏基因组学二代测序(mngs)显示抗真菌治疗后tm和症状和体征得到改善。
37.排除标准：患有hiv阳性或自身免疫性疾病、癌症或免疫缺陷的患者；或在过去3个月内接受过免疫抑制药物。
38.二、基因检测
39.用乙二胺四乙酸(edta)抗凝管抽取患者及父母外周静脉血各2ml，由广州金域医学检验中心通过高通量测序技术(二代测序)进行全外显子组测序检测。
40.采用qiaamp dna提取试剂盒(qiagen公司)抽提基因组dna，并测量其吸光度值及浓度。
41.dna标本经质检合格后，将样本溶于te solution(te溶液)，利用超声破碎仪(bioruptor)(le220,covaris,美国)，将dna进行片段化，使用dna文库构建试剂盒(180482，
qiagen qiaseq fx dna library kit，德国)将100ng dna酶切打断，末端修复和添加a碱基，加入2ul index adapter接头连接，0.8
×
ampure xp beads(a63882，beckman，美国)磁珠纯化和片段选择，pcr扩增(扩增条件：[98℃,2min[；[98℃,20s；60℃,30s；72℃,30s[10cycles；[72℃,1min[；[10℃,∞[)，1
×
ampure xp beads(a63882，beckman，美国)磁珠纯化pcr产物，完成文库构建。文库浓度≥10ng/ul，agilent 2100生物分析仪(dna 1000kit)检测文库片段大小处于300-500bp之间。
[0042]
采用全外显子组panel(idt捕获磁珠与hybridization and wash kit试剂盒，1056115，idt，美国)，对全外显子进行目标区域捕获，采用高保真dna聚合酶(kk2621，kapa，美国)对目标区域进行pcr扩增(浓度≥10ng/μl)(捕获产物扩增纯化后浓度)(pcr扩增条件：[98℃，45s[；[98℃，15s；65℃，30s；72℃，30s[8cycles；[72℃,1min[:[10℃,∞[)。使用novaseq 6000测序仪(illumina,美国)高通量模式，进行双端150bp(pair end 150bp)pe150测序。覆盖了2万个基因的外显子区及其侧翼内含子区的大约50bp，平均深度达到100-200乘(针对抗凝全血样本而言)。
[0043]
三、基因分析
[0044]
应用burrows-wheeler-alignment(bwa)工具对人类参考基因组组装grch38进行序列比对。随后使用picard软件排除pcr重复。由gatk最佳实践鉴定出的小变异，在应用vqsr的质量控制后，仍保留了175,537,409个高质量变异。在本研究中，我们重点研究了鉴定出的1,302,281个snp和271,749个indel。
[0045]
兴趣变量进一步使用annovar进行注释。其中，等位基因频率的注释数据库包括：1000个基因组项目(1kgp)、exome aggregation consortium(exac)、genome aggregation database(gnomad)、nhlbi-esp项目)(esp6500)和中国代谢分析项目(chinamap)。
[0046]
关注影响已知免疫功能基因的变异，从import数据库(https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/29485622/)中筛选了一个含有1793个基因的免疫基因。进一步要求惩罚选择的变异为研究中的所有患者所共有。另一方面，对所有变异进行了硬筛选，以确定具有或不具有已知免疫功能的基因上的新变异。在硬过滤过程中，保留了满足以下约束条件的变体：(1)外显子或剪接变体；(2)无意义或误义的变体；(3)不与重复或段重复重叠；(4)所有样本共享；(5)1000gp中等位基因频率≤0.01％或未报道；(6)gnomad等位基因频率≤0.01％或未报道；(7)esp6500中等位基因频率≤0.01％或未报道；(8)chinamap等位基因频率≤0.01％或未报道。限制因素(1)-(3)用来保留最有可能影响基因功能的变异。限制因素(5)、(8)旨在识别与该疾病相关的罕见或新变异，特别是在中国人群中。
[0047]
过滤后的变异被认为具有潜在的致病力，需要进一步的人工调查。按照美国医学遗传学学院和分子病理学协会(acmg/amp)的指导方针，使用intervar软件和clinvar的临床报告评估了这四种变异的致病性。对10种有害预测算法的组合，如sift、polyphen2和lrt，进行可能的变体研究。通过进化速率分析(evolutionary rate profiling,gerp)评分和结合注释依赖耗尽(combined annotation-dependent depletion,cadd)评分进一步研究变异对蛋白质功能的潜在影响。
[0048]
四、突变基因的验证
[0049]
验证技术路线为：核酸提取
→
pcr扩增
→
电泳鉴定
→
pcr产物纯化
→
测序
→
数据分析。
[0050]
4.1实验仪器、试剂、耗材
[0051]
表1.主要仪器、试剂和耗材
[0052][0053]
4.2核酸提取
[0054]
参考核酸提取操作说明书进行操作。
[0055]
4.3 pcr扩增
[0056]
4.3.1引物信息
[0057]
根据检测信息查找参考序列，用primer premier 5软件进行引物设计，引物信息如下。
[0058]
表2.引物信息
[0059][0060]
4.3.2扩增体系和条件
[0061]
表3.pcr扩增反应体系和条件
[0062][0063]
4.4电泳鉴定
[0064]
3μl pcr产物进行1.0％的琼脂糖凝胶检测，观察条带性状。琼脂糖凝胶电泳图如图2所示。图2中，最左侧为marker，m从上到下依次为5000bp、3000bp、2000bp、1000bp、75bp、500bp、250bp、100bp，右侧8个泳道分别代表8个不同病人的样本，rs1292324632和rs1310028733分别代表kcnj18突变的两个位点c.576g》c和c.715g》a。
[0065]
4.5pcr产物纯化
[0066]
pcr产物纯化按照磁珠纯化标准操作流程操作，利用磁珠能够吸附或者释放带电荷物质的原理，在高盐低ph溶液吸附dna，在低盐高ph溶液释放dna，从而达到分离提纯dna产物的目的。
[0067]
4.6测序
[0068]
将纯化后的pcr产物进行上机检测。
[0069]
4.7数据分析
[0070]
数据下机后更名分类，然后上传系统，数据从系统下载下来后使用phred\phrap软件进行snp分析并导出分析结果。
[0071]
五、结果分析
[0072]
hiv阴性tm感染患者全外显子基因测序流程及基因分析流程如图2所示。
[0073]
53例hiv阴性tsm患者中kcnj18基因突变致病评分情况如表4所示。
[0074]
表4.53例hiv阴性tsm患者中kcnj18基因突变致病评分情况
[0075]
[0076][0077]
注：表中n/a为数据库中未录入的突变，d为有害突变。
[0078]
53例hiv阴性tsm患者均存在kcnj18基因c.g576c和c.g715a位点突变，且均为新的非同义变体(如图2)。acmg/amp指南和clinvar数据库都没有对这两种变异提出任何良性结论。此外，所有的非同义变体都被至少一种有害预测算法预测为有害的。特别是，kcnj18的两个新变体c.g576c和c.g715a具有较高的gerp得分(如表4)，这表明该突变位点高度保守，因此更有可能具有重要功能。cadd评分将这两个变异分类为人类基因组中最有害的1％-0.1％的变异(表4)，进一步证实了gerp评分的预测。
[0079]
我们进一步研究了p.q192h和p.e239k两种突变体对kcnj18 3d蛋白结构的影响，kcnj18基因突变蛋白结构及功能预测图如图3所示。这两种突变体都聚集在kir2.6通道膜拓扑的细胞质c端结构域。突变体p.q192h位于免疫球蛋白(ig)样结构域(igld)的开头，与几个已知的对kir2.6结构和功能有影响的突变或其同源性的突变很接近。如p.r205h对kir2.6的功能表现出超形态效应，延长了半最大电流降解的过程，而p.a200p突变则导致功能完全丧失。野生型p.192q含有gln氨基酸，gln氨基酸既是亲水氨基酸也是酰胺氨基酸，因此具有形成氢键和肽键的潜力。另一方面，突变体p.q192h含有中性碱性的his氨基酸，突变体在主链和侧链之间增加了一个氮-氮键，可能对蛋白质结构产生影响。p.q192h被预测会引起稳定性下降(δδg＝-0.87)，进一步支持了这一观察结果。第2个突变p.e239k位于igld的中心，其中中等大小的氨基酸glu(138.4)被一个较大的氨基酸lys(168.6)取代。此外，lys带正电荷，pl＝9.8，而glue带负电荷，pl＝3.2。因此，预计该突变引起的稳定性下降
为δδg＝-0.529(表4)。此外，这两个突变通过启动kir通道突变位点的氨基酸序列比对，具有相对保守性。这两种突变的结合可能是致病的。
[0080]
经一代测序验证29例患者，发现29例患者均存在kcnj18基因c.g576c为杂合突变，而一代测序验证未检测到c.g715a位点突变，图4为3例hiv阴性tsm患者kcnj18基因突变一代测序验证结果。
[0081]
本实施例利用全外显子基因测序，明确kcnj18基因c.g576c和c.g715a为hiv阴性马尔尼菲篮状菌病患者可能的致病基因。基于全外显子基因测序结果提示kcnj18基因c.g576c和c.g715a位点突变导致kir通道功能障碍，进而影响机体t淋巴细胞、树突状细胞、巨噬细胞等免疫功能紊乱。kcnj18基因的c.g576c和/或c.g715a碱基位点作为生物标志物，可用于对hiv阴性马尔尼菲篮状菌病进行辅助诊断，为hiv阴性马尔尼菲篮状菌病的发病机制的研究提供可靠依据，未来可能作为该病的诊断和治疗靶点。
[0082]
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
[0083]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。